Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fremme af højopløsningsbilleddannelse af virussamlinger i væske og is

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63856
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1,4, 5, 6, 1, 7, 8, 2, 9, 1,5,6
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskrives protokoller til fremstilling af virussamlinger, der er egnede til væske-EM- og kryo-EM-analyse på nanoskala ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

Interessen for flydende elektronmikroskopi (liquid-EM) er steget kraftigt i de senere år, da forskere nu kan observere realtidsprocesser på nanoskala. Det er yderst ønskeligt at parre højopløselig cryo-EM-information med dynamiske observationer, da mange begivenheder forekommer på hurtige tidsskalaer - i millisekundområdet eller hurtigere. Forbedret viden om fleksible strukturer kan også hjælpe med at designe nye reagenser til bekæmpelse af nye patogener, såsom SARS-CoV-2. Endnu vigtigere er det, at se biologiske materialer i et flydende miljø giver et unikt glimt af deres præstationer i menneskekroppen. Her præsenteres nyudviklede metoder til at undersøge nanoskalaegenskaberne af virussamlinger i flydende og glasagtig is. For at nå dette mål blev veldefinerede prøver brugt som modelsystemer. Side om side sammenligninger af prøveforberedelsesmetoder og repræsentative strukturelle oplysninger præsenteres. Sub-nanometer funktioner er vist for strukturer løst i området ~ 3,5-Å-10 Å. Andre nylige resultater, der understøtter denne komplementære ramme, omfatter dynamisk indsigt i vaccinekandidater og antistofbaserede terapier, der er afbildet i væske. Samlet set fremmer disse korrelative applikationer vores evne til at visualisere molekylær dynamik, hvilket giver en unik kontekst for deres anvendelse i menneskers sundhed og sygdom.

Introduction

Biomedicinsk forskning forbedrer vores forståelse af menneskers sundhed og sygdom gennem udvikling af nye teknologier. Billeddannelse i høj opløsning ændrer vores syn på nanoverdenen - hvilket gør det muligt for os at studere celler og molekyler i udsøgte detaljer 1,2,3,4,5. Statisk information om dynamiske komponenter såsom bløde polymerer, proteinsamlinger eller humane vira afslører kun et begrænset øjebliksbillede af deres komplekse fortælling. For bedre at forstå, hvordan molekylære enheder fungerer, skal deres struktur og funktion undersøges i fællesskab.

Nylige fremskridt inden for produktion af materialer som atomtynd grafen eller siliciumbaserede mikrochips giver nye muligheder for strukturfunktionsanalyse i realtid ved hjælp af transmissionselektronmikroskoper (TEM'er). Disse materialer kan skabe hermetisk lukkede kamre til levende EM-billeddannelse 6,7,8,9,10,11. Det nye felt af væske-EM, stuetemperaturen korrelerer med cryo-EM, giver hidtil usete visninger af hårde eller bløde materialer i opløsning, så forskere samtidig kan studere strukturen og dynamikken i deres prøve. Liquid-EM-applikationer inkluderer realtidsoptagelser af terapeutiske nanopartikler, der interagerer med kræftstamceller samt ændringer i de molekylære forviklinger af virale patogener12,13,14.

Ligesom metodologiske fremskridt ansporede opløsningsrevolutionen inden for cryo-EM-feltet, er der behov for nye teknikker og metoder for at udvide brugen af væske-EM som et værktøj med høj kapacitet for det videnskabelige samfund. Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres her, er at strømline protokoller til forberedelse af flydende EM-prøver. Rationalet bag de udviklede teknikker er at anvende nye mikrochipdesign og autoloader-enheder, der er egnede til både væske- og cryo-EM-dataindsamling (figur 1)7,14,15,16,17. Samlingerne forsegles mekanisk ved hjælp af standardgitterklip til automatiserede instrumenter, såsom Krios, som kan rumme flere prøver pr. session eller en F200C TEM (figur 2). Denne metode udvider brugen af billeddannelse i høj opløsning ud over standard cryo-EM-applikationer, der demonstrerer bredere formål til materialeanalyse i realtid.

I den aktuelle videoartikel præsenteres protokoller til fremstilling af virussamlinger i væske med og uden kommercielt tilgængelige prøveholdere. Ved hjælp af den specialiserede prøveholder til væske-EM kan tynde væskeprøver give strukturelle oplysninger, der kan sammenlignes med cryo-EM-prøver, samt dynamisk indsigt i prøverne. Også demonstreret er metoder til forberedelse af flydende prøver ved hjælp af autoloaderværktøjer til rutiner med høj kapacitet. Den største fordel i forhold til andre teknikker er, at automatiseret prøveproduktion giver brugeren mulighed for hurtigt at vurdere deres prøver for optimal tykkelse og elektrondosering inden dataindsamling. Denne screeningsteknik identificerer hurtigt ideelle områder til realtidsoptagelser i væske eller is12,14,18,19. Med henblik på bestemmelse af 3D-struktur kan liquid-EM supplere de veletablerede cryo-EM-metoder, der er implementeret i cryo-EM. Læsere, der anvender konventionelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan overveje at bruge flydende EM-arbejdsgange til at give nye, dynamiske observationer af deres prøver på en måde, der supplerer deres nuværende strategier.

Virusprøver, der anvendes i denne protokol, omfatter oprenset adeno-associeret virussubtype 3 (AAV) opnået som gave og dyrket under standardbetingelser12. Der blev også anvendt ikke-infektiøse SARS CoV-2 subvirale samlinger afledt af serum fra COVID-19-patienter12 og opnået fra en kommerciel kilde. Endelig blev oprensede simian rotavirus (SA11 stamme) dobbeltlagspartikler (DLP'er) opnået fra laboratoriet af Dr. Sarah M. McDonald Esstman ved Wake Forest University og dyrket ved hjælp af standardbetingelser 6,17. Softwarepakker, der er beskrevet her, er frit tilgængelige, og linkene er angivet i afsnittet Materialetabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lastning af prøveholderen til liquid-EM

  1. Rengør siliciumnitrid (SiN) mikrochips ved at inkubere hver chip i 150 ml acetone i 2 minutter efterfulgt af inkubation i 150 ml methanol i 2 minutter. Lad chips tørre i laminær luftstrøm.
  2. Plasmarenser de tørrede chips ved hjælp af et glødeudladningsinstrument, der fungerer under standardbetingelser på 30 W, 15 mA i 45 s ved hjælp af Argon-gas.
  3. Læg en tør basismikrochip i spidsen af prøveholderen. Der tilsættes ~0,2 μL prøve (0,2-1 mg/ml virusenheder i 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) til basischippen. Efter et inkubationstrin på 1-2 minutter placeres den øverste chip på den våde basechip, der indeholder prøven.
  4. Klem enheden sammen for at danne et hermetisk forseglet kabinet, der holdes på plads mekanisk af tre messingskruer. Ved tætning af samlingen pumpes spidsen til 10-6 Torr ved hjælp af en turbopumpet tørpumpestation. Indehaveren er nu klar til at blive indsat i TEM.
    BEMÆRK: Select-holderen har ingen kølefunktioner og bruges ikke til cryo-EM.

2. Produktion af mikrochip sandwich samlinger

BEMÆRK: Forskellige SiN- eller siliciumdioxidmikrochips (SiO) kan bruges direkte fra de medfølgende gelpakker. Kulstofbelagte guldgitre kan også anvendes direkte som leveret.

  1. Plasma renser mikrochips og kulstofgitter ved hjælp af et glødudladningsinstrument, der fungerer under standardbetingelser på 30 W, 15 mA i 45 s ved hjælp af Argon-gas.
  2. Der tilsættes ~2 μL prøve indeholdt i 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 til en glødeudladet mikrochip anbragt på en gelpakke. Fjern overskydende opløsning (~ 50%) ved hjælp af et filterpapir eller en pipette. Efter et inkubationstrin på 1-2 minutter tilsættes det glødudledte kulstofgitter til den våde mikrochip, der indeholder prøven.
  3. Klem enheden sammen ved hjælp af en enkelt-tilt prøveholder eller autoloader gitterclips ved stuetemperatur for at danne et hermetisk forseglet kabinet. Til autolæsserklemmerne skal du placere sandwichenheden på den nederste C-clips, placere den øverste clips oven på samlingen og bruge standardfastspændingsværktøjet til at forsegle samlingen sammen.
    BEMÆRK: Den fastspændingsprocedure, der udføres her, bruger de samme trin som til cryo-EM-gitterfastspænding, men ved stuetemperatur. Fastspændte prøver kan opbevares i 2 måneder eller længere før billeddannelse, samtidig med at væske opretholdes i kabinettet. Der anvendes ingen lækagekontrol med en prøveholder ved stuetemperatur eller autoloaderen.
  4. Prøven er nu klar til at blive indsat i TEM. Prøver, der er placeret i autoloadere, undersøges under kryoforhold eller ved stuetemperatur.

3. Billeddannelsesprøver ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop

  1. Væske-EM-billeddannelse
    1. Prøveholderen indlæses i TEM udstyret med en feltemissionspistol (FEG) og fungerer ved 200 kV.
    2. Tænd for pistolen, og juster mikroskoptrinnets eucentriske højde i forhold til prøven ved hjælp af woblerfunktionen, idet prøven vippes fra -15° til +15° i kolonnen. Denne procedure justerer trinnet i Z-retningen for at imødekomme prøvetykkelsen. Og hjælper med at sikre en nøjagtig forstørrelse under billedoptagelse.
    3. Optag billeder som langrammede film ved hjælp af in situ-pakken integreret med en direkte detektor med en pixelafstand på 6 μm (Video 1 og Video 2). Individuelle billeder kan også optages ved hjælp af den serielle dataindsamlingssoftwarepakke20, der implementerer automatiserede billedbehandlingsrutiner. Anskaf billeder under lavdosisforhold ved forstørrelser fra 28.000x-92.000x og 40 billeder i sekundet.
    4. Juster eksponeringstiderne (0,25-1 s) for at minimere stråleskader på prøven. Brug et defokuseringsområde på -1-4 μm ved den angivne forstørrelse. Hvis der opstår en tyk løsning, skal du bruge højere defokuseringsværdier eller vælge et andet interesseområde.
    5. Sørg for, at opløsningen er til stede i prøverne under hele billeddannelsessessionen ved at fokusere elektronstrålen på et offerområde, der ikke bruges til dataindsamling, indtil der dannes bobler (supplerende figur 1).
  2. Cryo-EM-billeddannelse
    1. Læg de afklippede EM-gitre eller mikrochipsandwiches i TEM udstyret med en FEG og fungerer ved 300 kV. Tænd pistolen og juster mikroskoptrinnets eucentriske højde ved hjælp af en lignende procedure beskrevet for væske-TEM ovenfor (trin 3.1.2).
    2. Optag individuelle billeder ved hjælp af enkeltpartikelanalysesystemet, der er integreret i mikroskopsystemet, mens du implementerer automatiserede billeddannelsesrutiner. Optag billeder under lavdosisbetingelser ved hjælp af den direkte elektrondetektor til enkeltpartikelanalyse med en pixelafstand på 14 μm ved en forstørrelse på 59.000x og 40 billeder i sekundet.
    3. Brug et defokuseringsområde på 1-4 μm ved den angivne forstørrelse. Hvis der opstår tykke lag glasagtig is, skal du bruge højere defokuseringsværdier eller vælge et andet område til dataindsamling.

4. Dataanalyse og sammenligninger af 3D-strukturer

  1. Analyse af adeno-associeret virus (AAV) i flydende og glasagtig is
    1. Behandl film for AAV-partikler i væske og is ved hjælp af RELION-3.08 program21 eller anden billedbehandlingssoftware22. Udfør bevægelseskorrektion ved hjælp af MotionCor2 v1.2.3.
    2. Når det er korrigeret, udtrækkes partikler ved hjælp af autoplukningsværktøjet i programsoftwarepakken. Typiske boksstørrelser er 330 pixels for flydende prøver og 350 pixels for isprøver.
    3. Beregn indledende rekonstruktioner ved hjælp af C1-symmetri ved hjælp af programmets 3D-indledende modelrutine og / eller ab-initio-modelindstillingerne i databehandlingssoftwarepakken. I programmet skal du bruge en reguleringsparameter på T = 4 og en pixelstørrelse på 1,01 Å for flydende prøver og 1,13 Å for isprøver.
    4. Brug en maskeværdi på 300 Å under hele forfiningsprocedurerne. Udfør raffineringsprotokoller i databehandlingssoftwaren ved hjælp af I1-symmetri for at opnå flere EM-kort. Forventet strukturel opløsning kan ligge i intervallet 4 Å eller bedre. Brug partikelækvivalens, der implementerer icosahedral symmetri ved 16.800 for væske og 15.240 for is12,14.
      BEMÆRK: Opløsningsestimater er baseret på FSC-kriterierne (Gold-standard Fourier shell Correlation).
    5. Mask EM kortlægger ved ~ 250 Å og undersøger resultater ved hjælp af en molekylær strukturanalysesoftwarepakke23,24. I figur 3 vises udsnit i trin på ~5 nm.
    6. Uddrag capsidprotein (VP1) underenheder fra EM-kortene til sammenligning. Kvantificer dynamiske ændringer blandt EM-strukturer baseret på partikeldiametermålingerne (supplerende figur 2), og visualiser derefter ved hjælp af Morph-kortfunktionen i softwaren.
  2. Analyse af SARS-CoV-2 subvirale samlinger i væske
    1. Behandl film ved hjælp af RELION-3.08-programmet. Korrekt for billeddrift og stråleinduceret bevægelse ved hjælp af MotionCor2 v1.2.3. Korrekt for mikroskopets kontrastoverførselsfunktion (CTF).
    2. Brug værktøjet til automatisk valg i programmet til at vælge virale samlinger med en boksstørrelse på 800 pixels. For beregningseffektivitet kan ekstraherede partikler skaleres til 256 pixels. Få en indledende model ved hjælp af C1-symmetri i programmet med en reguleringsparameter på T = 2 og 1,66 Å pixelstørrelse.
    3. Udfør 3D-raffinement i programmet for at opnå et EM-kort, et eksempel vises ved ~ 8,25 Å i henhold til standard FSC-kriterier (figur 4). Visualiser EM-kort ved hjælp af molekylærstrukturanalysesoftwaren med skiver øget ved 25 nm som vist i figur 4.
  3. Analyse af rotavirus dobbeltlagspartikler (DLP'er) i glasagtig is
    1. Behandl film til rotavirus DLP'er ved hjælp af anden billedbehandlingssoftware. Brug MotionCor2 v1.2.3 til at korrigere for drift i billederne. Brug Patch CTF-estimering til at korrigere for objektiveffekter på billederne.
    2. Udtræk partikler ved hjælp af autoplukningsværktøjet i softwaren med en kassestørrelse på 950 pixels. Ned-prøve boksstørrelsen efter behov til computerformål.
    3. Beregn indledende modeller ved hjælp af ab-initio-indstillinger og C1-symmetri . Brug parametre for finjustering, herunder en pixelstørrelse på 1,47 Å og en maskeværdi på 800 Å.
    4. Udfør yderligere forfiningsrutiner, mens du pålægger I1-symmetri. Eksempler på resultater inkluderer et 10,15 Å EM-kort i henhold til FSC-kriterierne efter guldstandarden. De samlede anvendte partikler var 2050, hvilket svarer til 123.000 protomerenheder på grund af den icosahedrale symmetrioperator (figur 5).
    5. Masker endelige kort ved ~ 750 Å og visualiser resultater i softwarepakken til molekylær strukturanalyse. Eksempler på udsnit gennem EM-kortet er vist i figur 5 i trin på ~10 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En væske-TEM, der opererede ved 200 kV, blev brugt til alle væske-EM-billeddannelseseksperimenter, og en cryo-TEM, der opererede ved 300 kV, blev brugt til al cryo-EM-dataindsamling. Repræsentative billeder og strukturer af flere vira præsenteres for at demonstrere nytten af metoderne på tværs af forskellige forsøgspersoner. Disse omfatter rekombinant adeno-associeret virus subtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale samlinger afledt af patientserumet og simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DLP'er), SA11 stamme. For det første påvises sammenligninger for den samme AAV-prøve (1 mg/ml) afbildet i flydende bufferopløsning (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) og i glasagtig is (figur 3A-C; Supplerende figur 2). Væske-EM-prøverne blev fremstillet ved hjælp af SiN-baserede mikrochips og den specialiserede prøveholder. Kryo-EM-prøverne blev fremstillet ved hjælp af standard hullede kulstofgitter og forglasset ved hjælp af en avanceret prøveforberedelsesenhed til flydende ethan. De resulterende virusstrukturer havde lignende samlede diametre på ~ 25 nm. En sammenligning af individuelle VP1 capsid protomerer viste også konsistente træk i både flydende og is EM-kort (figur 3D). En forskel mellem væske-EM- og cryo-EM-dataene var, at der blev observeret yderligere dynamiske strukturer i væske, der ikke var til stede i cryo-EM-resultaterne (figur 3E)12.

Derefter blev deaktiveret SARS-CoV-2-prøver (0,25 mg/ml) fremstillet i bufferopløsning (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) ved hjælp af en ny mikrochipsandwichteknik 7,14. Den nye teknik anvender SiN-baserede mikrochips sammen med kulstofbelagte guldgitter. I dette præparat blev væskeprøven klemt mellem de to substrater (figur 2A-C). Klemte prøver blev fastspændt med en enkelt-tilt prøveholder eller autoloader C-klip, der almindeligvis anvendes til cryo-EM-prøveforberedelse. Prøver kan ses straks i TEM eller opbevares ved 4 °C i 2 måneder eller derover, afhængigt af stabiliteten af den biologiske prøve. Udseendet af boblende i væskeprøverne sikrer tilstedeværelsen af væskelaget. Væsketykkelse kan måles ved hjælp af EF-TEM-protokoller som beskrevet12. SARS-CoV-2 subvirale samlinger i væske syntes at have høj synlig kontrast i forhold til den omgivende væske (figur 4A, B). Nogle partikler viste synlige pigge på virusoverfladen, mens nogle partikler mangler pigge eller er sparsomt dekoreret med dem (supplerende figur S3). Klassegennemsnit og skiver gennem 8,25 Å-strukturen viste interne træk inden for partiklerne bestående af proteinunderenheder og det virale RNA-genom (figur 4C). Selvom nogle partikler syntes at indeholde C2-symmetri (efter test af C2-symmetri var partikelækvivalensen 2.674), adskilte den asymmetriske struktur sig ikke meget i forhold til symmetrisk struktur.

Endelig omfattede analysen rotavirus DLP'er (3 mg/ml; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) i glasagtig is ved manuelt at flashfryse mikrochipsandwichpræparater til flydende nitrogen. Den samme sandwichteknik, der blev brugt til fremstilling af flydende EM-prøver, blev anvendt til frosne hydrerede prøver. Sandwich blev forseglet med autoloader gitterklip og undersøgt ved hjælp af cryo-TEM under standardbetingelser. Lav forstørrelsesvisning af de frosne prøver viste ringe eller ingen kubisk eller sekskantet isforurening, og regioner med tætpakkede DLP'er blev observeret i hele visningsvinduerne (figur 5A, B). Billeder blev indsamlet ved hjælp af automatiserede rutiner implementeret i EPU-pakken. Klassegennemsnit og skiver gennem 10,15 Å-kortet afslørede stabile træk i overensstemmelse med virale proteinkomponenter og det dobbeltstrengede RNA-genom (figur 5D,E). Kontrastforskellen mellem DLP'erne og isbaggrunden var ikke så synlig stærk i cryo-EM-billederne sammenlignet med væske-EM-prøverne. Mens årsagen til denne interessante effekt stadig er ved at blive bestemt, er det værd at bemærke forskellen, da væske-EM kan tilbyde fremtidige fordele for billeddannelsessamfundet.

Figure 1
Figur 1: Teknikker anvendt til højopløsningsbilleddannelse af vira i væske og i is. De to arbejdsgange fremhæver forskellige metoder til forberedelse af væske-EM-prøver. Det venstre panel viser en skematisk repræsentation af en væske-EM-prøveholder. SiN-basismikrochippen indeholder et array (500 μm x 100 μm) integrerede mikrobrønde (10 μm x 10 μm), der er ~ 150 nm dybtgående med en ~ 30 nm tyk membran. Højre panel præsenterer et skema over mikrochipsandwichteknikken, som kan bruges til både væske-EM og cryo-EM forskning. Sandwichsamlingerne bruger en SiN-mikrochip parret med et kulstofbelagt guld TEM-gitter. Tværsnittet af samlingen angiver flere billeddannelsesvinduer fra 250 μm x 250 μm til 50 μm x 50 μm i størrelse med membrantykkelser på henholdsvis 10 nm eller 5 nm. Kulstofstøttefilmen er ~ 5 nm tyk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mikrochipsandwichteknikken til væske-EM og cryo-EM . (A) Mikrochipsandwichenheden bruger en SiN-mikrochip parret med et kulstofbelagt guld TEM-gitter. En glødudladet mikrochip placeres på en gelpakke, og virusprøver tilsættes til mikrochippen. Efter en kort inkubationsperiode fjernes overskydende opløsning, og sandwichen forsegles med TEM-gitteret. (B) Mikrochipsandwichen forsegles i en klippeanordning ved stuetemperatur og kan lægges direkte i en TEM-holder med en enkelt hældning eller et TEM-autoloadersystem. (C) Tværsnitstegninger af mikrochipsandwichenheden fremhæver dimensionerne på mikrochips og kulstoflag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af væske-EM og kryo-EM strukturer af AAV. (A) Struktur af AAV i opløsning (3,22 Å opløsning) med farvede radiale tætheder, der viser 5 nm skiver gennem kortet. Skala bar er 5 nm. Billeddannelsesmålinger er til dataindsamling ved hjælp af den direkte elektrondetektor. (B) Struktur af AAV afbildet i is (3,37 Å opløsning) med farvede radiale tætheder repræsenterer 5 nm skiver gennem strukturen. Skala bar er 5 nm. Billeddannelsesmålinger er til dataindsamling ved hjælp af den direkte elektrondetektor. (C) En interesseregion viser 5 s og 20 s tidspunkter sammen med Fourier-transformationer beregnet på forskellige tidspunkter. Venstre side viser CTF-estimater, højre side viser de eksperimentelle data. (D) Rotationsbilleder af AAV VP1-underenheden ekstraheret fra væske- og isstrukturerne. Segmenterne blev fortolket ved hjælp af krystalstrukturen (PDB-kode 3KIC, A-kæde25). Skalabjælken er 10 Å. (E) Dynamiske værdier i de flydende strukturer, der genereres ved hjælp af morph-kortfunktionen i molekylærstrukturanalysesoftwaren og beskrevet i trin 4.1.6-4.2.3. Fra venstre mod højre viser gennemsnitlige strukturer fra flere virussamlinger konformationsændringer med en tilsvarende ~ 5% diameterændring målt ved hjælp af EM-data. RMSD-værdier i voxels angiver ændringer i henhold til farveskalaen. Tallet er ændret fra12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SARS-CoV-2 subvirale samlinger fremstillet i væske ved hjælp af mikrochipsandwichteknikken. (A) Billede af SARS-CoV-2 subvirale samlinger isoleret fra serumfraktioner fra COVID-19-patienter. Billeddannelsesmålinger er til dataindsamling ved hjælp af den direkte elektrondetektor. Hvide bobler i øverste højre hjørne af billedet er en visuel indikator for, at væske er til stede i prøven. Skala bar er 100 nm. (B) Beregnet Fourier-transformation af billedet viser information i høj opløsning i gensidigt rum med ringe eller ingen drift i det tilsvarende billede. Klassegennemsnit viser unikke træk i de virale samlinger indeholdt i opløsningen. (C) En EM-rekonstruktion af de subvirale samlinger vises med farvede radiale tætheder ved 5 nm skiver gennem kortet. Skala bar er 25 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Rotavirus DLP'er fremstillet i væske ved hjælp af mikrochipsandwichteknikken. (A, B) Screeningstrin med lav forstørrelse ved hjælp af analysesoftwaren. Begrænsede iskrystaller blev observeret, og vinduesmembraner var tynde og klare, hvilket forenklede områdevalg til dataindsamling. Skalabjælke i (A) er 5 μm og i (B) er 500 nm. (C) Film blev erhvervet ved hjælp af den direkte elektrondetektor i tælletilstand i henhold til de angivne billeddannelsesmålinger. Skalabjælken er 50 nm. (D) Fouriertransformationsinformation indikerer information i høj opløsning, der er til stede i dataene, og klassegennemsnit viser stærke træk i det icosahedrale gitter. Klassegennemsnit viser træk i virussamlingerne fri for artefakter og i overensstemmelse med andre strukturelle observationer 6,15,17. (E) En EM-rekonstruktion af DLP'erne (10,15 Å-opløsning) vist med farvede radiale tætheder ved 10 nm skiver gennem kortet. Skalabjælken er 15 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Bekræftelse af tilstedeværelsen af væske i EM-prøver. Lavforstørrelsesbilleder af AAV-partikler i opløsning erhvervet under lavdosisbetingelser (<10 e-Å-2 s-1) mangler bobler. Ved hjælp af en fokuseret stråle på >100 e- Å-2 s-1 viste væskeprøver bobledannelse (sorte pile). Skalabjælken er 500 nm. Tallet er ændret fra12. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Måling af ændringer i AAV-dimensioner i væske. (A) Konturspor af viruspartikler blev erhvervet over en tidsramme på 20 s. Skala bar er 25 nm. (B,C) Tabel og grafiske repræsentationer af partikeldiametermålinger ved 1, 5, 10 og 20 sekunder. Den samlede ændring i partikeldiametre under 20 s-optagelsen var 0,28% ved en dosis på ~1e-Å-2 s-1. (D,E) Signal-støj-værdier bestemt på forskellige tidspunkter under filmoptagelse. Tallet er ændret fra12. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Højforstørrelsesbillede af patientafledte SARS-CoV-2-underkomplekser. Heterogene virale samlinger viste tilstedeværelsen af spikeproteiner (røde pile) på overfladen af nogle partikler. Andre partikler manglede i overfladespidser som mærket. Skala bar er 100 nm. Klik her for at downloade denne fil.

Video 1: Realtidsbilleddannelse af AAV i væske. Side om side sammenligning af en realtidsoptagelse af AAV i væske (venstre) og farvede konturspor af partiklerne, der diffunderer i opløsning (højre). Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Visualisering af billedsporing i væske. Side om side sammenligninger af en farvet og lavpasfiltreret film af AAV, der diffunderer i opløsning (venstre) farvede konturspor af partiklerne, der diffunderer i opløsning (højre). Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der præsenteres nye muligheder for at strømline nuværende liquid-EM-arbejdsgange ved hjælp af nye automatiserede værktøjer og teknologier tilpasset cryo-EM-feltet. Anvendelser, der involverer den nye mikrochipsandwichteknik, er vigtige i forhold til andre metoder, fordi de muliggør billeddannelsesanalyse i høj opløsning i flydende eller glasagtig is. Et af de mest kritiske trin i protokollen er at producere prøver med den ideelle væsketykkelse til at visualisere udsøgte detaljer på nanoskalaniveau. Ideelle områder af interesse identificeres ved lavere forstørrelser ved at screene hele prøven, inden der implementeres rutiner med høj kapacitet til automatiseret dataindsamling. Hvis de identificerede områder i væske- eller isprøver indeholder stråleskadelige artefakter eller forekommer for tykke til at identificere individuelle partikler, der er visuelt skarpe, bør de udelukkes fra dataindsamling. Begrænsninger i dataindsamling i høj opløsning inkluderer stråleinduceret bevægelse og brownsk bevægelse i væskeprøverne. Cryo-EM-metoder sigter mod at minimere bevægelse i biologiske prøver; Bevægelseskorrektionsmetoder er imidlertid beregningsmæssigt robuste til at afbøde disse opløsningsbegrænsende faktorer. Hvis væskeprøverne udviser langdistancedrift og termisk ustabilitet, kan tyndere prøver fremstilles ved at fjerne overskydende opløsning under prøveforberedelsestrin for at reducere tykkelsen af de flydende lag.

Molekylær trængsel blandt viruspartikler kan resultere, når prøver anvendes i høje koncentrationer. Hvis der er flere regioner med overlappende partikler på en måde, der begrænser robust dataindsamling, skal inputprøven reduceres i koncentration inden prøveforberedelse. At have en passende prøvekoncentration er et afgørende skridt i protokollen. Billeder, der indeholder et overskud af partikler, vil komplicere downstream-billedbehandlingsprocedurer. For oprensede viruspartikler er et passende koncentrationsområde mellem 0,3-3 mg / ml afhængigt af prøvens dimensioner og molekylvægt. Større vira (~ 100 nm diameter eller større) kræver typisk højere koncentrationer end mindre vira (~ 25 nm diameter eller mindre) for teknikkens succes. En anden faktor at overveje er det niveau, hvor partiklerne af interesse klæber til de glødudladede mikrochips. Hvis virusprøven ikke klæber godt til overfladen, kan der være behov for en større koncentration for tilstrækkeligt at forberede prøver til væske-EM eller cryo-EM. Alternativt kan prøven i stedet påføres det kulstofbelagte guldgitter med mikrochippen, der tjener som låg på kabinettet. Hvis disse procedurer ikke rekrutterer tilstrækkelige partikler til dataindsamlingsprocedurer, kan affinitetsfangstmetoder udgøre en levedygtig mulighed26,27,28.

Anvendelsen af visse tilsætningsstoffer såsom vaskemidler, glycerol, polyethylenglycoler og høje niveauer af saccharose eller glucose bør minimeres eller undgås til væske-EM-billeddannelse. Disse reagenser kan introducere artefakter i billederne samt føre til overdreven boblende, hydrolyseprodukter og dannelse af frie radikaler på grund af stråleskader. Sådanne effekter fører til dæmpede træk i de afbildede partikler og begrænser i sidste ende strukturel opløsning. En måde at fjerne disse reagenser på, hvis de anvendes i biokemiske præparater, er gennem omfattende dialyse til en bufferopløsning, der mangler tilsætningsstofferne. Disse reagenser skal testes og anvendes fra sag til sag. Når der er fremstillet tilstrækkelige prøver ved hjælp af mikrochipsandwichteknikken, kan de desuden afbildes med det samme eller opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til undersøgelse. Opbevaringstider afhænger af prøvens stabilitet.

Samlet set tillader brug af væske-EM i kombination med cryo-EM forskere at undersøge biologiske systemer med komplementære billeddannelsesværktøjer. Den nyudviklede mikrochipsandwichteknik giver konsistente prøver til TEM-billeddannelse i væske eller is. Teknikken giver også forskere et simpelt middel til at forberede og se prøver uden behov for en kommerciel prøveindehaver eller vitrifikationssystem. I kombination med automatiserede billedprotokoller kan der erhverves store mængder data i størrelsesordenen tusindvis af billeder pr. session pr. prøve. Parsons og kollegernes pionerarbejde 29,30,31,32,33 lagde grunden til at producere biologiske prøver i flydende kabinetter. De protokoller, der præsenteres her, beskriver, hvordan state-of-the-art værktøjer nu kan give et spændende middel til at visualisere biologiske makromolekyler gennem nye øjne. Fremtidige applikationer, der forventes at være resultatet af at mestre disse teknikker, når de er parret med højtydende computing, er mekanistisk indsigt i realtid til forståelse af struktur-funktionsforhold i 3D. Liquid-EM-feltet kan tjene til at hæve forskningen i nye vira, der udgør en trussel mod menneskers sundhed, måske endda bidrage til pandemiske beredskabsforanstaltninger. Sammenfattende bør brugen af disse protokoller gøre det muligt for forskere og ingeniører bedre at studere dynamiske processer ved atomdetaljer på tværs af en lang række prøver, der omfatter biovidenskab, medicin og materialeforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser. Forfatteren, Madeline J. Dressel-Dukes, er ansat hos Protochips, Inc., og Michael Spilman er ansat hos DirectElectron.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) for at levere renset AAV-3. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health og National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 til D.F.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Tags

Biokemi udgave 185 transmissionselektronmikroskopi TEM væske-EM kryo-EM adeno-associeret virus SARS-CoV-2 rotavirus dobbeltlagspartikler DLP'er strukturel biologi
Fremme af højopløsningsbilleddannelse af virussamlinger i væske og is
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiCecco, L. A., Berry, S., Jonaid,… More

DiCecco, L. A., Berry, S., Jonaid, G. M., Solares, M. J., Kaylor, L., Gray, J. L., Bator, C., Dearnaley, W. J., Spilman, M., Dressel-Dukes, M. J., Grandfield, K., McDonald Esstman, S. M., Kelly, D. F. Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice. J. Vis. Exp. (185), e63856, doi:10.3791/63856 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter