Summary
这里描述了使用透射电子显微镜制备适用于纳米级液体电镜和冷冻电镜分析的病毒组件的协议。
Abstract
近年来，人们对液电子显微镜（liquid-EM）的兴趣激增，因为科学家现在可以观察纳米级的实时过程。将高分辨率冷冻电镜信息与动态观察相结合是非常理想的，因为许多事件发生在快速的时间尺度上 - 在毫秒范围内或更快。提高对柔性结构的了解也有助于设计新型试剂来对抗新出现的病原体，例如SARS-CoV-2。更重要的是，在流体环境中观察生物材料可以对它们在人体中的表现进行独特的一瞥。这里介绍的是新开发的方法，用于研究液体和玻璃冰中病毒组装的纳米级特性。为了实现这一目标，使用定义明确的样本作为模型系统。并排比较了样品制备方法和代表性结构信息。显示了在~3.5-Å-10 Å范围内解析的结构的亚纳米特征。支持这一互补框架的其他最新结果包括候选疫苗和液体成像的基于抗体的疗法的动态见解。总体而言，这些相关应用提高了我们可视化分子动力学的能力，为它们在人类健康和疾病的使用提供了独特的背景。
Introduction
生物医学研究通过开发新技术提高了我们对人类健康和疾病的了解。高分辨率成像正在改变我们对纳米世界的看法 - 使我们能够以精致的细节研究细胞和分子1，2，3，4，5。动态组件（如软聚合物、蛋白质组装或人类病毒）的静态信息仅揭示了其复杂叙述的有限快照。为了更好地了解分子实体如何运作，必须共同研究它们的结构和功能。
原子薄石墨烯或硅基微芯片等材料生产的最新进展为使用透射电子显微镜（TEM）进行实时结构函数分析提供了新的机会。这些材料可以创建用于实时EM成像的密封室6，7，8，9，10，11。液电镜的新领域，室温与冷冻电镜相关，提供了溶液中硬质或软质材料的前所未有的视图，使科学家能够同时研究其样品的结构和动力学。液体电镜应用包括治疗性纳米颗粒与癌症干细胞相互作用的实时记录，以及病毒病原体12，13，14分子复杂性的变化。
正如方法学的进步刺激了冷冻电镜领域的分辨率革命一样，需要新的技术和方法来扩展液电镜作为科学界高通量工具的使用。本文介绍的方法的总体目标是简化液电镜样品制备方案。所开发技术背后的基本原理是采用新的微芯片设计和自动加载器设备，适用于液体和冷冻电镜数据收集（图1）7，14，15，16，17。组件使用自动化仪器的标准网格夹进行机械密封，例如 Krios，每个会话可容纳多个样品或 F200C TEM（图 2）。这种方法将高分辨率成像的使用扩展到标准冷冻电镜应用之外，展示了实时材料分析的更广泛用途。
在当前的视频文章中，介绍了在有或没有市售标本支架的情况下在液体中制备病毒组件的实验方案。使用用于液电镜的专用试样支架，薄液体试样可以提供与冷冻电镜样品相当的结构信息，以及试样的动态见解。还展示了使用自动进样器工具制备液体标本的方法，用于高通量常规。与其他技术相比，自动化样品生产的主要优点是允许用户在数据收集之前快速评估样品的最佳厚度和电子剂量。这种筛选技术可快速识别液体或冰12，14，18，19中实时记录的理想区域。出于 3D 结构测定的目的，液电镜可以补充冷冻电镜中实施的长期建立的冷冻电镜方法。采用传统TEM或冷冻电镜技术的读者可以考虑使用液电镜工作流程，以补充其当前策略的方式提供新的样品动态观察结果。
本协议中使用的病毒样品包括作为礼物获得并在标准条件下培养的纯化的腺相关病毒亚型3（AAV）12。还使用了从COVID-19患者血清中提取的非传染性SARS CoV-2亚病毒组件12，并从商业来源获得。最后，从维克森林大学的Sarah M. McDonald Esstman博士的实验室获得纯化的猿猴轮状病毒（SA11菌株）双层颗粒（DLP），并使用标准条件 6，17进行培养。此处描述的软件包是免费提供的，链接已在 “材料表 ”部分中提供。
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Protocol
1. 装载液体电磁的试样支架
- 通过将每个芯片在 150 mL 丙酮中孵育 2 分钟，然后在 150 mL 甲醇中孵育 2 分钟来清洁氮化硅 （SiN） 微芯片。让芯片在层流气流中干燥。
- 使用辉光放电仪器使用辉光放电仪器清洁干燥的芯片，使用氩气在 30 W、15 mA 的标准条件下运行 45 秒。
- 将干燥的基础微芯片装入样品支架的尖端。向基础芯片中加入 ~0.2 μL 样品（在 50 mM HEPES、pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM MgCl 2、10 mM CaCl2 中加入 0.2-1 mg/mL 病毒组装体）。在孵育步骤1-2分钟后，将顶部芯片放在含有样品的湿基芯片上。
- 将组件夹在一起以形成一个密封的外壳，由三个黄铜螺钉机械固定到位。密封组件后，使用涡轮泵干泵站将尖端泵送到 10-6 Torr。支架现在已准备好插入 TEM。
注意：选择支架没有冷却功能，不用于冷冻电镜。
2. 微芯片夹层组件的生产
注意：不同的SiN或二氧化硅（SiO）微芯片可以直接从发货的凝胶包中使用。碳涂层金网格也可以直接使用。
- 使用辉光放电仪器使用辉光放电仪器清洁微芯片和碳网格，使用氩气在 30 W、15 mA 的标准条件下运行 45 秒。
- 加入 ~2 μL 包含在 50 mM HEPES 中的样品，pH 7.5;150毫米氯化钠;10毫米氯化镁2;将10 mM CaCl2到放置在凝胶包上的发光放电微芯片中。使用滤纸或移液器去除多余的溶液（~50%）。在孵育步骤1-2分钟后，将发光放电的碳网格添加到含有样品的湿微芯片中。
- 在室温下使用单倾斜试样支架或自动加载器网格夹将组件夹紧在一起，以形成密封的外壳。对于自动装载机夹具，将夹层组件放在底部 C 形夹上，将顶部夹子放在组件顶部，并使用标准夹紧工具将组件密封在一起。
注意：此处执行的夹紧程序使用与冷冻电镜网格夹紧相同的步骤，但在室温下。夹紧的样品可以在成像前储存 2 个月或更长时间，同时将液体保持在外壳中。室温试样架或自动进样器不使用泄漏检查。 - 试样现在已准备好插入TEM。检查在低温条件下或室温下放置在自动进样器中的样品。
3. 使用透射电子显微镜对标本进行成像
- 液电镜成像
- 将试样支架装入配备场发射枪 （FEG） 并在 200 kV 下运行的 TEM 中。
- 打开喷枪，使用摆动功能调整显微镜载物台相对于样品的共心高度，将色谱柱中的样品从-15°倾斜到+15°。此过程在Z方向上调整载物台以适应样品厚度。并有助于确保图像记录期间的准确放大倍率。
- 使用与像素间距为6μm的直接检测器集成的 原位 封装将图像记录为长帧电影（视频1和 视频2）。单个图像也可以使用串行数据收集软件包20进行记录，实现自动成像例程。在低剂量条件下以 28，000x-92，000x 和每秒 40 帧的放大倍率采集图像。
- 调整曝光时间（0.25-1秒）以尽量减少光束对标本的损坏。在指定放大倍率下使用-1-4μm的散焦范围。如果遇到厚溶液，请使用更高的散焦值或选择不同的感兴趣区域。
- 通过将电子束聚焦在不用于数据收集的牺牲区域上，确保溶液在整个成像过程中存在于样品中，直到形成气泡（补充图1）。
- 冷冻电镜成像
- 将夹紧的电磁网格或微芯片三明治装入配备 FEG 并在 300 kV 下运行的 TEM 中。打开喷枪并调整显微镜载物台的共心高度，使用上述液体透射电镜描述的类似程序（步骤3.1.2）。
- 使用集成在显微镜系统中的单颗粒分析系统记录单个图像，同时实施自动成像程序。使用单颗粒分析直接电子检测器在低剂量条件下记录图像，其像素间距为14μm，放大倍率为59，000倍，每秒40帧。
- 在指定放大倍率下使用1-4μm的散焦范围。如果遇到厚厚的玻璃质冰层，请使用更高的散焦值，或选择不同的区域进行数据收集。
4. 数据分析和三维结构比较
- 液体和玻璃体冰中腺相关病毒（AAV）的分析
- 使用RELION-3.08程序21 或其他图像处理软件22处理液体和冰中AAV颗粒的电影。使用 MotionCor2 v1.2.3 执行运动校正。
- 更正后，使用程序软件包中的自动拾取工具提取颗粒。液体标本的典型框尺寸为 330 像素，冰标本的典型框尺寸为 350 像素。
- 使用程序的 3D 初始模型例程和/或数据处理软件包中的 从头模型 选项，使用 C1 对称性计算初始重建。在程序中，对液体试样使用 T = 4 的正则化参数和 1.01 Å 的像素大小，对冰标本使用 1.13 Å。
- 在整个细化过程中使用 300 Å 的掩码值。使用 I1 对称性在数据处理软件中执行细化协议，以获得多个 EM 映射。预期的结构分辨率可能在 4 Å 或更高的范围内。使用粒子等价实现二十面体对称性，液体为 16，800，冰12，14 为 15，240。
注意：分辨率估计基于黄金标准傅里叶壳相关 （FSC） 标准。 - 在~250 Å处掩蔽EM图，并使用分子结构分析软件包23，24检查结果。 在图3中，切片以~5 nm的增量显示。
- 从EM图中提取衣壳蛋白（VP1）亚基进行比较。根据粒径测量值量化EM结构之间的动态变化（补充图2），然后使用软件中的形态图功能进行可视化。
- 液体中SARS-CoV-2亚病毒组装体的分析
- 使用 RELION-3.08 程序处理影片。使用 MotionCor2 v1.2.3 校正图像漂移和光束感应运动。校正显微镜的对比度传递函数（CTF）。
- 使用程序中的自动拾取工具选择框大小为 800 像素的病毒组件。为了提高计算效率，提取的粒子可以重新缩放为 256 像素。在程序中使用 C1 对称性获得初始模型，正则化参数为 T = 2，像素大小为 1.66 Å。
- 在程序中执行 3D 细化以获得 EM 映射，根据标准 FSC 标准，示例显示在 ~8.25 Å 处（图 4）。使用分子结构分析软件可视化EM图，切片在25 nm处递增，如图 4所示。
- 玻璃体冰中轮状病毒双层颗粒（DLP）的分析
- 使用其他图像处理软件处理轮状病毒 DLP 的电影。使用 MotionCor2 v1.2.3 校正图像中的漂移。使用贴片 CTF 估计来校正图像上的镜头效应。
- 使用软件中的自动拾取工具提取颗粒，框大小为 950 像素。根据需要对盒子大小进行下采样，以便进行计算。
- 使用 从头选项 和 C1 对称性计算初始模型。使用细化参数，包括像素大小为 1.47 Å 和遮罩值 800 Å。
- 执行额外的细化例程，同时施加 I1 对称性。示例结果包括根据黄金标准FSC标准的10.15 Å EM图。使用的总颗粒为 2050 个，由于二十面体对称运算符，相当于 123，000 个原型单位（图 5）。
- 在 ~750 Å 处屏蔽最终图，并在分子结构分析软件包中可视化结果。通过EM图的示例切片如图 5 所示，增量为~10 nm。
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Representative Results
所有液电镜成像实验均使用工作在200 kV的液电镜，工作电压为300 kV的冷冻电镜用于所有冷冻电镜数据收集。展示了多种病毒的代表性图像和结构，以证明这些方法在各种测试对象中的实用性。这些包括重组腺相关病毒亚型 3 （AAV）、源自患者血清的 SARS-CoV-2 亚病毒组件以及猿轮状病毒双层颗粒 （DLP）、SA11 菌株。首先，演示在液体缓冲溶液（50 mM HEPES，pH 7.5;150 mM NaCl;10 mM MgCl2;10 mM CaCl2）和玻璃冰（图3A-C;补充图 2）。使用SiN基微芯片和专用样品支架制备液EM样品。冷冻电镜样品使用标准多孔碳网格制备，并使用最先进的样品制备装置玻璃化成液态乙烷。由此产生的病毒结构具有相似的~25nm总直径。对单个VP1衣壳原型的比较也显示出液体和冰EM图的一致特征（图3D）。液电镜和冷冻电镜数据之间的一个区别是，在液体中观察到冷冻电镜结果中不存在的其他动态结构（图3E）12。
接下来，检查使用新的微芯片夹心技术在缓冲溶液（50 mM HEPES，pH 7.5;150 mM NaCl;10 mM MgCl 2;10 mM CaCl2）中制备的失活 SARS-CoV-2 样品 （0.25 mg/mL）。新技术采用基于SiN的微芯片以及碳涂层的金网格。在该制备中，将液体样品夹在两个底物之间（图2A-C）。夹层试样用冷冻电镜样品制备中常用的单倾斜试样支架或自动加载器C形夹夹。样品可以立即在TEM中观察或在4°C下储存2个月或更长时间，具体取决于生物标本的稳定性。液体样品中冒泡的外观确保了液体层的存在。液体厚度可以使用EF-TEM协议测量，如12所述。液体中的SARS-CoV-2亚病毒组装体相对于周围液体似乎具有很高的可见对比度（图4A，B）。一些颗粒在病毒表面显示出可见的尖峰，而一些颗粒缺乏尖峰或稀疏地装饰着尖峰（补充图S 3）。通过 8.25 Å 结构的类平均值和切片显示了包含蛋白质亚基和病毒 RNA 基因组的颗粒内部特征（图 4C）。虽然一些粒子似乎含有C2对称性（在测试C2对称性时，粒子当量为2，674），但与对称结构相比，不对称结构没有太大差异。
最后，分析包括玻璃体冰中的轮状病毒DLP（3mg / mL;50 mM HEPES，pH 7.5;150 mM NaCl;10 mM MgCl 2;10 mM CaCl2），方法是手动将微芯片夹层制剂快速冷冻成液氮。冷冻水合标本采用与生产液电镜样品相同的夹心技术。用自动加载器网格夹密封三明治，并在标准条件下使用冷冻透射电镜进行检查。冷冻标本的低放大倍率视图显示几乎没有立方或六边形冰污染，并且在整个观察窗口中观察到密集的DLP区域（图5A，B）。使用EPU包中实现的自动化例程收集图像。通过10.15 Å图谱的类平均值和切片揭示了与病毒蛋白成分和双链RNA基因组一致的稳定特征（图5D，E）。与液电镜样品相比，冷冻电镜图像中DLP和冰背景之间的对比度差异没有那么明显。虽然这种有趣效应的原因仍在确定中，但值得注意的是差异，因为液电镜可能为成像界提供未来的优势。
图 1：用于对液体和冰中的病毒进行高分辨率成像的技术。 这两种工作流程重点介绍了不同的液电镜样品制备方法。左图显示了液态电磁样品支架的示意图。SiN基础微芯片包括一个阵列（500 μm x 100 μm）的集成微孔（10 μm x 10 μm），深度为~150 nm，膜厚~30 nm。右图显示了微芯片夹层技术的示意图，该技术可用于液电镜和冷冻电镜研究。夹层组件使用SiN微芯片与碳涂层金TEM网格配对。组件的横截面表示多个成像窗口，尺寸范围从250μm x 250μm到50μm x 50μm，膜厚度分别为10 nm或5 nm。碳支撑膜的厚度为~5nm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于液体电镜和冷冻电镜 的微芯片夹层技术。 （A） 微芯片夹层组件使用与碳涂层金 TEM 网格配对的 SiN 微芯片。将发光放电的微芯片放置在凝胶包上，并将病毒样品添加到微芯片中。经过短暂的孵育期后，除去多余的溶液，并用TEM网格密封三明治。（B）微芯片夹层在室温下密封在夹紧装置中，可直接装入单倾斜TEM支架或TEM自动加载器系统中。（C）微芯片夹层组件的横截面图突出了微芯片和碳层的尺寸。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：AAV 的液电镜和冷冻电镜结构的比较。 （A） 溶液中AAV的结构（3.22 Å分辨率），彩色径向密度显示5 nm切片。比例尺为 5 nm。成像指标用于使用直接电子探测器进行数据采集。（B）在冰中成像的AAV结构（3.37 Å分辨率）具有彩色径向密度，代表通过结构的5nm切片。比例尺为 5 nm。成像指标用于使用直接电子探测器进行数据采集。（C） 感兴趣区域显示 5 秒和 20 秒的时间点以及在不同时间点计算的傅里叶变换。左侧显示CTF估计值，右侧显示实验数据。（D）从液体和冰结构中提取的AAV VP1亚基的旋转视图。使用晶体结构（PDB代码3KIC，A链25）解释链段。比例尺为10 Å。 （E）使用分子结构分析软件中的形态图功能生成的液体结构中的动态值，并在步骤4.1.6-4.2.3中描述。从左到右，来自多个病毒组件的平均结构显示出构象变化，使用EM数据测量相应的~5%直径变化。体素中的 RMSD 值指示根据色阶的变化。该图已从12 修改而来。请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用微芯片夹心技术在液体中制备的 SARS-CoV-2 亚病毒组件。 （A） 从 COVID-19 患者的血清组分中分离的 SARS-CoV-2 亚病毒组件的图像。成像指标用于使用直接电子探测器进行数据采集。图像右上角的白色气泡是样品中存在液体的视觉指示器。比例尺为 100 nm。（B）计算出的图像傅里叶变换在倒易空间中显示高分辨率信息，在相应图像中几乎没有漂移。类平均值显示了溶液中包含的病毒组件中的独特特征。（C） 通过图以 5 nm 切片处的彩色径向密度显示亚病毒组件的 EM 重建。比例尺为 25 nm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用微芯片夹心技术在液体中制备的轮状病毒 DLP。 （A，B）使用分析软件的低倍率筛选步骤。观察到有限的冰晶，窗膜薄而清晰，简化了数据采集的区域选择。（A）中的比例尺为5μm，（B）中的比例尺为500nm。（C）根据指示的成像指标，使用计数模式下的直接电子检测器采集动画。比例尺为 50 nm。（D）傅里叶变换信息表示数据中存在的高分辨率信息，类平均值在二十面体晶格中显示出很强的特征。类平均值显示病毒组件中没有伪影的特征，并且与其他结构观察结果一致6，15，17。（E） DLP 的 EM 重建（10.15 Å 分辨率），通过地图以 10 nm 切片处的彩色径向密度显示。比例尺为 15 nm。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：确认EM样品中存在液体。在低剂量条件下（<10 e- Å-2 s-1）获得的溶液中AAV颗粒的低放大倍率图像缺乏气泡。使用>100 e- Å-2 s-1的聚焦光束，液体样品显示出气泡形成（黑色箭头）。比例尺为 500 nm。该图已从12 修改。 请点击这里下载此文件。
补充图2：测量液体中AAV尺寸的变化。（A）在20秒的时间范围内获得了病毒颗粒的轮廓痕迹。比例尺为 25 nm。（乙，丙）1、5、10 和 20 秒处颗粒直径测量值的表格和图形表示。在~1e-Å-2 s-1的剂量下，记录20 s期间颗粒直径的总体变化为0.28%。（D，E）短片采集期间在不同时间点确定的信噪比值。该图已从12 修改。 请点击这里下载此文件。
补充图3：患者来源的SARS-CoV-2亚复合物的高放大倍率图像。 异质病毒组装显示某些颗粒表面存在刺突蛋白（红色箭头）。其他颗粒缺乏标记的表面尖峰。比例尺为 100 nm。 请点击此处下载此文件。
视频1：液体中AAV的实时成像。 并排比较液体中AAV的实时记录（左）和颗粒在溶液中扩散的彩色轮廓痕迹（右）。 请点击此处下载此视频。
视频 2：液体中图像追踪的可视化。 AAV在溶液中扩散的彩色和低通滤波电影的并排比较（左） 颗粒在溶液中扩散的彩色轮廓迹线（右）。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
通过使用从冷冻电镜领域改编的新的自动化工具和技术，为简化当前的液电镜工作流程提供了新的机会。与其他方法相比，涉及新的微芯片夹层技术的应用具有重要意义，因为它们能够在液体或玻璃体冰中进行高分辨率成像分析。该协议中最关键的步骤之一是生产具有理想液体厚度的标本，以可视化纳米级的精美细节。在实施高通量例程进行自动数据收集之前，通过筛选整个样品，以较低的放大倍数确定理想的感兴趣区域。如果液体或冰标本中识别的区域包含光束损伤伪影，或者看起来太厚而无法识别视觉上清晰的单个颗粒，则应将其排除在数据收集之外。高分辨率数据采集的局限性包括液体样品中的光束诱导运动和布朗运动。冷冻电镜方法旨在最大限度地减少生物样品中的运动;然而，运动校正方法在减轻这些分辨率限制因素方面具有计算稳健性。如果液体样品存在长程漂移和热不稳定，则可以通过在样品制备步骤中去除过量溶液来制备更薄的样品，以减少液体层的厚度。
当以高浓度使用样品时，可能会导致病毒颗粒之间的分子拥挤。如果存在多个区域具有重叠的颗粒，从而限制了可靠的数据收集，则应在样品制备之前降低输入样品的浓度。具有合适的样品浓度是方案中的关键步骤。包含过量粒子的图像将使下游图像处理程序复杂化。对于纯化的病毒颗粒，适当的浓度范围在0.3-3 mg/mL之间，具体取决于样品的尺寸和分子量。较大的病毒（~100 nm直径或更大）通常需要比较小的病毒（~25 nm直径或更小）更高的浓度才能使该技术成功。另一个需要考虑的因素是目标颗粒粘附在辉光放电微芯片上的水平。如果病毒样本不能很好地粘附在表面，则可能需要更高的浓度来充分制备液电镜或冷冻电镜标本。或者，可以将样品应用于碳涂层的金网格，微芯片用作外壳的盖子。如果这些程序不能为数据收集程序募集足够的粒子，亲和捕获方法可能提供一个可行的选择26，27，28。
液体电镜成像应尽量减少或避免使用某些添加剂，如洗涤剂、甘油、聚乙二醇和高浓度蔗糖或葡萄糖。这些试剂可能会在图像中引入伪影，并导致过度鼓泡、水解产物和由于束损伤而形成自由基。这种效应会导致成像粒子中的柔和特征，并最终限制结构分辨率。如果这些试剂用于生化制剂，则去除这些试剂的一种方法是通过大量透析到缺乏添加剂的缓冲溶液中。这些试剂需要根据具体情况进行测试和使用。此外，一旦使用微芯片夹心技术生产出足够的标本，就可以立即对其进行成像或储存在4°C下，直到准备好检查。储存时间取决于样品稳定性。
总体而言，将液电镜与冷冻电镜结合使用，使研究人员能够使用互补的成像工具检查生物系统。新开发的微芯片夹层技术可为液体或冰块中的TEM成像提供一致的样品。该技术还为研究人员提供了一种简单的方法来制备和查看标本，而无需商业样品架或玻璃化系统。结合自动成像方案，每个样本可以采集大约数千张图像的大量数据。帕森斯及其同事29，30，31，32，33的开创性工作为在液体外壳中生产生物标本奠定了基础。这里介绍的协议描述了最先进的工具现在如何提供一种令人兴奋的方法，通过新的眼睛可视化生物大分子。掌握这些技术后，预计未来的应用与高性能计算相结合，是用于理解3D结构 - 功能关系的实时机制见解。液体电镜领域可能有助于提升对人类健康构成威胁的新型病毒的研究，甚至可能有助于大流行防范措施。总之，这些协议的使用应该允许科学家和工程师更好地研究原子细节的动态过程，包括生命科学，医学和材料研究的各种样品。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。作者Madeline J. Dressel-Dukes是Protochips，Inc.的员工，Michael Spilman是DirectElectron的员工。
Acknowledgments
作者感谢Luk H. Vandenberghe博士（哈佛医学院眼科）提供纯化的AAV-3。这项工作得到了美国国立卫生研究院和国家癌症研究所（R01CA193578，R01CA227261，R01CA219700至DFK）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
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