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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63856
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1,4, 5, 6, 1, 7, 8, 2, 9, 1,5,6
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University
* These authors contributed equally

Summary

Ici, des protocoles sont décrits pour préparer des assemblages de virus adaptés à l’analyse liquide-EM et cryo-EM à l’échelle nanométrique en utilisant la microscopie électronique à transmission.

Abstract

L’intérêt pour la microscopie électronique liquide (EM liquide) a explosé ces dernières années, car les scientifiques peuvent maintenant observer des processus en temps réel à l’échelle nanométrique. Il est extrêmement souhaitable de coupler des informations cryo-EM à haute résolution avec des observations dynamiques, car de nombreux événements se produisent à des échelles de temps rapides - de l’ordre de la milliseconde ou plus. Une meilleure connaissance des structures flexibles peut également aider à la conception de nouveaux réactifs pour lutter contre les agents pathogènes émergents, tels que le SRAS-CoV-2. Plus important encore, l’observation des matériaux biologiques dans un environnement fluide donne un aperçu unique de leur performance dans le corps humain. Les méthodes nouvellement développées ici sont présentées pour étudier les propriétés à l’échelle nanométrique des assemblages de virus dans la glace liquide et vitreuse. Pour atteindre cet objectif, des échantillons bien définis ont été utilisés comme systèmes modèles. Des comparaisons côte à côte des méthodes de préparation des échantillons et des informations structurelles représentatives sont présentées. Les caractéristiques sub-nanométriques sont montrées pour les structures résolues dans la plage de ~3,5-Å-10 Å. Parmi les autres résultats récents qui soutiennent ce cadre complémentaire, citons les connaissances dynamiques des candidats vaccins et des thérapies à base d’anticorps imagées dans un liquide. Dans l’ensemble, ces applications corrélatives font progresser notre capacité à visualiser la dynamique moléculaire, fournissant un contexte unique pour leur utilisation dans la santé et la maladie humaines.

Introduction

La recherche biomédicale améliore notre compréhension de la santé et des maladies humaines grâce au développement de nouvelles technologies. L’imagerie à haute résolution transforme notre vision du nanomonde - nous permettant d’étudier les cellules et les molécules dans les moindres détails 1,2,3,4,5. L’information statique des composants dynamiques tels que les polymères mous, les assemblages de protéines ou les virus humains ne révèle qu’un instantané limité de leur récit complexe. Pour mieux comprendre le fonctionnement des entités moléculaires, leur structure et leur fonction doivent être étudiées conjointement.

Les progrès récents dans la production de matériaux tels que le graphène atomiquement mince ou les micropuces à base de silicium offrent de nouvelles possibilités d’analyse structure-fonction en temps réel à l’aide de microscopes électroniques à transmission (MET). Ces matériaux peuvent créer des chambres hermétiquement scellées pour l’imagerie EM en direct 6,7,8,9,10,11. Le nouveau champ de liquide-EM, le corrélat à température ambiante à cryo-EM, fournit des vues sans précédent des matériaux durs ou mous en solution, permettant aux scientifiques d’étudier simultanément la structure et la dynamique de leur échantillon. Les applications EM liquides comprennent des enregistrements en temps réel de nanoparticules thérapeutiques interagissant avec les cellules souches cancéreuses ainsi que des changements dans les subtilités moléculaires des pathogènes viraux12,13,14.

Tout comme les progrès méthodologiques ont stimulé la révolution de la résolution dans le domaine de la cryo-EM, de nouvelles techniques et méthodes sont nécessaires pour étendre l’utilisation de la ME liquide en tant qu’outil à haut débit pour la communauté scientifique. L’objectif global des méthodes présentées ici est de rationaliser les protocoles de préparation des échantillons liquides. La raison d’être des techniques développées est d’utiliser de nouvelles conceptions de micropuces et de dispositifs de chargement automatique, adaptés à la collecte de données liquides et cryo-EM (Figure 1)7,14,15,16,17. Les assemblages sont scellés mécaniquement à l’aide de clips de grille standard pour les instruments automatisés, tels que le Krios, qui peut accueillir plusieurs échantillons par session ou un TEM F200C (Figure 2). Cette méthodologie étend l’utilisation de l’imagerie haute résolution au-delà des applications cryo-EM standard, démontrant des objectifs plus larges pour l’analyse des matériaux en temps réel.

Dans le présent article vidéo, des protocoles sont présentés pour la préparation d’assemblages de virus dans un liquide avec et sans porte-échantillons disponibles dans le commerce. En utilisant le porte-échantillon spécialisé pour les échantillons liquides-EM, les échantillons liquides minces peuvent fournir des informations structurelles comparables aux échantillons cryo-EM, ainsi que des informations dynamiques sur les échantillons. Des méthodes de préparation d’échantillons liquides à l’aide d’outils de chargement automatique pour les routines à haut débit ont également été démontrées. Le principal avantage par rapport aux autres techniques est que la production automatisée d’échantillons permet à l’utilisateur d’évaluer rapidement ses échantillons pour une épaisseur et un dosage d’électrons optimaux avant la collecte des données. Cette technique de criblage identifie rapidement les zones idéales pour les enregistrements en temps réel dans un liquide ou de la glace12,14,18,19. Aux fins de la détermination de la structure 3D, la solution EM liquide peut compléter les méthodes cryo-EM établies de longue date mises en œuvre dans la cryo-EM. Les lecteurs utilisant des technologies conventionnelles de GDT ou de cryo-EM peuvent envisager d’utiliser des flux de travail liquide-EM pour fournir de nouvelles observations dynamiques de leurs échantillons d’une manière qui complète leurs stratégies actuelles.

Les échantillons de virus utilisés dans ce protocole comprennent le virus adéno-associé purifié de sous-type 3 (AAV) obtenu en cadeau et cultivé dans des conditions standard12. Des assemblages sous-viraux non infectieux du SRAS-CoV-2 dérivés du sérum de patients atteints de COVID-1912 et obtenus d’une source commerciale ont également été utilisés. Enfin, des particules à double couche (DLP) purifiées du rotavirus simien (souche SA11) ont été obtenues dans le laboratoire du Dr Sarah M. McDonald Esstman à l’Université de Wake Forest et cultivées en utilisant des conditions standard 6,17. Les progiciels décrits ici sont disponibles gratuitement et les liens ont été fournis dans la section Tableau des matériaux.

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Protocol

1. Chargement du porte-échantillon pour liquide-EM

  1. Nettoyez les micropuces de nitrure de silicium (SiN) en incubant chaque puce dans 150 mL d’acétone pendant 2 minutes, suivie d’une incubation dans 150 mL de méthanol pendant 2 min. Laissez les copeaux sécher dans un flux d’air laminaire.
  2. Nettoyez au plasma les copeaux séchés à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard de 30 W, 15 mA pendant 45 s en utilisant du gaz argon.
  3. Chargez une micropuce à base sèche dans l’extrémité du porte-échantillon. Ajouter ~0,2 μL d’échantillon (0,2-1 mg/mL d’assemblages de virus dans 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) à la puce de base. Après une étape d’incubation de 1 à 2 minutes, placez la puce supérieure sur la puce de base humide contenant l’échantillon.
  4. Serrez l’ensemble ensemble pour former une enceinte hermétiquement scellée, maintenue mécaniquement en place par trois vis en laiton. Lors de l’étanchéité de l’ensemble, pompez la pointe à 10-6 Torr à l’aide d’une station de pompage à sec turbo-pompée . Le support est maintenant prêt à être inséré dans le TEM.
    REMARQUE: Le support de sélection n’a aucune capacité de refroidissement et n’est pas utilisé pour cryo-EM.

2. Production d’assemblages sandwich à micropuce

REMARQUE: Différentes micropuces SiN ou dioxyde de silicium (SiO) peuvent être utilisées directement à partir des packs de gel expédiés. Les grilles en or revêtues de carbone peuvent également être utilisées directement telles qu’elles sont fournies.

  1. Nettoyez au plasma les micropuces et les grilles de carbone à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard de 30 W, 15 mA pendant 45 s en utilisant du gaz argon.
  2. Ajouter ~2 μL d’échantillon contenu dans 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 à une micropuce à décharge luminescente placée sur un sachet de gel. Éliminer l’excès de solution (~50%) à l’aide d’un papier filtre ou d’une pipette. Après une étape d’incubation de 1 à 2 minutes, ajoutez la grille de carbone à décharge luminescente à la micropuce humide contenant l’échantillon.
  3. Serrez l’ensemble à l’aide d’un porte-échantillon à inclinaison unique ou de clips de grille de chargeur automatique à température ambiante pour former un boîtier hermétiquement fermé. Pour les pinces à chargement automatique, placez l’ensemble sandwich sur le clip C inférieur, placez le clip supérieur sur le dessus de l’ensemble et utilisez l’outil de serrage standard pour sceller l’ensemble.
    REMARQUE: La procédure de serrage effectuée ici utilise les mêmes étapes que pour le serrage cryo-EM de grille, mais à température ambiante. Les échantillons serrés peuvent être conservés pendant 2 mois ou plus avant l’imagerie tout en maintenant le liquide dans l’enceinte. Aucun contrôle d’étanchéité n’est utilisé avec un porte-échantillon à température ambiante ou le chargeur automatique.
  4. Le spécimen est maintenant prêt à être inséré dans le TEM. Examiner les échantillons placés dans des chargeurs automatiques dans des conditions cryogéniques ou à température ambiante.

3. Imagerie d’échantillons au microscope électronique à transmission

  1. Imagerie EM liquide
    1. Charger le porte-échantillon dans le TEM équipé d’un canon à émission de champ (FEG) et fonctionnant à 200 kV.
    2. Allumez le pistolet et ajustez la hauteur eucentrique de l’étage du microscope par rapport à l’échantillon en utilisant la fonction wobbler, en inclinant l’échantillon de -15° à +15° dans la colonne. Cette procédure ajuste l’étage dans la direction Z pour s’adapter à l’épaisseur de l’échantillon. Et permet d’assurer un grossissement précis pendant l’enregistrement de l’image.
    3. Enregistrez des images sous forme de films à cadre long à l’aide du boîtier in situ intégré à un détecteur direct ayant un espacement des pixels de 6 μm (vidéo 1 et vidéo 2). Les images individuelles peuvent également être enregistrées à l’aide du progiciel de collecte de données série20, mettant en œuvre des routines d’imagerie automatisées. Obtenez des images dans des conditions de faible dose à des grossissements allant de 28 000 x à 92 000x et 40 images par seconde.
    4. Ajuster les temps d’exposition (0,25-1 s) pour minimiser les dommages causés par le faisceau à l’échantillon. Utilisez une plage de flou de -1-4 μm au grossissement spécifié. Si une solution épaisse est rencontrée, utilisez des valeurs de défocalisation plus élevées ou sélectionnez une autre région d’intérêt.
    5. Assurez-vous que la solution est présente dans les échantillons tout au long de la séance d’imagerie en concentrant le faisceau d’électrons sur une zone sacrificielle non utilisée pour la collecte de données, jusqu’à ce que des bulles se forment (figure supplémentaire 1).
  2. Imagerie cryo-EM
    1. Chargez les grilles EM coupées ou les sandwichs à micropuce dans le TEM équipé d’un FEG et fonctionnant à 300 kV. Allumez le pistolet et ajustez la hauteur eucentrique de la platine du microscope, en utilisant une procédure similaire décrite pour le TEM liquide ci-dessus (étape 3.1.2).
    2. Enregistrez des images individuelles à l’aide du système d’analyse de particules unique intégré au système de microscope tout en mettant en œuvre des routines d’imagerie automatisées. Enregistrez des images dans des conditions à faible dose à l’aide du détecteur d’électrons direct à analyse de particules unique ayant un espacement des pixels de 14 μm à un grossissement de 59 000x et 40 images par seconde.
    3. Utilisez une plage de flou de 1 à 4 μm au grossissement spécifié. Si d’épaisses couches de glace vitreuse sont rencontrées, utilisez des valeurs de flou plus élevées ou sélectionnez une autre région pour la collecte de données.

4. Analyse des données et comparaisons de structures 3D

  1. Analyse du virus adéno-associé (AAV) dans la glace liquide et vitreuse
    1. Traiter les films pour les particules AAV dans le liquide et la glace en utilisant RELION-3.08 programme21 ou un autre logiciel de traitement d’image22. Effectuez une correction de mouvement à l’aide de MotionCor2 v1.2.3.
    2. Une fois corrigées, extraire les particules à l’aide de l’outil de prélèvement automatique dans le progiciel du programme. Les tailles de boîte typiques sont de 330 pixels pour les spécimens liquides et de 350 pixels pour les spécimens de glace.
    3. Calculez les reconstructions initiales à l’aide de la symétrie C1 à l’aide de la routine du modèle initial 3D du programme et/ou des options de modèle ab-initio dans le progiciel de traitement des données. Dans le programme, utilisez un paramètre de régularisation de T = 4 et une taille de pixel de 1,01 Å pour les échantillons liquides et de 1,13 Å pour les spécimens de glace.
    4. Utilisez une valeur de masque de 300 Å tout au long des procédures d’affinement. Exécuter des protocoles d’affinement dans le logiciel de traitement des données en utilisant la symétrie I1 pour obtenir plusieurs cartes EM. La résolution structurelle attendue peut être de l’ordre de 4 Å ou mieux. Utiliser l’équivalence des particules en appliquant la symétrie icosaédrique à 16 800 pour le liquide et à 15 240 pour la glace12,14.
      REMARQUE : Les estimations de résolution sont basées sur les critères de corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence.
    5. Masquez les cartes EM à ~250 Å et examinez les résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse de structure moléculaire23,24. Dans la figure 3, les tranches sont représentées par incréments de ~5 nm.
    6. Extraire les sous-unités de la protéine de capside (VP1) des cartes EM à des fins de comparaison. Quantifier les changements dynamiques entre les structures EM en fonction des mesures du diamètre des particules (Figure supplémentaire 2), puis visualisez à l’aide de la fonction Morph map du logiciel.
  2. Analyse des assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dans un liquide
    1. Traitez les films à l’aide du programme RELION-3.08. Correction de la dérive de l’image et du mouvement induit par le faisceau à l’aide de MotionCor2 v1.2.3. Corriger la fonction de transfert de contraste (CTF) du microscope.
    2. Utilisez l’outil de sélection automatique du programme pour sélectionner des assemblages viraux d’une taille de boîte de 800 pixels. Pour l’efficacité de calcul, les particules extraites peuvent être redimensionnées à 256 pixels. Obtenez un modèle initial en utilisant la symétrie C1 dans le programme avec un paramètre de régularisation de T = 2 et une taille de pixel de 1,66 Å.
    3. Effectuez un raffinement 3D dans le programme pour obtenir une carte EM, un exemple est montré à ~8,25 Å selon les critères FSC standard (Figure 4). Visualisez les cartes EM à l’aide du logiciel d’analyse de structure moléculaire avec des tranches incrémentées à 25 nm, comme illustré à la figure 4.
  3. Analyse des particules à double couche (DLP) du rotavirus dans la glace vitrée
    1. Traiter les films pour les DLP de rotavirus à l’aide d’autres logiciels de traitement d’image. Utilisez MotionCor2 v1.2.3 pour corriger la dérive des images. Utilisez l’estimation CTF du patch pour corriger les effets de lentille sur les images.
    2. Extrayez les particules à l’aide de l’outil de prélèvement automatique du logiciel avec une taille de boîte de 950 pixels. Sous-échantillonnez la taille de la boîte selon les besoins informatiques.
    3. Calculez les modèles initiaux à l’aide des options ab-initio et de la symétrie C1. Utilisez des paramètres d’affinement, notamment une taille de pixel de 1,47 Å et une valeur de masque de 800 Å.
    4. Effectuez des routines de raffinement supplémentaires tout en imposant la symétrie I1. Les exemples de résultats incluent une carte EM de 10,15 Å, selon les critères FSC de référence. Le nombre total de particules utilisées était de 2050, ce qui équivaut à 123 000 unités protomères en raison de l’opérateur de symétrie icosaédrique (Figure 5).
    5. Masquez les cartes finales à ~750 Å et visualisez les résultats dans le progiciel d’analyse de structure moléculaire. Des exemples de tranches à travers la carte EM sont présentés à la figure 5 par incréments de ~10 nm.

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Representative Results

Un TEM liquide fonctionnant à 200 kV a été utilisé pour toutes les expériences d’imagerie EM liquide et un cryo-TEM fonctionnant à 300 kV a été utilisé pour toute la collecte de données cryo-EM. Des images et des structures représentatives de plusieurs virus sont présentées pour démontrer l’utilité des méthodes sur divers sujets de test. Il s’agit notamment du virus adéno-associé recombinant de sous-type 3 (AAV), des assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dérivés du sérum du patient et des particules à double couche du rotavirus simien (DLP), souche SA11. Tout d’abord, des comparaisons sont démontrées pour le même échantillon d’AAV (1 mg/mL) imagé dans une solution tampon liquide (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) et dans de la glace vitrée (Figure 3A-C; Figure supplémentaire 2). Les échantillons EM liquides ont été préparés à l’aide de micropuces à base de SiN et du porte-échantillon spécialisé. Les échantillons cryo-EM ont été préparés à l’aide de grilles de carbone trouées standard et vitrifiés à l’aide d’une unité de préparation d’échantillons de pointe en éthane liquide. Les structures virales résultantes avaient des diamètres globaux similaires de ~25 nm. Une comparaison des protomères individuels de la capside VP1 a également montré des caractéristiques cohérentes dans les cartes EM liquides et glacées (Figure 3D). Une différence entre les données liquide-EM et cryo-EM était que des structures dynamiques supplémentaires ont été observées dans le liquide qui n’étaient pas présentes dans les résultats cryo-EM (Figure 3E)12.

Ensuite, des échantillons de SARS-CoV-2 désactivés (0,25 mg/mL) ont été examinés préparés dans une solution tampon (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) à l’aide d’une nouvelle technique sandwich à micropuce 7,14. La nouvelle technique utilise des micropuces à base de SiN ainsi que des grilles en or revêtues de carbone. Dans cette préparation, l’échantillon liquide a été pris en sandwich entre les deux substrats (Figure 2A-C). Les échantillons pris en sandwich ont été serrés avec un porte-échantillon à inclinaison unique ou des clips C à chargeur automatique couramment utilisés dans la préparation d’échantillons cryo-EM. Les échantillons peuvent être visualisés immédiatement dans le TEM ou conservés à 4 °C pendant 2 mois ou plus, selon la stabilité de l’échantillon biologique. L’apparition de bulles dans les échantillons liquides assure la présence de la couche liquide. L’épaisseur du liquide peut être mesurée à l’aide des protocoles EF-TEM décrits12. Les assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dans un liquide semblaient présenter un contraste visible élevé par rapport au liquide environnant (Figure 4A,B). Certaines particules présentaient des pics visibles à la surface du virus, tandis que d’autres en manquaient ou en étaient peu décorées (figure supplémentaire S3). Les moyennes de classe et les tranches à travers la structure 8,25 Å ont montré des caractéristiques internes dans les particules comprenant des sous-unités protéiques et le génome de l’ARN viral (Figure 4C). Bien que certaines particules semblaient contenir une symétrie C2 (lors du test de symétrie C2, l’équivalence des particules était de 2 674), la structure asymétrique ne différait pas beaucoup par rapport à la structure symétrique.

Enfin, l’analyse a inclus des DLP à rotavirus (3 mg/mL; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) dans de la glace vitrée par congélation manuelle de préparations sandwich à micropuce dans de l’azote liquide. La même technique de sandwich utilisée pour produire des échantillons EM liquides a été utilisée pour les échantillons hydratés congelés. Les sandwichs ont été scellés avec des pinces de grille de chargeur automatique et examinés à l’aide du cryo-TEM dans des conditions standard. Les vues à faible grossissement des spécimens congelés ont montré peu ou pas de contamination par la glace cubique ou hexagonale et des régions de DLP densément tassées ont été observées tout au long des fenêtres d’observation (figure 5A, B). Les images ont été collectées à l’aide de routines automatisées implémentées dans le package EPU. Les moyennes de classe et les tranches à travers la carte de 10,15 Å ont révélé des caractéristiques stables compatibles avec les composants protéiques viraux et le génome de l’ARN double brin (Figure 5D,E). La différence de contraste entre les DLP et le fond de glace n’était pas aussi visible dans les images cryo-EM par rapport aux échantillons liquide-EM. Bien que la cause de cet effet intéressant soit encore en cours de détermination, il convient de noter la différence, car les EM liquides peuvent offrir des avantages futurs pour la communauté de l’imagerie.

Figure 1
Figure 1 : Techniques utilisées pour l’imagerie à haute résolution des virus dans le liquide et dans la glace. Les deux flux de travail mettent en évidence différentes méthodes de préparation d’échantillons liquides-EM. Le panneau de gauche montre une représentation schématique d’un porte-échantillon EM liquide. La micropuce de base SiN comprend un réseau (500 μm x 100 μm) de micropuits intégrés (10 μm x 10 μm) d’une profondeur de ~150 nm avec une membrane de ~30 nm d’épaisseur. Le panneau de droite présente un schéma de la technique sandwich à micropuce, qui peut être utilisée à la fois pour la recherche liquide-EM et cryo-EM. Les assemblages sandwich utilisent une micropuce SiN jumelée à une grille TEM dorée revêtue de carbone. Une coupe transversale de l’ensemble indique plusieurs fenêtres d’imagerie allant de 250 μm x 250 μm à 50 μm x 50 μm avec des épaisseurs de membrane de 10 nm ou 5 nm, respectivement. Le film de support en carbone a une épaisseur de ~5 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Technique sandwich par micropuce pour les EM liquides et les cryo-EM. (A) L’assemblage sandwich de micropuce utilise une micropuce SiN jumelée à une grille TEM en or revêtue de carbone. Une micropuce à décharge luminescente est placée sur une boîte de gel et des échantillons de virus sont ajoutés à la micropuce. Après une brève période d’incubation, l’excès de solution est éliminé et le sandwich est scellé avec la grille TEM. (B) Le sandwich à micropuce est scellé dans un dispositif de clipse à température ambiante et peut être chargé directement dans un support TEM à inclinaison unique ou un système de chargeur automatique TEM. (C) Les dessins en coupe transversale de l’assemblage sandwich de micropuce mettent en évidence les dimensions des micropuces et de la couche de carbone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison des structures liquide-EM et cryo-EM de l’AAV. (A) Structure de l’AAV en solution (résolution de 3,22 Å) avec des densités radiales colorées montrant des tranches de 5 nm à travers la carte. La barre d’échelle est de 5 nm. Les métriques d’imagerie sont destinées à l’acquisition de données à l’aide du détecteur d’électrons direct. (B) Structure de l’AAV imagée dans la glace (résolution de 3,37 Å) avec des densités radiales colorées représentant des tranches de 5 nm à travers la structure. La barre d’échelle est de 5 nm. Les métriques d’imagerie sont destinées à l’acquisition de données à l’aide du détecteur d’électrons direct. (C) Une région d’intérêt montre des points de temps de 5 s et 20 s ainsi que des transformées de Fourier calculées à différents points de temps. Le côté gauche montre les estimations de la CTF, le côté droit montre les données expérimentales. (D) Vues rotationnelles de la sous-unité AAV VP1 extraite des structures liquide et glacée. Les segments ont été interprétés à l’aide de la structure cristalline (code PDB 3KIC, chaîneA 25). La barre d’échelle est de 10 Å. (E) Valeurs dynamiques dans les structures liquides générées à l’aide de la fonction de carte de morphologie du logiciel d’analyse de structure moléculaire et décrites aux étapes 4.1.6-4.2.3. De gauche à droite, les structures moyennées de plusieurs assemblages de virus montrent des changements conformationnels avec un changement de diamètre correspondant de ~5%, mesuré à l’aide de données EM. Les valeurs RMSD en voxels indiquent les changements en fonction de l’échelle de couleurs. La figure a été modifiée de12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : assemblages sous-viraux du SRAS-CoV-2 préparés dans un liquide à l’aide de la technique sandwich par micropuce. (A) Image des assemblages sous-viraux du SRAS-CoV-2 isolés à partir de fractions sériques de patients atteints de COVID-19. Les métriques d’imagerie sont destinées à l’acquisition de données à l’aide du détecteur d’électrons direct. Les bulles blanches dans le coin supérieur droit de l’image sont un indicateur visuel de la présence de liquide dans l’échantillon. La barre d’échelle est de 100 nm. (B) La transformée de Fourier calculée de l’image montre des informations à haute résolution dans l’espace réciproque avec peu ou pas de dérive dans l’image correspondante. Les moyennes de classe montrent des caractéristiques uniques dans les assemblages viraux contenus dans la solution. (C) Une reconstruction EM des assemblages sous-viraux est montrée avec des densités radiales colorées à des tranches de 5 nm à travers la carte. La barre d’échelle est de 25 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : DLP du rotavirus préparées dans un liquide à l’aide de la technique sandwich par micropuce. (A,B) Étapes de criblage à faible grossissement à l’aide du logiciel d’analyse. Des cristaux de glace limités ont été observés, et les membranes des fenêtres étaient minces et claires, ce qui simplifiait la sélection des zones pour l’acquisition des données. La barre d’échelle dans (A) est de 5 μm et dans (B) est de 500 nm. (C) Les films ont été acquis à l’aide du détecteur d’électrons direct en mode comptage selon les paramètres d’imagerie indiqués. La barre d’échelle est de 50 nm. (D) L’information de la transformée de Fourier indique que l’information à haute résolution présente dans les données et les moyennes de classe montrent de fortes caractéristiques dans le réseau icosaédrique. Les moyennes de classe montrent des caractéristiques dans les assemblages de virus exemptes d’artefacts et cohérentes avec d’autres observations structurelles 6,15,17. (E) Une reconstruction EM des DLP (résolution de 10,15 Å) montrée avec des densités radiales colorées à des tranches de 10 nm à travers la carte. La barre d’échelle est de 15 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Confirmation de la présence de liquide dans les échantillons EM. Les images à faible grossissement de particules AAV en solution acquises dans des conditions de faible dose (<10 e- Å-2 s-1) sont dépourvues de bulles. En utilisant un faisceau focalisé de >100 e- Å-2 s-1, des échantillons liquides ont montré la formation de bulles (flèches noires). La barre d’échelle est de 500 nm. Le chiffre a été modifié de12. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Mesure des changements dans les dimensions de l’AAV dans le liquide. (A) Des traces de contour de particules virales ont été acquises sur une période de 20 s. La barre d’échelle est de 25 nm. (B,C) Tableau et représentations graphiques des mesures de diamètre des particules à 1, 5, 10 et 20 secondes. Le changement global du diamètre des particules au cours de l’enregistrement de 20 s était de 0,28% à une dose de ~1e- Å-2 s-1. (D, E) Valeurs signal/bruit déterminées à différents moments lors de l’acquisition du film. Le chiffre a été modifié de12. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Image à fort grossissement des sous-complexes SARS-CoV-2 dérivés du patient. Des assemblages viraux hétérogènes ont montré la présence de protéines de pointe (flèches rouges) à la surface de certaines particules. D’autres particules manquaient de pointes de surface telles qu’elles étaient marquées. La barre d’échelle est de 100 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo 1 : Imagerie en temps réel de l’AAV dans un liquide. Comparaison côte à côte d’un enregistrement en temps réel d’AAV dans un liquide (à gauche) et de traces de contour colorées des particules diffusant en solution (à droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Visualisation du traçage d’images dans un liquide. Comparaisons côte à côte d’un film filtré coloré et passe-bas d’AAV diffusant en solution (à gauche) des tracés de contour colorés des particules diffusant en solution (à droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

De nouvelles opportunités sont présentées pour rationaliser les flux de travail actuels de liquide EM en utilisant de nouveaux outils automatisés et des technologies adaptées du domaine cryo-EM. Les applications impliquant la nouvelle technique sandwich par micropuce sont importantes par rapport à d’autres méthodes, car elles permettent une analyse d’imagerie à haute résolution dans la glace liquide ou vitreuse. L’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à produire des spécimens avec l’épaisseur de liquide idéale pour visualiser des détails exquis à l’échelle nanométrique. Les régions d’intérêt idéales sont identifiées à des grossissements plus faibles en examinant l’échantillon entier avant de mettre en œuvre des routines à haut débit pour la collecte automatisée de données. Si les régions identifiées dans les échantillons liquides ou de glace contiennent des artefacts endommagés par le faisceau ou semblent trop épaisses pour identifier des particules individuelles visuellement nettes, elles devraient être exclues de la collecte de données. Les limites de l’acquisition de données à haute résolution comprennent le mouvement induit par le faisceau et le mouvement brownien dans les échantillons liquides. Les méthodes cryo-EM visent à minimiser le mouvement dans les échantillons biologiques; Cependant, les méthodes de correction de mouvement sont robustes sur le plan informatique pour atténuer ces facteurs limitant la résolution. Si les échantillons liquides présentent une dérive à longue distance et une instabilité thermique, des échantillons plus minces peuvent être préparés en éliminant l’excès de solution pendant les étapes de préparation de l’échantillon afin de réduire l’épaisseur des couches liquides.

L’encombrement moléculaire entre les particules virales peut se produire lorsque les échantillons sont utilisés à des concentrations élevées. S’il y a plusieurs régions avec des particules qui se chevauchent d’une manière qui limite la collecte de données robustes, la concentration de l’échantillon d’entrée devrait être réduite avant la préparation de l’échantillon. Avoir une concentration d’échantillon appropriée est une étape cruciale du protocole. Les images qui contiennent un excès de particules compliqueront les procédures de traitement d’image en aval. Pour les particules virales purifiées, une plage de concentration adéquate se situe entre 0,3 et 3 mg/mL, selon les dimensions et le poids moléculaire de l’échantillon. Les virus plus gros (~100 nm de diamètre ou plus) nécessitent généralement des concentrations plus élevées que les virus plus petits (~25 nm de diamètre ou moins) pour le succès de la technique. Un autre facteur à considérer est le niveau auquel les particules d’intérêt adhèrent aux micropuces déchargées par la lueur. Si l’échantillon de virus n’adhère pas bien à la surface, une concentration plus élevée peut être nécessaire pour préparer adéquatement les échantillons pour la ME liquide ou cryo-EM. Alternativement, l’échantillon peut plutôt être appliqué sur la grille d’or recouverte de carbone avec la micropuce servant de couvercle de l’enceinte. Si ces procédures ne parviennent pas à recruter suffisamment de particules pour les procédures de collecte de données, les méthodes de capture par affinité peuvent présenter une option viable26,27,28.

L’utilisation de certains additifs tels que les détergents, le glycérol, le polyéthylèneglycol et des niveaux élevés de saccharose ou de glucose doit être minimisée ou évitée pour l’imagerie EM liquide. Ces réactifs peuvent introduire des artefacts dans les images et entraîner un bouillonnement excessif, des produits d’hydrolyse et la formation de radicaux libres en raison des dommages causés par le faisceau. De tels effets conduisent à des caractéristiques atténuées dans les particules imagées et limitent finalement la résolution structurelle. Une façon d’éliminer ces réactifs s’ils sont utilisés dans des préparations biochimiques consiste à procéder à une dialyse approfondie dans une solution tampon dépourvue d’additifs. Ces réactifs devront être testés et utilisés au cas par cas. De plus, une fois qu’un nombre suffisant d’échantillons ont été produits à l’aide de la technique du sandwich à micropuce, ils peuvent être imagés immédiatement ou conservés à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être examinés. Les temps de stockage dépendent de la stabilité de l’échantillon.

Dans l’ensemble, l’utilisation de la ME liquide en combinaison avec la cryo-EM permet aux chercheurs d’examiner les systèmes biologiques avec des outils d’imagerie complémentaires. La nouvelle technique de sandwich par micropuce produit des échantillons cohérents pour l’imagerie TEM dans un liquide ou de la glace. La technique fournit également aux chercheurs un moyen simple de préparer et de visualiser des spécimens sans avoir besoin d’un porte-échantillon commercial ou d’un système de vitrification. En combinaison avec des protocoles d’imagerie automatisés, de grandes quantités de données de l’ordre de milliers d’images par session peuvent être acquises par échantillon. Le travail de pionnier de Parsons et de ses collègues 29,30,31,32,33 a jeté les bases de la production de spécimens biologiques dans des enclos liquides. Les protocoles présentés ici décrivent comment des outils de pointe peuvent maintenant fournir un moyen passionnant de visualiser les macromolécules biologiques à travers de nouveaux yeux. Les applications futures qui devraient résulter de la maîtrise de ces techniques, lorsqu’elles sont associées au calcul haute performance, sont des informations mécanistes en temps réel pour comprendre les relations structure-fonction en 3D. Le domaine des ME liquides peut servir à élever la recherche sur les nouveaux virus qui constituent une menace pour la santé humaine, peut-être même contribuer aux mesures de préparation en cas de pandémie. En résumé, l’utilisation de ces protocoles devrait permettre aux scientifiques et aux ingénieurs de mieux étudier les processus dynamiques au niveau des détails atomiques, à travers une grande variété d’échantillons englobant les sciences de la vie, la médecine et la recherche sur les matériaux.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. L’auteur, Madeline J. Dressel-Dukes, est une employée de Protochips, Inc. et Michael Spilman est un employé de DirectElectron.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Département d’ophtalmologie) pour avoir fourni AAV-3 purifié. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health et le National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 à D.F.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

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References

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Biochimie numéro 185 microscopie électronique à transmission MET liquide-EM cryo-EM virus adéno-associé SARS-CoV-2 particules à double couche de rotavirus DLP biologie structurale
Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace
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