Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ex Vivo Organoidmodell av adenovirus-kreiterade genraderingar i musurotelceller

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63855
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

Detta protokoll beskriver processen för generering och karakterisering av musuroteliala organoider som hyser deletioner i gener av intresse. Metoderna inkluderar skörd av musurotelceller, ex vivo-transduktion med adenovirus som driver Cre-uttryck med en CMV-promotor och in vitro såväl som in vivo-karakterisering .

Abstract

Blåscancer är ett understuderat område, särskilt i genetiskt modifierade musmodeller (GEMM). Inavlade GEMM med vävnadsspecifika Cre- och loxP-platser har varit guldstandarden för villkorlig eller inducerbar geninriktning. För att ge snabbare och effektivare experimentella modeller utvecklas ett ex vivo organoidodlingssystem med adenovirus Cre och normala urotelceller som bär flera loxP-alleler av tumörsuppressorerna Trp53, Pten och Rb1. Normala urotelceller avlägsnas enzymatiskt från fyra blåsor av trippel floxerade möss (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). De uroteliala cellerna transduceras ex vivo med adenovirus-Cre som drivs av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transducerade blåsorganoiderna odlas, förökas och karakteriseras in vitro och in vivo. PCR används för att bekräfta genraderingar i Trp53, Pten och Rb1. Immunofluorescens (IF) färgning av organoider visar positivt uttryck av uroteliala härstamningsmarkörer (CK5 och p63). Organoiderna injiceras subkutant i värdmöss för tumörutvidgning och seriella passager. Immunohistokemin (IHC) hos xenografter uppvisar positivt uttryck av CK7, CK5 och p63 och negativt uttryck av CK8 och Uroplakin 3. Sammanfattningsvis är adenovirusmedierad genradering från musurotelceller konstruerade med loxP-platser en effektiv metod för att snabbt testa den tumörogena potentialen hos definierade genetiska förändringar.

Introduction

Blåscancer är den fjärde vanligaste cancerformen hos män och drabbar mer än 80 000 personer årligen i USA1. Platinabaserad kemoterapi har varit vårdstandarden för patienter med avancerad blåscancer i mer än tre decennier. Landskapet för behandling av blåscancer har revolutionerats av det senaste Godkännandet av Food and Drug Administration (FDA) av immunterapi (anti-PD-1 och anti-PD-L1 immunkontrollpunktshämmare), erdafitinib (en fibroblasttillväxtfaktorreceptorhämmare) och enfortumab vedotin (ett antikropps-läkemedelskonjugat)2,3,4. Det finns dock inga kliniskt godkända biomarkörer tillgängliga för att förutsäga svaren på kemoterapi eller immunterapi. Det finns ett kritiskt behov av att generera informativa prekliniska modeller som kan förbättra förståelsen för de mekanismer som driver utvecklingen av urinblåsecancer och utveckla prediktiva biomarkörer för olika behandlingsmetoder.

Ett stort hinder i blåstranslationsforskning är bristen på prekliniska modeller som rekapitulerar human blåscancerpatogenes och behandlingssvar 5,6. Flera prekliniska modeller har utvecklats, inklusive in vitro 2D-modeller (cellinjer eller villkorligt omprogrammerade celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) och in vivo-modeller (xenograft, cancerframkallande, genetiskt modifierade modeller och patient-härledd xenograft)2,6. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) är användbara för många tillämpningar inom blåscancerbiologi, inklusive analyser av tumörfenotyper, mekanistiska undersökningar av kandidatgener och / eller signalvägar och preklinisk utvärdering av terapeutiska svar 6,7. GEMM kan använda platsspecifika rekombinaser (Cre-loxP) för att kontrollera genetiska deletioner i en eller flera tumörsuppressorgener. Processen att generera önskade GEMM med flera genraderingar är tidskrävande, mödosam och dyr5. Det övergripande målet med denna metod är att utveckla en snabb och effektiv metod för ex vivo Cre-leverans för att etablera TKO-modeller (bladder triple knockout) från normala mus-urotelceller som bär trippel floxerade alleler (Trp53, Pten och Rb1)8. Den stora fördelen med ex vivo-metoden är det snabba arbetsflödet (1-2 veckor istället för år av musavel). Denna artikel beskriver protokollet för skörd av normala urotelceller med floxerade alleler, ex vivo adenovirustransduktion, organoidkulturer och in vitro- och in vivo-karakterisering hos immunkompetenta C57 BL / 6J-möss. Denna metod kan vidare användas för att generera kliniskt relevanta organoider av blåscancer hos immunkompetenta möss som hyser någon kombination av floxerade alleler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 and 180502).
OBS: Utför steg 1-3 samma dag.

1. Dissektion av musblåsan

  1. Förberedelse för dissektion
    1. Förbered alla sterila instrument inklusive sax, pincett, steril DPBS i 35 mm odlingsfat, 70% etanol, steril gasväv och rena pappershanddukar. Rengör alla ytor på dissektionsområdet. Generera manliga trippel floxerade möss Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f (4 möss, 10 veckor gamla), som tidigare beskrivits i Dr. Goodrichs laboratorium 8.
  2. Dödshjälp och snitt
    1. Avliva mössen genom CO 2-kvävning med en flödeshastighet på 2,0 l / min, följt av cervikal dislokation. Rengör dissektionsområdet med 70% etanol och täck med en ren pappershandduk.
    2. Placera musen på gasväv i dissektionsområdet. Spraya 70% etanol på musens buk och använd steril dissektionssax för att göra ett nedre mittlinje buksnitt som exponerar urinblåsan.
  3. Dissekera blåsan
    1. Använd pincett för att ta tag i urinblåsan och dra försiktigt upp så att bilaterala ureterovesiska korsningar identifieras. Använd sax för att ta bort blåsans fundus efter gränslinjen mellan de två urinledaröppningarna.
    2. Överför blåsan till en steril skål med 2 ml DPBS. Ta bort fett- och bindväv och sätt blåsan i en ny skål med steril 2 ml DPBS. Ta nu ut adenoviruset från -80 °C förvaring och förvara det på is.

2. Dissociation av urotelceller

  1. Förberedelse för celldissociation
    1. Förbered alla sterila instrument, inklusive pincett, kirurgiska skalpeller (ett blad i storlek 10 med handtag), steril DPBS i 35 mm odlingsrätter, komplett odlingsmedium utan kolavskalad FBS definierad som CCM (-), kollagenas / hyaluronidasblandning, rekombinant enzym för trypsinsubstitut, 10% kolavskalad FBS i DPBS med 10 μM färsk Y-27632, en 100 μm steril cellsil och ett 15 ml centrifugrör.
      OBS: Det kompletta odlingsmediet (CCM) består av bröstepitelcellstillväxtmedium kompletterat med de tillhandahållna tillväxtfaktorerna och 5% kolavskalad FBS, 1% L-glutaminsubstitut, 100 μg / ml primocin och 10 μM färskt Y-27632.
  2. Mincing och smältning av urinblåsan
    1. Överför och tvätta blåsan igen med 2 ml steril DPBS i en 35 mm skål i ett biosäkerhetsskåp.
    2. Samla blåsvävnader från fyra möss i en skål med 1 ml CCM (-) och hacka varje blåsa i fyra lika stora bitar med hjälp av ett kirurgiskt blad. Använd pincett för att fälla ut blåsan för att utsätta urotelytan för mediet.
    3. Överför blåsbitarna och mediet till ett 15 ml centrifugrör. Tvätta skålen med 2 ml CCM (-) 2x och samla den i ett centrifugrör till en total volym på 5 ml.
    4. Tillsätt kollagenas/hyaluronidasblandningen till en slutlig koncentration på 300 U/ml kollagenas och 100 U/ml hyaluronidas och placera röret horisontellt i en 37 °C orbitalinkuberande skakapparat i 30 minuter vid 200 rpm.
    5. Efter vävnadssmältning, tillsätt en lika stor volym (5 ml) 10% kolavskalad FBS i DPBS i röret och centrifugera röret vid 200 x g i 5 min.
    6. Ta bort och kassera supernatanten. Tillsätt 2 ml trypsinsubstitut i cellpelleten och blanda väl. Sätt röret i en cellinkubator vid 37 °C och 5 %CO2 i 4 min.
    7. Efter inkubation, pipettera upp och ner 10x med en standard P1000-spets. Tillsätt 5 ml 10% kolavskalad FBS i DPBS.
    8. Sila de disassocierade cellerna genom en 100 μm steril cellsil. Samla upp cellsuspensionen och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
  3. Räkna och återanvända celler
    1. Ta bort och kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten med 1 ml CCM.
    2. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer och platta endast 0,5 x 106 celler i en brunn på en 24-brunnsplatta med 0,5 ml färsk CCM. Ta nu ut matrisextrakten från Engelbreth-Holm-Swarm mussarkomceller (se materialtabell) från -20 °C lagring och tina på is. Förvärm en 6-brunnsplatta i en 37 °C cellinkubator.
      OBS: De återstående cellerna kan centrifugeras och frysas som cellpellets för icke-virustransduktionskontroll.

3. Adenoviral transduktion och pläteringsorganoider

VARNING: Var försiktig när du bearbetar adenovirus. Laboratoriepersonal bör följa biosäkerhetsnivå 2 och desinficera adenovirus med 10% blekmedel.

  1. Tillsätt 2 μL adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) i 24-brunnsplattan. Blanda väl med de disassocierade urotelcellerna.
  2. För att förbättra transduktionseffekten, utför spinokulering genom att centrifugera 24-brunnsplattan vid 300 x g i 30 minuter vid rumstemperatur. Placera 24-brunnsplattan i en cellinkubator vid 37 °C och 5 %CO2 i 1 timme.
  3. Överför celler och medium från brunnen till ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter. Ta bort och kassera supernatanten, tillsätt 50 μL CCM och blanda väl med cellerna längst ner.
  4. Tillsätt 140 μL matrisextrakt och blanda försiktigt väl för att undvika luftbubblor. Tillsätt lösningen snabbt i den förvärmda 6-brunnsplattan vid 50 μl / kupol för att skapa kupoler för organoider.
  5. Överför plattan försiktigt till en 37 °C inkubator med 5 % CO2 och låt kupolerna stelna i 5 minuter. Vänd 6-brunnsplattan upp och ner och fortsätt stelningen i ytterligare 25 minuter.
  6. Efter inkubation tillsätt 2,5 ml CCM till varje brunn och placera plattan i en inkubator för organoidkultur.

4. Organoidodling och passaging

  1. Byt medium var 3-4: e dag. Utför organoidodling, passering och frysning som rapporterats i Lee et al.9. Utför inbäddning av organoider med hjälp av provbehandlingsgel som beskrivs i Fujii et al.10.
  2. Ta bort mediet och tillsätt 1 ml dispas till varje brunn. Bryt försiktigt kupolen och blanda väl med en P1000-pipettspets.
  3. Placera plattan i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i 30 min. Samla sedan alla celler i ett 15 ml centrifugrör och tvätta brunnen med 4 ml 10% kolavskalad FBS i DPBS. Om organoidcellerna visas som stora kluster, utför steg 2.2.6. och steg 2.2.7. för att få bortkopplade celler.
  4. Centrifugera röret vid 200 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och tvätta cellerna med 1 ml CCM.
  5. Resuspend cellerna i 70% matris extrakt och följ steg 3.4.-3.6. för odling. Alternativt kan kryokonservera cellerna genom att återsuspera i 90% kolavskalad FBS och 10% DMSO kompletterad med 10 μM färsk Y-27632.

5. Organoidceller implantation i C57BL / 6J mus subkutant

  1. Förberedelse för implantation
    1. Förbered 25G 1,5 i nålar, en 1 ml spruta, 1 mg / ml dispas, matrisextrakt, 10% kolavskalad FBS i DPBS med 10 μM färsk Y-27632 och ett 15 ml centrifugrör.
  2. Organoid cell samling
    1. Efter att ha uppnått en stabil kultur i minst 5 passager, samla de expanderade organoidcellerna för in vivo-injektion . Följ steg 4.2.-4.4. och återsuspendera celler i 1 ml CCM.
  3. Räkna celler och subkutan injektion
    1. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer. Efter centrifugering vid 200 x g i 5 min, återsuspendera 2 x 106 celler i 100 μL 50% matrisextrakt i DPBS. Placera suspensionen på is och ta den i ett biosäkerhetsskåp i ett djurprocedurrum.
    2. Bedöva två manliga C57BL/6J möss (10 veckor gamla) med 4% isofluran och 1 L/min O2 flöde i ca 4 min i en kammare. När mössen har tappat sin rätningsreflex och deras andningsmönster har blivit djupare och långsammare, överför mössen till en icke-rebreathing krets med 2% isofluran och 1 L / min O2 flöde. Applicera veterinärsalva för att skydda djurens ögon från traumatisk skada.
    3. Raka ett område runt injektionsstället vid musens högra flank och använd 70% etanol för att rengöra, och använd sedan en 25 G nål för att direkt injicera 100 μL cellsuspension i höger flank under anestesi.
    4. Efter injektion, ta bort inhalationsanestesi och placera mössen i en bur under en värmelampa tills de återhämtat sig och mobiliserats helt. Returnera mössen för bostäder och övervaka tumörbildning.

6. Tumöruppsamling och in vivo-förökning

  1. Följ förberedelsen Steg 2.1.1. Avliva möss genom CO 2-kvävning med en flödeshastighet på 2,0 L / min följt av cervikal dislokation efter att en tumör med ~ 2,0 cm diameter (nästan 2-3 veckor) har bildats. Överför mössen till ett rent dissektionsområde, spraya 70% etanol på musflanketumörområdet och använd steril dissektionssax och pincett för att göra ett snitt för att separera tumören.
  2. Tvätta tumören i en 60 mm skål med 5 ml DPBS och använd sax för att ta bort bindväven. Skär en bit av den färska tumören och sänk den med 4% paraformaldehyd i DPBS i 48 timmar och skicka för paraffininbäddning och sektionering för histologianalys.
  3. Bearbeta den andra halvan av den färska tumören för celldisassociation. Hacka kortfattat den färska tumören i 1 mm3 bitar för dissociation i en 60 mm skål med 5 ml CCM (-). Sedan, efter att ha följt steg 2.2.4.-2.2.8., injicera de disassocierade cellerna i nya C57BL / 6J-möss för in vivo-passaging enligt steg 5.3. eller behåll som in vitro-organoidkultur enligt steg 3.4.-3.6. eller frys direkt i flytande kväve med 90% kolavskalad FBS och 10% DMSO med 10 μM färsk Y-27632.
  4. Om det behövs, återvinn de frusna cellerna genom att tina dem snabbt i ett 37 °C vattenbad och tvätta med CCM(-). Därefter återsuspendera dem i 100 μL 50% matrisextrakt i DPBS för direkt injektion i möss för in vivo tumörbildning. Använd minst 2 x 106 tinade celler för en in vivo-injektion .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbetsflödet för adenovirus-Kre-medierade genraderingar i musurotelceller visas i figur 1A. Den medföljande videon visar hur de uroteliala cellerna avlägsnas från urinblåsans fundus och hur de tredubbla floxerade cellerna transduceras ex vivo med Ad5CMVCre. Figur 1A visade att minimal submukosa och muskelceller avlägsnades efter enzymsmältning. För att bekräfta effektiviteten av adenovirus-Cre-leverans transducerades disassocierade urotelceller från trippel floxerade möss med membranriktad tdTomato / membranlokaliserat förbättrat grönt fluorescerande protein (mT / mG) med adenovirus Cre. Grönt fluorescerande protein (GFP) detekterades i nästan 100% av cellerna, vilket indikerar hög effektivitet av adenovirustransduktion (figur 1B).

De stabila TKO-organoiderna etablerades enligt standardorganoidprotokoll (in vitro med mer än 5 passager; Figur 2A). H&E och immunofluorescens (IF) av in vitro-organoidsektioner (figur 2A) visade en morfologi av högkvalitativt urotelcancer med positivt uttryck av uroteliala härstamningsmarkörer CK5 och p6311. PCR-analys avslöjade rekombinerade alleler i TKO-organoiderna, medan orekombinerade floxerade alleler endast detekterades i urotelceller obehandlade med adenovirus (figur 2B). Totalt 2 x 106 primära ex vivo-organoider injicerades i C57BL/6J för initial subkutan (SQ) tumörbildning på 8 veckor. Därefter samlades SQ-tumör (passage 1) och passerades hos möss. I allmänhet behövdes 2-3 veckor för att bilda en 2 cm SQ-tumör (passager 2-5) (Figur 2C). Immunohistokemin (IHC) av TKO in vivo xenograft visade positivt uttryck av CK7 (patchy), CK5 och p63 och negativt uttryck av CK8 och Uroplakin 3 (Figur 2D). För att upptäcka kontaminering av mesenkymceller färgades TKO-tumörerna för vimentin. H&E-fläcken visade tumören till vänster och kapseln till höger avgränsad av den gula linjen. Positivt vimentin detekterades endast i tumörkapseln eller stroma (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: Adenovirus-Cre-medierade genraderingar i musurotelceller med loxP-platser . (A) Arbetsflödet för TKO-organoidgenerering via ex vivo adenovirus Ad5CMVCre. En kort tid 30 min enzymuppslutning var tillräcklig för att skilja uroteliala celler från den underliggande submucosa och muscularis propria. De disassocierade urotelialcellerna transducerades med Ad5CMVCre för TKO-organoider och injicerades därefter i C57BL / 6J-möss. (B) Trippel floxerade urotelceller med mT / mG (konstitutivt transgenuttryck av rött fluorescerande protein som omvandlas till grönt fluorescerande protein efter Cre-rekombination) transducerades med Ad5CMVCre. Nästan 100% av cellerna var GFP-positiva, vilket indikerar mycket effektiv transduktion och Cre-rekombination. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av TKO-organoider via ex vivo adenovirus-Cre-rekombinas. (A) De disassocierade Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / uroteliala celler transducerades med adenovirus (Ad5CMVCre) för att generera TKO-organoider (ljust fält). TKO-organoiderna var inbäddade med provbearbetningsgel och färgades för H&E och immunofluorescens. (B) Genomiskt DNA extraherades från trippel floxerade urotelceller (lane 2) och TKO-organoider (lane 4) och förstärktes med PCR för att detektera floxerade alleler eller Cre-rekombinerade alleler av Trp53, Rb1 och Pten. PCR-band färgades med etidiumbromid. Körfält 1 och bana 3 var negativa och positiva rekombinerade kontroller. (C) En grov TKO SQ-tumör (passage 4) visades dag 17 efter SQ-injektion. (D) Tumörvävnadssektioner från TKO SQ-xenografterna färgades med H&E, IF (CK5, CK8) eller IHC (CK7, p63, Upk3). Förkortningar: CK5 = Cytokeratin 5; CK20 = Cytokeratin 20; CK8 = Cytokeratin 8; CK7 = Cytokeratin 7; Upk3 = Uroplakin III. (E) Tumörvävnadssektioner från TKO SQ-xenografterna färgades med H&E och IF (vimentin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GEMM har varit guldstandarderna för cancermodellering initierad från normala celler, vilket gör att konsekvenserna av potentiella onkogena störningar (onkogen aktivering och / eller förlust av tumörsuppressorer) kan testas noggrant. Här tillhandahålls ett snabbt och effektivt protokoll för att generera organoider av blåscancer via ex vivo-genredigering av normala musuroteliala celler som bär floxerade alleler i gener av intresse. H&E- och IHC-färgning visar att TKO-organoider uppvisar histologi som överensstämmer med högkvalitativt urotelialt urotelium, med skivepiteldifferentiering och en basalliknande subtyp både som in vitro-organoider och som in vivo xenografter. TKO-organoiderna kan användas in vitro för att studera effekterna av Trp53-, Rb1 - och Pten-förlust , läkemedelsscreening och molekylär bedömning av signalvägar. Snabb tumörbildning hos C57BL / 6J-möss kommer att möjliggöra in vivo-studier utformade för att utvärdera behandlingssvar på systemiska terapier som kemoterapi eller immunterapi.

Urotelium består av ett lager basalceller (positivt för CK5 och p63), 1-2 lager av mellanliggande celler (Uroplakins och p63 positiva) och paraplyceller (Uroplakins, CK8 och CK20 positiva)6. Ett kritiskt steg i metoden är den begränsade tiden (30 min) av vävnadsdisassociation istället för en långvarig (4 timmar) enzymsmältning, vilket möjliggör minimal kontaminering av icke-uroteliala submucosaceller (Figur 1A). En längre disassociationstid kan öka andelen stromaceller, såsom endotelceller och fibroblastceller. Ex vivo-transduktionssteget av adenovirus är mycket effektivt. Efter ex vivo adenovirus Cre transduktion visualiserades GFP i nästan 100% av urotelceller med mT / mG-reporteralleler (figur 1B).

Det finns begränsningar för ex vivo-metoden. För det första är de disassocierade cellerna inte förvalda före adenovirustransduktion. Till exempel är celler inte differentierade för urotelceller jämfört med icke-urotelceller eller luminala celler jämfört med basala celler. Cellsortering med EpCAM och/eller CD49f kan användas för att sortera rena epitelceller och/eller stamceller före ex vivo-transduktion 12,13. För det andra riktar sig adenoviruset som driver Cre-uttryck med CMV-promotor som används i detta protokoll mot ett brett spektrum av celltyper efter vävnadsdisassociation (urotelial vs. icke-urotelial, basal vs. luminala celler). Denna ospecifika inriktning kan leda till en selektionsbias som orsakar överväxt av celler med den mest onkogena potentialen. Celltypspecifika adenovirusvektorer har använts topiskt i både lungcancer och blåscancer GEMMs 14,15,16,17. Framtida studier med ex vivo-celltypspecifikt adenovirus (adenovirus med en CK8-promotor eller en CK5-promotor) kan ta itu med frågor om ursprungsceller om TKO-organoiderna härrör från basala eller luminala celler18. CK20- eller Upk2-promotorspecifikt adenovirus (inte tillgängligt för vår kunskap) kan också utformas för att transducera paraplyceller i urotelet. Framtida studier behövs dock för att undersöka effektiviteten och specificiteten hos dessa promotorspecifika adenovirus för ex vivo urinvägsinfektion. Det kan finnas en skillnad i adenovirus-Cre-effektivitet mellan in vivo- och ex vivo-transduktion på grund av värdmiljön18. För det tredje begränsas ex vivo-metoden av bristen på tumörmiljö, vilket kan påverka in vivo-tumörigenesen och histomorfologin. Trots dessa begränsningar är en stor fördel med ex vivo-metoden det snabba arbetsflödet (1-2 veckor istället för år av musuppfödning). Den andra fördelen med ex vivo-metoden är att adenovirus-Cre (Ad5CMVCre) är kommersiellt tillgängligt, enkelt och nästan 100% effektivt för viral transduktion och Cre-rekombination (figur 1B). Däremot kräver alternativa ex vivo-metoder som använder CRISPR-redigering eller lentiviral transduktion ytterligare klonval på grund av mindre effektiv genomisk redigering 5,13,19,20.

Sammanfattningsvis är den beskrivna ex vivo adenovirusmetoden bekväm, snabb och effektiv för att generera blåscancermodeller som använder valfri kombination av gener av intresse (floxerade alleler) relaterade till human blåscancer. Dessa modeller kan kombineras med celltypspecifikt adenovirus och cellsortering för att hantera ursprungscellens inverkan på blåscancerfenotyp och för att utvärdera behandlingssvar på immunterapier i en miljö av definierade genetiska mutationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta forskningsarbete stöddes delvis av NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 och R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation och Friends of Urology Foundation. Vi tackar Marisa Blask och Mila Pakhomova för korrekturläsningen av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μm sterile cell strainer Corning 431752
1 mL syringe BD 309659
25G 1.5 inches needle EXELINT International 26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) UI Viral Vector Core VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J Jackson Lab 000664
Charcoal-stripped FBS Gibco A3382101
Collagenase/hyaluronidase Stemcell Technologies 07912
Dispase Stemcell Technologies 07913
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX) Gibco 35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium Lonza CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) Corning CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20 DAKO M7019 IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7 Santa Cruz Biotechnology SC-23876 IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63 Abcam ab735 IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3 Fitzgerald 10R-U103A IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin Santa Cruz Biotechnology SC-6260 IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-s IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator Thermo Fisher 51033557
Polyclonal chicken anti-CK5 Biolegend 905901 IF 1:500
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher 12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 VWR 35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel) Thermo Fisher HG-4000-012
Surgical blade size 10 Integra Miltex 4-110
Sorvall Legend RT Thermo Fisher 75004377
Sorvall T1 centrifuge Thermo Fisher 75002383
Y-27632 Selleckchem S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  3. DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
  4. Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
  5. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  6. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  7. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  8. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  9. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  10. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
  11. Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
  12. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
  13. Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
  14. Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
  15. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  16. Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
  17. Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
  18. Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
  19. Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
  20. Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).

Tags

Cancerforskning nummer 183
<em>Ex Vivo</em> Organoidmodell av adenovirus-kreiterade genraderingar i musurotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K.,… More

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W., Li, Q. Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63855, doi:10.3791/63855 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter