Summary
Этот метод биохимической очистки с протеомным анализом на основе масс-спектрометрии облегчает надежную характеристику амилоидных фибровых ядер, что может ускорить идентификацию мишеней для профилактики болезни Альцгеймера.
Abstract
Белковые фибриллярные включения являются ключевыми патологическими признаками множественных нейродегенеративных заболеваний. На ранних стадиях болезни Альцгеймера (БА) бета-амилоидные пептиды образуют протофибриллы во внеклеточном пространстве, которые действуют как семена, которые постепенно растут и созревают в большие амилоидные бляшки. Несмотря на это базовое понимание, современные знания о структуре, составе и моделях осаждения амилоидных фибрилов в мозге ограничены. Одним из основных препятствий была неспособность выделить высокоочищенные амилоидные фибриллы из экстрактов мозга. Подходы на основе аффинной очистки и лазерного захвата на основе микродиссекции ранее использовались для выделения амилоидов, но ограничены небольшим количеством материала, который может быть восстановлен. Этот новый, надежный протокол описывает биохимическую очистку ядер амилоидных бляшек с использованием солюбилизации додецилсульфата натрия (SDS) с ультрацентрифугированием и ультразвуком градиента плотности сахарозы и дает высокочистые фибриллы от пациентов с БА и тканей мозга модели АД. Протеомный анализ очищенного материала на основе масс-спектрометрии (MS) представляет собой надежную стратегию идентификации почти всех первичных белковых компонентов амилоидных фибрилл. Предыдущие протеомные исследования белков в амилоидной короне выявили неожиданно большую и функционально разнообразную коллекцию белков. Примечательно, что после уточнения стратегии очистки количество белков совместной очистки сократилось более чем в 10 раз, что указывает на высокую чистоту изолированного нерастворимого материала SDS. Отрицательное окрашивание и иммунозолотая электронная микроскопия позволили подтвердить чистоту этих препаратов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять пространственные и биологические атрибуты, которые способствуют отложению этих белков в амилоидные включения. Взятые вместе, эта аналитическая стратегия имеет хорошие возможности для повышения понимания биологии амилоида.
Introduction
Амилоид является чрезвычайно стабильным супрамолекулярным расположением, которое содержится в разнообразной панели белков, некоторые из которых приводят к патологическим изменениям1. Накопление внутри- или внеклеточных амилоидных агрегатов наблюдается при нескольких нейродегенеративных заболеваниях2. Амилоидные агрегаты неоднородны и обогащены большим количеством белков и липидов3. В последние годы интерес к амилоидному протеому вызвал значительный интерес среди базовых и трансляционных нейробиологов. Было разработано несколько методов извлечения и очистки амилоидных агрегатов из тканей мозга мыши и посмертного вскрытия человека. Микродиссекция лазерного захвата, иммунопреципитация, децеллюляризация и биохимическая изоляция амилоидных агрегатов являются широко используемыми методами извлечения и очистки амилоидных бляшек, фибрилл и олигомеров 4,5,6,7. Многие из этих исследований были сосредоточены на определении белкового состава этих плотно упакованных фибриллярных отложений с использованием полуколичественного РС. Тем не менее, имеющиеся результаты противоречивы, и удивительно большое количество совместно очищающих белков, о которых сообщалось ранее, трудно интерпретировать.
Основным ограничением существующей литературы, описывающей протеом амилоидного ядра в мозге мышиных моделей AD и AD, является то, что очищенный материал содержит неуправляемое количество совместно очищающих белков. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы преодолеть это ограничение и разработать надежную биохимическую очистку для выделения амилоидных фибрильных кернов. Эта стратегия использует ранее описанный биохимический метод ультрацентрифугирования на основе ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы для выделения нерастворимых амилоидных фракций SDS из посмертных тканей мозга человека и мыши 8,9. Этот метод основан на существующей литературе, но идет дальше с ультразвуком и промывкой SDS для удаления большинства слабо связанных амилоид-ассоциированных белков, что приводит к выделению высокоочищенных амилоидных фибрилл (рисунок 1). Фибриллы, очищенные этим протоколом, преодолевают несколько существующих проблем, часто встречающихся в структурных исследованиях амилоидных фибрилл, выделенных из экстрактов мозга. Визуализация этих фибрилл с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) подтверждает целостность и чистоту очищенного материала (рисунок 2). В этом исследовании изолированные фибриллы солюбилизируются и перевариваются до пептидов с трипсином, а анализ РС без меток может легко выявить идентичность белков, образующих ядро фибрилл. Примечательно, что некоторые из этих белков имеют врожденную тенденцию к образованию супрамолекулярных сборок в немембранных органеллах. Кроме того, многие из белков, идентифицированных при анализе бета-амилоидных (Aβ) фибрилл, также связаны с другими нейродегенеративными заболеваниями, предполагая, что эти белки могут играть ключевую роль в множественных протеинопатиях.
Этот метод SDS/ультразвука вряд ли изменит или нарушит структуру фибрилловых сердечников. Очищенный материал также подходит для широкого спектра подходов к протеомному анализу сверху вниз и снизу вверх и дополнительных стратегий структурного анализа на основе MS, таких как химическое сшивание или водородно-дейтериевый обмен. Общее восстановление с использованием этого метода относительно высокое и, таким образом, подходит для подробных структурных исследований, которые требуют от микрограммов до миллиграммов очищенного материала. Очищенный материал также подходит для структурных исследований с использованием криоЭМ и атомно-силовой микроскопии. Этот протокол в сочетании со стабильной изотопной маркировкой млекопитающих может облегчить исследования твердотельного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) амилоидной структуры10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол предполагает использование тканей мозга человека или позвоночных. Все исследования проводились в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами Северо-Западного университета. Текущий рабочий процесс стандартизирован с использованием APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) мышей мозг коры мозга и гиппокампаобласти мозга 11. Этот протокол был оптимизирован для извлечения мозга у мышей в возрасте 6-9 месяцев, и он может эффективно очищать амилоиды как от самцов, так и от самок животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего понимания общей экспериментальной процедуры см. схему рабочего процесса на рисунке 1 .
1. Сбор тканей и очистка амилоида
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале амилоидные фибриллы должны быть изолированы от свежерассеченных областей мозга. Тем не менее, этот метод также хорошо работает с замороженными тканями мозга. Ниже приведен краткий обзор замороженных тканей мозга для хранения для использования в более позднее время.
- Сбор и хранение мозговой ткани: рассекайте мозг мыши и быстро собирайте области, насыщенные амилоидом (т. Е. Кору и гиппокамп), с последующим замораживанием в жидком азоте или спиртовой ванне с сухим льдом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мгновенное замораживание помогает сохранить структурные атрибуты компонентов ткани. Мышей усыпляют изофлураном и вывихом шейки матки12,13. Рекомендуется избегать использования CO2, так как это может поставить под угрозу целостность протеома мозга. - После вскрытия, разрезайте и храните свежие ткани небольшими блоками (например, 5 мм х 5 мм), так как это способствует более эффективной гомогенизации перед экстракцией амилоида. Перенесите ткань в стерильный криогенный флакон, затяните его колпачок и быстро погружайтесь.
- Храните ткани замороженными в ультрахолодных условиях (т.е. -80 °C или жидкий азот). Если экстракция должна быть выполнена через несколько дней, храните ткани при -20 ° C и избегайте циклов замораживания и оттаивания. Разморозьте замороженные ткани на влажном льду, когда они будут готовы к извлечению и очистке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прямой контакт тканей с жидким азотом может привести к повреждению тканей и белка. Обратите внимание, что спиртовая ванна может удалить постоянные маркеры с этикеток тюбиков.
2. Обогащение нерастворимого материала SDS
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги на льду и центрифуге при 4 °C, если не указано иное. Подробная информация обо всех буферах и решениях, используемых в этом протоколе, приведена в дополнительном файле 1. Производители и каталожные номера химикатов и приборов приведены в Таблице материалов.
- Начните со свежерассеченных или замороженных участков мозговой ткани (размороженных на льду), помещенных в трубку объемом 2 мл, содержащую 6-8 керамических шариков и свежеприготовленный ледяной буфер гомогенизации (1 мл на 0,25-1 г влажной тканевой массы).
- Перенесите трубки на гомогенизатор шариковой мельницы и измельчите содержимое ткани при 4000 об/мин, с двумя циклами по 30 с каждый и интервалом 30 с между ними.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, моторизованные системы мешалки или гомогенизатора могут быть использованы для измельчения и гомогенизации тканей. - Добавьте 9 мл буфера гомогенизации ледяного холода к 1 мл гомогената всей ткани мозга в пробирках по 15 мл, запечатайте полосками лабораторной восковой пленки и вращайте от начала до конца на ночь при 4 °C, чтобы обеспечить надежную солюбилизацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить нежелательный крупный клеточный мусор и липиды, на следующее утро раскрутите трубки при 800 х г при 4 °C в течение 10 минут и соберите супернатант в свежую трубку. Повторно суспендируют оставшуюся гранулу в 2 мл ледяного буфера гомогенизации, хорошо перемешивают, снова вращают в течение 10 мин при 4 °C и объединяют два супернатанта. - Медленно добавляют твердую сахарозу к суспензии тканевого экстракта до конечной концентрации 1,2 М, хорошо перемешивают и центрифугируют при 250 000 х г в течение 45 мин при 4 °C.
- Осторожно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторно суспендируют гранулу в 2 мл гомогенизационного буфера, содержащего 1,9 М сахарозы, путем тритурации с последующим центрифугированием при 125 000 х г в течение 45 мин при 4°С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера может быть отрегулирован в зависимости от количества материала, извлеченного из предыдущего шага. В общем, 10 объемов буфера гомогенизации (V / V) идеально подходят для этого этапа. - Соберите верхний белый твердый слой с помощью пипетки, переложите его в свежую трубку и солюбилизируйте в 1 мл ледяного буфера промывки путем пипетки вверх и вниз несколько раз, без введения пузырьков воздуха.
- Помимо верхнего слоя, гранула также обогащена амилоидными фибриллами. Для получения более высокой урожайности соедините две фракции и продолжайте. Аккуратно снимите средний водный слой с помощью пипетки и выбросьте.
- Центрифугировать комбинированные фракции при 8000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
- Добавьте 1 мл ледяного буфера пищеварения к промытым гранулам, повторно суспендируйте и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 3 ч.
- Центрифугу при 8000 х г в течение 20 мин при 4 °C и удалите супернатант с помощью пипетки.
- Повторно суспендировать и промыть (аналогично этапу 2.8.) переваренную гранулу два раза в 1 мл ледяного буфера Tris.
- Повторно суспендируют промытую гранулу в 1 мл солюбилизационного буфера, содержащего 1% SDS и 1,3 М сахарозы, путем пипетки вверх и вниз. Центрифуга быстро при 200 000 х г в течение 60 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя амилоидные фибриллы обладают высокой устойчивостью к моющим средствам и денатурантам, очень длительное воздействие моющего средства (1% SDS) может повлиять на целостность фибрилл или удалить плотно связанные белки, что поставит под угрозу последующий анализ. Поэтому сразу после повторного использования гранул приступают к центрифугированию. - Сохраните гранулу и увеличьте объем оставшегося супернатанта путем добавления 50 мМ буфера Триса (в соотношении 1:0,3) для снижения концентрации сахарозы с 1,3 до 1 М и центрифуги еще раз при 200 000 х г в течение 45 мин при 4 °С.
- Растворите две гранулы в 100 мкл буфера Tris, содержащего 0,5% SDS и пул для очистки амилоида. Видимые гранулы маленькие и должны казаться непрозрачными и белыми (см. Рисунок 2А).
3. Очистка амилоида
ПРИМЕЧАНИЕ: Соедините две гранулы, солюбилизируйте путем пипетки до получения однородного раствора и приступайте к следующим этапам очистки амилоида.
- Для полной солюбилизации богатого амилоидом материала, присутствующего в гранулах, подвергните трубку механической сдвигу, производимой ультразвуковыми волнами в устройстве обработки ультразвуком в ванне, работающем в течение 30 с ON и 30 s OFF на средней частоте в течение 20 циклов.
- Немедленно центрифугируют материал при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C и повторно саспендируют гранулу в 500 мкл 0,5% буфера SDS Tris.
- Повторите шаг 3.1. и шаг 3.2. четыре раза в общей сложности пять стирок. Количество стирок можно увеличить для улучшения чистоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы обработки ультразвуком и промывки оптимизированы при 0,5% SDS, поскольку более высокие концентрации могут повлиять на структуру, целостность или белковый состав фибрилл. Увеличивать концентрацию SDS на этом этапе не рекомендуется. - После заключительной стадии центрифугирования промыть гранулу в 200 мкл сверхчистой воды и центрифугу при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C, чтобы удалить все оставшиеся моющие средства. Промытые гранулы, содержащие очищенные амилоидные фибриллы, кажутся полупрозрачными по цвету и иногда их трудно увидеть.
- Растворить конечную гранулу, содержащую очищенные амилоидные фибриллы, в 100 мкл сверхчистой воды. Немедленно перейдите к следующему шагу для последующей обработки или сохраните фибрюшную суспензию при -20 °C для дальнейшего анализа. Если замерзли, оттаивайте на льду перед началом осадков.
4. Осаждение хлороформа метанола
ПРИМЕЧАНИЕ: Если конечной целью является проведение анализа белка, рекомендуется обессолить и удалить дополнительные небелковые примеси.
- Добавьте 400 мкл метанола к очищенным 100 мкл амилоидных фибрилл в пробирке объемом 1,5 мл и вихревой лунке.
- Добавьте 100 мкл хлороформа в трубку и вихревой колодец.
- Добавьте 300 мкл сверхчистой воды и тщательно вихрь. Это делает смесь мутной из-за осаждения белка.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 2 мин при РТ.
- Аккуратно удалите водный слой (т.е. верхний), не нарушая интерфейсный слой, содержащий белковую чешуйку.
- Снова добавьте тот же объем метанола и центрифугу при 12 000 х г в течение 2 мин при РТ.
- Выбросьте супернатант с помощью пипетки и высушите гранулы на воздухе в RT. Избегайте пересушки; амилоидную фракцию трудно повторно рассасывать при пересушивании.
5. Переваривание трипсина
- Растворите гранулы в 50 мкл буфера гуанидина гидрохлорида (GuHCl). Настаивайте ультразвуком на ледяной водяной бане и нагревайте при 95 °C в течение 5 мин, если это необходимо.
- Тщательно вихрь на RT в течение 45 мин до 1 ч, чтобы растворить его полностью. Гранула не будет видна после этого шага, а раствор выглядит прозрачным на вид.
- Добавьте такой же объем 0,2% раствора поверхностно-активного вещества. Солюбилизируют при РТ с вихрем в течение 60 мин. Этот шаг усиливает ферментативную активность трипсина.
- Добавьте 1 мкл трис-2-карбоксиэтилфосфина (TCEP) из исходного раствора 500 мМ. Инкубировать в течение 60 мин.
- Добавить 2 мкл 500 мМ йодоацетамида (ИАА) и инкубировать в темноте в течение 20 мин.
- Гасит IAA 5 мкл раствора TCEP в течение 15 мин.
- Добавьте в пробирку необходимый объем 50 мМ раствора бикарбоната аммония для снижения концентрации гуанидина до 1,5 М.
- Добавьте в пробирку 1% раствор поверхностно-активного вещества (1 мкл/50 мкг белка).
- Добавьте трипсин (1 мкг/100 мкг белка) и оставьте трубку перемешивать при 37 °C на ночь.
6. Пептидная очистка
- На следующее утро подкислите переваренный раствор пептида, понизив рН до 2,0 путем добавления муравьиной кислоты.
- Активируйте спиновую колонку C18 (n-октадецил) в трубке приемника объемом 2 мл путем добавления 200 мкл 50% раствора метанола и отжима при 1500 х г в течение 2 мин при RT. Повторите этап активации.
- Уравновешивайте слои смолы C18 путем добавления 200 мкл буфера равновесия и вращения в течение 2 мин с теми же условиями. Повторите этот шаг.
- Загрузите подкисленный пептидный раствор на колонну C18 и центрифугу при 1500 х г в течение 2 мин при RT. Соберите проточную трубу и перезагрузите ее еще раз. Отбросьте второй сквозной поток.
- Промыть пептиды, связанные со смолой C18, с помощью промывочного буфера 2x, как это сделано на шаге 6.3. Используйте тот же буфер равновесия для промывки колонны.
- Элюируют пептиды путем добавления 40 мкл буфера элюирования с последующим центрифугированием при 1500 х г, в течение 2 мин при RT. Повторите стадию элюирования три раза, чтобы увеличить выход восстановленных пептидов.
- Высушите пептиды в быстром вакуумном концентраторе путем выпаривания водного раствора. Сухие пеллеты могут быть сохранены при -20 °C в течение нескольких недель до анализа MS.
7. Настройка масс-спектрометра для пептидного анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры MS см. в Дополнительном файле 1 (адаптированном из предыдущей публикации из лаборатории)14.
- Перед загрузкой пептидных образцов для анализа MS растворите сухие пептидные гранулы в 20 мкл буфера загрузки образца и выполните микро BCA для количественной оценки концентрации восстановленных пептидов.
- Перенесите растворенные пептиды в стеклянный флакон и загрузите 3 мкг (количественно из микро BCA) пептидов в автосэмплер системы UPLC.
- Загрузите образцы в вентилируемую колонку ловушки (колонна C18 HPLC, 0,075 мм x 20 мм) со скоростью потока 250 нЛ/мин.
- Расположите колонну ловушки на одной линии с аналитической колонной (0,075 мкм х 500 мм) и соберите наконечник излучателя к источнику электрораспылительной ионизации (ESI), подвергающемуся воздействию напряжения распыления 2000 В.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании выполняется ESI, в котором подвижная фаза подвергается высоковольтной ионизации в газовую фазу. Созданный этим спрей направляется в вакуумную камеру МС через нагретый капилляр. Находясь под вакуумом, десоляция капель и выброс ионов происходит в присутствии тепла и напряжения. После этого ионы ускоряются к анализатору массы в присутствии высоковольтной среды. - Проанализируйте образцы с помощью 2-х часовых прогонов сбора. Это исследование проводится с использованием зависимого от данных сбора с наиболее интенсивной парадигмой отбора топ-20 ионов-предшественников.
ПРИМЕЧАНИЕ: При получении, зависящем от данных, ограниченное число пептидов-предшественников обнаруживается при сканировании MS1 и подвергается фрагментации для анализа MS2. Однако динамическое исключение здесь проблематично, поскольку высокообильные пептиды Aβ будут опущены для фрагментации и приведут к занижению их количества. - Для абсолютной количественной оценки пептидов Aβ запустите те же образцы еще раз, используя целевой метод MS / MS. Для этого исследования подготовлен исчерпывающий список всех соотношений m/z для различных возможных триптических пептидов Aβ для моделей мышей APP (см. Дополнительную таблицу 1). Другие группы должны подготовить аналогичный список в соответствии с имеющейся моделью мыши и возможными пептидами, полученными из интересующего белка (например, Aβ для AD).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения проблемы исключения высокообильных пептидов используйте целевой подход, предоставив список выбранных значений m/z, соответствующих триптическим пептидам Aβ. Этот подход решает проблему зависящего от данных исключения пептидов Aβ и может количественно оценить абсолютные количества различных мономеров (пептидов Aβ38, 40 и 42) с высоким разрешением. - Масс-спектрометр генерирует MS-спектры образцов пептидов и сохраняет необработанные файлы данных в целевом каталоге. Используйте этот файл для выполнения спектрального сопоставления с использованием хорошо зарекомендовавших себя статистических и биоинформатических инструментов. Доступно несколько интерактивных и автономных инструментов поиска и анализа баз данных.
8. Анализ данных MS
- Извлеките файлы MS1 и MS2 с помощью автономного инструмента Rawconverter (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Выполните идентификацию, количественную оценку и подробный анализ данных в веб-поисковой системе ms data. В данном исследовании использовался интегрированный протеомический конвейер - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
ПРИМЕЧАНИЕ: Доступно несколько других онлайн и оффлайн инструментов анализа данных MS, которые также могут быть использованы, такие как MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - После загрузки файлов MS1 и MS2 выберите обновленную базу данных протеомов мыши. Здесь для идентификации пептидов с использованием алгоритмов11 ProLuCId и SEQUEST выбрана обновленная база данных мыши, содержащая дополнительные мутации, специфичные для приложения.
- В системе анализа IP2 выберите параметры по умолчанию и измените их в соответствии с экспериментальными требованиями. В этом исследовании используется толерантность к массе пептида 50 ppm для предшественника и 600 ppm для фрагментов (см. Дополнительный файл 1 для других параметров, используемых в IP2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут изменять параметры поиска в соответствии с экспериментальными целями. Например, для идентификации посттрансляционных модификаций добавьте дифференциальные значения модификации для различных ПТМ (например, убиквитинирование, СУМОилирование, фосфорилирование).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь обобщен подробный способ выделения и очистки амилоидных фибрилл с использованием модифицированного метода ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахарозы (см. фиг.1). Инновацией в этом методе является включение этапов стирки на основе ультразвука с использованием системы обработки ультразвуком на водяной бане с последующей солюбилизацией SDS, которая удаляет многие слабо связанные белки из амилоидных фибрилл, которые совместно очищаются с очень плотными и чистыми фибриллами. Стадия ультразвука генерирует высокую силу сдвига и перемешивает фибриллы, ослабляя гидрофобные силы и высвобождая растворимые слабо связанные белки SDS в буфер промывки SDS. В свою очередь, извлекаются небольшие количества высокочистых амилоидных фибрильных ядер. Как показано на фиг.2А, видимую гранулу, которая изначально кажется непрозрачной (возможно, из-за примесей), можно увидеть после обогащения; однако после ультразвуковой обработки и многократной промывки SDS гранула становится полупрозрачной и почти не видна. Репрезентативное конголезское красное окрашивание очищенных амилоидов по сравнению с растворимой фракцией SDS документирует обогащение амилоидных фибрилл (рисунок 2B). Красное окрашивание Конго может быть использовано для подтверждения амилоидного материала в различных фракциях и может быть визуализировано с помощью яркого полевого микроскопа. Как показано на рисунке 2C, растворимая фракция SDS не окрашивается красным красителем Конго.
Структура очищенных фибрилл с отрицательным окрашиванием просвечивающего электронного микроскопического анализа подтвердила наличие почти чистых амилоидных фибрилл (рисунок 2D). Кроме того, маркировка иммунозолотого с использованием комбинации антител Aβ42 (6E10 и 4G8) подтвердила наличие пептидов Aβ42 (рисунок 2E). Чтобы исследовать состав и структурные особенности очищенного материала, мы использовали методы иммуноблота для пептидов Aβ и структурных сигнатур (например, фибрилл). Репрезентативный анализ фракций, собранных во время выделения амилоида, показал относительное изобилие пептидов и фибрилл Aβ42 с использованием анти-Aβ42 и антифибрильных (LOC) антител (рисунок 3A). Аналогичным образом, западное пятно репрезентативных фракций также показало обогащение Aβ42-содержащих фибрилл в высокомолекулярных белках, захваченных в лунках геля SDS PAGE (рисунок 3B). Чтобы понять состав этих высокомолекулярных фибрилл, очищенные амилоидные фракции были подвергнуты протеомному анализу на основе MS. Эти полуколичественные результаты показали наличие примерно 250 белков, в то время как фракция, собранная перед ультразвуком и промывками SDS, содержала более 2500 белков (рисунок 3C). Это указывает на эффективность этих двух важнейших шагов, которые включены в этот протокол очистки. Взятые вместе, несколько независимых результатов указывают на высокое содержание аналогичных классов белков в ядрах фибрилл.
Анализ клеточных компонентов Gene Ontology (GO) для одного репрезентативного набора данных MS на рисунке 4 показал, что большое количество белков, присутствующих в ядрах фибрилл, связано с немембранно-связанными органеллами и супрамолекулярными комплексами. Это наблюдение, вероятно, связано с присущей многим белкам тенденцией агрегироваться или соагрегироваться с другими белками в белковых включениях, которые находятся в непосредственной близости. Физические силы играют решающую роль в этих взаимодействиях. Другими клеточными органеллами и компонентами, в первую очередь представленными этими белками, являются митохондрии, цитоскелет, клеточная мембрана и миелиновая оболочка. Многие из этих белков взаимодействуют с пептидами Aβ, олигомерами или протофибриллами на разных стадиях образования амилоида. Они могут взаимодействовать близко к плазматической мембране, где высвобождаются пептиды Aβ. Взаимодействие может также происходить, когда некоторые из этих белков высвобождаются непосредственно или через везикулярный транспорт во внеклеточное пространство. Секреция или экзоцитоз белковых агрегатов является одной из многих стратегий, которые клетки используют, чтобы справиться и уменьшить нагрузку, связанную с белковыми агрегатами15. Это оставляет еще одну возможность, когда некоторые внутриклеточные белки могут связываться с пептидами Aβ. Протокол обеспечивает основу для дальнейшей оптимизации в зависимости от экспериментальных целей. Например, чистота и выход, изменяя количество ультразвуковых и SDS-промывок, могут быть соответствующим образом настроены.
Рисунок 1: Схематический обзор рабочего процесса выделения ядра амилоидных фибрилл из посмертных тканей мозга человека или модели животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подтверждение экстракции амилоида с использованием биохимического окрашивания и визуализации амилоидных фибрилл. (А) Обогащенная амилоидсодержащая SDS нерастворимая гранула выглядит непрозрачной небелого цвета. B) конголезское окрашивание красным цветом растворимого супернатанта SDS и нерастворимых гранул SDS, содержащих очищенный амилоид, смочещенный на 0,45 мкм нитроцеллюлозной мембране; Показания BCA использовались для нормализации нагрузочного количества белков. Анализ BCA был выполнен в соответствии с инструкциями производителя. (C) Изображения яркого поля растворимого и амилоидного материала SDS после окрашивания конго красным цветом (шкала: 100 мкм). (D) Визуализация растворимой фракции SDS и очищенных амилоидных фибрилл с использованием отрицательного окрашивания под электронным микроскопом (шкала бара: 100 нм). (E) Подтверждение наличия пептидов Aβ42 в очищенных амилоидных фибриллах методом электронной микроскопии иммунозолоты с использованием антител Aβ42 (6E10 и 4G8) (шкала бар: 50 нм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Валидация очистки амилоида с использованием иммуноблота и анализа РС. (А) Точечное пятно и (В) Вестерн-блот-анализ нескольких репрезентативных фракций, собранных в процессе очистки амилоида с использованием антифибрильного LOC и анти-Aβ42 антитела; Показания анализа BCA использовались для нормализации нагрузочного количества белков. C) количество белков, извлеченных в результате масс-спектрометрического анализа обогащенных и очищенных амилоидных фракций без маркировки; Микро-анализ BCA использовался для загрузки 3 мкг переваренных пептидов для каждого анализа MS. Анализы BCA и micro BCA проводились в соответствии с инструкциями производителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ генной онтологии белков, содержащихся в очищенных амилоидных фракциях. (A) Клеточные компоненты и (B) пути KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Буферы и растворы, параметры масс-спектрометрии и параметры поиска ProLuCID для идентификации пептидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1 - Репрезентативный список соотношений m/z, идентифицированных в MS run для бета-амилоидных пептидов APP knock в мышиных моделях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработка четкого понимания структуры и состава амилоида является сложной задачей для структурных биологов и биохимиков из-за биологических сложностей и экспериментальных ограничений в извлечении очищенных фибрилл из тканей мозга AD16,17. Амилоидные фибриллы полиморфны на молекулярном уровне, показывая гетерогенную популяцию различной длины и сложности18,19. Для лучшего понимания их биологических особенностей и патологической значимости требуется исчерпывающая характеристика состава полиморфных амилоидных фибрилл, полученных из посмертных тканей головного мозга человека и мыши с АД20,21. Большое подмножество белков непосредственно взаимодействует с Aβ42, в то время как другие могут иметь тенденцию к образованию крупных фибриллярных структур или белковых комплексов 22,23,24. Сложнее определить роль, которую играют белки, взаимодействующие с Aβ42, в образовании амилоида, стабилизации и удлинении, поскольку это связано с патологией БА. В последние годы несколько протеомных исследований выявили различия и сходства в белковом составе различных супрамолекулярных компоновок, безмембранных органелл, тел включения и белковых агрегатов 25,26,27. На ранних стадиях БА множественные клеточные белки (например, Aβ42 и связанный с микротрубочками тау-белок и аполипопротеин Е) неправильно складываются и совместно агрегируются в нескольких областях мозга28,29. Амилоидогенные белковые образования являются одним из основных патологических признаков БА и, вероятно, способствуют патогенезу3.
Очищение амилоидных фибрилл от больного человеческого мозга является утомительной и сложной задачей и имеет множество ограничений. Одним из основных недостатков существующих методов является низкая чистота извлеченного материала, что часто ограничивает их детальный структурный анализ с использованием методов визуализации, таких как криоЭМ. Аналогичным образом, исследования ЯМР требуют нескольких миллиграммов очищенного материала, который также должен быть помечен тяжелыми изотопами (т.е. 15Н)30. Посмертный человеческий мозг может удовлетворить первое требование, так как исходный материал может быть увеличен до нескольких граммов тканей человека; однако маркировка тканей головного мозга человека тяжелыми изотопами невозможна. С другой стороны, маркировка моделей мышей AD изотопами 15N возможна (хотя и дорогостоящая) и в настоящее время все более распространена31,32. Наша лаборатория использовала маркировку pulse-chase для изучения динамики оборота синаптического белка во время болезни и старения мозга14. Мы также использовали маркировку тяжелых изотопов целых животных для идентификации долгоживущих белков и понимания их физиологической значимости в сложных биологических структурах33,34. Однако для мозга мыши требуется большое количество исходного материала для получения работоспособного количества ядер фибрилл. Этот метод успешно решает эти проблемы, улучшая выход и чистоту экстрагированных амилоидных фибрилл путем модификации существующих принципов биохимической изоляции. Таким образом, этот надежный протокол для извлечения амилоидных фибрилл из тканей мозга может быть легко использован для структурных исследований на основе криоЭМ и ЯМР.
Этот метод использует существующую парадигму субклеточного фракционирования на основе градиента плотности сахарозы и удаляет неспецифические совместно очищающие белки последовательными шагами. После удаления клеточного мусора, миелина, ДНК и клеточных липидов выделяют богатые амилоидом нерастворимые гранулы SDS. Включение дополнительных этапов многократных промывок SDS, связанных с ультразвуком, помогает уменьшить количество совместно очищающих клеточных компонентов, слабо связанных белков и меньших растворимых полиморфов амилоидов, растворимых в SDS. Конечная гранула солюбилизируется в сверхчистой воде и может использоваться для многих применений, включая эксперименты по посеву, биохимические или фармакологические исследования и структурный анализ. Очищенные амилоидные фибриллы из тканей мозга AD также используются для понимания протеомного состава и структурных особенностей фибрилловых ядер с использованием протеомики на основе MS. Этот анализ подтвердил наличие подмножества клеточных белков (представленных на фиг.4) в ядре фибрилл, что может указывать на возможную роль более чем одного белка в образовании, удлинении и стабилизации амилоидных фибрилл в течение длительного времени. Некоторые из белков, идентифицированных в этом анализе, известны своей связью с более чем одним нейродегенеративным расстройством, например, Adam22, APP, ApoE, β-катениновые нейрофиламентные белки, белки 14-3-3 и другие.
Существует вероятность того, что некоторые загрязняющие белки могут появиться в протеомном анализе из-за того, что после гомогенизации некоторые необоснованные взаимодействия могут происходить между белками из-за высокой гидрофобности амилоидных фибрилл. Некоторые из этих белков прилипают к ядрам и не удаляются даже после нескольких раундов обработки ультразвуком и этапов промывки SDS. Это одно из ограничений этой стратегии очистки амилоида. Тем не менее, она может быть решена с использованием подходящих отрицательных средств контроля и выполнения эффективных статистических отсечек в крупномасштабных протеомных исследованиях. Другое ограничение, с которым мы столкнулись, связано с недооценкой обилия пептидов Aβ после переваривания трипсина. Эта проблема была решена в этом рабочем процессе с помощью целевой стратегии анализа MS/MS. Анализ GO для путей KEGG указывает на обилие белков, принадлежащих путям, участвующим во многих нейродегенеративных заболеваниях, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, боковом амиотрофическом склерозе (БАС) и прионных заболеваниях. Эти белки являются важными игроками в нескольких патологических путях и, таким образом, имеют известное участие в инициации и прогрессировании заболевания. Интересно, что некоторые из этих белков требуют дальнейшего анализа для определения их возможной причастности к патологии БА и другим нейродегенеративным заболеваниям.
Будущие исследования чистого амилоидного материала из других моделей заболеваний могут обеспечить глубокое понимание структурных моделей и состава основных фибрилл и могут помочь в определении ключевых терапевтических целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NIH R01AG061865 R.J.V. и J.N.S. Авторы благодарят членов исследовательской группы Вассара и Саваса в Северо-Западном университете за их вдумчивые дискуссии. Мы также искренне благодарим д-ра(ов). Ансгар Займер и Ральф Ланген из Университета Южной Калифорнии за их важный вклад. Мы благодарим доктора Фариду Корабову за подготовку образцов и электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием в Центре передовой микроскопии Северо-Западного университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C.
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
