Summary
Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.
Abstract
Proteinaceous fibrilläre Einschlüsse sind wichtige pathologische Kennzeichen mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen. In den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) bilden Amyloid-Beta-Peptide Protofibrillen im extrazellulären Raum, die als Samen fungieren, die allmählich wachsen und zu großen Amyloid-Plaques reifen. Trotz dieses grundlegenden Verständnisses ist das derzeitige Wissen über die Struktur, Zusammensetzung und Ablagerungsmuster von Amyloidfibrillen im Gehirn begrenzt. Eine Hauptbarriere war die Unfähigkeit, hochgereinigte Amyloidfibrillen aus Gehirnextrakten zu isolieren. Affinitätsreinigungs- und Lasereinfang-Mikrodissektions-basierte Ansätze wurden bisher zur Isolierung von Amyloiden verwendet, sind jedoch durch die geringe Menge an Material, die zurückgewonnen werden kann, begrenzt. Dieses neuartige, robuste Protokoll beschreibt die biochemische Reinigung von Amyloid-Plaquekernen unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat (SDS) -Solubilisierung mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Ultraschall und liefert hochreine Fibrillen von AD-Patienten und AD-Modell-Hirngeweben. Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende proteomische Bottom-up-Proteomanalyse des gereinigten Materials stellt eine robuste Strategie zur Identifizierung fast aller primären Proteinkomponenten von Amyloidfibrillen dar. Frühere proteomische Studien von Proteinen in der Amyloidkorone haben eine unerwartet große und funktionell vielfältige Sammlung von Proteinen ergeben. Insbesondere wurde nach der Verfeinerung der Reinigungsstrategie die Anzahl der mitreinigenden Proteine um mehr als das 10-fache reduziert, was auf die hohe Reinheit des isolierten unlöslichen SDS-Materials hinweist. Negative Färbung und Immun-Gold-Elektronenmikroskopie ermöglichten die Bestätigung der Reinheit dieser Präparate. Weitere Studien sind erforderlich, um die räumlichen und biologischen Eigenschaften zu verstehen, die zur Ablagerung dieser Proteine in Amyloideinschlüsse beitragen. Zusammengenommen ist diese analytische Strategie gut positioniert, um das Verständnis der Amyloidbiologie zu verbessern.
Introduction
Amyloid ist eine extrem stabile supramolekulare Anordnung, die in einer Vielzahl von Proteinen vorkommt, von denen einige zu pathologischen Veränderungen führen1. Die Akkumulation von intra- oder extrazellulären Amyloidaggregaten wird bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungenbeobachtet 2. Amyloid-Aggregate sind heterogen und mit einer Vielzahl von Proteinen und Lipiden angereichert3. In den letzten Jahren hat das Interesse am Amyloid-Proteom bei grundlegenden und translationalen Neurowissenschaftlern ein erhebliches Interesse geweckt. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Amyloidaggregate aus Maus- und postmortalem menschlichem Hirngewebe zu extrahieren und zu reinigen. Laser-Capture-Mikrodissektion, Immunpräzipitation, Dezellularisierung und biochemische Isolierung von Amyloid-Aggregaten sind weit verbreitete Methoden zur Extraktion und Reinigung von Amyloid-Plaques, Fibrillen und Oligomeren 4,5,6,7. Viele dieser Studien haben sich darauf konzentriert, die Proteinzusammensetzung dieser dicht gepackten fibrillären Ablagerungen unter Verwendung von semiquantitativer MS zu bestimmen. Die verfügbaren Ergebnisse sind jedoch inkonsistent, und die überraschend große Anzahl von Co-Cleanifying-Proteinen, die zuvor berichtet wurden, sind schwierig zu interpretieren.
Die primäre Einschränkung der bestehenden Literatur, die das Amyloidkernproteom in AD- und AD-Mausmodellgehirnen beschreibt, besteht darin, dass das gereinigte Material eine unüberschaubare Anzahl von mitreinigenden Proteinen enthält. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, diese Einschränkung zu überwinden und eine robuste biochemische Reinigung zur Isolierung von Amyloidfibrillenkernen zu entwickeln. Diese Strategie verwendet eine zuvor beschriebene auf Succharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende biochemische Methode zur Isolierung von SDS-unlöslichen angereicherten Amyloidfraktionen aus postmortalem AD-Hirngewebevon Menschen und Mäusen 8,9. Diese Methode baut auf der vorhandenen Literatur auf, geht aber mit Ultraschall und SDS-Waschungen weiter, um die meisten der lose gebundenen Amyloid-assoziierten Proteine zu entfernen, was zur Isolierung von hochgereinigten Amyloidfibrillen führt (Abbildung 1). Die durch dieses Protokoll gereinigten Fibrillen überwinden mehrere bestehende Herausforderungen, die häufig in Strukturstudien von Amyloidfibrillen auftreten, die aus Gehirnextrakten isoliert wurden. Die Visualisierung dieser Fibrillen mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt die Integrität und Reinheit des gereinigten Materials (Abbildung 2). In dieser Studie werden die isolierten Fibrillen mit Trypsin gelöst und zu Peptiden verdaut, und eine markierungsfreie MS-Analyse kann die Identität der Proteine, die den Fibrillenkern bilden, leicht aufdecken. Insbesondere haben einige dieser Proteine eine inhärente Tendenz, supramolekulare Anordnungen in nicht membrangebundenen Organellen zu bilden. Darüber hinaus sind viele der Proteine, die bei der Analyse von Amyloid-Beta (Aβ)-Fibrillen identifiziert wurden, auch mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert, was darauf hindeutet, dass diese Proteine eine Schlüsselrolle bei multiplen Proteinopathien spielen können.
Es ist unwahrscheinlich, dass diese SDS / Ultraschallmethode die Struktur der Fibrillenkerne verändert oder stört. Das gereinigte Material eignet sich auch für eine Vielzahl von Top-down- und Bottom-up-Proteomanalyseansätzen und zusätzlichen MS-basierten Strukturanalysestrategien, wie chemische Vernetzung oder Wasserstoff-Deuterium-Austausch. Die Gesamtausbeute mit dieser Methode ist relativ hoch und eignet sich daher für detaillierte Strukturuntersuchungen, die Mikrogramm bis Milligramm des gereinigten Materials erfordern. Das gereinigte Material eignet sich auch für Strukturuntersuchungen mittels KryoEM und Rasterkraftmikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit der stabilen Isotopenmarkierung von Säugetieren Festkörper-Kernspinresonanzuntersuchungen (NMR) derAmyloidstruktur 10 erleichtern.
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Protocol
Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von menschlichem oder wirbeltierischem Hirngewebe. Die gesamte Forschung wurde in Übereinstimmung mit den genehmigten institutionellen Richtlinien der Northwestern University durchgeführt. Der aktuelle Workflow wird mit APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F) Mouse brain cortikical und hippocampal brain region extracts11 standardisiert. Dieses Protokoll wurde für Gehirnextrakte von Mäusen im Alter von 6-9 Monaten optimiert und kann Amyloide sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren effektiv reinigen.
HINWEIS: Ein besseres Verständnis des gesamten experimentellen Verfahrens finden Sie in Abbildung 1 für einen Schaltplan des Workflows.
1. Gewebeentnahme und Amyloidreinigung
HINWEIS: Idealerweise sollten Amyloidfibrillen aus frisch sezierten Hirnregionen isoliert werden. Diese Methode funktioniert jedoch auch gut mit schnapp- oder schockgefrorenem Hirngewebe. Im Folgenden finden Sie einen kurzen Überblick über das Einfrieren von Hirngewebe zum Aufbewahren zur späteren Verwendung.
- Gewinnung und Lagerung von Hirngewebe: Sezieren Sie Mäusegehirne und ernten Sie schnell die mit Amyloiden beladenen Regionen (d. H. Kortex und Hippocampus), gefolgt von einem Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder einem Trockeneisalkoholbad.
HINWEIS: Das Einfrieren von Schnappschüssen hilft, die strukturellen Eigenschaften der Gewebebestandteile zu erhalten. Die Mäuse werden durch Isofluran und zervikale Dislokation eingeschläfert12,13. Es wird empfohlen, die Verwendung von CO2 zu vermeiden, da dies die Integrität des Gehirnproteoms beeinträchtigen kann. - Nach der Dissektion schneiden und lagern Sie frisches Gewebe in kleinen Blöcken (z. B. 5 mm x 5 mm), da dies eine effizientere Homogenisierung vor der Amyloidextraktion ermöglicht. Übertragen Sie das Gewebe in die sterile kryogene Durchstechflasche, ziehen Sie ihre Kappe fest und tauchen Sie schnell ein.
- Halten Sie das Gewebe unter ultrakalten Bedingungen (d. h. -80 ° C oder flüssigem Stickstoff) gefroren. Wenn die Extraktion einige Tage später durchgeführt werden soll, lagern Sie das Gewebe bei -20 °C und vermeiden Sie Gefrier- und Tauzyklen. Tauen Sie das gefrorene Gewebe auf nassem Eis auf, wenn es zur Extraktion und Reinigung bereit ist.
HINWEIS: Der direkte Kontakt der Gewebe mit flüssigem Stickstoff kann zu Gewebe- und Proteinschäden führen. Beachten Sie, dass ein Alkoholbad Permanentmarker von den Tubenetiketten entfernen kann.
2. Anreicherung von unlöslichem SDS-Material
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis und Zentrifuge bei 4 °C durch, sofern nicht anders angegeben. Einzelheiten zu allen Puffern und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Zusatzdatei 1. Hersteller und Katalognummern von Chemikalien und Instrumenten sind in der Materialtabelle angegeben.
- Beginnen Sie mit frisch sezierten oder schockgefrorenen Hirngeweberegionen (aufgetaut auf Eis), die in ein 2-ml-Röhrchen mit 6-8 Keramikperlen und frisch zubereitetem eiskaltem Homogenisierungspuffer (1 ml für 0,25-1 g nasse Gewebemasse) gegeben werden.
- Übertragen Sie die Rohre in den Homogenisator der Rührwerksmühle und mahlen Sie den Gewebeinhalt bei 4000 U / min mit zwei Zyklen von je 30 s und einem Abstand von 30 s dazwischen.
HINWEIS: Alternativ können motorisierte Rührer- oder Homogenisatorsysteme verwendet werden, um das Gewebe zu mahlen und zu homogenisieren. - Fügen Sie 9 ml eiskalten Homogenisierungspuffer zu dem 1 ml Gehirn-Ganzgewebehomogenat in 15 ml-Röhrchen hinzu, versiegeln Sie es mit Laborwachsfilmstreifen und drehen Sie es über Nacht bei 4 ° C, um eine robuste Solubilisierung zu gewährleisten.
HINWEIS: Um unerwünschte große Zelltrümmer und Lipide zu entfernen, drehen Sie am nächsten Morgen die Röhrchen bei 800 x g bei 4 ° C für 10 Minuten und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen. Das restliche Pellet in 2 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer resuspendieren, gut mischen, 10 min bei 4 °C erneut drehen und die beiden Überstände kombinieren. - Langsam feste Saccharose in die Gewebeextraktsuspension bis zu einer Endkonzentration von 1,2 M geben, gut mischen und bei 250.000 x g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Resuspendiert das Pellet in 2 ml Homogenisierungspuffer mit 1,9 m Saccharose durch Triturating, gefolgt von Zentrifugation bei 125.000 x g für 45 min bei 4 °C.
HINWEIS: Das Puffervolumen kann basierend auf der Menge des aus dem vorherigen Schritt zurückgewonnenen Materials angepasst werden. Im Allgemeinen sind 10 Volumina Homogenisierungspuffer (V/V) ideal für diesen Schritt. - Sammeln Sie die oberste weiße feste Schicht mit einer Pipette, geben Sie sie in ein frisches Rohr und lösen Sie sie in 1 ml eiskaltem Waschpuffer, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen einzuführen.
- Neben der obersten Schicht ist das Pellet auch mit Amyloidfibrillen angereichert. Für eine höhere Ausbeute kombinieren Sie die beiden Fraktionen und fahren Sie fort. Entfernen Sie vorsichtig die mittlere wässrige Schicht mit einer Pipette und entsorgen Sie sie.
- Die kombinierten Fraktionen bei 8000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- 1 ml eiskalten Aufschlusspuffer in das gewaschene Pellet geben, resuspendieren und bei Raumtemperatur (RT) für 3 h inkubieren.
- Bei 8000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
- Das verdaute Pellet zweimal in 1 ml eiskaltem Tris-Puffer aussetzen und waschen (wie in Schritt 2.8).
- Resuspendiert das gewaschene Pellet in 1 ml Lösungsmittelpuffer mit 1% SDS und 1,3 m Saccharose durch Pipettieren nach oben und unten. Zentrifugieren Sie schnell bei 200.000 x g für 60 min bei 4 °C.
HINWEIS: Obwohl die Amyloidfibrillen sehr resistent gegen Detergenzien und Denaturierungsmittel sind, können sehr lange Expositionen gegenüber dem Reinigungsmittel (1% SDS) die Integrität der Fibrillen beeinträchtigen oder die fest gebundenen Proteine entfernen, was nachfolgende Analysen beeinträchtigt. Fahren Sie daher unmittelbar nach der erneuten Aussetzung der Pellets mit der Zentrifugation fort. - Speichern Sie das Pellet und erhöhen Sie das Volumen des verbleibenden Überstands, indem Sie 50 mM Tris-Puffer (im Verhältnis 1:0,3) hinzufügen, um die Saccharosekonzentration von 1,3 auf 1 M zu reduzieren, und zentrifugieren Sie es noch einmal bei 200.000 x g für 45 min bei 4 °C.
- Die beiden Pellets werden in 100 μL Tris-Puffer mit 0,5% SDS und Pool zur Amyloidreinigung gelöst. Sichtbare Pellets sind klein und sollten undurchsichtig und cremefarben erscheinen (siehe Abbildung 2A).
3. Amyloid-Reinigung
HINWEIS: Kombinieren Sie die beiden Pellets, lösen Sie sie durch Pipettieren, bis Sie eine gleichmäßige Lösung erhalten, und fahren Sie mit den folgenden Schritten der Amyloidreinigung fort.
- Zur vollständigen Solubilisierung des in Pellets vorhandenen amyloidreichen Materials wird das Rohr einer mechanischen Scherung unterzogen, die durch Ultraschallwellen in einem Badbeschallungsgerät erzeugt wird, das 30 s ON und 30 s OFF bei einer mittleren Frequenz für 20 Zyklen läuft.
- Zentrigrieren Sie das Material sofort bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL 0,5% SDS Tris-Puffer.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1. und Schritt 3.2. viermal für insgesamt fünf Wäschen. Die Anzahl der Waschungen kann erhöht werden, um die Reinheit zu verbessern.
HINWEIS: Ultraschall- und Waschschritte werden bei 0,5% SDS optimiert, da höhere Konzentrationen die Struktur, Integrität oder Proteinzusammensetzung der Fibrillen beeinträchtigen können. Eine Erhöhung der SDS-Konzentration in diesem Schritt wird nicht empfohlen. - Nach dem letzten Zentrifugationsschritt waschen Sie das Pellet in 200 μL Reinstwasser und zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C, um das verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen. Das gewaschene Pellet mit gereinigten Amyloidfibrillen erscheint halbtransparent in der Farbe und ist manchmal schwer zu sehen.
- Das letzte Pellet mit gereinigten Amyloidfibrillen wird in 100 μL Reinstwasser gelöst. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt für die nachgelagerte Verarbeitung fort oder speichern Sie die Fibrillensuspension bei -20 °C zur weiteren Analyse. Wenn gefroren, tauen Sie auf Eis, bevor Sie mit dem Niederschlag beginnen.
4. Methanol-Chloroform-Fällung
HINWEIS: Wenn das Endziel darin besteht, eine Proteinanalyse durchzuführen, wird empfohlen, zusätzliche nicht proteinhaltige Verunreinigungen zu entsalzen und zu entfernen.
- Fügen Sie 400 μL Methanol zu den gereinigten 100 μL Amyloidfibrillen in einem 1,5-ml-Rohr und einer Wirbelvertiefung hinzu.
- Fügen Sie 100 μL Chloroform in die Röhre und Wirbelvertiefung hinzu.
- Fügen Sie 300 μL Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie gründlich ein. Dadurch wird die Mischung durch Proteinausfällung trüb.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min bei RT.
- Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Schicht (d. h. die Oberseite), ohne die Grenzflächenschicht zu stören, die die Proteinflocke enthält.
- Fügen Sie das gleiche Volumen Methanol erneut hinzu und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 2 min bei RT.
- Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und trocknen Sie das Pellet bei RT an der Luft. Die Amyloidfraktion ist bei Übertrocknung schwer wieder aufzulösen.
5. Trypsin-Verdauung
- Lösen Sie das Pellet in 50 μL Guanidinhydrochlorid (GuHCl) Puffer auf. In einem eiskalten Wasserbad beschallen und bei Bedarf 5 min bei 95 °C erhitzen.
- Vortex gründlich bei RT für 45 min bis 1 h, um es vollständig aufzulösen. Das Pellet ist nach diesem Schritt nicht mehr sichtbar und die Lösung sieht klar aus.
- Fügen Sie das gleiche Volumen von 0,2% Tensidlösung hinzu. Solubilisieren Sie bei RT mit Vortexing für 60 min. Dieser Schritt erhöht die enzymatische Aktivität von Trypsin.
- Fügen Sie 1 μL Tris-2-carboxyethylphosphin (TCEP) aus der 500 mM Stammlösung hinzu. 60 min inkubieren
- 2 μL 500 mM Iodacetamid (IAA) hinzufügen und 20 min im Dunkeln inkubieren.
- Abschrecken Sie die IAA mit 5 μL TCEP-Lösung für 15 min.
- Geben Sie das erforderliche Volumen von 50 mM Ammoniumbicarbonatlösung in das Röhrchen, um die Guanidinkonzentration auf 1,5 M zu reduzieren.
- 1%ige Tensidlösung in die Tube geben (1 μL/50 μg Protein).
- Trypsin (1 μg/100 μg Protein) zugeben und die Röhrchenmischung über Nacht bei 37 °C belassen.
6. Peptid-Reinigung
- Am nächsten Morgen die verdaute Peptidlösung ansäuern, indem Sie den pH-Wert durch Zugabe von Ameisensäure auf 2,0 senken.
- Aktivieren Sie die C18-Spinsäule (n-Octadecyl) in einem 2-ml-Empfängerröhrchen, indem Sie 200 μL 50% Methanollösung hinzufügen, und drehen Sie bei 1500 x g für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Aktivierungsschritt.
- Gleichen Sie die C18-Säulenharzbetten aus, indem Sie 200 μL Gleichgewichtspuffer hinzufügen und 2 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen drehen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Laden Sie die angesäuerte Peptidlösung auf die C18-Säule und zentrifugieren Sie sie bei 1500 x g für 2 min bei RT. Sammeln Sie den Durchfluss und laden Sie ihn noch einmal neu. Verwerfen Sie den zweiten Durchfluss.
- Waschen Sie die an das C18-Harz gebundenen Peptide mit dem Waschpuffer 2x, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Verwenden Sie den gleichen Gleichgewichtspuffer zum Waschen der Säule.
- Eluieren Sie die Peptide durch Zugabe von 40 μL Elutionspuffer, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1500 x g, für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Elutionsschritt dreimal, um die Ausbeute der gewonnenen Peptide zu erhöhen.
- Trocknen Sie die Peptide in einem Geschwindigkeits-Vakuumkonzentrator, indem Sie die wässrige Lösung verdampfen. Trockenpellets können vor der MS-Analyse einige Wochen bei -20 °C gelagert werden.
7. Aufbau eines Massenspektrometers für die Peptidanalyse
HINWEIS: Informationen zu MS-Parametern finden Sie in der Zusatzdatei 1 (angepasst an eine frühere Veröffentlichung aus dem Labor)14.
- Bevor Sie die Peptidproben für die MS-Analyse laden, lösen Sie die trockenen Peptidpellets in 20 μL Probenladepuffer auf und führen Sie Mikro-BCA durch, um die Konzentration der gewonnenen Peptide zu quantifizieren.
- Übertragen Sie die gelösten Peptide in einem Glasfläschchen und beladen Sie 3 μg (quantifiziert aus Mikro-BCA) von Peptiden in den UPLC-System-Autosampler.
- Laden Sie die Proben auf eine belüftete Fallensäule (C18 HPLC-Säule, 0,075 mm x 20 mm) mit einer Durchflussrate von 250 nL/min.
- Ordnen Sie die Fallensäule in einer Linie mit einer analytischen Säule (0,075 μm x 500 mm) an und montieren Sie eine Emitterspitze an der Elektrosprühionisationsquelle (ESI), die einer Sprühspannung von 2000 V ausgesetzt ist.
HINWEIS: In dieser Studie wird ESI durchgeführt, bei dem die mobile Phase einer Hochspannungsionisation in die Gasphase unterzogen wird. Das dadurch erzeugte Spray wird durch eine beheizte Kapillare in die Vakuumkammer der MS geleitet. Unter Vakuum erfolgt die Entsolvation von Tröpfchen und der Ausstoß von Ionen in Gegenwart von Wärme und Spannung. Danach werden die Ionen in Gegenwart einer Hochspannungsumgebung in Richtung des Massenanalysators beschleunigt. - Analysieren Sie die Proben mit 2 h Erfassungsläufen. Diese Studie wird unter Verwendung einer datenabhängigen Erfassung mit dem intensivsten Top-20-Vorläufer-Ionenauswahlparadigma durchgeführt.
HINWEIS: Bei der datenabhängigen Erfassung wird eine begrenzte Anzahl von Vorläuferpeptiden im MS1-Scan nachgewiesen und für die MS2-Analyse einer Fragmentierung unterzogen. Der dynamische Ausschluss ist hier jedoch problematisch, da hochreichlich vorkommende Aβ-Peptide zur Fragmentierung weggelassen werden und zu einer Unterschätzung ihrer Menge führen. - Zur absoluten Quantifizierung von Aβ-Peptiden führen Sie dieselben Proben noch einmal mit der anvisierten MS/MS-Methode durch. Für diese Studie wird eine erschöpfende Liste aller m/z-Verhältnisse für verschiedene mögliche tryptische Aβ-Peptide für die APP-Knock-in-Mausmodelle erstellt (siehe Ergänzende Tabelle 1). Andere Gruppen sollten eine ähnliche Liste in Übereinstimmung mit dem verfügbaren Mausmodell und den möglichen Peptiden, die aus dem interessierenden Protein erzeugt werden (z. B. Aβ für AD), erstellen.
HINWEIS: Um den Ausschluss von hochreichlich vorhandenen Peptiden zu beheben, verwenden Sie einen gezielten Ansatz, indem Sie eine Liste ausgewählter m / z-Werte bereitstellen, die den tryptischen Peptiden von Aβ entsprechen. Dieser Ansatz adressiert das Problem des datenabhängigen Ausschlusses von Aβ-Peptiden und kann die absoluten Mengen verschiedener Monomere (Aβ38-, 40- und 42-Peptide) mit hoher Auflösung quantifizieren. - Das Massenspektrometer erzeugt MS-Spektren der Peptidproben und speichert Rohdatendateien im Zielverzeichnis. Verwenden Sie diese Datei, um einen Spektralabgleich mit etablierten statistischen und bioinformatischen Werkzeugen durchzuführen. Es stehen mehrere Online- und Offline-Tools für die Datenbanksuche und -analyse zur Verfügung.
8. MS-Datenanalyse
- Extrahieren Sie die MS1- und MS2-Dateien mit dem Offline-Rawconverter-Tool (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Führen Sie Identifikations-, Quantifizierungs- und detaillierte Analysen der Daten in einer webbasierten MS-Datensuchmaschine durch. In dieser Studie wurde Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) verwendet.
HINWEIS: Mehrere andere Online- und Offline-MS-Datenanalyse-Tools sind verfügbar und können ebenfalls verwendet werden, z. B. MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Wählen Sie nach dem Hochladen der MS1- und MS2-Dateien eine aktualisierte Mausproteomdatenbank aus. Hier wird eine aktualisierte Mausdatenbank ausgewählt, die zusätzliche App-Knock-in-spezifische Mutationen für die Identifizierung von Peptiden mit den ProLuCId- und SEQUEST-Algorithmen11 enthält.
- Wählen Sie im IP2-Analysesystem die Standardparameter aus und ändern Sie sie entsprechend den experimentellen Anforderungen. In dieser Studie wird eine Peptidmassentoleranz von 50 ppm für Vorläufer und 600 ppm für Fragmente verwendet (siehe Ergänzende Datei 1 für andere Parameter, die in IP2 verwendet werden).
HINWEIS: Forscher können die Suchparameter in Übereinstimmung mit den experimentellen Zielen ändern. Um beispielsweise posttranslationale Modifikationen zu identifizieren, fügen Sie differentielle Modifikationswerte für verschiedene PTMs hinzu (z. B. Ubiquitinierung, SUMOylierung, Phosphorylierung).
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Representative Results
Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amyloidfibrillen unter Verwendung eines modifizierten Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugationsreinigungsverfahrens zusammengefasst (siehe Abbildung 1). Die Innovation bei dieser Methode ist die Einbeziehung von Schritten des ultraschallbasierten Waschens mit einem Wasserbadbeschallungssystem, gefolgt von einer SDS-Solubilisierung, die viele lose assoziierte Proteine aus den Amyloidfibrillen entfernt, die mit den hochdichten und sauberen Fibrillen mitreinigen. Der Ultraschallschritt erzeugt eine hohe Scherkraft und bewegt die Fibrillen, löst die hydrophoben Kräfte und setzt die löslichen lose assoziierten SDS-Proteine in den SDS-Waschpuffer frei. Im Gegenzug werden kleine Mengen hochreiner Amyloidfibrillenkerne zurückgewonnen. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ist nach der Anreicherung ein sichtbares Pellet zu sehen, das zunächst undurchsichtig erscheint (möglicherweise aufgrund von Verunreinigungen); Nach der Ultraschalluntersuchung und mehreren SDS-Wäschen wird das Pellet jedoch halbtransparent und ist kaum sichtbar. Die repräsentative Kongo-Rotfärbung von gereinigten Amyloiden im Vergleich zur SDS-löslichen Fraktion dokumentiert die Anreicherung der Amyloidfibrillen (Abbildung 2B). Die kongolesrote Färbung kann verwendet werden, um das Amyloidmaterial in verschiedenen Fraktionen zu bestätigen und kann mit einem Hellfeldmikroskop sichtbar gemacht werden. Wie in Abbildung 2C gezeigt, färbt sich die lösliche SDS-Fraktion nicht mit dem kongolesroten Farbstoff an.
Die Struktur der gereinigten Fibrillen mit negativer Färbetransmissionselektronenmikroskopie-Analyse bestätigte das Vorhandensein von nahezu reinen Amyloidfibrillen (Abbildung 2D). Zusätzlich bestätigte die Immungoldmarkierung mit einer Kombination von Aβ42 (6E10 und 4G8) Antikörpern das Vorhandensein von Aβ42-Peptiden (Abbildung 2E). Um die Zusammensetzung und die strukturellen Eigenschaften des gereinigten Materials zu untersuchen, verwendeten wir Immunoblot-Techniken für Aβ-Peptide und charakteristische strukturelle Signaturen (z. B. Fibrillen). Die repräsentative Punkt-Blot-Analyse der während der Amyloid-Isolierung gesammelten Fraktionen zeigte eine relative Häufigkeit von Aβ42-Peptiden und Fibrillen unter Verwendung von Anti-Aβ42- und Anti-Fibrillen-Antikörpern (LOC) (Abbildung 3A). In ähnlicher Weise zeigte der Western Blot der repräsentativen Fraktionen auch eine Anreicherung von Aβ42-haltigen Fibrillen in hochmolekularen Proteinen, die in den Vertiefungen des SDS PAGE-Gels gefangen sind (Abbildung 3B). Um die Zusammensetzung dieser hochmolekularen Fibrillen zu verstehen, wurden gereinigte Amyloidfraktionen einer MS-basierten Proteomanalyse unterzogen. Diese semiquantitativen Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von etwa 250 Proteinen, während die vor Ultraschall und SDS-Waschungen gesammelte Fraktion mehr als 2500 Proteine enthielt (Abbildung 3C). Dies zeigt die Wirksamkeit dieser beiden entscheidenden Schritte, die in diesem Reinigungsprotokoll enthalten sind. Zusammengenommen weisen mehrere unabhängige Ergebnisse auf die hohe Häufigkeit ähnlicher Proteinklassen in Fibrillenkernen hin.
Die Analyse der zellulären Komponenten von Gene Ontology (GO) für einen repräsentativen MS-Datensatz in Abbildung 4 zeigte, dass eine große Anzahl von Proteinen, die in den Fibrillenkernen vorhanden sind, mit nicht membrangebundenen Organellen und supramolekularen Komplexen assoziiert sind. Diese Beobachtung ist wahrscheinlich auf die inhärente Tendenz vieler Proteine zurückzuführen, sich selbst zu aggregieren oder mit anderen Proteinen in proteinhaltigen Einschlüssen, die sich in unmittelbarer Nähe befinden, zu koaggregieren. Physikalische Kräfte spielen bei diesen Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle. Die anderen zellulären Organellen und Komponenten, die hauptsächlich durch diese Proteine repräsentiert werden, sind Mitochondrien, Zytoskelett, Zellmembran und Myelinscheide. Viele dieser Proteine interagieren mit Aβ-Peptiden, Oligomeren oder Protofibrillen in verschiedenen Stadien der Amyloidbildung. Sie könnten in der Nähe der Plasmamembran interagieren, wo Aβ-Peptide freigesetzt werden. Die Interaktion kann auch stattfinden, während einige dieser Proteine direkt oder über vesikulären Transport in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Die Sekretion oder Exozytose von Proteinaggregaten ist eine von vielen Strategien, die Zellen verwenden, um die mit Proteinaggregaten verbundene Belastung zu bewältigen und zu reduzieren15. Dies lässt eine weitere Möglichkeit zu, bei der einige der intrazellulären Proteine an Aβ-Peptide binden können. Das Protokoll bietet einen Rahmen für die weitere Optimierung in Abhängigkeit von den experimentellen Zielen. Zum Beispiel können Reinheit und Ausbeute durch Änderung der Anzahl der Ultraschall- und SDS-Waschungen entsprechend fein abgestimmt werden.
Abbildung 1: Eine schematische Übersicht über den Workflow zur Isolierung von Amyloidfibrillenkernen aus AD-postmortalem menschlichem oder tierischem Modellhirngewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bestätigung der Amyloidextraktion durch biochemische Färbung und Bildgebung von Amyloidfibrillen. (A) Angereichertes amyloidhaltiges SDS-unlösliches Pellet erscheint cremefarben undurchsichtig. B) Kongorote Färbung von SDS-löslichem Überstand und SDS-unlöslichem Pellet, das gereinigtes Amyloid enthält, das auf einer 0,45-μm-Nitrocellulosemembran getupft ist; BCA-Messwerte wurden zur Normalisierung der Beladungsmenge der Proteine verwendet. Der BCA-Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. (C) Hellfeldbilder von SDS-löslichem und amyloidem Material nach Kongo-Rotfärbung (Maßstabsstab: 100 μm). (D) Visualisierung von SDS-löslicher Fraktion und gereinigten Amyloidfibrillen mittels negativer Färbung unter dem Elektronenmikroskop (Maßstabsstab: 100 nm). (E) Bestätigung der Häufigkeit von Aβ42-Peptiden in gereinigten Amyloidfibrillen durch Immungoldelektronenmikroskopie unter Verwendung von Aβ42 (6E10 und 4G8) Antikörpern (Skalenbalken: 50 nm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Validierung der Amyloidreinigung mittels Immunoblot- und MS-Analyse. (A) Punkt-Blot- und (B) Western-Blot-Analyse mehrerer repräsentativer Fraktionen, die während des Amyloid-Reinigungsprozesses unter Verwendung von Anti-Fibrillen-LOC- und Anti-Aβ42-Antikörpern gesammelt wurden; BCA-Assay-Messwerte wurden zur Normalisierung der Beladungsmenge der Proteine verwendet. C) Anzahl der Proteine, die bei der markierungsfreien Massenspektrometrie-Analyse angereicherter und gereinigter Amyloidfraktionen gewonnen wurden; Der Mikro-BCA-Assay wurde verwendet, um 3 μg verdaute Peptide für jede MS-Analyse zu laden. BCA- und Micro-BCA-Assays wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Genontologische Analyse von Proteinen, die in gereinigten Amyloidfraktionen reichlich vorhanden sind . (A) Zellige Komponenten und (B) KEGG-Signalwege. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei 1: Puffer und Lösungen, massenspektrometrische Parameter und ProLuCID-Suchparameter zur Identifizierung von Peptiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1 - Eine repräsentative Liste der in MS Run identifizierten m/z-Verhältnisse für Amyloid-Beta-Peptide von APP-Knock in Mausmodellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die Entwicklung eines klaren Verständnisses der Struktur und Zusammensetzung von Amyloiden ist für Strukturbiologen und Biochemiker aufgrund der biologischen Komplexität und der experimentellen Einschränkungen bei der Extraktion gereinigter Fibrillen aus AD-Hirngewebeneine Herausforderung 16,17. Amyloidfibrillen sind auf molekularer Ebene polymorph und zeigen eine heterogene Population unterschiedlicher Länge und Komplexität18,19. Um ihre biologischen Merkmale und ihre pathologische Relevanz besser zu verstehen, ist eine umfassende Charakterisierung der Zusammensetzung polymorpher Amyloidfibrillen, die aus postmortalem menschlichem und AD-Maus-Hirngewebe gewonnen werden, erforderlich20,21. Eine große Teilmenge von Proteinen interagiert direkt mit Aβ42, während andere dazu neigen, große fibrilläre Strukturen oder Proteinkomplexe zu bilden22,23,24. Es ist schwieriger, die Rolle der Proteine zu bestimmen, die mit Aβ42 bei der Bildung, Stabilisierung und Verlängerung von Amyloiden in Bezug auf die AD-Pathologie interagieren. In den letzten Jahren haben mehrere proteomische Studien die Unterschiede und Ähnlichkeiten in der Proteinzusammensetzung verschiedener supramolekularer Anordnungen, membranloser Organellen, Einschlusskörper und Proteinaggregateaufgeklärt 25,26,27. In den frühen Stadien der AD falten sich mehrere zelluläre Proteine (z. B. Aβ42 und Mikrotubuli-assoziiertes Tau-Protein und Apolipoprotein E) in mehreren Gehirnregionen falsch und koaggregieren28,29. Amyloidogene proteinhaltige Formationen sind ein wichtiges pathologisches Kennzeichen von AD und tragen wahrscheinlich zur Pathogenesebei 3.
Die Reinigung von Amyloidfibrillen aus erkrankten menschlichen Gehirnen ist eine mühsame und herausfordernde Aufgabe und hat mehrere Einschränkungen. Ein großer Nachteil der bestehenden Methoden ist die geringe Reinheit des extrahierten Materials, die ihre detaillierte Strukturanalyse mit bildgebenden Verfahren wie KryoEM oft einschränkt. Ebenso erfordern NMR-Studien einige Milligramm gereinigtes Material, das auch mit schweren Isotopen (dh 15N) markiert werden muss30. Postmortale menschliche Gehirne können die erste Anforderung erfüllen, da das Ausgangsmaterial auf einige Gramm menschliches Gewebe erhöht werden kann; Es ist jedoch nicht möglich, menschliches Hirngewebe mit schweren Isotopen zu kennzeichnen. Auf der anderen Seite ist die Kennzeichnung der AD-Mausmodelle mit 15N-Isotopen möglich (wenn auch kostspielig) und wird jetztimmer häufiger mit 31,32 angegeben. Unser Labor hat die Pulse-Chase-Markierung verwendet, um die synaptische Proteinumsatzdynamik während der Krankheit und des Alterns von Gehirnen zu untersuchen14. Wir haben auch die Kennzeichnung schwerer Isotopen für das ganze Tier verwendet, um langlebige Proteine zu identifizieren und ihre physiologische Relevanz in ausgeklügelten biologischen Strukturenzu verstehen 33,34. Für das Gehirn der Maus sind jedoch große Mengen an Ausgangsmaterial erforderlich, um eine praktikable Menge der Fibrillenkerne zu erhalten. Diese Methode löst diese Probleme erfolgreich, indem sie die Ausbeute und Reinheit der extrahierten Amyloidfibrillen verbessert, indem sie die bestehenden biochemischen Isolationsprinzipien modifiziert. Daher kann dieses robuste Protokoll für die Extraktion von Amyloidfibrillen aus Hirngewebe leicht für KryoEM- und NMR-basierte Strukturstudien verwendet werden.
Diese Methode nutzt das bestehende auf Saccharosedichtegradienten basierende subzelluläre Fraktionierungsparadigma und entfernt unspezifische co-reinigende Proteine in aufeinanderfolgenden Schritten. Nach der Entfernung von Zelltrümmern, Myelin, DNA und Zelllipiden werden die amyloidreichen unlöslichen SDS-Pellets isoliert. Die Einbeziehung zusätzlicher Schritte mehrerer Ultraschall-gekoppelter SDS-Waschungen hilft, die Anzahl der mitreinigenden zellulären Komponenten, lose gebundenen Proteine und kleineren SDS-löslichen Polymorphe von Amyloiden zu reduzieren. Das endgültige Pellet wird in Reinstwasser gelöst und kann für viele Anwendungen verwendet werden, einschließlich Aussaatexperimenten, biochemischen oder pharmakologischen Studien und Strukturanalysen. Die gereinigten Amyloidfibrillen aus AD-Hirngewebe werden auch verwendet, um die proteomische Zusammensetzung und die strukturellen Merkmale von Fibrillenkernen mithilfe von MS-basierter Proteomik zu verstehen. Diese Analyse bestätigte das Vorhandensein einer Untergruppe zellulärer Proteine (dargestellt in Abbildung 4) im Kern der Fibrillen, was auf die mögliche Rolle von mehr als einem Protein bei der Bildung, Verlängerung und Stabilisierung von Amyloidfibrillen über einen langen Zeitraum hinweisen könnte. Einige der in dieser Analyse identifizierten Proteine sind für ihre Assoziation mit mehr als einer neurodegenerativen Erkrankung bekannt, zum Beispiel Adam22, APP, ApoE, β-Catenin-Neurofilamentproteine, 14-3-3-Proteine und andere.
Es besteht die Möglichkeit, dass einige kontaminierende Proteine in der Proteomanalyse auftreten, da nach der Homogenisierung aufgrund der hohen Hydrophobie von Amyloidfibrillen einige ungerechtfertigte Wechselwirkungen zwischen Proteinen auftreten können. Einige dieser Proteine haften an den Kernen und werden auch nach mehreren Runden der Ultraschall- und SDS-Waschschritte nicht entfernt. Dies ist eine Einschränkung dieser Amyloid-Reinigungsstrategie. Es könnte jedoch durch geeignete Negativkontrollen und die Durchführung effektiver statistischer Cutoffs in groß angelegten proteomischen Studien angegangen werden. Eine weitere Einschränkung, auf die wir gestoßen sind, bezieht sich auf die Unterschätzung der Aβ-Peptidhäufigkeit nach der Trypsin-Verdauung. Dies wurde in diesem Workflow durch eine gezielte MS/MS-Analysestrategie adressiert. Die GO-Analyse für KEGG-Signalwege zeigt die Häufigkeit von Proteinen, die zu Signalwegen gehören, die an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, z. B. Alzheimer, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Prionenerkrankungen. Diese Proteine sind wichtige Akteure in mehreren pathologischen Signalwegen und haben daher eine bekannte Beteiligung an der Entstehung und Progression der Krankheit. Interessanterweise benötigen einige dieser Proteine weitere Analysen, um ihre mögliche Beteiligung an der Pathologie von AD und anderen neurodegenerativen Erkrankungen zu bestimmen.
Zukünftige Studien über das reine Amyloidmaterial aus anderen Krankheitsmodellen können ein tiefes Verständnis der strukturellen Muster und der Zusammensetzung von Kernfibrillen liefern und bei der Identifizierung wichtiger therapeutischer Ziele helfen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01AG061865 an R.J.V. und J.N.S. unterstützt. Die Autoren danken Vassar und den Mitgliedern der Savas-Forschungsgruppe an der Northwestern University für ihre nachdenklichen Diskussionen. Wir danken auch herzlich Dr. s. Ansgar Seimer und Ralf Langen von der University of South California für ihren entscheidenden Input. Wir danken Dr. Farida Korabova für die Probenvorbereitung und die Bildgebung negativer Färbeelektronenmikroskopie am Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
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