Summary
Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.
Abstract
De interesse in vloeistof-elektronenmicroscopie (liquid-EM) is de afgelopen jaren omhooggeschoten omdat wetenschappers nu real-time processen op nanoschaal kunnen observeren. Het is uiterst wenselijk om cryo-EM-informatie met hoge resolutie te koppelen aan dynamische waarnemingen, omdat veel gebeurtenissen zich op snelle tijdschalen voordoen - in het millisecondebereik of sneller. Verbeterde kennis van flexibele structuren kan ook helpen bij het ontwerpen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen, zoals SARS-CoV-2, te bestrijden. Wat nog belangrijker is, het bekijken van biologische materialen in een vloeibare omgeving biedt een unieke glimp van hun prestaties in het menselijk lichaam. Hier worden nieuw ontwikkelde methoden gepresenteerd om de nanoschaaleigenschappen van virusassemblages in vloeibaar en glasachtig ijs te onderzoeken. Om dit doel te bereiken, werden goed gedefinieerde monsters gebruikt als modelsystemen. Vergelijkingen van monstervoorbereidingsmethoden en representatieve structurele informatie worden naast elkaar gepresenteerd. Sub-nanometerkenmerken worden weergegeven voor structuren die zijn opgelost in het bereik van ~ 3,5-Å-10 Å. Andere recente resultaten die dit complementaire kader ondersteunen, omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten en op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Over het algemeen bevorderen deze correlatieve toepassingen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden ze een unieke context voor hun gebruik in de menselijke gezondheid en ziekte.
Introduction
Biomedisch onderzoek verbetert ons begrip van de menselijke gezondheid en ziekte door de ontwikkeling van nieuwe technologieën. Beeldvorming met hoge resolutie transformeert ons beeld van de nanowereld - waardoor we cellen en moleculen in prachtig detailkunnen bestuderen 1,2,3,4,5. Statische informatie van dynamische componenten zoals zachte polymeren, eiwitassemblages of menselijke virussen onthult slechts een beperkte momentopname van hun complexe verhaal. Om beter te begrijpen hoe moleculaire entiteiten werken, moeten hun structuur en functie gezamenlijk worden onderzocht.
Recente ontwikkelingen in de productie van materialen zoals atomair dun grafeen of op silicium gebaseerde microchips bieden nieuwe mogelijkheden voor real-time structuurfunctieanalyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopen (TEMs). Deze materialen kunnen hermetisch afgesloten kamers creëren voor live EM-beeldvorming 6,7,8,9,10,11. Het nieuwe veld van liquid-EM, de kamertemperatuurcorrelecorrel met cryo-EM, biedt ongekende weergaven van harde of zachte materialen in oplossing, waardoor wetenschappers tegelijkertijd de structuur en dynamiek van hun monster kunnen bestuderen. Liquid-EM-toepassingen omvatten real-time opnames van therapeutische nanodeeltjes die interageren met kankerstamcellen en veranderingen in de moleculaire fijne kneepjes van virale pathogenen 12,13,14.
Net zoals methodologische vooruitgang de resolutierevolutie op het gebied van cryo-EM heeft gestimuleerd, zijn nieuwe technieken en methoden nodig om het gebruik van liquid-EM als een high-throughput tool voor de wetenschappelijke gemeenschap uit te breiden. Het algemene doel van de hier gepresenteerde methoden is om de protocollen voor de voorbereiding van vloeibare EM-monsters te stroomlijnen. De reden achter de ontwikkelde technieken is om nieuwe microchipontwerpen en autoloader-apparaten te gebruiken, geschikt voor zowel vloeistof- als cryo-EM-gegevensverzameling (figuur 1) 7,14,15,16,17. De assemblages worden mechanisch afgedicht met behulp van standaard rasterclips voor geautomatiseerde instrumenten, zoals de Krios, die plaats biedt aan meerdere monsters per sessie of een F200C TEM (figuur 2). Deze methodologie breidt het gebruik van beeldvorming met hoge resolutie verder uit dan standaard cryo-EM-toepassingen die bredere doeleinden voor real-time materiaalanalyse demonstreren.
In het huidige videoartikel worden protocollen gepresenteerd voor het bereiden van virusassemblages in vloeistof met en zonder in de handel verkrijgbare monsterhouders. Met behulp van de gespecialiseerde monsterhouder voor liquid-EM kunnen dunne vloeibare monsters structurele informatie bieden die vergelijkbaar is met cryo-EM-monsters, evenals dynamische inzichten van de monsters. Ook worden methoden gedemonstreerd voor het voorbereiden van vloeibare monsters met behulp van autoloader-gereedschappen voor routines met hoge doorvoer. Het grote voordeel ten opzichte van andere technieken is dat geautomatiseerde monsterproductie de gebruiker in staat stelt om zijn monsters snel te beoordelen op optimale dikte en elektronendosering voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Deze screeningstechniek identificeert snel ideale gebieden voor real-time opnames in vloeistof of ijs 12,14,18,19. Met het oog op de bepaling van de 3D-structuur kan liquid-EM een aanvulling vormen op de reeds lang bestaande cryo-EM-methoden die in cryo-EM zijn geïmplementeerd. Lezers die conventionele TEM- of cryo-EM-technologieën gebruiken, kunnen overwegen om liquid-EM-workflows te gebruiken om nieuwe, dynamische observaties van hun monsters te bieden op een manier die hun huidige strategieën aanvult.
Virusmonsters die in dit protocol worden gebruikt, omvatten gezuiverde adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV) verkregen als een geschenk en gekweekt onder standaardomstandigheden12. Ook werden niet-infectieuze SARS CoV-2 subvirale assemblages gebruikt die zijn afgeleid van het serum van COVID-19-patiënten12 en verkregen uit een commerciële bron. Ten slotte werden gezuiverde simian rotavirus (SA11-stam) dubbellaagse deeltjes (DLPs) verkregen uit het laboratorium van Dr. Sarah M. McDonald Esstman aan de Wake Forest University en gekweekt met behulp van standaardomstandigheden 6,17. Softwarepakketten die hier worden beschreven, zijn vrij beschikbaar en de koppelingen zijn beschikbaar in de sectie Materiaaltabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laden van de monsterhouder voor liquid-EM
- Reinig de siliciumnitride (SiN) microchips door elke chip gedurende 2 minuten in 150 ml aceton te incuberen, gevolgd door incubatie in 150 ml methanol gedurende 2 minuten. Laat chips drogen in laminaire luchtstroom.
- Plasma reinigt de gedroogde chips met behulp van een gloeid-ontladingsinstrument dat werkt onder standaardomstandigheden van 30 W, 15 mA gedurende 45 s met behulp van Argon-gas.
- Laad een droge basismicrochip in de punt van de monsterhouder. Voeg ~0,2 μL monster (0,2-1 mg/ml virusassemblages in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) toe aan de basischip. Na een incubatiestap van 1-2 minuten plaatst u de bovenste chip op de natte basischip met het monster.
- Klem de assemblage samen tot een hermetisch afgesloten behuizing, mechanisch op zijn plaats gehouden door drie messing schroeven. Na het afdichten van de assemblage pompt u de punt naar 10-6 Torr met behulp van een droog pompstation met turbocompressor. De houder is nu klaar om in de TEM te worden gestoken.
OPMERKING: De selecte houder heeft geen koelmogelijkheden en wordt niet gebruikt voor cryo-EM.
2. Productie van microchip sandwichassemblages
OPMERKING: Verschillende SiN- of siliciumdioxide (SiO) microchips kunnen rechtstreeks uit de verzonden gelverpakkingen worden gebruikt. Koolstofgecoate gouden roosters kunnen ook direct worden gebruikt zoals geleverd.
- Plasma reinigt de microchips en koolstofroosters met behulp van een gloeiontladingsinstrument dat werkt onder standaardomstandigheden van 30 W, 15 mA gedurende 45 s met behulp van Argon-gas.
- Voeg ~2 μL monster toe in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 op een gloeiende microchip geplaatst op een gelverpakking. Verwijder overtollige oplossing (~50%) met een filtreerpapier of een pipet. Voeg na een incubatiestap van 1-2 minuten het gloeiende koolstofrooster toe aan de natte microchip die het monster bevat.
- Klem de assemblage samen met behulp van een enkele kantelbare monsterhouder of autoloader-rasterclips bij kamertemperatuur om een hermetisch afgesloten behuizing te vormen. Plaats voor de autoladerklemmen de sandwichassemblage op de onderste C-clip, plaats de bovenste clip bovenop de assemblage en gebruik het standaard klemgereedschap om de assemblage samen te dichten.
OPMERKING: De klemprocedure die hier wordt uitgevoerd, gebruikt dezelfde stappen als voor cryo-EM-rasterklemmen, maar dan bij kamertemperatuur. Geklemde monsters kunnen 2 maanden of langer worden bewaard voordat ze worden afbeeldd, terwijl de vloeistof in de behuizing behouden blijft. Er wordt geen lekcontrole gebruikt met een monsterhouder op kamertemperatuur of de autoloader. - Het exemplaar is nu klaar om in de TEM te worden geplaatst. Onderzoek monsters die in autoloaders zijn geplaatst onder cryo-omstandigheden of bij kamertemperatuur.
3. Beeldvorming van monsters met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop
- Liquid-EM beeldvorming
- Laad de monsterhouder in de TEM die is uitgerust met een veldemissiepistool (FEG) en werkt bij 200 kV.
- Schakel het pistool in en pas de eucentrische hoogte van het microscoopstadium aan ten opzichte van het monster met behulp van de wobbler-functie, waarbij het monster in de kolom van -15° naar +15° wordt gekanteld. Met deze procedure wordt het stadium in de Z-richting aangepast aan de dikte van het monster. En zorgt voor een nauwkeurige vergroting tijdens het opnemen van beelden.
- Neem beelden op als langbeeldfilms met behulp van het in situ-pakket dat is geïntegreerd met een directe detector met een pixelafstand van 6 μm (video 1 en video 2). Individuele beelden kunnen ook worden opgenomen met behulp van het seriële softwarepakket20 voor gegevensverzameling, waarbij geautomatiseerde beeldvormingsroutines worden geïmplementeerd. Verkrijg beelden onder omstandigheden met een lage dosis bij vergrotingen variërend van 28.000x-92.000x en 40 frames per seconde.
- Pas de belichtingstijden (0,25-1 s) aan om stralingsschade aan het monster te minimaliseren. Gebruik een onscherptebereik van -1-4 μm bij de opgegeven vergroting. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen, gebruikt u hogere onscherptewaarden of selecteert u een ander interessegebied.
- Zorg ervoor dat de oplossing aanwezig is in de monsters tijdens de beeldvormingssessie door de elektronenbundel te richten op een opofferingsgebied dat niet wordt gebruikt voor gegevensverzameling, totdat bellen worden gevormd (aanvullende figuur 1).
- Cryo-EM beeldvorming
- Laad de geknipte EM-roosters of microchipsandwiches in de TEM die is uitgerust met een FEG en werkt op 300 kV. Schakel het pistool in en pas de eucentrische hoogte van de microscooptrap aan, volgens een vergelijkbare procedure die hierboven is beschreven voor de vloeistof-TEM (stap 3.1.2).
- Neem individuele beelden op met behulp van het analysesysteem voor één deeltjes dat in het microscoopsysteem is geïntegreerd, terwijl geautomatiseerde beeldvormingsroutines worden geïmplementeerd. Neem beelden op onder omstandigheden met lage doses met behulp van de directe elektronendetector voor analyse van één deeltjes met een pixelafstand van 14 μm bij een vergroting van 59.000x en 40 frames per seconde.
- Gebruik een onscherptebereik van 1-4 μm bij de opgegeven vergroting. Als dikke lagen glasachtig ijs worden aangetroffen, gebruikt u hogere onscherptewaarden of selecteert u een ander gebied voor gegevensverzameling.
4. Data-analyse en 3D-structuurvergelijkingen
- Analyse van adeno-geassocieerd virus (AAV) in vloeibaar en glasachtig ijs
- Verwerk films voor AAV-deeltjes in vloeistof en ijs met behulp van RELION-3.08 programma21 of andere beeldverwerkingssoftware22. Voer bewegingscorrectie uit met MotionCor2 v1.2.3.
- Eenmaal gecorrigeerd, extraheer deeltjes met behulp van de auto-picking tool in het programma softwarepakket. Typische doosformaten zijn 330 pixels voor vloeibare exemplaren en 350 pixels voor ijsmonsters.
- Bereken de eerste reconstructies met behulp van C1-symmetrie met behulp van de 3D-initiële modelroutine van het programma en / of de ab-initio-modelopties in het gegevensverwerkingssoftwarepakket. Gebruik in het programma een regularisatieparameter van T = 4 en een pixelgrootte van 1,01 Å voor vloeibare monsters en 1,13 Å voor ijsmonsters.
- Gebruik een maskerwaarde van 300 Å tijdens de verfijningsprocedures. Voer verfijningsprotocollen uit in de gegevensverwerkingssoftware met behulp van I1-symmetrie om meerdere EM-kaarten te verkrijgen. De verwachte structurele resolutie kan in het bereik van 4 Å of beter liggen. Gebruik deeltjesequivalentie en implementeer icosaëstrale symmetrie bij 16.800 voor vloeistof en 15.240 voor ijs12,14.
OPMERKING: Schattingen zijn gebaseerd op de gold-standard Fourier shell correlation (FSC) criteria. - Maskeer EM-kaarten op ~250 Å en onderzoek de resultaten met behulp van een moleculair structuuranalysesoftwarepakket23,24. In figuur 3 worden segmenten weergegeven in stappen van ~5 nm.
- Extract capsid protein (VP1) subeenheden uit de EM-kaarten ter vergelijking. Kwantificeer dynamische veranderingen tussen EM-structuren op basis van de deeltjesdiametermetingen (aanvullende figuur 2) en visualiseer vervolgens met behulp van de Morph-kaartfunctie in de software.
- Analyse van SARS-CoV-2 subvirale assemblages in vloeistof
- Verwerk films met behulp van het RELION-3.08 programma. Corrigeer voor beelddrift en door straal geïnduceerde beweging met MotionCor2 v1.2.3. Correct voor de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) van de microscoop.
- Gebruik de auto-picking tool in het programma om virale assemblages met een doosgrootte van 800 pixels te selecteren. Voor computationele efficiëntie kunnen geëxtraheerde deeltjes worden aangepast tot 256 pixels. Verkrijg een eerste model met behulp van C1-symmetrie in het programma met een regularisatieparameter van T = 2 en 1,66 Å pixelgrootte.
- Voer 3D-verfijning uit in het programma om een EM-kaart te verkrijgen, een voorbeeld wordt weergegeven bij ~ 8,25 Å volgens standaard FSC-criteria (figuur 4). Visualiseer EM-kaarten met behulp van de moleculaire structuuranalysesoftware met plakjes verhoogd bij 25 nm, zoals weergegeven in figuur 4.
- Analyse van rotavirus dubbellaagse deeltjes (DLP's) in glasachtig ijs
- Verwerk films voor rotavirus-DLP's met behulp van andere beeldverwerkingssoftware. Gebruik MotionCor2 v1.2.3 om te corrigeren voor drift in de afbeeldingen. Gebruik Patch CTF-schatting om te corrigeren voor lenseffecten op de afbeeldingen.
- Extraheer deeltjes met behulp van de auto-picking tool in de software met een doosgrootte van 950 pixels. Bekijk een steekproef van de grootte van de doos als dat nodig is voor computerdoeleinden.
- Bereken de eerste modellen met ab-initio-opties en C1-symmetrie . Gebruik verfijningsparameters, waaronder een pixelgrootte van 1,47 Å en een maskerwaarde van 800 Å.
- Voer extra verfijningsroutines uit terwijl u I1-symmetrie oplegt. Voorbeelden van resultaten zijn een 10,15 Å EM-kaart, volgens de gouden standaard FSC-criteria. De totale gebruikte deeltjes waren 2050, wat overeenkomt met 123.000 protomeereenheden als gevolg van de icosaëstrale symmetrie-operator (figuur 5).
- Maskeer de eindkaarten op ~750 Å en visualiseer de resultaten in het softwarepakket voor moleculaire structuuranalyse. Voorbeeldsegmenten door de EM-kaart worden weergegeven in figuur 5 in stappen van ~ 10 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een vloeistof-TEM die op 200 kV werkte, werd gebruikt voor alle vloeistof-EM-beeldvormingsexperimenten en een cryo-TEM die op 300 kV werkte, werd gebruikt voor alle cryo-EM-gegevensverzameling. Representatieve afbeeldingen en structuren van meerdere virussen worden gepresenteerd om het nut van de methoden bij verschillende proefpersonen aan te tonen. Deze omvatten recombinante adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale assemblages afgeleid van het serum van de patiënt en simian rotavirus dubbellaagse deeltjes (DLPs), SA11-stam. Ten eerste worden vergelijkingen aangetoond voor hetzelfde AAV-monster (1 mg/ml) dat is afgebeeld in vloeibare bufferoplossing (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) en in glasachtig ijs (figuur 3A-C; Aanvullende figuur 2). De liquid-EM monsters werden bereid met behulp van SiN-gebaseerde microchips en de gespecialiseerde monsterhouder. De cryo-EM-monsters werden bereid met behulp van standaard gatachtige koolstofroosters en verglaasd met behulp van een ultramoderne monstervoorbereidingseenheid tot vloeibaar ethaan. De resulterende virusstructuren hadden vergelijkbare totale diameters van ~ 25 nm. Een vergelijking van individuele VP1 capsid protomeren toonde ook consistente kenmerken in zowel vloeibare als ijs EM-kaarten (figuur 3D). Een verschil tussen de liquid-EM- en cryo-EM-gegevens was dat extra dynamische structuren in vloeistof werden waargenomen die niet aanwezig waren in de cryo-EM-resultaten (figuur 3E)12.
Vervolgens werden gedeactiveerde SARS-CoV-2-monsters (0,25 mg / ml) bereid in bufferoplossing (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) met behulp van een nieuwe microchip sandwichtechniek 7,14. De nieuwe techniek maakt gebruik van SiN-gebaseerde microchips samen met koolstofgecoate gouden roosters. Bij deze bereiding werd het vloeibare monster ingeklemd tussen de twee substraten (figuur 2A-C). Ingeklemde monsters werden geklemd met een single-tilt monsterhouder of autoloader C-clips die vaak worden gebruikt bij cryo-EM-monstervoorbereiding. Monsters kunnen onmiddellijk in de TEM worden bekeken of gedurende 2 maanden of langer bij 4 °C worden bewaard, afhankelijk van de stabiliteit van het biologische monster. Het verschijnen van borrelen in de vloeistofmonsters zorgt voor de aanwezigheid van de vloeibare laag. Vloeistofdikte kan worden gemeten met behulp van EF-TEM-protocollen zoals beschreven12. SARS-CoV-2 subvirale assemblages in vloeistof bleken een hoog zichtbaar contrast te hebben met betrekking tot de omringende vloeistof (figuur 4A,B). Sommige deeltjes vertoonden zichtbare pieken op het virusoppervlak, terwijl sommige deeltjes geen spikes hebben of er spaarzaam mee zijn versierd (aanvullende figuur S3). Klassegemiddelden en segmenten door de 8,25 Å-structuur vertoonden interne kenmerken in de deeltjes bestaande uit eiwitsubeenheden en het virale RNA-genoom (figuur 4C). Hoewel sommige deeltjes C2-symmetrie bleken te bevatten (bij het testen van C2-symmetrie was de deeltjesequivalentie 2.674), verschilde de asymmetrische structuur niet veel in vergelijking met de symmetrische structuur.
Ten slotte omvatte de analyse rotavirus-DLP's (3 mg/ml; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) in glasachtig ijs door handmatig microchipsandwichpreparaten in vloeibare stikstof te flash-freezingen. Dezelfde sandwichtechniek die werd gebruikt om vloeibare EM-monsters te produceren, werd gebruikt voor bevroren gehydrateerde monsters. Sandwiches werden verzegeld met autoloader grid clips en onderzocht met behulp van de cryo-TEM onder standaardomstandigheden. Lage vergrotingsbeelden van de bevroren exemplaren toonden weinig tot geen kubieke of zeshoekige ijsverontreiniging en regio's van dicht opeengepakte DLP's werden waargenomen in de kijkvensters (figuur 5A, B). Afbeeldingen werden verzameld met behulp van geautomatiseerde routines die in het EPU-pakket zijn geïmplementeerd. Klassegemiddelden en segmenten door de 10,15 Å-kaart onthulden stabiele kenmerken die consistent zijn met virale eiwitcomponenten en het dubbelstrengs RNA-genoom (figuur 5D, E). Het contrastverschil tussen de DLP's en de ijsachtergrond was niet zo zichtbaar sterk in de cryo-EM-beelden in vergelijking met de vloeistof-EM-monsters. Hoewel de oorzaak van dit interessante effect nog steeds wordt bepaald, is het vermeldenswaard het verschil, omdat liquid-EM toekomstige voordelen kan bieden voor de beeldvormingsgemeenschap.
Figuur 1: Technieken die worden gebruikt voor beeldvorming met hoge resolutie van virussen in vloeistof en in ijs. De twee workflows benadrukken verschillende vloeistof-EM-monstervoorbereidingsmethoden. Het linkerpaneel toont een schematische weergave van een vloeistof-EM monsterhouder. De SiN-basismicrochip bevat een array (500 μm x 100 μm) van geïntegreerde microwells (10 μm x 10 μm) die ~ 150 nm diep zijn met een ~ 30 nm dik membraan. Het rechterpaneel presenteert een schema van de microchip sandwich techniek, die gebruikt kan worden voor zowel liquid-EM als cryo-EM onderzoek. De sandwichassemblages maken gebruik van een SiN-microchip in combinatie met een met koolstof gecoat gouden TEM-rooster. De dwarsdoorsnede van de assemblage geeft meerdere beeldvensters aan, variërend van 250 μm x 250 μm tot 50 μm x 50 μm groot met membraandiktes van respectievelijk 10 nm of 5 nm. De koolstofondersteunende film is ~5 nm dik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De microchip sandwich techniek voor liquid-EM en cryo-EM. (A) De microchip sandwich assemblage maakt gebruik van een SiN microchip in combinatie met een carbon-coated gouden TEM grid. Een gloeiende microchip wordt op een gelverpakking geplaatst en virusmonsters worden aan de microchip toegevoegd. Na een korte incubatietijd wordt overtollige oplossing verwijderd en wordt de sandwich verzegeld met het TEM-rooster. (B) De sandwich met microchip wordt bij kamertemperatuur verzegeld in een knipapparaat en kan rechtstreeks in een TEM-houder met één kanteling of een TEM-autoloadersysteem worden geladen. (C) Dwarsdoorsnedetekeningen van het microchipsandwichassemblage benadrukken de afmetingen van de microchips en de koolstoflaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van liquid-EM en cryo-EM structuren van AAV. (A) Structuur van AAV in oplossing (3,22 Å-resolutie) met gekleurde radiale dichtheden die 5 nm-segmenten door de kaart laten zien. Schaalbalk is 5 nm. Imaging metrics zijn voor data-acquisitie met behulp van de directe elektronendetector. (B) Structuur van AAV afgebeeld in ijs (3,37 Å resolutie) met gekleurde radiale dichtheden vertegenwoordigen 5 nm plakjes door de structuur. Schaalbalk is 5 nm. Imaging metrics zijn voor data-acquisitie met behulp van de directe elektronendetector. (C) Een interessegebied toont 5 s en 20 s tijdpunten samen met Fouriertransformaties berekend op verschillende tijdstippen. Linkerkant toont CTF-schattingen, rechterkant toont de experimentele gegevens. (D) Rotatiebeelden van de AAV VP1-subeenheid die wordt geëxtraheerd uit de vloeistof- en ijsstructuren. De segmenten werden geïnterpreteerd met behulp van de kristalstructuur (PDB-code 3KIC, A-keten25). De schaalbalk is 10 Å. (E) Dynamische waarden in de vloeibare structuren die worden gegenereerd met behulp van de morph map-functie in de moleculaire structuuranalysesoftware en beschreven in stap 4.1.6-4.2.3. Van links naar rechts vertonen gemiddelde structuren van meerdere virusassemblages conformatieveranderingen met een overeenkomstige diameterverandering van ~ 5%, gemeten met behulp van EM-gegevens. RMSD-waarden in voxels geven veranderingen aan op basis van de kleurschaal. Het cijfer is gewijzigd van12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: SARS-CoV-2 subvirale assemblages bereid in vloeistof met behulp van de microchip sandwich techniek. (A) Afbeelding van SARS-CoV-2 sub-virale assemblages geïsoleerd uit serumfracties van COVID-19-patiënten. Imaging metrics zijn voor data-acquisitie met behulp van de directe elektronendetector. Witte bubbels in de rechterbovenhoek van de afbeelding zijn een visuele indicator dat er vloeistof in het monster aanwezig is. Schaalbalk is 100 nm. (B) Berekende Fouriertransformatie van het beeld toont informatie met een hoge resolutie in de wederkerige ruimte met weinig tot geen drift in het overeenkomstige beeld. Klassegemiddelden tonen unieke kenmerken in de virale assemblages in de oplossing. (C) Een EM-reconstructie van de subvirale assemblages wordt getoond met gekleurde radiale dichtheden bij 5 nm-plakjes door de kaart. Schaalbalk is 25 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Rotavirus-DLP's bereid in vloeistof met behulp van de microchip sandwichtechniek. (A,B) Screeningsstappen voor lage vergroting met behulp van de analysesoftware. Beperkte ijskristallen werden waargenomen en raammembranen waren dun en helder, waardoor de gebiedsselectie voor gegevensverzameling werd vereenvoudigd. Schaalbalk in (A) is 5 μm en in (B) is 500 nm. (C) Films werden verkregen met behulp van de directe elektronendetector in de telmodus volgens de aangegeven beeldmetrieken. Schaalbalk is 50 nm. (D) Fouriertransformatie-informatie geeft informatie met een hoge resolutie aan die aanwezig is in de gegevens en klassegemiddelden vertonen sterke kenmerken in het icosaëdrale rooster. Klassegemiddelden tonen kenmerken in de virusassemblages die vrij zijn van artefacten en consistent zijn met andere structurele waarnemingen 6,15,17. (E) Een EM-reconstructie van de DLP's (10,15 Å-resolutie) weergegeven met gekleurde radiale dichtheden bij 10 nm segmenten door de kaart. Schaalbalk is 15 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Bevestiging van de aanwezigheid van vloeistof in EM-monsters. Lage vergrotingsbeelden van AAV-deeltjes in oplossing verkregen onder omstandigheden met lage doses (<10 e- Å-2 s-1) missen bubbels. Met behulp van een gerichte bundel van >100 e- Å-2 s-1 vertoonden vloeistofmonsters bubbelvorming (zwarte pijlen). Schaalbalk is 500 nm. Het cijfer is gewijzigd van12. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Meting van veranderingen in AAV-afmetingen in vloeistof. (A) Contoursporen van virusdeeltjes werden verworven over een tijdsbestek van 20 s. Schaalbalk is 25 nm. (B,C) Tabel en grafische weergaven van deeltjesdiametermetingen op 1, 5, 10 en 20 seconden. De totale verandering in deeltjesdiameters tijdens de 20 s-opname was 0,28% bij een dosis ~1e- Å-2 s-1. (D,E) Signaal-ruiswaarden bepaald op verschillende tijdstippen tijdens het verkrijgen van films. Het cijfer is gewijzigd van12. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Afbeelding met hoge vergroting van van de patiënt afgeleide SARS-CoV-2-subcomplexen. Heterogene virale assemblages toonden de aanwezigheid van spike-eiwitten (rode pijlen) op het oppervlak van sommige deeltjes. Andere deeltjes ontbraken in oppervlaktepieken zoals gelabeld. Schaalbalk is 100 nm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Video 1: Real-time beeldvorming van AAV in vloeistof. Zij-aan-zij vergelijking van een real-time opname van AAV in vloeistof (links) en gekleurde contoursporen van de deeltjes die in oplossing diffunderen (rechts). Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Visualisatie van beeldtracering in vloeistof. Zij-aan-zij vergelijkingen van een gekleurde en laagdoorlaat gefilterde film van AAV diffuserend in oplossing (links) gekleurde contoursporen van de deeltjes die in oplossing diffunderen (rechts). Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er worden nieuwe mogelijkheden geboden om de huidige liquid-EM-workflows te stroomlijnen door gebruik te maken van nieuwe geautomatiseerde tools en technologieën die zijn aangepast aan het cryo-EM-veld. Toepassingen met betrekking tot de nieuwe microchip sandwichtechniek zijn belangrijk met betrekking tot andere methoden omdat ze beeldvormingsanalyse met hoge resolutie in vloeibaar of glasachtig ijs mogelijk maken. Een van de meest kritieke stappen in het protocol is het produceren van monsters met de ideale vloeistofdikte om prachtige details op nanoschaalniveau te visualiseren. Ideale interessegebieden worden geïdentificeerd bij lagere vergrotingen door het volledige monster te screenen voordat routines met hoge doorvoer worden geïmplementeerd voor geautomatiseerde gegevensverzameling. Als de geïdentificeerde gebieden in vloeibare of ijsmonsters beam-damage artefacten bevatten of te dik lijken om individuele deeltjes te identificeren die visueel scherp zijn, moeten ze worden uitgesloten van gegevensverzameling. Beperkingen in data-acquisitie met hoge resolutie zijn onder meer door de bundel geïnduceerde beweging en Brownse beweging in de vloeistofmonsters. Cryo-EM-methoden zijn gericht op het minimaliseren van beweging in biologische monsters; bewegingscorrectiemethoden zijn echter computationeel robuust in het beperken van deze resolutiebeperkende factoren. Als de vloeistofmonsters drift over lange afstand en thermische instabiliteit vertonen, kunnen dunnere monsters worden bereid door overtollige oplossing te verwijderen tijdens de monstervoorbereidingsstappen om de dikte van de vloeibare lagen te verminderen.
Moleculaire verdringing tussen virusdeeltjes kan het gevolg zijn wanneer monsters in hoge concentraties worden gebruikt. Als er meerdere regio's zijn met overlappende deeltjes op een manier die robuuste gegevensverzameling beperkt, moet het inputmonster vóór de monstervoorbereiding in concentratie worden verminderd. Het hebben van een geschikte monsterconcentratie is een cruciale stap in het protocol. Beelden die een teveel aan deeltjes bevatten, zullen downstream beeldverwerkingsprocedures bemoeilijken. Voor gezuiverde virusdeeltjes ligt een adequaat concentratiebereik tussen 0,3-3 mg /ml, afhankelijk van de afmetingen en het molecuulgewicht van het monster. Grotere virussen (~ 100 nm diameter of groter) vereisen meestal hogere concentraties dan kleinere virussen (~ 25 nm diameter of minder) voor het succes van de techniek. Een andere factor om te overwegen is het niveau waarop de deeltjes van belang zich hechten aan de gloeiende microchips. Als het virusmonster niet goed aan het oppervlak hecht, kan een grotere concentratie nodig zijn om monsters adequaat voor te bereiden op liquid-EM of cryo-EM. Als alternatief kan het monster in plaats daarvan worden aangebracht op het met koolstof gecoate gouden rooster met de microchip als deksel van de behuizing. Als deze procedures er niet in slagen voldoende deeltjes te rekruteren voor procedures voor het verzamelen van gegevens, kunnen methoden voor affiniteitsverzameling een haalbare optie vormen 26,27,28.
Het gebruik van bepaalde additieven zoals detergentia, glycerol, polyethyleenglycolen en hoge niveaus van sucrose of glucose moet worden geminimaliseerd of vermeden voor liquid-EM-beeldvorming. Deze reagentia kunnen artefacten in de afbeeldingen introduceren en leiden tot overmatig borrelen, hydrolyseproducten en vorming van vrije radicalen als gevolg van stralingsschade. Dergelijke effecten leiden tot gedempte kenmerken in de afgebeelde deeltjes en beperken uiteindelijk de structurele resolutie. Een manier om deze reagentia te verwijderen als ze worden gebruikt in biochemische preparaten is door uitgebreide dialyse in een bufferoplossing zonder de additieven. Deze reagentia moeten van geval tot geval worden getest en gebruikt. Bovendien kunnen, zodra voldoende monsters zijn geproduceerd met behulp van de microchip sandwichtechniek, deze onmiddellijk in beeld worden gebracht of bij 4 °C worden bewaard totdat ze klaar zijn om te worden onderzocht. De opslagtijden zijn afhankelijk van de stabiliteit van het monster.
Over het algemeen stelt het gebruik van liquid-EM in combinatie met cryo-EM onderzoekers in staat om biologische systemen te onderzoeken met complementaire beeldvormingstools. De nieuw ontwikkelde microchip sandwich techniek levert consistente monsters voor TEM beeldvorming in vloeistof of ijs. De techniek biedt onderzoekers ook een eenvoudig middel om specimens te bereiden en te bekijken zonder dat er een commerciële monsterhouder of vitrificatiesysteem nodig is. In combinatie met geautomatiseerde beeldvormingsprotocollen kunnen per specimen grote hoeveelheden data in de orde van grootte van duizenden beelden per sessie worden verkregen. Het pionierswerk van Parsons en collega's 29,30,31,32,33 legde de basis voor het produceren van biologische specimens in vloeibare behuizingen. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven hoe state-of-the-art tools nu een opwindend middel kunnen bieden om biologische macromoleculen door nieuwe ogen te visualiseren. Toekomstige toepassingen die naar verwachting het resultaat zullen zijn van het beheersen van deze technieken, in combinatie met high-performance computing, zijn real-time mechanistische inzichten voor het begrijpen van structuur-functierelaties in 3D. Het liquid-EM-veld kan dienen om onderzoek naar nieuwe virussen die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid te verheffen, misschien zelfs bijdragen aan pandemieparaatheidsmaatregelen. Kortom, het gebruik van deze protocollen zou wetenschappers en ingenieurs in staat moeten stellen om dynamische processen op atomair detail beter te bestuderen, in een grote verscheidenheid aan monsters die levenswetenschappen, geneeskunde en materiaalonderzoek omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. De auteur, Madeline J. Dressel-Dukes, is een werknemer van Protochips, Inc. en Michael Spilman is een werknemer van DirectElectron.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) voor het verstrekken van gezuiverde AAV-3. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health en het National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 tot D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
