Summary
هنا يتم وصف البروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات المناسبة لتحليل السائل EM و cryo-EM على المستوى النانوي باستخدام المجهر الإلكتروني المرسل.
Abstract
ارتفع الاهتمام بالمجهر الإلكتروني السائل (Liquid-EM) في السنوات الأخيرة حيث يمكن للعلماء الآن مراقبة العمليات في الوقت الفعلي على المستوى النانوي. من المرغوب فيه للغاية إقران معلومات cryo-EM عالية الدقة بالملاحظات الديناميكية حيث تحدث العديد من الأحداث في نطاقات زمنية سريعة - في نطاق ميلي ثانية أو أسرع. يمكن أن تساعد المعرفة المحسنة بالهياكل المرنة أيضا في تصميم كواشف جديدة لمكافحة مسببات الأمراض الناشئة ، مثل SARS-CoV-2. والأهم من ذلك ، أن مشاهدة المواد البيولوجية في بيئة سائلة توفر لمحة فريدة عن أدائها في جسم الإنسان. تظهر هنا طرق مطورة حديثا للتحقيق في الخصائص النانوية لتجمعات الفيروسات في الجليد السائل والزجاجي. لتحقيق هذا الهدف ، تم استخدام عينات محددة جيدا كأنظمة نموذجية. يتم تقديم مقارنات جنبا إلى جنب لطرق تحضير العينات والمعلومات الهيكلية التمثيلية. يتم عرض ميزات النانومتر الفرعي للهياكل التي تم حلها في نطاق ~ 3.5-Å-10 Å. تشمل النتائج الحديثة الأخرى التي تدعم هذا الإطار التكميلي رؤى ديناميكية للقاحات المرشحة والعلاجات القائمة على الأجسام المضادة المصورة في سائل. بشكل عام ، تعمل هذه التطبيقات المترابطة على تعزيز قدرتنا على تصور الديناميات الجزيئية ، مما يوفر سياقا فريدا لاستخدامها في صحة الإنسان والمرض.
Introduction
تعمل البحوث الطبية الحيوية على تحسين فهمنا لصحة الإنسان والمرض من خلال تطوير تقنيات جديدة. يعمل التصوير عالي الدقة على تغيير نظرتنا إلى عالم النانو - مما يسمح لنا بدراسة الخلايا والجزيئات بتفاصيل رائعة1،2،3،4،5. تكشف المعلومات الثابتة للمكونات الديناميكية مثل البوليمرات اللينة أو مجموعات البروتين أو الفيروسات البشرية عن لقطة محدودة فقط من سردها المعقد. لفهم كيفية عمل الكيانات الجزيئية بشكل أفضل ، يجب التحقيق في هيكلها ووظيفتها بشكل مشترك.
توفر التطورات الحديثة في إنتاج مواد مثل الجرافين الرقيق ذريا أو الرقائق الدقيقة القائمة على السيليكون فرصا جديدة لتحليل وظيفة البنية في الوقت الفعلي باستخدام المجاهر الإلكترونية المرسلة (TEMs). يمكن لهذه المواد إنشاء غرف محكمة الغلق للتصوير EM المباشر6،7،8،9،10،11. يوفر المجال الجديد ل Liquid-EM ، درجة حرارة الغرفة المرتبطة ب cryo-EM ، مناظر غير مسبوقة للمواد الصلبة أو اللينة في المحلول ، مما يسمح للعلماء بدراسة بنية وديناميكيات عينتهم في وقت واحد. تشمل تطبيقات Liquid-EM تسجيلات في الوقت الفعلي للجسيمات النانوية العلاجية التي تتفاعل مع الخلايا الجذعية السرطانية بالإضافة إلى التغيرات في التعقيدات الجزيئية لمسببات الأمراض الفيروسية12،13،14.
مثلما حفز التقدم المنهجي ثورة الحل في مجال cryo-EM ، هناك حاجة إلى تقنيات وأساليب جديدة لتوسيع استخدام السائل الكهرومغناطيسي كأداة عالية الإنتاجية للمجتمع العلمي. الهدف العام من الطرق المعروضة هنا هو تبسيط بروتوكولات تحضير عينة السائل EM. الأساس المنطقي وراء التقنيات المطورة هو استخدام تصميمات رقاقة جديدة وأجهزة تحميل تلقائي ، مناسبة لكل من جمع البيانات السائلة و cryo-EM (الشكل 1) 7،14،15،16،17. يتم إغلاق التجميعات ميكانيكيا باستخدام مشابك الشبكة القياسية للأدوات الآلية ، مثل Krios ، والتي يمكن أن تستوعب عينات متعددة لكل جلسة أو F200C TEM (الشكل 2). توسع هذه المنهجية استخدام التصوير عالي الدقة بما يتجاوز تطبيقات cryo-EM القياسية التي توضح أغراضا أوسع لتحليل المواد في الوقت الفعلي.
في مقالة الفيديو الحالية ، يتم تقديم بروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات في السائل مع وبدون حاملي العينات المتاحة تجاريا. باستخدام حامل العينات المتخصص ل Liquid-EM ، يمكن أن توفر العينات السائلة الرقيقة معلومات هيكلية مماثلة لعينات cryo-EM ، بالإضافة إلى رؤى ديناميكية للعينات. كما تم عرض طرق تحضير العينات السائلة باستخدام أدوات التحميل الآلي لإجراءات الإنتاجية العالية. الميزة الرئيسية على التقنيات الأخرى هي أن الإنتاج الآلي للعينات يسمح للمستخدم بتقييم عيناته بسرعة للحصول على السماكة المثلى وجرعة الإلكترون قبل جمع البيانات. تحدد تقنية الفحص هذه بسرعة المناطق المثالية للتسجيلات في الوقت الفعلي في السائل أو الجليد12،14،18،19. لأغراض تحديد هيكل 3D ، قد يكمل Liquid-EM طرق cryo-EM الراسخة المطبقة في cryo-EM. قد يفكر القراء الذين يستخدمون تقنيات TEM أو cryo-EM التقليدية في استخدام سير عمل السائل الكهرومغناطيسي لتقديم ملاحظات جديدة وديناميكية لعيناتهم بطريقة تكمل استراتيجياتهم الحالية.
تشمل عينات الفيروسات المستخدمة في هذا البروتوكول النوع الفرعي 3 من الفيروس المنقى المرتبط بالغدي (AAV) الذي تم الحصول عليه كهدية واستزراعه في ظل الظروف القياسية12. كما تم استخدام مجموعات غير معدية من فيروس SARS CoV-2 المستمدة من مصل مرضى COVID-1912 وتم الحصول عليها من مصدر تجاري. أخيرا ، تم الحصول على جزيئات مزدوجة الطبقات (DLPs) من فيروس سيميان الروتا المنقى (سلالة SA11) من مختبر الدكتورة سارة إم ماكدونالد إستمان في جامعة ويك فورست واستزراعها باستخدام الظروف القياسية 6،17. حزم البرامج الموضحة هنا متاحة مجانا وتم توفير الروابط في قسم جدول المواد .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحميل حامل العينة للسائل EM
- نظف رقائق نيتريد السيليكون (SiN) الدقيقة عن طريق احتضان كل شريحة في 150 مل من الأسيتون لمدة دقيقتين تليها حضانة في 150 مل من الميثانول لمدة دقيقتين. اترك الرقائق تجف في تدفق الهواء الرقائقي.
- تقوم البلازما بتنظيف الرقائق المجففة باستخدام أداة تفريغ متوهجة تعمل في ظل ظروف قياسية تبلغ 30 واط و 15 مللي أمبير لمدة 45 ثانية باستخدام غاز الأرجون.
- قم بتحميل رقاقة قاعدة جافة في طرف حامل العينة. أضف ~ 0.2 ميكرولتر من العينة (0.2-1 مجم / مل من مجموعات الفيروسات في 50 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 150 mM كلوريد الصوديوم ؛ 10 mM MgCl 2 ؛ 10 mM CaCl2) إلى الشريحة الأساسية. بعد خطوة حضانة مدتها 1-2 دقيقة ، ضع الشريحة العلوية على شريحة القاعدة الرطبة التي تحتوي على العينة.
- قم بتثبيت المجموعة معا لتشكيل حاوية محكمة الغلق ، مثبتة في مكانها ميكانيكيا بواسطة ثلاثة براغي نحاسية. عند إغلاق التجميع ، قم بضخ الطرف إلى 10-6 Torr باستخدام محطة ضخ جافة بضخ توربيني. الحامل جاهز الآن لإدخاله في TEM.
ملاحظة: لا يحتوي حامل التحديد على إمكانات تبريد ولا يستخدم في cryo-EM.
2. إنتاج مجموعات شطيرة رقاقة
ملاحظة: يمكن استخدام رقائق SiN أو ثاني أكسيد السيليكون (SiO) المختلفة مباشرة من عبوات الجل المشحونة. يمكن أيضا استخدام شبكات الذهب المطلية بالكربون مباشرة كما تم توفيرها.
- تقوم البلازما بتنظيف الرقائق الدقيقة وشبكات الكربون باستخدام أداة تفريغ توهج تعمل في ظل ظروف قياسية تبلغ 30 واط و 15 مللي أمبير لمدة 45 ثانية باستخدام غاز الأرجون.
- إضافة ~ 2 ميكرولتر من العينة الموجودة في 50 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ؛ 10 mM MgCl2 ؛ 10 mM CaCl2 إلى رقاقة متوهجة مفرغة من التوهج موضوعة على عبوة هلام. قم بإزالة المحلول الزائد (~ 50٪) باستخدام ورق ترشيح أو ماصة. بعد خطوة حضانة مدتها 1-2 دقيقة ، أضف شبكة الكربون المتوهجة إلى الرقاقة الدقيقة الرطبة التي تحتوي على العينة.
- قم بتثبيت المجموعة معا باستخدام حامل عينة أحادي الإمالة أو مقاطع شبكة محمل تلقائي في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حاوية محكمة الغلق. بالنسبة لمشابك التحميل التلقائي ، ضع مجموعة الساندويتش على مشبك C السفلي ، ضع المشبك العلوي أعلى المجموعة واستخدم أداة التثبيت القياسية لإغلاق المجموعة معا.
ملاحظة: يستخدم إجراء التثبيت الذي يتم إجراؤه هنا نفس الخطوات المستخدمة في تثبيت شبكة cryo-EM ، ولكن في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين العينات المثبتة لمدة 2 أشهر أو أكثر قبل التصوير مع الحفاظ على السائل في العلبة. لا يتم استخدام فحص التسرب مع حامل عينة درجة حرارة الغرفة أو أداة التحميل التلقائي. - العينة جاهزة الآن لإدخالها في TEM. افحص العينات الموضوعة في أجهزة التحميل التلقائي تحت ظروف التبريد أو في درجة حرارة الغرفة.
3. تصوير العينات باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ
- التصوير الكهرومغناطيسي السائل
- قم بتحميل حامل العينة في TEM المجهز بمسدس انبعاث ميداني (FEG) ويعمل عند 200 كيلو فولت.
- قم بتشغيل البندقية واضبط الارتفاع المركزي لمرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب ، وإمالة العينة من -15 درجة إلى +15 درجة في العمود. يضبط هذا الإجراء المرحلة في الاتجاه Z لاستيعاب سمك العينة. ويساعد على ضمان تكبير دقيق أثناء تسجيل الصور.
- سجل الصور كأفلام ذات إطارات طويلة باستخدام الحزمة في الموقع المدمجة مع كاشف مباشر بمسافة بكسل تبلغ 6 ميكرومتر (الفيديو 1 والفيديو 2). يمكن أيضا تسجيل الصور الفردية باستخدام حزمة برامج جمع البيانات التسلسلية20 ، وتنفيذ إجراءات التصوير الآلي. التقط الصور في ظل ظروف الجرعة المنخفضة بتكبير يتراوح من 28000 × إلى 92000 × و 40 إطارا في الثانية.
- اضبط أوقات التعرض (0.25-1 ثانية) لتقليل تلف الحزمة للعينة. استخدم نطاق إلغاء التركيز البؤري من -1-4 ميكرومتر عند التكبير المحدد. في حالة مواجهة حل سميك، استخدم قيم إلغاء تركيز بؤري أعلى أو حدد منطقة اهتمام مختلفة.
- تأكد من وجود المحلول في العينات طوال جلسة التصوير عن طريق تركيز شعاع الإلكترون على منطقة قربانية غير مستخدمة لجمع البيانات ، حتى تتشكل الفقاعات (الشكل التكميلي 1).
- التصوير بالتبريد الكهرومغناطيسي
- قم بتحميل شبكات EM المقطوعة أو شطائر الرقائق الدقيقة في TEM المجهز ب FEG ويعمل عند 300 كيلو فولت. قم بتشغيل البندقية واضبط الارتفاع المركزي لمرحلة المجهر ، باستخدام إجراء مماثل موصوف للسائل TEM أعلاه (الخطوة 3.1.2).
- سجل الصور الفردية باستخدام نظام تحليل الجسيمات المفردة المدمج في نظام المجهر أثناء تنفيذ إجراءات التصوير الآلي. سجل الصور في ظل ظروف الجرعة المنخفضة باستخدام كاشف الإلكترون المباشر لتحليل الجسيمات المفردة الذي يحتوي على تباعد بكسل يبلغ 14 ميكرومتر عند تكبير 59000x و 40 إطارا في الثانية.
- استخدم نطاق إلغاء التركيز البؤري من 1-4 ميكرومتر عند التكبير المحدد. في حالة مواجهة طبقات سميكة من الجليد الزجاجي، استخدم قيم إلغاء تركيز أعلى أو حدد منطقة مختلفة لجمع البيانات.
4. تحليل البيانات ومقارنات هيكل 3 D
- تحليل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في الجليد السائل والزجاجي
- قم بمعالجة الأفلام لجزيئات AAV في السائل والجليد باستخدام برنامج RELION-3.0821 أو برنامج معالجة الصور الآخر22. قم بإجراء تصحيح الحركة باستخدام MotionCor2 v1.2.3.
- بمجرد التصحيح ، استخرج الجسيمات باستخدام أداة الانتقاء التلقائي في حزمة برامج البرنامج. أحجام الصناديق النموذجية هي 330 بكسل للعينات السائلة و 350 بكسل لعينات الجليد.
- احسب عمليات إعادة البناء الأولية باستخدام تناظر C1 باستخدام روتين النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد للبرنامج و / أو خيارات نموذج ab-initio في حزمة برامج معالجة البيانات. في البرنامج ، استخدم معلمة تنظيم T = 4 وحجم بكسل 1.01 Å للعينات السائلة و 1.13 Å لعينات الجليد.
- استخدم قيمة قناع 300 Å طوال إجراءات التحسين. إجراء بروتوكولات التحسين في برنامج معالجة البيانات باستخدام تناظر I1 للحصول على خرائط EM متعددة. قد تكون الدقة الهيكلية المتوقعة في حدود 4 Å أو أفضل. استخدم معادلة الجسيمات لتنفيذ تناظر icosahedral عند 16,800 للسائل و 15,240 للثلج12,14.
ملاحظة: تستند تقديرات الدقة إلى معايير ارتباط غلاف فورييه (FSC) ذات المعيار الذهبي. - قناع خرائط EM في ~ 250 Å وفحص النتائج باستخدام حزمة برامج تحليل البنية الجزيئية23،24. في الشكل 3 ، تظهر الشرائح بزيادات ~ 5 نانومتر.
- استخراج وحدات بروتين القفيصة (VP1) الفرعية من خرائط EM للمقارنة. تحديد التغيرات الديناميكية بين هياكل EM بناء على قياسات قطر الجسيمات (الشكل التكميلي 2) ، ثم التصور باستخدام وظيفة خريطة Morph في البرنامج.
- تحليل التجميعات شبه الفيروسية ل SARS-CoV-2 في السائل
- معالجة الأفلام باستخدام برنامج RELION-3.08. تصحيح انحراف الصورة والحركة التي يسببها الشعاع باستخدام MotionCor2 v1.2.3. تصحيح لوظيفة نقل التباين (CTF) للمجهر.
- استخدم أداة الانتقاء التلقائي في البرنامج لتحديد التجميعات الفيروسية بحجم صندوق 800 بكسل. لتحقيق الكفاءة الحسابية ، يمكن إعادة قياس الجسيمات المستخرجة إلى 256 بكسل. احصل على نموذج أولي باستخدام تناظر C1 في البرنامج مع معلمة تنظيم بحجم T = 2 و 1.66 Å بكسل.
- قم بإجراء تحسين 3D في البرنامج للحصول على خريطة EM ، يظهر مثال في ~ 8.25 Å وفقا لمعايير FSC القياسية (الشكل 4). تصور خرائط EM باستخدام برنامج تحليل التركيب الجزيئي مع شرائح متزايدة عند 25 نانومتر كما هو موضح في الشكل 4.
- تحليل جسيمات فيروس الروتا مزدوجة الطبقات (DLPs) في الجليد الزجاجي
- قم بمعالجة الأفلام ل DLPs للفيروسات العجلية باستخدام برامج معالجة الصور الأخرى. استخدم MotionCor2 v1.2.3 لتصحيح الانجراف في الصور. استخدم تقدير CTF للتصحيح لتصحيح تأثيرات العدسة على الصور.
- استخرج الجسيمات باستخدام أداة الانتقاء التلقائي في البرنامج بحجم صندوق 950 بكسل. قم بأخذ عينة من حجم الصندوق حسب الحاجة لأغراض الحوسبة.
- احسب النماذج الأولية باستخدام خيارات ab-initio وتناظر C1. استخدم معلمات التحسين بما في ذلك حجم البكسل 1.47 Å وقيمة قناع 800 Å.
- قم بإجراء إجراءات تحسين إضافية مع فرض تناظر I1. تتضمن النتائج النموذجية خريطة 10.15 Å EM ، وفقا لمعايير FSC القياسية الذهبية. كان إجمالي الجسيمات المستخدمة 2050 ، وهو ما يعادل 123000 وحدة بروتومر بسبب مشغل تناظر icosahedral (الشكل 5).
- قناع الخرائط النهائية في ~ 750 Å وتصور النتائج في حزمة برامج تحليل البنية الجزيئية. يتم عرض أمثلة الشرائح عبر خريطة EM في الشكل 5 بزيادات ~ 10 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام TEM السائل الذي يعمل عند 200 كيلو فولت لجميع تجارب التصوير السائل الكهرومغناطيسي وتم استخدام cryo-TEM الذي يعمل عند 300 كيلو فولت لجميع عمليات جمع بيانات cryo-EM. يتم تقديم صور وهياكل تمثيلية لفيروسات متعددة لإثبات فائدة الطرق عبر مواضيع الاختبار المختلفة. وتشمل هذه الأنواع الفرعية 3 من الفيروس المرتبط بالغدي المؤتلف (AAV) ، والتجمعات الفيروسية الفرعية ل SARS-CoV-2 المشتقة من مصل المريض ، وجزيئات الفيروسة العجلية المزدوجة (DLPs) ، سلالة SA11. أولا، تم إجراء مقارنات لنفس عينة AAV (1 ملغم/مل) المصورة في محلول سائل عازل (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl؛ 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) وفي الجليد الزجاجي (الشكل 3A-C; الشكل التكميلي 2). تم تحضير عينات السائل الكهرومغناطيسي باستخدام رقائق دقيقة قائمة على SiN وحامل العينات المتخصص. تم تحضير عينات cryo-EM باستخدام شبكات كربونية قياسية وتزجيجها باستخدام وحدة تحضير عينات حديثة إلى إيثان سائل. كان لهياكل الفيروس الناتجة أقطار إجمالية مماثلة تبلغ ~ 25 نانومتر. أظهرت مقارنة بين البروتومرات القفيصة VP1 الفردية أيضا ميزات متسقة في كل من خرائط EM السائلة والجليدية (الشكل 3D). كان أحد الاختلافات بين بيانات السائل EM و cryo-EM هو أنه لوحظت هياكل ديناميكية إضافية في السائل لم تكن موجودة في نتائج cryo-EM (الشكل 3E)12.
بعد ذلك ، تم فحص عينات SARS-CoV-2 المعطلة (0.25 مجم / مل) المحضرة في محلول عازل (50 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 150 mM NaCl ؛ 10 mM MgCl 2 ؛ 10 mM CaCl2) باستخدام تقنية شطيرة رقاقة جديدة 7,14. تستخدم التقنية الجديدة رقائق دقيقة قائمة على SiN جنبا إلى جنب مع شبكات الذهب المطلية بالكربون. في هذا المستحضر ، كانت العينة السائلة محصورة بين الركيزتين (الشكل 2A-C). تم تثبيت العينات المحصورة بحامل عينة أحادي الإمالة أو مشابك C ذاتية التحميل شائعة الاستخدام في تحضير عينة cryo-EM. يمكن عرض العينات على الفور في TEM أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 2 أشهر أو أكثر ، اعتمادا على استقرار العينة البيولوجية. يضمن ظهور الفقاعات في العينات السائلة وجود الطبقة السائلة. يمكن قياس سمك السائل باستخدام بروتوكولات EF-TEM كما هو موضح12. يبدو أن التجميعات شبه الفيروسية ل SARS-CoV-2 في السائل لها تباين مرئي مرتفع فيما يتعلق بالسائل المحيط (الشكل 4 أ ، ب). أظهرت بعض الجسيمات طفرات مرئية على سطح الفيروس بينما تفتقر بعض الجسيمات إلى المسامير أو تكون مزينة بها بشكل ضئيل (الشكل التكميلي S3). أظهرت متوسطات الفصل والشرائح من خلال بنية 8.25 Å السمات الداخلية داخل الجسيمات التي تضم وحدات فرعية من البروتين وجينوم الحمض النووي الريبي الفيروسي (الشكل 4C). على الرغم من أن بعض الجسيمات يبدو أنها تحتوي على تناظر C2 (عند اختبار تناظر C2 ، كان تكافؤ الجسيمات 2,674) ، إلا أن البنية غير المتماثلة لم تختلف كثيرا مقارنة بالبنية المتماثلة.
وأخيرا، شمل التحليل DLPs للفيروس العجلي (3 ملغم/مل؛ 50 ملي مول HEPES، الرقم الهيدروجيني 7.5؛ 150 ملي مول كلوريد الصوديوم؛ 10 ملي مول كلوريد الصوديوم 2؛ 10 ملي مول كلوريد الصوديوم2؛ 10 ملي مول كلوريد الصوديوم2) في الثلج الزجاجي عن طريق تجميد مستحضرات شطيرة الرقاقة الدقيقة يدويا إلى نيتروجين سائل. تم استخدام نفس تقنية الساندويتش المستخدمة لإنتاج عينات السائل EM للعينات المجمدة. تم ختم السندويشات بمشابك شبكة التحميل التلقائي وفحصها باستخدام cryo-TEM في ظل الظروف القياسية. أظهرت المناظر منخفضة التكبير للعينات المجمدة تلوثا ضئيلا أو سداسيا بالجليد ، ولوحظت مناطق من DLPs المعبأة بكثافة في جميع أنحاء نوافذ العرض (الشكل 5 أ ، ب). تم جمع الصور باستخدام إجراءات آلية تم تنفيذها في حزمة EPU. كشفت متوسطات الفصل والشرائح من خلال خريطة 10.15 Å عن ميزات مستقرة تتوافق مع مكونات البروتين الفيروسي وجينوم الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (الشكل 5D ، E). لم يكن فرق التباين بين DLPs وخلفية الجليد قويا بشكل واضح في صور cryo-EM مقارنة بعينات السائل EM. في حين أن سبب هذا التأثير المثير للاهتمام لا يزال قيد التحديد ، تجدر الإشارة إلى الفرق لأن السائل الكهرومغناطيسي قد يوفر مزايا مستقبلية لمجتمع التصوير.
الشكل 1: التقنيات المستخدمة للتصوير عالي الدقة للفيروسات في السائل والجليد. يسلط سير العمل الضوء على طرق تحضير عينات السائل الكهرومغناطيسي المختلفة. تظهر اللوحة اليسرى تمثيلا تخطيطيا لحامل عينة السائل EM. تتضمن رقاقة قاعدة SiN مجموعة (500 ميكرومتر × 100 ميكرومتر) من الآبار الدقيقة المتكاملة (10 ميكرومتر × 10 ميكرومتر) التي يبلغ عمقها ~ 150 نانومتر مع غشاء سميك ~ 30 نانومتر. تقدم اللوحة اليمنى مخططا لتقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة ، والتي يمكن استخدامها في كل من أبحاث السائل الكهرومغناطيسي و cryo-EM. تستخدم مجموعات الساندويتش رقاقة SiN مقترنة بشبكة TEM ذهبية مغلفة بالكربون. يشير المقطع العرضي للتجميع إلى نوافذ تصوير متعددة يتراوح حجمها من 250 ميكرومتر × 250 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر بسماكة غشاء تبلغ 10 نانومتر أو 5 نانومتر على التوالي. يبلغ سمك فيلم دعم الكربون ~ 5 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة للسائل EM و cryo-EM. (أ) تستخدم مجموعة شطيرة الرقاقة الدقيقة رقاقة دقيقة SiN مقترنة بشبكة TEM ذهبية مغلفة بالكربون. يتم وضع رقاقة دقيقة متوهجة على عبوة هلام وتضاف عينات الفيروس إلى الرقاقة. بعد فترة حضانة قصيرة ، تتم إزالة المحلول الزائد ، ويتم إغلاق الساندويتش بشبكة TEM. (ب) يتم إغلاق شطيرة الرقاقة الدقيقة في جهاز قص في درجة حرارة الغرفة ويمكن تحميلها مباشرة في حامل TEM أحادي الإمالة أو نظام تحميل تلقائي TEM. (ج) تبرز رسومات المقطع العرضي لمجموعة شطيرة الرقاقة الدقيقة أبعاد الرقائق الدقيقة وطبقة الكربون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مقارنة بين هياكل السائل الكهرومغناطيسي و cryo-EM ل AAV. (A) هيكل AAV في محلول (دقة 3.22 Å) بكثافات شعاعية ملونة تظهر شرائح 5 نانومتر عبر الخريطة. شريط المقياس 5 نانومتر. مقاييس التصوير مخصصة للحصول على البيانات باستخدام كاشف الإلكترون المباشر. (ب) هيكل AAV المصور في الجليد (دقة 3.37 Å) بكثافات شعاعية ملونة تمثل شرائح 5 نانومتر عبر الهيكل. شريط المقياس 5 نانومتر. مقاييس التصوير مخصصة للحصول على البيانات باستخدام كاشف الإلكترون المباشر. (ج) توضح المنطقة محل الاهتمام نقطتي زمنية مقدارها 5 s و20 s بالإضافة إلى تحويلات فورييه المحسوبة عند نقاط زمنية مختلفة. يعرض الجانب الأيسر تقديرات CTF ، ويعرض الجانب الأيمن البيانات التجريبية. (د) المناظر الدورانية للوحدة الفرعية AAV VP1 المستخرجة من الهياكل السائلة والجليدية. تم تفسير الأجزاء باستخدام البنية البلورية (رمز PDB 3KIC ، سلسلة25). شريط المقياس هو 10 Å. (E) القيم الديناميكية في الهياكل السائلة المتولدة باستخدام وظيفة خريطة morph في برنامج تحليل البنية الجزيئية والموصوفة في الخطوة 4.1.6-4.2.3. من اليسار إلى اليمين ، تظهر الهياكل المتوسطة من تجميعات الفيروسات المتعددة تغييرات توافقية مع تغيير قطر ~ 5٪ ، يتم قياسه باستخدام بيانات EM. تشير قيم RMSD في voxels إلى التغييرات وفقا لمقياس اللون. تم تعديل الرقم من12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مجموعات SARS-CoV-2 شبه الفيروسية المحضرة في سائل باستخدام تقنية شطيرة الرقاقة. (أ) صورة لتجمعات SARS-CoV-2 شبه الفيروسية المعزولة من أجزاء المصل من مرضى COVID-19. مقاييس التصوير مخصصة للحصول على البيانات باستخدام كاشف الإلكترون المباشر. الفقاعات البيضاء في الزاوية العلوية اليمنى من الصورة هي مؤشر مرئي على وجود سائل في العينة. شريط المقياس 100 نانومتر. (ب) يظهر تحويل فورييه المحسوب للصورة معلومات عالية الدقة في الفضاء المتبادل مع انحراف ضئيل أو معدوم في الصورة المقابلة. تظهر متوسطات الفصل ميزات فريدة في التجميعات الفيروسية الموجودة في المحلول. (ج) تظهر إعادة بناء EM للتجميعات شبه الفيروسية بكثافات شعاعية ملونة عند شرائح 5 نانومتر عبر الخريطة. شريط المقياس 25 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: DLPs فيروس الروتا المحضرة في سائل باستخدام تقنية شطيرة الرقاقة. (أ ، ب) خطوات فحص التكبير المنخفض باستخدام برنامج التحليل. لوحظت بلورات ثلجية محدودة ، وكانت أغشية النوافذ رقيقة وواضحة ، مما يبسط اختيار المنطقة للحصول على البيانات. شريط المقياس في (A) هو 5 ميكرومتر وفي (B) هو 500 نانومتر. (ج) تم الحصول على الأفلام باستخدام كاشف الإلكترون المباشر في وضع العد وفقا لمقاييس التصوير المشار إليها. شريط المقياس 50 نانومتر. (د) تشير معلومات تحويل فورييه إلى معلومات عالية الدقة موجودة في البيانات وتظهر متوسطات الفئة سمات قوية في الشبكة الوجوهية. تظهر متوسطات الفصل ميزات في مجموعات الفيروسات خالية من القطع الأثرية ومتسقة مع الملاحظات الهيكلية الأخرى6،15،17. (ه) إعادة بناء EM ل DLPs (دقة 10.15 Å) موضحة بكثافات شعاعية ملونة عند شرائح 10 نانومتر عبر الخريطة. شريط المقياس 15 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: تأكيد وجود السائل في عينات EM. تفتقر الصور منخفضة التكبير لجزيئات AAV في المحلول المكتسب في ظل ظروف الجرعة المنخفضة (<10 e- Å-2 s-1) إلى الفقاعات. باستخدام شعاع مركز من >100 e- Å-2 s-1 ، أظهرت العينات السائلة تكوين فقاعة (أسهم سوداء). شريط المقياس 500 نانومتر. تم تعديل الرقم من12. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: قياس التغيرات في أبعاد AAV في السائل. (أ) تم الحصول على آثار كفاف لجزيئات الفيروس خلال إطار زمني مدته 20 ثانية. شريط المقياس 25 نانومتر. (ب، ج) تمثيلات الجدول والرسوم البيانية لقياسات قطر الجسيمات في 1 و 5 و 10 و 20 ثانية. كان التغير الكلي في أقطار الجسيمات خلال تسجيل 20 ثانية 0.28٪ بجرعة ~ 1e- Å-2 s-1. (د، ه) يتم تحديد قيم الإشارة إلى الضوضاء عند نقطة زمنية مختلفة أثناء الحصول على الفيلم. تم تعديل الرقم من12. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: صورة عالية التكبير للمجمعات الفرعية SARS-CoV-2 المشتقة من المريض. أظهرت التجمعات الفيروسية غير المتجانسة وجود بروتينات سبايك (الأسهم الحمراء) على سطح بعض الجزيئات. كانت الجسيمات الأخرى تفتقر إلى المسامير السطحية كما هو مذكور. شريط المقياس 100 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
فيديو 1: تصوير في الوقت الحقيقي ل AAV في سائل. مقارنة جنبا إلى جنب لتسجيل في الوقت الفعلي ل AAV في السائل (يسار) وآثار الكنتور الملونة للجسيمات المنتشرة في المحلول (يمين). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: تصور تتبع الصور في السائل. مقارنات جنبا إلى جنب لفيلم ملون ومرشح منخفض التمرير ل AAV ينتشر في المحلول (يسار) آثار كفاف ملونة للجسيمات المنتشرة في المحلول (يمين). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تقديم فرص جديدة لتبسيط سير عمل السائل الكهرومغناطيسي الحالي باستخدام أدوات وتقنيات آلية جديدة مقتبسة من مجال cryo-EM. تعتبر التطبيقات التي تنطوي على تقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة الجديدة مهمة فيما يتعلق بالطرق الأخرى لأنها تتيح تحليل التصوير عالي الدقة في الثلج السائل أو الزجاجي. واحدة من أهم الخطوات في البروتوكول هي إنتاج عينات بسمك سائل مثالي لتصور تفاصيل رائعة على المستوى النانوي. يتم تحديد المناطق المثالية ذات الأهمية عند التكبير المنخفض عن طريق فحص العينة بأكملها قبل تنفيذ إجراءات عالية الإنتاجية لجمع البيانات تلقائيا. إذا كانت المناطق المحددة في العينات السائلة أو الجليدية تحتوي على قطع أثرية تالفة أو تبدو سميكة جدا بحيث لا يمكن تحديد الجسيمات الفردية الهشة بصريا ، فيجب استبعادها من جمع البيانات. تشمل القيود في الحصول على البيانات عالية الدقة الحركة التي يسببها الشعاع والحركة البراونية في العينات السائلة. تهدف طرق Cryo-EM إلى تقليل الحركة في العينات البيولوجية. ومع ذلك ، فإن طرق تصحيح الحركة قوية حسابيا في التخفيف من عوامل تحديد الدقة هذه. إذا كانت العينات السائلة تمثل انحرافا طويل المدى وعدم استقرار حراري ، فيمكن تحضير عينات أرق عن طريق إزالة المحلول الزائد أثناء خطوات تحضير العينة لتقليل سمك الطبقات السائلة.
قد ينتج الازدحام الجزيئي بين جزيئات الفيروس عند استخدام العينات بتركيزات عالية. إذا كانت هناك مناطق متعددة ذات جسيمات متداخلة بطريقة تحد من جمع البيانات القوية ، فيجب تقليل تركيز عينة الإدخال قبل تحضير العينة. يعد وجود تركيز عينة مناسب خطوة حاسمة في البروتوكول. الصور التي تحتوي على فائض من الجسيمات ستعقد إجراءات معالجة الصور النهائية. بالنسبة لجزيئات الفيروس المنقى ، يتراوح نطاق التركيز الكافي بين 0.3-3 مجم / مل ، اعتمادا على الأبعاد والوزن الجزيئي للعينة. عادة ما تتطلب الفيروسات الأكبر (~ قطر 100 نانومتر أو أكثر) تركيزات أعلى من الفيروسات الأصغر (~ قطر 25 نانومتر أو أقل) لنجاح التقنية. هناك عامل آخر يجب مراعاته وهو المستوى الذي تلتصق عنده الجسيمات ذات الاهتمام بالرقائق الدقيقة التي يتم تفريغها من التوهج. إذا لم تلتصق عينة الفيروس جيدا بالسطح ، فقد تكون هناك حاجة إلى تركيز أكبر لإعداد العينات بشكل مناسب للسائل EM أو cryo-EM. بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق العينة بدلا من ذلك على شبكة الذهب المطلية بالكربون مع وجود رقاقة تعمل كغطاء للعلبة. إذا فشلت هذه الإجراءات في تجنيد جزيئات كافية لإجراءات جمع البيانات ، فقد تقدم طرق التقاط التقارب خيارا قابلا للتطبيق26،27،28.
يجب التقليل من استخدام بعض المواد المضافة مثل المنظفات والجلسرين والبولي إيثيلين جلايكول والمستويات العالية من السكروز أو الجلوكوز أو تجنبها للتصوير السائل الكهرومغناطيسي. قد تدخل هذه الكواشف القطع الأثرية في الصور وكذلك تؤدي إلى فقاعات مفرطة ومنتجات التحلل المائي وتشكيل الجذور الحرة بسبب تلف الحزمة. تؤدي هذه التأثيرات إلى ميزات صامتة في الجسيمات المصورة وتحد في النهاية من الدقة الهيكلية. تتمثل إحدى طرق إزالة هذه الكواشف إذا تم استخدامها في المستحضرات الكيميائية الحيوية في غسيل الكلى المكثف في محلول عازل يفتقر إلى المواد المضافة. وسيتعين اختبار هذه الكواشف واستخدامها على أساس كل حالة على حدة. علاوة على ذلك ، بمجرد إنتاج عينات كافية باستخدام تقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة ، يمكن تصويرها على الفور أو تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للفحص. تعتمد أوقات التخزين على استقرار العينة.
بشكل عام ، يسمح استخدام السائل الكهرومغناطيسي مع cryo-EM للباحثين بفحص الأنظمة البيولوجية باستخدام أدوات التصوير التكميلية. تنتج تقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة المطورة حديثا عينات متسقة لتصوير TEM في السائل أو الجليد. كما توفر هذه التقنية وسيلة بسيطة للباحثين لإعداد العينات وعرضها دون الحاجة إلى حامل عينة تجاري أو نظام تزجيج. بالاقتران مع بروتوكولات التصوير الآلي ، يمكن الحصول على كميات كبيرة من البيانات بترتيب آلاف الصور لكل جلسة لكل عينة. وضع العمل الرائد لبارسونز وزملائه29،30،31،32،33 الأساس التأسيسي لإنتاج العينات البيولوجية في حاويات سائلة. تصف البروتوكولات المعروضة هنا كيف يمكن للأدوات الحديثة الآن أن توفر وسيلة مثيرة لتصور الجزيئات البيولوجية الكبيرة من خلال عيون جديدة. التطبيقات المستقبلية التي من المتوقع أن تنتج عن إتقان هذه التقنيات ، عند إقرانها بالحوسبة عالية الأداء ، هي رؤى ميكانيكية في الوقت الفعلي لفهم العلاقات بين الهيكل والوظيفة في 3D. قد يعمل مجال السائل الكهرومغناطيسي على رفع مستوى الأبحاث حول الفيروسات الجديدة التي تشكل تهديدا لصحة الإنسان ، وربما يساهم حتى في تدابير التأهب للجوائح. باختصار ، يجب أن يسمح استخدام هذه البروتوكولات للعلماء والمهندسين بدراسة العمليات الديناميكية بشكل أفضل في التفاصيل الذرية ، عبر مجموعة كبيرة ومتنوعة من العينات التي تشمل علوم الحياة والطب وأبحاث المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. المؤلفة ، مادلين ج. دريسل ديوكس ، موظفة في شركة Protochips، Inc. ومايكل سبيلمان موظف في DirectElectron.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بالدكتور Luk H. Vandenberghe (كلية الطب بجامعة هارفارد ، قسم طب العيون) لتوفير AAV-3 المنقى. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للسرطان (R01CA193578 ، R01CA227261 ، R01CA219700 إلى DFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
