Summary
Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.
Abstract
Le inclusioni fibrillari proteiche sono caratteristiche patologiche chiave di più malattie neurodegenerative. Nelle prime fasi della malattia di Alzheimer (AD), i peptidi amiloide-beta formano protofibrille nello spazio extracellulare, che agiscono come semi che gradualmente crescono e maturano in grandi placche amiloidi. Nonostante questa comprensione di base, l'attuale conoscenza della struttura, della composizione e dei modelli di deposizione delle fibrille amiloidi nel cervello è limitata. Uno dei principali ostacoli è stata l'incapacità di isolare fibrille amiloidi altamente purificate dagli estratti cerebrali. Gli approcci basati sulla purificazione dell'affinità e sulla microdissezione di cattura laser sono stati precedentemente utilizzati per isolare le amiloidi, ma sono limitati dalla piccola quantità di materiale che può essere recuperato. Questo nuovo e robusto protocollo descrive la purificazione biochimica dei nuclei della placca amiloide utilizzando la solubilizzazione del dodecil solfato di sodio (SDS) con ultracentrifugazione e ultrasuoni del gradiente di densità di saccarosio e produce fibrille altamente pure da pazienti CON AD e tessuti cerebrali modello AD. L'analisi proteomica bottom-up basata sulla spettrometria di massa (MS) del materiale purificato rappresenta una solida strategia per identificare quasi tutti i componenti proteici primari delle fibrille amiloidi. Precedenti studi proteomici sulle proteine nelle coronae amiloidi hanno rivelato una collezione di proteine inaspettatamente ampia e funzionalmente diversificata. In particolare, dopo aver perfezionato la strategia di purificazione, il numero di proteine co-purificanti è stato ridotto di oltre 10 volte, indicando l'elevata purezza del materiale insolubile SDS isolato. La colorazione negativa e la microscopia elettronica immuno-oro hanno permesso di confermare la purezza di questi preparati. Sono necessari ulteriori studi per comprendere gli attributi spaziali e biologici che contribuiscono alla deposizione di queste proteine in inclusioni amiloidi. Nel complesso, questa strategia analitica è ben posizionata per aumentare la comprensione della biologia amiloide.
Introduction
L'amiloide è una disposizione supramolecolare estremamente stabile che si trova in un gruppo diversificato di proteine, alcune delle quali portano a cambiamenti patologici1. L'accumulo di aggregati amiloidi intra- o extracellulari è osservato in diverse malattie neurodegenerative2. Gli aggregati amiloidi sono eterogenei e sono arricchiti con un gran numero di proteine e lipidi3. Negli ultimi anni, l'interesse per il proteoma amiloide ha generato un notevole interesse tra i neuroscienziati di base e traslazionali. Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre e purificare gli aggregati amiloidi dai tessuti cerebrali umani di topo e post-mortem. La microdissezione a cattura laser, l'immunoprecipitazione, la decellularizzazione e l'isolamento biochimico degli aggregati amiloidi sono metodi ampiamente utilizzati per estrarre e purificare placche amiloidi, fibrille e oligomeri 4,5,6,7. Molti di questi studi si sono concentrati sulla determinazione della composizione proteica di questi depositi fibrillari strettamente imballati utilizzando la SM semi-quantitativa. Tuttavia, i risultati disponibili sono incoerenti e il numero sorprendentemente elevato di proteine co-purificanti precedentemente riportate sono difficili da interpretare.
La limitazione principale della letteratura esistente che descrive il proteoma del nucleo amiloide nei cervelli modello murino AD e AD è che il materiale purificato contiene un numero ingestibile di proteine co-purificanti. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di superare questa limitazione e sviluppare una robusta purificazione biochimica per isolare i nuclei delle fibrille amiloidi. Questa strategia impiega un metodo biochimico basato sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità di densità del saccarosio precedentemente descritto per l'isolamento di frazioni amiloidi arricchite insolubili SDS da tessuti cerebrali umani e murini post-mortem AD 8,9. Questo metodo si basa sulla letteratura esistente, ma va oltre con l'ultrasonicazione e i lavaggi SDS per rimuovere la maggior parte delle proteine associate all'amiloide liberamente legate, portando all'isolamento di fibrille amiloidi altamente purificate (Figura 1). Le fibrille purificate da questo protocollo superano diverse sfide esistenti frequentemente incontrate negli studi strutturali delle fibrille amiloidi isolate dagli estratti cerebrali. La visualizzazione di queste fibrille con microscopia elettronica a trasmissione (TEM) conferma l'integrità e la purezza del materiale purificato (Figura 2). In questo studio, le fibrille isolate vengono solubilizzate e digerite in peptidi con tripsina e l'analisi della SM senza etichetta può facilmente rivelare l'identità delle proteine che formano il nucleo della fibrilla. In particolare, alcune di queste proteine hanno una tendenza intrinseca a formare assemblaggi supramolecolari in organelli non legati alla membrana. Inoltre, molte delle proteine identificate nell'analisi delle fibrille amiloide-beta (Aβ) sono anche associate ad altre malattie neurodegenerative, suggerendo che queste proteine possono svolgere un ruolo chiave in più proteinopatie.
È improbabile che questo metodo SDS / ultrasuoni alteri o interrompa la struttura dei nuclei delle fibrille. Il materiale purificato è adatto anche per una vasta gamma di approcci di analisi proteomica top-down e bottom-up e ulteriori strategie di analisi strutturale basate su MS, come la reticolazione chimica o lo scambio idrogeno-deuterio. Il recupero complessivo utilizzando questo metodo è relativamente elevato e, quindi, è adatto per studi strutturali dettagliati, che richiedono microgrammi a milligrammi del materiale purificato. Il materiale purificato è adatto anche per studi strutturali utilizzando crioEM e microscopia a forza atomica. Questo protocollo, in combinazione con l'etichettatura isotopica stabile dei mammiferi, può facilitare gli studi di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (NMR) della struttura amiloide10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo protocollo prevede l'uso di tessuti cerebrali umani o vertebrati. Tutta la ricerca è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali approvate della Northwestern University. L'attuale flusso di lavoro è standardizzato utilizzando APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) mouse cervello corticale e ippocampo cervello e la regione del cervello espopuleestratti 11. Questo protocollo è stato ottimizzato per gli estratti cerebrali di topi a 6-9 mesi di età e può purificare efficacemente gli amiloidi da animali maschi e femmine.
NOTA: per una migliore comprensione della procedura sperimentale complessiva, vedere la Figura 1 per uno schema del flusso di lavoro.
1. Raccolta dei tessuti e purificazione dell'amiloide
NOTA: Idealmente, le fibrille amiloidi dovrebbero essere isolate dalle regioni cerebrali appena sezionate. Tuttavia, questo metodo funziona bene anche con tessuti cerebrali congelati a scatto o flash. Di seguito è riportato un breve schema di tessuti cerebrali con congelamento a scatto per la conservazione per l'uso in un secondo momento.
- Raccolta e conservazione del tessuto cerebrale: seziona i cervelli dei topi e raccogli rapidamente le regioni cariche di amiloide (cioè corteccia e ippocampo), seguite dal congelamento a scatto in azoto liquido o da un bagno di alcol di ghiaccio secco.
NOTA: il congelamento a scatto aiuta a preservare gli attributi strutturali dei costituenti del tessuto. I topi sono eutanasizzati da isoflurano e lussazione cervicale12,13. Si consiglia di evitare l'uso di CO 2 poichéciò può compromettere l'integrità del proteoma cerebrale. - Post-dissezione, tagliare e conservare i tessuti freschi in piccoli blocchi (ad esempio, 5 mm x 5 mm), in quanto ciò facilita un'omogeneizzazione più efficiente prima dell'estrazione dell'amiloide. Trasferire il tessuto alla fiala criogenica sterile, stringere il cappuccio e immergere rapidamente.
- Mantenere i tessuti congelati in condizioni ultrafredde (cioè -80 °C o azoto liquido). Se l'estrazione deve essere eseguita pochi giorni dopo, conservare i tessuti a -20 °C ed evitare cicli di congelamento e scongelamento. Scongelare i tessuti congelati sul ghiaccio bagnato quando sono pronti per l'estrazione e la purificazione.
NOTA: Il contatto diretto dei tessuti con l'azoto liquido può causare danni ai tessuti e alle proteine. Si noti che un bagno alcolico può rimuovere i marcatori permanenti dalle etichette del tubo.
2. Arricchimento di materiale insolubile SDS
NOTA: Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e centrifugare a 4 °C, salvo diversa indicazione. I dettagli di tutti i buffer e le soluzioni utilizzate in questo protocollo sono forniti nel file supplementare 1. I produttori e i numeri di catalogo di sostanze chimiche e strumenti sono forniti nella Tabella dei materiali.
- Inizia con regioni del tessuto cerebrale appena sezionate o congelate a scatto (scongelate sul ghiaccio) poste in un tubo da 2 ml contenente 6-8 perline di ceramica e un tampone di omogeneizzazione ghiacciato appena preparato (1 mL per 0,25-1 g di massa di tessuto umido).
- Trasferire i tubi all'omogeneizzatore del mulino a perline e macinare il contenuto di tessuto a 4000 giri / min, con due cicli di 30 s ciascuno e un intervallo di 30 s in mezzo.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare sistemi di agitatori o omogeneizzatori motorizzati per macinare e omogeneizzare i tessuti. - Aggiungere 9 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato a freddo a 1 mL di omogeneizzato di tessuto intero cerebrale in tubi da 15 mL, sigillare con strisce di film di cera da laboratorio e ruotare end-to-end durante la notte a 4 °C per garantire una solubilizzazione robusta.
NOTA: Per rimuovere detriti cellulari e lipidi indesiderati di grandi dimensioni, la mattina successiva, ruotare i tubi a 800 x g a 4 °C per 10 minuti e raccogliere il surnatante in un tubo fresco. Risospesciare il pellet rimanente in 2 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciato, mescolare bene, girare di nuovo per 10 minuti a 4 °C e unire i due supernatanti. - Aggiungere lentamente saccarosio solido alla sospensione di estratto tissutale fino a una concentrazione finale di 1,2 M, mescolare bene e centrifugare a 250.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
- Rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta. Risospesso il pellet in 2 mL di tampone di omogeneizzazione contenente 1,9 M di saccarosio mediante triturazione, seguito da centrifugazione a 125.000 x g per 45 min a 4 °C.
NOTA: il volume del buffer può essere regolato in base alla quantità di materiale recuperato dal passaggio precedente. In generale, 10 volumi di buffer di omogeneizzazione (V/V) sono ideali per questo passaggio. - Raccogliere lo strato solido bianco superiore utilizzando una pipetta, trasferirlo in un tubo fresco e solubilizzare in 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato tubando su e giù più volte, senza introdurre bolle d'aria.
- Oltre allo strato superiore, il pellet è anche arricchito con fibrille amiloidi. Per una resa più elevata, combinare le due frazioni e procedere. Rimuovere con attenzione lo strato acquoso centrale usando una pipetta e scartare.
- Centrifugare le frazioni combinate a 8000 x g per 20 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di tampone di digestione ghiacciato al pellet lavato, risospeso e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 ore.
- Centrifugare a 8000 x g per 20 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Risospendare e lavare (come nella fase 2.8.) il pellet digerito due volte in 1 mL di tampone Tris ghiacciato.
- Risospesciare il pellet lavato in 1 mL di tampone di solubilizzazione contenente 1% di SDS e 1,3 M di saccarosio mediante pipettaggio su e giù. Centrifugare rapidamente a 200.000 x g per 60 minuti a 4 °C.
NOTA: Sebbene le fibrille amiloidi siano altamente resistenti ai detergenti e ai denaturanti, esposizioni molto lunghe al detergente (1% SDS) possono compromettere l'integrità delle fibrille o rimuovere le proteine strettamente legate, il che comprometterà le analisi successive. Pertanto, subito dopo aver risospeso il pellet, procedere alla centrifugazione. - Salvare il pellet e aumentare il volume del surnatante rimanente aggiungendo un tampone Tris da 50 mM (in rapporto 1:0,3) per ridurre la concentrazione di saccarosio da 1,3 a 1 M e centrifugare ancora una volta a 200.000 x g per 45 minuti a 4 °C.
- Sciogliere i due pellet in 100 μL di tampone Tris contenente 0,5% SDS e piscina per la purificazione dell'amiloide. I pellet visibili sono piccoli e dovrebbero apparire opachi e bianco sporco (vedere figura 2A).
3. Purificazione dell'amiloide
NOTA: Unire i due pellet, solubilizzare mediante pipettaggio fino ad ottenere una soluzione uniforme e procedere con le seguenti fasi di purificazione dell'amiloide.
- Per la completa solubilizzazione del materiale ricco di amiloidi presente nei pellet, sottoporre il tubo a cesoiatura meccanica prodotta da onde ultrasoniche in un dispositivo di sonicazione a bagno funzionante per 30 s ON e 30 s OFF ad una frequenza di medio raggio per 20 cicli.
- Centrifugare immediatamente il materiale a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C e risospescere il pellet in 500 μL di tampone SDS Tris allo 0,5%.
- Ripetere il passaggio 3.1. e Passo 3.2. quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Il numero di lavaggi può essere aumentato per migliorare la purezza.
NOTA: le fasi di sonicazione e lavaggio sono ottimizzate allo 0,5% di SDS poiché concentrazioni più elevate possono influire sulla struttura, l'integrità o la composizione proteica delle fibrille. Aumentare la concentrazione di SDS in questa fase non è raccomandato. - Dopo la fase finale di centrifugazione, lavare il pellet in 200 μL di acqua ultrapura e centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere l'eventuale detersivo rimanente. Il pellet lavato contenente fibrille amiloidi purificate appare di colore semitrasparente ed è difficile da vedere a volte.
- Sciogliere il pellet finale contenente fibrille amiloidi purificate in 100 μL di acqua ultrapura. Procedere immediatamente alla fase successiva per la lavorazione a valle o salvare la sospensione di fibrille a -20 °C per ulteriori analisi. Se congelato, scongelare sul ghiaccio prima di iniziare le precipitazioni.
4. Precipitazione del cloroformio di metanolo
NOTA: Se l'obiettivo finale è quello di eseguire l'analisi delle proteine, si consiglia di dissalare e rimuovere ulteriori impurità non proteiche.
- Aggiungere 400 μL di metanolo ai 100 μL purificati di fibrille amiloidi in un tubo da 1,5 ml e un pozzetto vortice.
- Aggiungere 100 μL di cloroformio al tubo e vortice bene.
- Aggiungere 300 μL di acqua ultrapura e vortice accuratamente. Questo rende la miscela torbida a causa della precipitazione proteica.
- Centrifuga a 12.000 x g per 2 min a RT.
- Rimuovere con attenzione lo strato acquoso (cioè in alto) senza disturbare lo strato di interfaccia contenente il fiocco proteico.
- Aggiungere nuovamente lo stesso volume di metanolo e centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti a RT.
- Scartare il surnatante usando una pipetta e asciugare all'aria il pellet a RT. Evitare l'essiccazione eccessiva; la frazione amiloide è difficile da ridistribuire se eccessivamente essiccata.
5. Digestione della tripsina
- Sciogliere il pellet in 50 μL di tampone di guanidina cloridrato (GuHCl). Sonicare in un bagno di acqua ghiacciata e riscaldare a 95 °C per 5 minuti, se necessario.
- Vortice completo a RT per 45 minuti a 1 ora per dissolverlo completamente. Il pellet non sarà visibile dopo questo passaggio e la soluzione appare chiara nell'aspetto.
- Aggiungere lo stesso volume di soluzione di tensioattivo allo 0,2%. Solubilizzare a RT con vortice per 60 min. Questo passaggio migliora l'attività enzimatica della tripsina.
- Aggiungere 1 μL di tris-2-carbossietilfosfina (TCEP) dalla soluzione madre da 500 mM. Incubare per 60 min.
- Aggiungere 2 μL di 500 mM di iodoacetammide (IAA) e incubare al buio per 20 min.
- Spegnere l'IAA con 5 μL di soluzione TCEP per 15 min.
- Aggiungere il volume richiesto di 50 mM di soluzione di bicarbonato di ammonio al tubo per ridurre la concentrazione di guanidina a 1,5 M.
- Aggiungere una soluzione di tensioattivo all'1% al tubo (1 μL/50 μg di proteine).
- Aggiungere tripsina (1 μg/100 μg di proteine) e lasciare la miscelazione in provetta a 37 °C durante la notte.
6. Pulizia dei peptidi
- La mattina successiva, acidificare la soluzione peptidica digerita abbassando il pH a 2,0 aggiungendo acido formico.
- Attivare la colonna di spin C18 (n-ottadecil) in un tubo ricevitore da 2 mL aggiungendo 200 μL di soluzione di metanolo al 50% e ruotare a 1500 x g per 2 minuti a RT. Ripetere la fase di attivazione.
- Equilibrare i letti in resina della colonna C18 aggiungendo 200 μL di tampone di equilibrio e ruotando per 2 minuti con le stesse condizioni. Ripetere questo passaggio.
- Caricare la soluzione peptidica acidificata sulla colonna C18 e centrifugare a 1500 x g per 2 minuti a RT. Raccogliere il flusso e ricaricarlo ancora una volta. Scartate il secondo flusso.
- Lavare i peptidi legati alla resina C18 con il tampone di lavaggio 2x, come fatto nel passaggio 6.3. Utilizzare lo stesso tampone di equilibrio per lavare la colonna.
- Eluire i peptidi aggiungendo 40 μL di tampone di eluizione seguito da centrifugazione a 1500 x g, per 2 minuti a RT. Ripetere la fase di eluizione tre volte per aumentare la resa dei peptidi recuperati.
- Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto a velocità facendo evaporare la soluzione acquosa. I pellet secchi possono essere salvati a -20 °C per alcune settimane prima dell'analisi MS.
7. Impostazione dello spettrometro di massa per l'analisi peptidica
NOTA: per i parametri MS, vedere il file supplementare 1 (adattato da una precedente pubblicazione del laboratorio)14.
- Prima di caricare i campioni peptidici per l'analisi MS, sciogliere i pellet peptidici secchi in 20 μL di tampone di carico del campione ed eseguire micro BCA per quantificare la concentrazione di peptidi recuperati.
- Trasferire i peptidi disciolti in una fiala di vetro e caricare 3 μg (quantificati da micro BCA) di peptidi nell'autocampionatore del sistema UPLC.
- Caricare i campioni su una colonna di trappola ventilata (colonna HPLC C18, 0,075 mm x 20 mm) con una portata di 250 nL/min.
- Disporre la colonna trappola in linea con una colonna analitica (0,075 μm x 500 mm) e assemblare una punta dell'emettitore alla sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) sottoposta a una tensione di spruzzo di 2000 V.
NOTA: In questo studio viene eseguito ESI, in cui la fase mobile è sottoposta a ionizzazione ad alta tensione nella fase gassosa. Lo spray creato da questo è diretto alla camera a vuoto della SM attraverso un capillare riscaldato. Mentre si è sotto vuoto, la de-solvatazione delle goccioline e l'espulsione degli ioni avviene in presenza di calore e tensione. Successivamente, gli ioni vengono accelerati verso l'analizzatore di massa in presenza di un ambiente ad alta tensione. - Analizza i campioni con 2 ore di acquisizione. Questo studio viene eseguito utilizzando l'acquisizione dipendente dai dati con il paradigma di selezione degli ioni precursori 20 più intenso.
NOTA: nell'acquisizione dipendente dai dati, un numero limitato di peptidi precursori viene rilevato nella scansione MS1 e sottoposto a frammentazione per l'analisi MS2. Tuttavia, l'esclusione dinamica è problematica qui poiché i peptidi Aβ altamente abbondanti saranno omessi per frammentazione e si tradurrà in una sottostima della loro quantità. - Per la quantificazione assoluta dei peptidi Aβ, eseguire gli stessi campioni ancora una volta utilizzando il metodo MS/MS mirato. Per questo studio, viene preparato un elenco esaustivo di tutti i rapporti m/z per vari possibili peptidi triptici Aβ per i modelli murini knock-in APP (vedere Tabella supplementare 1). Altri gruppi dovrebbero preparare un elenco simile in conformità con il modello murino disponibile e i possibili peptidi generati dalla proteina di interesse (ad esempio, Aβ per AD).
NOTA: Per affrontare l'esclusione di peptidi altamente abbondanti, utilizzare un approccio mirato fornendo un elenco di valori m/z selezionati corrispondenti ai peptidi trittici Aβ. Questo approccio affronta il problema dell'esclusione data-dipendente dei peptidi Aβ e può quantificare le quantità assolute di diversi monomeri (Aβ38, 40 e 42 peptidi) con alta risoluzione. - Lo spettrometro di massa genera spettri MS dei campioni peptidici e salva i file di dati grezzi nella directory di destinazione. Utilizzare questo file per eseguire la corrispondenza spettrale utilizzando strumenti statistici e bioinformatici consolidati. Sono disponibili più strumenti di ricerca e analisi di database online e offline.
8. Analisi dei dati MS
- Estrarre i file MS1 e MS2 utilizzando lo strumento Rawconverter offline (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Eseguire l'identificazione, la quantificazione e l'analisi dettagliata dei dati su un motore di ricerca di dati MS basato sul Web. In questo studio è stato utilizzato Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
NOTA: sono disponibili diversi altri strumenti di analisi dei dati MS online e offline, come MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Dopo aver caricato i file MS1 e MS2, selezionare un database del proteoma del mouse aggiornato. Qui, un database di topi aggiornato contenente ulteriori mutazioni specifiche knock-in dell'app viene selezionato per l'identificazione dei peptidi utilizzando gli algoritmi ProLuCId e SEQUEST11.
- Nel sistema di analisi IP2, selezionare i parametri predefiniti e modificarli in base alle esigenze sperimentali. In questo studio, viene utilizzata una tolleranza di massa peptidica di 50 ppm per il precursore e 600 ppm per i frammenti (fare riferimento al file supplementare 1 per altri parametri utilizzati in IP2).
NOTA: I ricercatori possono modificare i parametri di ricerca in base agli obiettivi sperimentali. Ad esempio, per identificare le modifiche post-traduzionali, aggiungere valori di modifica differenziale per vari PTM (ad esempio, ubiquitinazione, SUMOilazione, fosforilazione).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Qui, viene riassunto un metodo dettagliato per l'isolamento e la purificazione delle fibrille amiloidi utilizzando un metodo di purificazione ultracentrifugazione con gradiente di densità di saccarosio modificato (vedere Figura 1). L'innovazione in questo metodo è l'inclusione di fasi di lavaggio ad ultrasuoni utilizzando un sistema di sonicazione a bagnomaria seguito dalla solubilizzazione SDS, che rimuove molte proteine vagamente associate dalle fibrille amiloidi che co-purificano con le fibrille altamente dense e pulite. La fase di ultrasuoni genera un'elevata forza di taglio e agita le fibrille, allentando le forze idrofobiche e rilasciando le proteine solubili SDS liberamente associate nel tampone di lavaggio SDS. A loro volta, vengono recuperate piccole quantità di nuclei di fibrille amiloidi altamente pure. Come mostrato nella Figura 2A, un pellet visibile, che inizialmente appare opaco (probabilmente a causa di impurità), può essere visto dopo l'arricchimento; tuttavia, a seguito dell'ultrasonicazione e dei lavaggi multipli SDS, il pellet diventa semitrasparente ed è appena visibile. La colorazione rossa rappresentativa del Congo degli amiloidi purificati rispetto alla frazione solubile SDS documenta l'arricchimento delle fibrille amiloidi (Figura 2B). La colorazione rosso Congo può essere utilizzata per confermare il materiale amiloide in diverse frazioni e può essere visualizzata utilizzando un microscopio a campo luminoso. Come mostrato nella Figura 2C, la frazione solubile SDS non si macchia con il colorante rosso Congo.
La struttura delle fibrille purificate con analisi al microscopio elettronico a trasmissione di colorazione negativa ha confermato la presenza di fibrille amiloidi quasi pure (Figura 2D). Inoltre, l'etichettatura di immunogold utilizzando una combinazione di anticorpi Aβ42 (6E10 e 4G8) ha confermato la presenza di peptidi Aβ42 (Figura 2E). Per studiare la composizione e le caratteristiche strutturali del materiale purificato, abbiamo utilizzato tecniche immunoblot per peptidi Aβ e firme strutturali distintive (ad esempio, fibrille). L'analisi rappresentativa del dot blot delle frazioni raccolte durante l'isolamento dell'amiloide ha mostrato un'abbondanza relativa di peptidi e fibrille Aβ42 utilizzando anticorpi anti-Aβ42 e anti-fibrille (LOC) (Figura 3A). Allo stesso modo, la macchia occidentale delle frazioni rappresentative ha anche mostrato un arricchimento di fibrille contenenti Aβ42 in proteine ad alto peso molecolare intrappolate nei pozzetti del gel SDS PAGE (Figura 3B). Per comprendere la composizione di queste fibrille ad alto peso molecolare, le frazioni amiloidi purificate sono state sottoposte ad analisi proteomica basata sulla SM. Questi risultati semi-quantitativi hanno rivelato la presenza di circa 250 proteine, mentre la frazione raccolta prima dell'ultrasonicazione e dei lavaggi SDS conteneva più di 2500 proteine (Figura 3C). Ciò indica l'efficacia di questi due passaggi cruciali inclusi in questo protocollo di purificazione. Presi insieme, più risultati indipendenti indicano l'elevata abbondanza di classi proteiche simili nei nuclei delle fibrille.
L'analisi dei componenti cellulari di Gene Ontology (GO) per un set di dati rappresentativo della SM nella Figura 4 ha rivelato che un gran numero di proteine presenti nei nuclei delle fibrille sono associate a organelli non legati alla membrana e complessi supramolecolari. Questa osservazione è probabilmente dovuta alla tendenza intrinseca di molte proteine ad aggregarsi o co-aggregarsi con altre proteine in inclusioni proteiche che si trovano nelle immediate vicinanze. Le forze fisiche svolgono ruoli cruciali in queste interazioni. Gli altri organelli cellulari e componenti rappresentati principalmente da queste proteine sono mitocondri, citoscheletro, membrana cellulare e guaina mielinica. Molte di queste proteine interagiscono con peptidi Aβ, oligomeri o protofibrille in diversi stadi di formazione dell'amiloide. Potrebbero interagire vicino alla membrana plasmatica, dove vengono rilasciati i peptidi Aβ. L'interazione può anche avvenire mentre alcune di queste proteine vengono rilasciate direttamente o tramite trasporto vescicolare nello spazio extracellulare. La secrezione o esocitosi degli aggregati proteici è una delle tante strategie che le cellule usano per far fronte e ridurre il carico associato agli aggregati proteici15. Ciò lascia un'altra opportunità in cui alcune delle proteine intracellulari possono legarsi ai peptidi Aβ. Il protocollo fornisce un framework per un'ulteriore ottimizzazione a seconda degli obiettivi sperimentali. Ad esempio, la purezza e la resa, alterando il numero di ultrasuoni e lavaggi SDS, possono essere regolate di conseguenza.
Figura 1: Panoramica diagrammatica del flusso di lavoro per l'isolamento del nucleo di fibrille amiloidi da tessuti cerebrali umani o animali modello post-mortem ad AD. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Conferma dell'estrazione dell'amiloide mediante colorazione biochimica e imaging delle fibrille amiloidi. (A) Il pellet insolubile SDS contenente amiloide arricchito appare di colore bianco sporco opaco. B) colorazione rosso Congo di surnatante solubile SDS e pellet insolubile SDS contenente amiloide purificata blotted su membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm; Le letture BCA sono state utilizzate per la normalizzazione della quantità di carico delle proteine. Il test BCA è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore. (C) Immagini in campo luminoso di materiale solubile e amiloide SDS dopo colorazione rosso Congo (barra della scala: 100 μm). (D) Visualizzazione della frazione solubile SDS e delle fibrille amiloidi purificate utilizzando la colorazione negativa al microscopio elettronico (barra di scala: 100 nm). (E) Conferma dell'abbondanza di peptidi Aβ42 nelle fibrille amiloidi purificate mediante microscopia elettronica immunogold utilizzando anticorpi Aβ42 (6E10 e 4G8) (barra di scala: 50 nm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Validazione della purificazione dell'amiloide mediante immunoblot e analisi della SM. (A) Dot blot e (B) Western blot analisi di diverse frazioni rappresentative raccolte durante il processo di purificazione dell'amiloide utilizzando anti-fibrille LOC e anticorpo anti-Aβ42; Le letture del saggio BCA sono state utilizzate per la normalizzazione della quantità di carico delle proteine. (C) Numero di proteine recuperate nell'analisi di spettrometria di massa senza etichetta di frazioni amiloidi arricchite e purificate; Il test micro BCA è stato utilizzato per caricare 3 μg di peptidi digeriti per ogni analisi della SM. I test BCA e micro BCA sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi ontologica di proteine abbondanti in frazioni amiloidi purificate. (A) Componenti cellulari e (B) vie KEGG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File 1 supplementare: Tamponi e soluzioni, parametri di spettrometria di massa e parametri di ricerca ProLuCID per l'identificazione di peptidi. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1- Un elenco rappresentativo dei rapporti m/z identificati nella SM run per i peptidi beta amiloidi di APP knock in modelli murini. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sviluppare una chiara comprensione della struttura e della composizione dell'amiloide è difficile per i biologi strutturali e i biochimici a causa delle complessità biologiche e delle limitazioni sperimentali nell'estrazione di fibrille purificate dai tessuti cerebrali dell'AD16,17. Le fibrille amiloidi sono polimorfiche a livello molecolare, mostrando una popolazione eterogenea di varie lunghezze e complessità18,19. Per comprendere meglio le loro caratteristiche biologiche e la rilevanza patologica, è necessaria una caratterizzazione esaustiva della composizione delle fibrille amiloidi polimorfiche ottenute da tessuti cerebrali umani e di topo AD post-mortem20,21. Un ampio sottoinsieme di proteine interagisce direttamente con Aβ42, mentre altri possono avere la tendenza a formare grandi strutture fibrillari o complessi proteici 22,23,24. È più difficile determinare i ruoli svolti dalle proteine che interagiscono con Aβ42 nella formazione, stabilizzazione e allungamento dell'amiloide in relazione alla patologia dell'AD. Negli ultimi anni, diversi studi proteomici hanno chiarito le differenze e le somiglianze nella composizione proteica di varie disposizioni supramolecolari, organelli senza membrana, corpi di inclusione e aggregati proteici 25,26,27. Nelle prime fasi dell'AD, più proteine cellulari (ad esempio, Aβ42 e proteina tau associata a microtubuli e apolipoproteina E) si piegano e si co-aggregano in più regioni cerebrali28,29. Le formazioni proteiche amiloidogeniche sono una delle principali caratteristiche patologiche dell'AD e probabilmente contribuiscono alla patogenesi3.
La purificazione delle fibrille amiloidi dal cervello umano malato è un compito noioso e impegnativo e ha molteplici limitazioni. Uno dei principali svantaggi dei metodi esistenti è la bassa purezza del materiale estratto, che spesso limita la loro analisi strutturale dettagliata utilizzando metodi di imaging, come il crioEM. Allo stesso modo, gli studi NMR richiedono alcuni milligrammi di materiale purificato, che deve anche essere etichettato con isotopi pesanti (cioè 15N) 30. Il cervello umano post-mortem può soddisfare il primo requisito, in quanto il materiale di partenza può essere aumentato fino a pochi grammi di tessuti umani; tuttavia, non è possibile etichettare i tessuti cerebrali umani con isotopi pesanti. D'altra parte, etichettare i modelli di topi AD con 15N isotopi è possibile (anche se costoso) ed è ora sempre più comune31,32. Il nostro laboratorio ha utilizzato l'etichettatura pulse-chase per studiare le dinamiche di turnover delle proteine sinaptiche durante la malattia e l'invecchiamento del cervello14. Abbiamo anche usato l'etichettatura di isotopi pesanti di animali interi per identificare proteine longeve e comprendere la loro rilevanza fisiologica in strutture biologiche elaborate33,34. Tuttavia, per il cervello del topo, sono necessarie grandi quantità di materiale di partenza per ottenere una quantità praticabile dei nuclei delle fibrille. Questo metodo affronta con successo questi problemi migliorando la resa e la purezza delle fibrille amiloidi estratte modificando i principi di isolamento biochimico esistenti. Pertanto, questo robusto protocollo per l'estrazione di fibrille amiloidi dai tessuti cerebrali può essere prontamente utilizzato per studi strutturali basati su crioEM e NMR.
Questo metodo utilizza il paradigma di frazionamento subcellulare basato sul gradiente di densità del saccarosio esistente e rimuove le proteine co-purificanti non specifiche in fasi successive. Dopo la rimozione di detriti cellulari, mielina, DNA e lipidi cellulari, i pellet insolubili SDS ricchi di amiloidi vengono isolati. L'incorporazione di ulteriori fasi di lavaggi SDS accoppiati ad ultrasuoni multipli aiuta a ridurre il numero di componenti cellulari co-purificanti, proteine liberamente legate e polimorfi solubili SDS più piccoli di amiloidi. Il pellet finale viene solubilizzato in acqua ultrapura e può essere utilizzato per molte applicazioni, tra cui esperimenti di semina, studi biochimici o farmacologici e analisi strutturali. Le fibrille amiloidi purificate dai tessuti cerebrali dell'AD vengono anche utilizzate per comprendere la composizione proteomica e le caratteristiche strutturali dei nuclei di fibrille utilizzando la proteomica basata sulla SM. Questa analisi ha confermato la presenza di un sottoinsieme di proteine cellulari (rappresentate in Figura 4) nel nucleo delle fibrille, che possono indicare i possibili ruoli di più di una proteina nella formazione, allungamento e stabilizzazione delle fibrille amiloidi nel lungo corso del tempo. Alcune delle proteine identificate in questa analisi sono note per la loro associazione con più di una malattia neurodegenerativa, ad esempio Adam22, APP, ApoE, proteine neurofilamenti β-catenina, proteine 14-3-3 e altre.
Ci sono possibilità che alcune proteine contaminanti possano apparire in analisi proteomica a causa del fatto che, a seguito di omogeneizzazione, alcune interazioni ingiustificate possono verificarsi tra le proteine a causa dell'elevata idrofobicità delle fibrille amiloidi. Alcune di queste proteine si attaccano ai nuclei e non vengono rimosse anche dopo più cicli di sonicazione e fasi di lavaggio SDS. Questa è una limitazione di questa strategia di purificazione dell'amiloide. Tuttavia, potrebbe essere affrontato utilizzando adeguati controlli negativi ed eseguendo efficaci cutoff statistici in studi proteomici su larga scala. Un'altra limitazione che abbiamo riscontrato riguarda la sottostima dell'abbondanza di peptidi Aβ dopo la digestione della tripsina. Questo è stato affrontato in questo flusso di lavoro da una strategia mirata di analisi MS / MS. L'analisi GO per i percorsi KEGG indica l'abbondanza di proteine appartenenti a percorsi coinvolti in molte malattie neurodegenerative, ad esempio il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e le malattie da prioni. Queste proteine sono attori importanti in molteplici percorsi patologici e, quindi, hanno un coinvolgimento noto nell'inizio e nella progressione della malattia. È interessante notare che alcune di queste proteine richiedono ulteriori analisi per determinare il loro possibile coinvolgimento nella patologia dell'AD e di altre malattie neurodegenerative.
Studi futuri sul materiale amiloide puro da altri modelli di malattia possono fornire una comprensione approfondita dei modelli strutturali e della composizione delle fibrille del nucleo e possono aiutare a identificare i principali bersagli terapeutici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Gli autori ringraziano i membri del gruppo di ricerca Vassar e Savas della Northwestern University per le loro discussioni ponderate. Ringraziamo sinceramente anche i dottori. Ansgar Seimer e Ralf Langen della University of South California per il loro contributo cruciale. Ringraziamo la dott.ssa Farida Korabova per la preparazione del campione e l'imaging al microscopio elettronico con colorazione negativa presso il Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C.
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
