Summary
Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.
Abstract
Eiwithoudende fibrillaire insluitsels zijn belangrijke pathologische kenmerken van meerdere neurodegeneratieve ziekten. In de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer (AD) vormen amyloïde-bètapeptiden protofibrillen in de extracellulaire ruimte, die fungeren als zaden die geleidelijk groeien en rijpen tot grote amyloïde plaques. Ondanks dit basisbegrip is de huidige kennis van de amyloïde fibrilstructuur, samenstelling en afzettingspatronen in de hersenen beperkt. Een belangrijke barrière is het onvermogen om sterk gezuiverde amyloïde fibrillen uit hersenextracten te isoleren. Affiniteitszuivering en laservangst microdissectie-gebaseerde benaderingen zijn eerder gebruikt om amyloïden te isoleren, maar worden beperkt door de kleine hoeveelheid materiaal die kan worden teruggewonnen. Dit nieuwe, robuuste protocol beschrijft de biochemische zuivering van amyloïde plaquekernen met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) oplosbaarheid met sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en ultrasoon geluid en levert zeer zuivere fibrillen van AD-patiënten en AD-model hersenweefsels. Massaspectrometrie (MS) -gebaseerde bottom-up proteomische analyse van het gezuiverde materiaal vertegenwoordigt een robuuste strategie om bijna alle primaire eiwitcomponenten van amyloïde fibrillen te identificeren. Eerdere proteomische studies van eiwitten in de amyloïde coronae hebben een onverwacht grote en functioneel diverse verzameling eiwitten onthuld. Met name na het verfijnen van de zuiveringsstrategie werd het aantal co-zuiverende eiwitten met meer dan 10-voudig verminderd, wat wijst op de hoge zuiverheid van het geïsoleerde SDS-onoplosbare materiaal. Negatieve kleuring en immuno-goud elektronenmicroscopie maakten bevestiging van de zuiverheid van deze preparaten mogelijk. Verdere studies zijn nodig om de ruimtelijke en biologische kenmerken te begrijpen die bijdragen aan de afzetting van deze eiwitten in amyloïde insluitsels. Alles bij elkaar genomen is deze analytische strategie goed gepositioneerd om het begrip van amyloïde biologie te vergroten.
Introduction
Amyloïde is een extreem stabiele supramoleculaire opstelling die wordt aangetroffen in een divers panel van eiwitten, waarvan sommige leiden tot pathologische veranderingen1. De accumulatie van intra- of extracellulaire amyloïde aggregaten wordt waargenomen bij verschillende neurodegeneratieve ziekten2. Amyloïde aggregaten zijn heterogeen en verrijkt met een groot aantal eiwitten en lipiden3. In de afgelopen jaren heeft de interesse in het amyloïde proteoom aanzienlijke interesse gewekt onder basis- en translationele neurowetenschappers. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om amyloïde aggregaten uit menselijke hersenweefsels van muizen en postmortems te extraheren en te zuiveren. Laser-capture microdissectie, immunoprecipitatie, decellularisatie en biochemische isolatie van amyloïde aggregaten zijn veelgebruikte methoden om amyloïde plaques, fibrillen en oligomerente extraheren en te zuiveren 4,5,6,7. Veel van deze studies hebben zich gericht op het bepalen van de eiwitsamenstelling van deze dicht opeengepakte fibrillaire afzettingen met behulp van semi-kwantitatieve MS. De beschikbare resultaten zijn echter inconsistent en het verrassend grote aantal co-zuiverende eiwitten dat eerder werd gerapporteerd, is een uitdaging om te interpreteren.
De primaire beperking van de bestaande literatuur die het amyloïde kernproteoom in AD- en AD-muizenmodelhersenen beschrijft, is dat het gezuiverde materiaal een onbeheersbaar aantal co-zuiverende eiwitten bevat. Het algemene doel van deze methode is om deze beperking te overwinnen en een robuuste biochemische zuivering te ontwikkelen voor het isoleren van amyloïde fibrilkernen. Deze strategie maakt gebruik van een eerder beschreven sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie-gebaseerde biochemische methode voor de isolatie van SDS onoplosbare verrijkte amyloïde fracties uit post-mortem AD menselijke en muis hersenweefsels 8,9. Deze methode bouwt voort op de bestaande literatuur, maar gaat verder met ultrasoonbehandeling en SDS-wasbeurten om de meeste losjes gebonden amyloïde-geassocieerde eiwitten te verwijderen, wat leidt tot de isolatie van sterk gezuiverde amyloïde fibrillen (figuur 1). De fibrillen die door dit protocol worden gezuiverd, overwinnen verschillende bestaande uitdagingen die vaak worden aangetroffen in structurele studies van amyloïde fibrillen geïsoleerd uit hersenextracten. Visualisatie van deze fibrillen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bevestigt de integriteit en zuiverheid van het gezuiverde materiaal (figuur 2). In deze studie worden de geïsoleerde fibrillen opgelost en verteerd tot peptiden met trypsine, en labelvrije MS-analyse kan gemakkelijk de identiteit onthullen van de eiwitten die de fibrilkern vormen. Met name sommige van deze eiwitten hebben een inherente neiging om supramoleculaire assemblages te vormen in niet-membraangebonden organellen. Bovendien zijn veel van de eiwitten die zijn geïdentificeerd in de analyse van amyloïde-bèta (Aβ) fibrillen ook geassocieerd met andere neurodegeneratieve ziekten, wat suggereert dat deze eiwitten een sleutelrol kunnen spelen bij meerdere proteïnopathieën.
Het is onwaarschijnlijk dat deze SDS / ultrasone methode de structuur van de fibrilkernen zal veranderen of verstoren. Het gezuiverde materiaal is ook geschikt voor een breed scala aan top-down en bottom-up proteomische analysebenaderingen en aanvullende ms-gebaseerde structurele analysestrategieën, zoals chemische crosslinking of waterstof-deuteriumuitwisseling. Het totale herstel met behulp van deze methode is relatief hoog en is dus geschikt voor gedetailleerde structurele studies, waarvoor microgram tot milligram van het gezuiverde materiaal nodig is. Het gezuiverde materiaal is ook geschikt voor structurele studies met cryoEM en atoomkrachtmicroscopie. Dit protocol, in combinatie met de stabiele isotopische etikettering van zoogdieren, kan solid-state nucleaire magnetische resonantie (NMR) studies van amyloïde structuur10 vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol omvat het gebruik van menselijke of gewervelde hersenweefsels. Al het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde institutionele richtlijnen van de Northwestern University. De huidige workflow is gestandaardiseerd met behulp van APP-knock-in (AppNL-G-F/NL-G-F) hersenschors- en hippocampus hersengebiedextractenvan muizen 11. Dit protocol is geoptimaliseerd voor hersenextracten van muizen op de leeftijd van 6-9 maanden en kan amyloïden van zowel mannelijke als vrouwelijke dieren effectief zuiveren.
OPMERKING: Voor een beter begrip van de algemene experimentele procedure, zie Figuur 1 voor een schema van de workflow.
1. Weefseloogst en amyloïde zuivering
OPMERKING: Idealiter moeten amyloïde fibrillen worden geïsoleerd uit vers ontleedde hersengebieden. Deze methode werkt echter ook goed met snap- of flash-bevroren hersenweefsels. Hieronder vindt u een korte schets van snap-freezing hersenweefsels voor opslag voor gebruik op een later tijdstip.
- Oogsten en opslaan van hersenweefsel: ontleed muizenhersenen en oogst snel de met amyloïden beladen gebieden (d.w.z. cortex en hippocampus), gevolgd door snap-bevriezing in vloeibare stikstof of een droogijsalcoholbad.
OPMERKING: Snap freezing helpt om de structurele kenmerken van de bestanddelen van het weefsel te behouden. De muizen worden geëuthanaseerd door isofluraan en cervicale dislocatie12,13. Het wordt geadviseerd om het gebruik van CO2 te vermijden, omdat dat de integriteit van het proteoom van de hersenen in gevaar kan brengen. - Na de dissectie, snijd en bewaar verse weefsels in kleine blokken (bijv. 5 mm x 5 mm), omdat dit een efficiëntere homogenisatie vóór amyloïde-extractie mogelijk maakt. Breng het weefsel over naar de steriele cryogene injectieflacon, draai de dop aan en dompel snel onder.
- Houd weefsels bevroren in ultrakoude omstandigheden (d.w.z. -80 °C of vloeibare stikstof). Als de extractie een paar dagen later moet worden uitgevoerd, bewaar de weefsels dan bij -20 °C en vermijd vries- en dooicycli. Ontdooi de bevroren weefsels op nat ijs wanneer ze klaar zijn voor extractie en zuivering.
OPMERKING: Direct contact van de weefsels met vloeibare stikstof kan weefsel- en eiwitschade veroorzaken. Merk op dat een alcoholbad permanente markers van de buisetiketten kan verwijderen.
2. Verrijking van sds onoplosbaar materiaal
OPMERKING: Voer alle stappen uit op ijs en centrifugeer bij 4 °C, tenzij anders vermeld. Details van alle buffers en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt, zijn opgenomen in aanvullend dossier 1. Fabrikanten en catalogusnummers van chemicaliën en instrumenten zijn opgenomen in de tabel met materialen.
- Begin met vers ontleedde of snap-bevroren hersenweefselgebieden (ontdooid op ijs) geplaatst in een buis van 2 ml met 6-8 keramische kralen en vers bereide ijskoude homogenisatiebuffer (1 ml voor 0,25-1 g natte weefselmassa).
- Breng de buizen over naar de kraalmolenhomogenisator en maal de weefselinhoud bij 4000 tpm, met twee cycli van elk 30 s en een interval van 30 s ertussen.
OPMERKING: Als alternatief kunnen gemotoriseerde roerder- of homogenisatorsystemen worden gebruikt om de weefsels te malen en te homogeniseren. - Voeg 9 ml ijskoude homogenisatiebuffer toe aan de 1 ml hersenweefselhomogenaat in buizen van 15 ml, sluit af met laboratoriumwasfilmstrips en draai 's nachts van begin tot eind op 4 ° C om een robuuste oplosbaarheid te garanderen.
OPMERKING: Om ongewenst groot cellulair afval en lipiden te verwijderen, draait u de volgende ochtend de buizen op 800 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten en verzamelt u het supernatant in een verse buis. Resuspendeer de resterende pellet in 2 ml ijskoude homogenisatiebuffer, meng goed, spin opnieuw gedurende 10 minuten bij 4 °C en combineer de twee supernatanten. - Voeg langzaam vaste sucrose toe aan de suspensie van het weefselextract tot een eindconcentratie van 1,2 M, meng goed en centrifugeer op 250.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg met een pipet. Resuspensie van de pellet in 2 ml homogenisatiebuffer met 1,9 M sucrose door trituratie, gevolgd door centrifugeren bij 125.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Het buffervolume kan worden aangepast op basis van de hoeveelheid materiaal die uit de vorige stap is teruggewonnen. Over het algemeen is 10 volumes homogenisatiebuffer (V/V) ideaal voor deze stap. - Verzamel de bovenste witte vaste laag met behulp van een pipet, breng deze over in een verse buis en solubiliteer in 1 ml ijskoude wasbuffer door meerdere keren op en neer te pipetteren, zonder luchtbellen te introduceren.
- Naast de toplaag is de pellet ook verrijkt met amyloïde fibrillen. Voor een hogere opbrengst combineert u de twee fracties en gaat u verder. Verwijder voorzichtig de middelste waterige laag met een pipet en gooi deze weg.
- Centrifugeer de gecombineerde fracties bij 8000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 ml ijskoude verteringsbuffer toe aan de gewassen pellet, resuspendeer en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 uur.
- Centrifugeer bij 8000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant met een pipet.
- Resuspendeer en was (hetzelfde als stap 2.8.) de verteerde pellet twee keer in 1 ml ijskoude Tris-buffer.
- Resuspendeer de gewassen pellet in 1 ml oplosbuffer met 1% SDS en 1,3 M sucrose door op en neer te pipetteren. Centrifugeer snel bij 200.000 x g gedurende 60 min bij 4 °C.
OPMERKING: Hoewel de amyloïde fibrillen zeer resistent zijn tegen detergentia en denaturanten, kunnen zeer lange blootstellingen aan het wasmiddel (1% SDS) de integriteit van de fibrillen beïnvloeden of de strak gebonden eiwitten verwijderen, wat latere analyses in gevaar zal brengen. Ga daarom onmiddellijk na het resuspenderen van de pellets over tot centrifugatie. - Bewaar de pellet en verhoog het volume van het resterende supernatant door 50 mM Tris-buffer toe te voegen (in verhouding 1:0,3) om de sucroseconcentratie te verlagen van 1,3 tot 1 M en nogmaals te centrifugeren bij 200.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C.
- Los de twee pellets op in 100 μL Tris-buffer met 0,5% SDS en pool voor amyloïde zuivering. Zichtbare pellets zijn klein en moeten ondoorzichtig en gebroken wit lijken (zie figuur 2A).
3. Amyloïde zuivering
OPMERKING: Combineer de twee pellets, solubiliteer door te pipetteren totdat een uniforme oplossing is verkregen en ga verder met de volgende stappen van amyloïde zuivering.
- Voor volledige oplosbaarheid van het amyloïde-rijke materiaal dat aanwezig is in pellets, onderwerpt u de buis aan mechanische afschuiving geproduceerd door ultrasone golven in een badapparaat dat 30 s AAN en 30 s UIT draait op een middellangeafstandsfrequentie gedurende 20 cycli.
- Centrifugeer het materiaal onmiddellijk bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en resuspeneer de pellet in 500 μL van 0,5% SDS Tris-buffer.
- Herhaal stap 3.1. en stap 3.2. vier keer voor een totaal van vijf wasbeurten. Het aantal wasbeurten kan worden verhoogd om de zuiverheid te verbeteren.
OPMERKING: Ultrasoonapparaat en wasstappen zijn geoptimaliseerd bij 0,5% SDS, omdat hogere concentraties de structuur, integriteit of eiwitsamenstelling van de fibrillen kunnen beïnvloeden. Het verhogen van de SDS-concentratie bij deze stap wordt niet aanbevolen. - Was de pellet na de laatste centrifugatiestap in 200 μL ultrazuiver water en centrifugeer op 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om het resterende reinigingsmiddel te verwijderen. De gewassen pellet met gezuiverde amyloïde fibrillen lijkt semi-transparant van kleur en is soms moeilijk te zien.
- Los de laatste pellet met gezuiverde amyloïde fibrillen op in 100 μL ultrapuur water. Ga onmiddellijk naar de volgende stap voor downstream-verwerking of bewaar de fibrilsuspensie bij -20 °C voor verdere analyse. Indien bevroren, ontdooien op ijs voordat de neerslag begint.
4. Methanol chloroform precipitatie
OPMERKING: Als het uiteindelijke doel is om eiwitanalyse uit te voeren, wordt aanbevolen om extra niet-eiwithoudende onzuiverheden te ontzouten en te verwijderen.
- Voeg 400 μL methanol toe aan de gezuiverde 100 μL amyloïde fibrillen in een buis van 1,5 ml en vortexput.
- Voeg 100 μL chloroform toe aan de buis en vortex goed.
- Voeg 300 μL ultrapuur water en vortex grondig toe. Hierdoor wordt het mengsel troebel door eiwitneerslag.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 2 min bij RT.
- Verwijder voorzichtig de waterige laag (d.w.z. de bovenkant) zonder de interfacelaag met de eiwitvlok te verstoren.
- Voeg hetzelfde volume methanol opnieuw toe en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 2 minuten bij RT.
- Gooi het supernatant weg met een pipet en droog de pellet aan de lucht bij RT. Vermijd overdroging; amyloïde fractie is moeilijk opnieuw op te lossen als het te veel wordt gedroogd.
5. Trypsine spijsvertering
- Los de pellet op in 50 μL guanidinehydrochloride (GuHCl) buffer. Soniceer in een ijskoud waterbad en verwarm op 95 °C gedurende 5 minuten, indien nodig.
- Vortex grondig op RT gedurende 45 minuten tot 1 uur om het volledig op te lossen. De pellet zal na deze stap niet meer zichtbaar zijn en de oplossing ziet er helder uit.
- Voeg hetzelfde volume van 0,2% oppervlakteactieve oplossing toe. Solubilize op RT met vortexing gedurende 60 min. Deze stap verbetert de enzymatische activiteit van trypsine.
- Voeg 1 μL tris-2-carboxyethylfosfine (TCEP) toe uit de 500 mM stamoplossing. Incubeer gedurende 60 min.
- Voeg 2 μL 500 mM jodoacetamide (IAZ) toe en incubeer in het donker gedurende 20 minuten.
- Doof het IAZ met 5 μL TCEP-oplossing gedurende 15 min.
- Voeg het vereiste volume ammoniumbicarbonaatoplossing van 50 mM toe aan de buis om de guanidineconcentratie te verlagen tot 1,5 M.
- Voeg 1% oppervlakteactieve oplossing toe aan de buis (1 μL/50 μg eiwit).
- Voeg trypsine (1 μg/100 μg eiwit) toe en laat de buis een nacht op 37 °C mengen.
6. Peptide opschonen
- Verzuur de volgende ochtend de verteerde peptide-oplossing door de pH te verlagen tot 2,0 door mierenzuur toe te voegen.
- Activeer de C18 (n-octadecyl) spinkolom in een ontvangerbuis van 2 ml door 200 μL 50% methanoloplossing toe te voegen en draai bij 1500 x g gedurende 2 minuten bij RT. Herhaal de activeringsstap.
- Breng de C18-kolomharsbedden in evenwicht door 200 μL equilibratiebuffer toe te voegen en gedurende 2 minuten onder dezelfde omstandigheden te draaien. Herhaal deze stap.
- Laad de verzuurde peptide-oplossing op de C18-kolom en centrifugeer op 1500 x g gedurende 2 minuten bij RT. Verzamel de doorstroom en laad deze nog een keer opnieuw. Gooi de tweede doorstroom weg.
- Was de peptiden gebonden aan de C18-hars met de wasbuffer 2x, zoals gedaan in stap 6.3. Gebruik dezelfde evenwichtsbuffer voor het wassen van de kolom.
- Eluteer de peptiden door 40 μL elutiebuffer toe te voegen, gevolgd door centrifugatie bij 1500 x g, gedurende 2 minuten bij RT. Herhaal de elutiestap drie keer om de opbrengst van de teruggewonnen peptiden te verhogen.
- Droog de peptiden in een snelvacuümconcentrator door de waterige oplossing te verdampen. Droge pellets kunnen enkele weken voor de MS-analyse bij -20 °C worden bewaard.
7. Massaspectrometer instellen voor peptideanalyse
OPMERKING: Voor MS-parameters, zie Aanvullend bestand 1 (aangepast van een eerdere publicatie uit het lab)14.
- Voordat u de peptidemonsters voor de MS-analyse laadt, lost u de droge peptidepellets op in 20 μL monsterlaadbuffer en voert u micro-BCA uit om de concentratie van herstelde peptiden te kwantificeren.
- Breng de opgeloste peptiden over in een glazen injectieflacon en laad 3 μg (gekwantificeerd uit micro BCA) peptiden in de AUTOSAMPLER van het UPLC-systeem.
- Plaats de monsters op een geventileerde valkolom (C18 HPLC-kolom, 0,075 mm x 20 mm) met een debiet van 250 nL/min.
- Plaats de valkolom in lijn met een analytische kolom (0,075 μm x 500 mm) en monteer een emitterpunt naar de elektrospray-ionisatiebron (ESI) die wordt onderworpen aan een sproeispanning van 2000 V.
OPMERKING: In deze studie wordt ESI uitgevoerd, waarbij de mobiele fase wordt onderworpen aan hoogspanningsionisatie in de gasfase. De spray die hierdoor ontstaat, wordt via een verwarmd capillair naar de vacuümkamer van de MS geleid. Onder vacuüm vindt de de-solvatie van druppels en het uitwerpen van ionen plaats in de aanwezigheid van warmte en spanning. Daarna worden de ionen versneld naar de massaanalysator in de aanwezigheid van een hoogspanningsomgeving. - Analyseer de monsters met 2 uur acquisitieruns. Deze studie wordt uitgevoerd met behulp van data-afhankelijke acquisitie met het meest intense top 20 precursor ion selectie paradigma.
OPMERKING: Bij gegevensafhankelijke acquisitie wordt een beperkt aantal precursorpeptiden gedetecteerd in de MS1-scan en onderworpen aan fragmentatie voor MS2-analyse. De dynamische uitsluiting is hier echter problematisch, omdat zeer overvloedige Aβ-peptiden worden weggelaten voor fragmentatie en resulteren in een onderschatting van hun hoeveelheid. - Voor absolute kwantificering van Aβ-peptiden, voer dezelfde monsters nog een keer uit met behulp van de gerichte MS / MS-methode. Voor deze studie wordt een uitputtende lijst opgesteld van alle m/z-verhoudingen voor verschillende mogelijke tryptische Aβ-peptiden voor de APP knock-in muismodellen (zie Aanvullende Tabel 1). Andere groepen moeten een soortgelijke lijst opstellen in overeenstemming met het beschikbare muismodel en de mogelijke peptiden die worden gegenereerd uit het eiwit van belang (bijv. Aβ voor AD).
OPMERKING: Om de uitsluiting van zeer overvloedige peptiden aan te pakken, gebruikt u een gerichte aanpak door een lijst met geselecteerde m / z-waarden te verstrekken die overeenkomen met Aβ-tryptische peptiden. Deze benadering pakt het probleem van gegevensafhankelijke uitsluiting van Aβ-peptiden aan en kan de absolute hoeveelheden van verschillende monomeren (Aβ38, 40 en 42 peptiden) met hoge resolutie kwantificeren. - De massaspectrometer genereert MS-spectra van de peptidemonsters en slaat onbewerkte gegevensbestanden op in de doelmap. Gebruik dit bestand om spectrale matching uit te voeren met behulp van gevestigde statistische en bioinformatica tools. Er zijn meerdere online en offline zoek- en analysetools voor databases beschikbaar.
8. Gegevensanalyse van de lidstaten
- Pak de MS1- en MS2-bestanden uit met behulp van de offline Rawconverter-tool (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Voer identificatie, kwantificering en gedetailleerde analyses van de gegevens uit op een webgebaseerde MS-gegevenszoekmachine. In deze studie werd Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) gebruikt.
OPMERKING: Verschillende andere online en offline MS-gegevensanalysetools zijn beschikbaar en kunnen ook worden gebruikt, zoals MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Nadat u de MS1- en MS2-bestanden hebt geüpload, selecteert u een bijgewerkte proteoomdatabase voor muizen. Hier wordt een bijgewerkte muisdatabase met aanvullende App knock-in specifieke mutaties geselecteerd voor de identificatie van peptiden met behulp van ProLuCId- en SEQUEST-algoritmen11.
- Selecteer in het IP2-analysesysteem de standaardparameters en wijzig deze volgens de experimentele vereisten. In deze studie wordt een peptidemassatolerantie van 50 ppm voor precursor en 600 ppm voor fragmenten gebruikt (zie aanvullend bestand 1 voor andere parameters die in IP2 worden gebruikt).
OPMERKING: Onderzoekers kunnen de zoekparameters wijzigen in overeenstemming met de experimentele doelstellingen. Voeg bijvoorbeeld voor het identificeren van posttranslationele modificaties differentiële modificatiewaarden toe voor verschillende PTM's (bijv. ubiquitinatie, SUMOylation, fosforylering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt een gedetailleerde methode voor de isolatie en zuivering van amyloïde fibrillen samengevat met behulp van een gemodificeerde sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatiezuiveringsmethode (zie figuur 1). De innovatie in deze methode is de opname van stappen van ultrasoon wassen met behulp van een waterbad sonicatiesysteem gevolgd door SDS-oplosbaarheid, die veel losjes geassocieerde eiwitten verwijdert uit de amyloïde fibrillen die co-zuiveren met de zeer dichte en schone fibrillen. De ultrasone stap genereert een hoge schuifkracht en roert de fibrillen, waardoor de hydrofobe krachten worden losgemaakt en de SDS-oplosbare losjes geassocieerde eiwitten in de SDS-wasbuffer worden vrijgegeven. Op hun beurt worden kleine hoeveelheden zeer zuivere amyloïde fibrilkernen teruggewonnen. Zoals te zien is in figuur 2A, kan een zichtbare pellet, die aanvankelijk ondoorzichtig lijkt (mogelijk als gevolg van onzuiverheden), worden gezien na verrijking; na de ultrasoonbehandeling en meerdere SDS-wasbeurten wordt de pellet echter semi-transparant en is nauwelijks zichtbaar. De representatieve Congorode kleuring van gezuiverde amyloïden in vergelijking met de SDS-oplosbare fractie documenteert de verrijking van de amyloïde fibrillen (figuur 2B). Congorode kleuring kan worden gebruikt om het amyloïde materiaal in verschillende fracties te bevestigen en kan worden gevisualiseerd met behulp van een heldere veldmicroscoop. Zoals te zien is in figuur 2C, kleurt de sds-oplosbare fractie niet met de Congorode kleurstof.
De structuur van de gezuiverde fibrillen met negatieve kleuring transmissie elektronenmicroscopie analyse bevestigde de aanwezigheid van bijna zuivere amyloïde fibrillen (Figuur 2D). Bovendien bevestigde immunogold-etikettering met behulp van een combinatie van Aβ42 (6E10 en 4G8) antilichamen de aanwezigheid van Aβ42-peptiden (figuur 2E). Om de samenstelling en structurele kenmerken van het gezuiverde materiaal te onderzoeken, gebruikten we immunoblottechnieken voor Aβ-peptiden en kenmerkende structurele handtekeningen (bijv. Fibrillen). Representatieve dot blot analyse van de fracties verzameld tijdens amyloïde isolatie toonde een relatieve abundantie van Aβ42 peptiden en fibrillen met behulp van anti-Aβ42 en anti-fibril (LOC) antilichamen (Figuur 3A). Evenzo toonde de western blot van de representatieve fracties ook verrijking van Aβ42-bevattende fibrillen in eiwitten met een hoog molecuulgewicht die vastzaten in de putten van de SDS PAGE-gel (figuur 3B). Om de samenstelling van deze fibrillen met een hoog molecuulgewicht te begrijpen, werden gezuiverde amyloïde fracties onderworpen aan ms-gebaseerde proteomische analyse. Deze semi-kwantitatieve resultaten onthulden de aanwezigheid van ongeveer 250 eiwitten, terwijl de fractie verzameld vóór ultrasoonbehandeling en SDS-wasbeurten meer dan 2500 eiwitten bevatte (figuur 3C). Dit geeft de effectiviteit aan van deze twee cruciale stappen die zijn opgenomen in dit zuiveringsprotocol. Alles bij elkaar wijzen meerdere onafhankelijke resultaten op de hoge abundantie van vergelijkbare eiwitklassen in fibrilkernen.
Gen Ontology (GO) cellulaire componentanalyse voor een representatieve MS-dataset in figuur 4 onthulde dat een groot aantal eiwitten aanwezig in de fibrilkernen geassocieerd zijn met niet-membraangebonden organel en supramoleculaire complexen. Deze waarneming is waarschijnlijk te wijten aan de inherente neiging van veel eiwitten om zichzelf te aggregeren of samen te voegen met andere eiwitten in eiwitachtige insluitsels die zich in de nabijheid bevinden. Fysieke krachten spelen een cruciale rol in deze interacties. De andere cellulaire organel en componenten die voornamelijk door deze eiwitten worden vertegenwoordigd, zijn mitochondriën, cytoskelet, celmembraan en myelineschede. Veel van deze eiwitten interageren met Aβ-peptiden, oligomeren of protofibrillen in verschillende stadia van amyloïdevorming. Ze kunnen interageren dicht bij het plasmamembraan, waar Aβ-peptiden vrijkomen. De interactie kan ook plaatsvinden terwijl sommige van deze eiwitten direct of via vesiculair transport in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven. Secretie of exocytose van eiwitaggregaten is een van de vele strategieën die cellen gebruiken om de last van eiwitaggregaten het hoofd te bieden en te verminderen15. Dit laat een andere kans waar sommige van de intracellulaire eiwitten kunnen binden aan Aβ-peptiden. Het protocol biedt een kader voor verdere optimalisatie, afhankelijk van de experimentele doelen. De zuiverheid en opbrengst kunnen bijvoorbeeld, door het aantal ultrasoon- en SDS-wasbeurten te wijzigen, dienovereenkomstig worden afgestemd.
Figuur 1: Een schematisch overzicht van de workflow voor isolatie van amyloïde fibrillenkern uit AD postmortem menselijke of model dierlijke hersenweefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bevestiging van amyloïde-extractie met behulp van biochemische kleuring en beeldvorming van amyloïde fibrillen. (A) Verrijkte amyloïde-bevattende SDS onoplosbare pellet lijkt ondoorzichtig gebroken wit van kleur. B) Congorode kleuring van sds-oplosbaar supernatant en sds-onoplosbare pellets die gezuiverde amyloïde bevatten, uitgewist op 0,45 μm nitrocellulosemembraan; BCA-metingen werden gebruikt voor normalisatie van de laadhoeveelheid van de eiwitten. BCA-test werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. (C) Bright-field beelden van SDS oplosbaar en amyloïde materiaal na Congo rode kleuring (schaal bar: 100 μm). (D) Visualisatie van SDS oplosbare fractie en gezuiverde amyloïde fibrillen met behulp van negatieve kleuring onder de elektronenmicroscoop (schaalbalk: 100 nm). (E) Bevestiging van de overvloed aan Aβ42-peptiden in gezuiverde amyloïde fibrillen door immunogold elektronenmicroscopie met behulp van Aβ42 (6E10 en 4G8) antilichamen (schaalbalk: 50 nm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van amyloïde zuivering met behulp van immunoblot- en MS-analyse. (A) Dot blot en (B) Western blot-analyse van verschillende representatieve fracties verzameld tijdens het amyloïde zuiveringsproces met behulp van anti-fibril LOC en anti-Aβ42-antilichaam; BCA-testmetingen werden gebruikt voor normalisatie van de laadhoeveelheid van de eiwitten. c) het aantal eiwitten dat is teruggewonnen in de labelvrije massaspectrometrieanalyse van verrijkte en gezuiverde amyloïdefracties; micro BCA-test werd gebruikt voor het laden van 3 μg verteerde peptiden voor elke MS-analyse. BCA- en micro-BCA-testen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Genontologie analyse van eiwitten die overvloedig aanwezig zijn in gezuiverde amyloïde fracties. (A) Cellulaire componenten en (B) KEGG-routes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Buffers en oplossingen, massaspectrometrieparameters en ProLuCID-zoekparameters voor de identificatie van peptiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1- Een representatieve lijst van m/z-verhoudingen geïdentificeerd in MS-run voor amyloïde bètapeptiden van APP-klop in muismodellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwikkelen van een duidelijk begrip van de amyloïde structuur en samenstelling is een uitdaging voor structurele biologen en biochemici vanwege de biologische complexiteit en experimentele beperkingen bij het extraheren van gezuiverde fibrillen uit AD-hersenweefsels16,17. Amyloïde fibrillen zijn polymorf op moleculair niveau en vertonen een heterogene populatie van verschillende lengtes en complexiteiten18,19. Om hun biologische kenmerken en pathologische relevantie beter te begrijpen, is een uitputtende karakterisering van de samenstelling van polymorfe amyloïde fibrillen verkregen uit postmortem menselijke en AD-muis hersenweefsels vereist20,21. Een grote subset van eiwitten heeft een directe interactie met Aβ42, terwijl anderen de neiging kunnen hebben om grote fibrillaire structuren of eiwitcomplexen te vormen 22,23,24. Het is uitdagender om de rollen te bepalen die worden gespeeld door de eiwitten die interageren met Aβ42 in amyloïdevorming, stabilisatie en verlenging als het gaat om AD-pathologie. In de afgelopen jaren hebben verschillende proteomische studies de verschillen en overeenkomsten in de eiwitsamenstelling van verschillende supramoleculaire arrangementen, membraanloze organellen, inclusielichamen en eiwitaggregatenopgehelderd 25,26,27. In de vroege stadia van AD vouwen meerdere cellulaire eiwitten (bijv. Aβ42 en microtubule-geassocieerd tau-eiwit en apolipoproteïne E) verkeerd en co-aggregeren in meerdere hersengebieden28,29. Amyloidogene eiwitachtige formaties zijn een belangrijk pathologisch kenmerk van AD en dragen waarschijnlijk bij aan pathogenese3.
De zuivering van amyloïde fibrillen uit zieke menselijke hersenen is een vervelende en uitdagende taak en heeft meerdere beperkingen. Een groot nadeel van de bestaande methoden is de lage zuiverheid van geëxtraheerd materiaal, wat vaak hun gedetailleerde structurele analyse beperkt met behulp van beeldvormingsmethoden, zoals cryoEM. Evenzo vereisen NMR-studies een paar milligram gezuiverd materiaal, dat ook moet worden geëtiketteerd met zware isotopen (d.w.z. 15N)30. Post-mortem menselijke hersenen kunnen aan de eerste vereiste voldoen, omdat het uitgangsmateriaal kan worden verhoogd tot een paar gram menselijk weefsel; het labelen van menselijke hersenweefsels met zware isotopen is echter niet mogelijk. Aan de andere kant is het labelen van de AD-muismodellen met 15N isotopen mogelijk (hoewel kostbaar) en komt het nu steeds vaker voor31,32. Ons lab heeft pulse-chase labeling gebruikt om de synaptische eiwitvernieuwingsdynamiek tijdens ziekte en ouder wordende hersenen tebestuderen 14. We hebben ook zware isotoopetikettering voor hele dieren gebruikt om langlevende eiwitten te identificeren en hun fysiologische relevantie in uitgebreide biologische structuren te begrijpen33,34. Voor de muizenhersenen zijn echter grote hoeveelheden uitgangsmateriaal nodig om een werkbare hoeveelheid van de fibrilkernen te verkrijgen. Deze methode pakt deze problemen met succes aan door de opbrengst en zuiverheid van de geëxtraheerde amyloïde fibrillen te verbeteren door de bestaande biochemische isolatieprincipes te wijzigen. Daarom kan dit robuuste protocol voor amyloïde fibrillenextractie uit hersenweefsels gemakkelijk worden gebruikt voor cryoEM- en NMR-gebaseerde structurele studies.
Deze methode maakt gebruik van het bestaande op sucrosedichtheidsgradiënt gebaseerde subcellulaire fractioneringsparadigma en verwijdert niet-specifieke co-zuiverende eiwitten in opeenvolgende stappen. Na het verwijderen van celresten, myeline, DNA en cellulaire lipiden, worden de amyloïde-rijke SDS onoplosbare pellets geïsoleerd. De integratie van extra stappen van meerdere ultrasone gekoppelde SDS-wasbeurten helpt het aantal co-zuiverende cellulaire componenten, losjes gebonden eiwitten en kleinere SDS-oplosbare polymorfen van amyloïden te verminderen. De uiteindelijke pellet wordt opgelost in ultrapuur water en kan worden gebruikt voor vele toepassingen, waaronder zaaiexperimenten, biochemische of farmacologische studies en structurele analyse. De gezuiverde amyloïde fibrillen uit AD-hersenweefsels worden ook gebruikt om de proteomische samenstelling en structurele kenmerken van fibrilkernen te begrijpen met behulp van MS-gebaseerde proteomics. Deze analyse bevestigde de aanwezigheid van een subset van cellulaire eiwitten (weergegeven in figuur 4) in de kern van de fibrillen, wat kan wijzen op de mogelijke rollen van meer dan één eiwit in de vorming, verlenging en stabilisatie van amyloïde fibrillen gedurende een lange tijd. Sommige van de eiwitten die in deze analyse worden geïdentificeerd, staan bekend om hun associatie met meer dan één neurodegeneratieve aandoening, bijvoorbeeld Adam22, APP, ApoE, β-catenine neurofilamenteiwitten, 14-3-3-eiwitten en anderen.
Er zijn mogelijkheden dat sommige verontreinigende eiwitten kunnen verschijnen in proteomische analyse vanwege het feit dat, na homogenisatie, sommige ongerechtvaardigde interacties kunnen optreden tussen eiwitten als gevolg van de hoge hydrofobiciteit van amyloïde fibrillen. Sommige van deze eiwitten kleven aan de kernen en worden niet verwijderd, zelfs niet na meerdere rondes van ultrasoonapparaat en SDS-wasstappen. Dit is een beperking van deze amyloïde zuiveringsstrategie. Het kan echter worden aangepakt met behulp van geschikte negatieve controles en het uitvoeren van effectieve statistische cutoffs in grootschalige proteomische studies. Een andere beperking die we tegenkwamen, heeft betrekking op de onderschatting van de overvloed aan Aβ-peptiden na trypsinevertering. Dit is in deze workflow aangepakt door middel van een gerichte MS/MS-analysestrategie. GO-analyse voor KEGG-routes geeft de overvloed aan eiwitten aan die behoren tot pathways die betrokken zijn bij veel neurodegeneratieve ziekten, bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose (ALS) en Prion-ziekten. Deze eiwitten zijn belangrijke spelers in meerdere pathologische routes en hebben dus een bekende betrokkenheid bij het initiëren en progressie van ziekten. Interessant is dat sommige van deze eiwitten verdere analyse vereisen om hun mogelijke betrokkenheid bij de pathologie van AD en andere neurodegeneratieve ziekten te bepalen.
Toekomstige studies naar het zuivere amyloïde materiaal uit andere ziektemodellen kunnen een diepgaand inzicht geven in de structurele patronen en samenstelling van kernfibrillen en kunnen helpen bij het identificeren van belangrijke therapeutische doelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie R01AG061865 aan R.J.V. en J.N.S. De auteurs bedanken Vassar en Savas onderzoeksgroepsleden aan de Northwestern University voor hun doordachte discussies. We bedanken dr(en) ook oprecht. Ansgar Seimer en Ralf Langen van de University of South California voor hun cruciale inbreng. We bedanken Dr. Farida Korabova voor monstervoorbereiding en negatieve kleuring elektronenmicroscopie beeldvorming aan het Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C.
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
