Summary
Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.
Abstract
Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie (Flüssig-EM) ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da Wissenschaftler nun Echtzeitprozesse auf der Nanoskala beobachten können. Es ist äußerst wünschenswert, hochauflösende Kryo-EM-Informationen mit dynamischen Beobachtungen zu koppeln, da viele Ereignisse auf schnellen Zeitskalen auftreten - im Millisekundenbereich oder schneller. Verbesserte Kenntnisse über flexible Strukturen können auch bei der Entwicklung neuartiger Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 helfen. Noch wichtiger ist, dass die Betrachtung biologischer Materialien in einer flüssigen Umgebung einen einzigartigen Einblick in ihre Leistung im menschlichen Körper bietet. Hier werden neu entwickelte Methoden vorgestellt, um die nanoskaligen Eigenschaften von Virusanordnungen in flüssigem und glasigem Eis zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden gut definierte Stichproben als Modellsysteme verwendet. Direkte Vergleiche von Probenvorbereitungsmethoden und repräsentativen Strukturinformationen werden vorgestellt. Sub-Nanometer-Merkmale werden für Strukturen gezeigt, die im Bereich von ~3,5-Å-10 Å aufgelöst sind. Andere aktuelle Ergebnisse, die diesen komplementären Rahmen unterstützen, umfassen dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten und Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet sind. Insgesamt verbessern diese korrelativen Anwendungen unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für ihre Verwendung in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.
Introduction
Biomedizinische Forschung verbessert unser Verständnis von menschlicher Gesundheit und Krankheit durch die Entwicklung neuer Technologien. Hochauflösende Bildgebung verändert unseren Blick auf die Nanowelt - und ermöglicht es uns, Zellen und Moleküle in exquisiten Details zu untersuchen 1,2,3,4,5. Statische Informationen dynamischer Komponenten wie weicher Polymere, Proteinanordnungen oder menschlicher Viren zeigen nur eine begrenzte Momentaufnahme ihrer komplexen Erzählung. Um besser zu verstehen, wie molekulare Einheiten funktionieren, müssen ihre Struktur und Funktion gemeinsam untersucht werden.
Jüngste Fortschritte bei der Herstellung von Materialien wie atomar dünnem Graphen oder siliziumbasierten Mikrochips bieten neue Möglichkeiten für die Echtzeit-Strukturfunktionsanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs). Diese Materialien können hermetisch abgeschlossene Kammern für die Live-EM-Bildgebung 6,7,8,9,10,11 erzeugen. Das neue Feld der Flüssig-EM, die Raumtemperatur korreliert mit Kryo-EM, bietet beispiellose Ansichten von harten oder weichen Materialien in Lösung, so dass Wissenschaftler gleichzeitig die Struktur und Dynamik ihrer Probe untersuchen können. Flüssig-EM-Anwendungen umfassen Echtzeitaufnahmen von therapeutischen Nanopartikeln, die mit Krebsstammzellen interagieren, sowie Veränderungen in den molekularen Feinheiten viraler Krankheitserreger12,13,14.
So wie methodische Fortschritte die Auflösungsrevolution im Kryo-EM-Bereich vorangetrieben haben, sind neue Techniken und Methoden erforderlich, um den Einsatz von Flüssig-EM als Hochdurchsatzwerkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft zu erweitern. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Protokolle zur Vorbereitung von Flüssig-EM-Proben zu rationalisieren. Der Grund für die entwickelten Techniken ist der Einsatz neuer Mikrochip-Designs und Autoloader-Geräte, die sowohl für die Datenerfassung von Flüssigkeiten als auch für Kryo-EM geeignet sind (Abbildung 1)7,14,15,16,17). Die Baugruppen werden mechanisch mit Standard-Rasterclips für automatisierte Instrumente wie dem Krios versiegelt, der mehrere Proben pro Sitzung aufnehmen kann, oder einem F200C TEM (Abbildung 2). Diese Methodik erweitert den Einsatz hochauflösender Bildgebung über Standard-Kryo-EM-Anwendungen hinaus und demonstriert breitere Zwecke für die Echtzeit-Materialanalyse.
Im aktuellen Videoartikel werden Protokolle zur Herstellung von Virusbaugruppen in Flüssigkeit mit und ohne handelsübliche Probenhalter vorgestellt. Mit dem speziellen Probenhalter für Flüssig-EM können dünnflüssige Proben strukturelle Informationen liefern, die mit Kryo-EM-Proben vergleichbar sind, sowie dynamische Einblicke in die Proben. Demonstriert werden auch Methoden zur Vorbereitung flüssiger Proben mit Autoloader-Werkzeugen für Hochdurchsatzroutinen. Der große Vorteil gegenüber anderen Techniken besteht darin, dass die automatisierte Probenproduktion es dem Benutzer ermöglicht, seine Proben vor der Datenerfassung schnell auf optimale Dicke und Elektronendosierung zu beurteilen. Diese Screening-Technik identifiziert schnell ideale Bereiche für Echtzeitaufnahmen in Flüssigkeit oder Eis12,14,18,19. Für die Zwecke der 3D-Strukturbestimmung kann Liquid-EM die seit langem etablierten Kryo-EM-Methoden ergänzen, die in Kryo-EM implementiert sind. Leser, die konventionelle TEM- oder Kryo-EM-Technologien einsetzen, können die Verwendung von Flüssig-EM-Workflows in Betracht ziehen, um neue, dynamische Beobachtungen ihrer Proben in einer Weise bereitzustellen, die ihre aktuellen Strategien ergänzt.
Zu den in diesem Protokoll verwendeten Virusproben gehören gereinigte adenoassoziierte Virussubtypen 3 (AAV), die als Geschenk gewonnen und unter Standardbedingungen kultiviertwerden 12. Ebenfalls verwendet wurden nicht-infektiöse subvirale SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus dem Serum von COVID-19-Patienten12 gewonnen und aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden. Schließlich wurden gereinigte Affenrotavirus (SA11-Stamm) Doppelschichtpartikel (DLPs) aus dem Labor von Dr. Sarah M. McDonald Esstman an der Wake Forest University gewonnen und unter Standardbedingungen 6,17 kultiviert. Die hier beschriebenen Softwarepakete sind frei verfügbar und die Links wurden im Abschnitt Materialverzeichnis bereitgestellt.
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Protocol
1. Beladung des Probenhalters für Flüssig-EM
- Reinigen Sie die Siliziumnitrid (SiN)-Mikrochips, indem Sie jeden Chip in 150 ml Aceton für 2 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 ml Methanol für 2 min. Lassen Sie die Späne im laminaren Luftstrom trocknen.
- Plasmareinigung der getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas betrieben wird.
- Legen Sie einen Mikrochip mit trockener Basis in die Spitze des Probenhalters. Fügen Sie ~0,2 μL Probe (0,2-1 mg/ml Virusanordnungen in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) zum Basischip hinzu. Nach einem 1-2-minütigen Inkubationsschritt legen Sie den oberen Chip auf den nassen Basischip, der die Probe enthält.
- Klemmen Sie die Baugruppe zusammen, um ein hermetisch abgeschlossenes Gehäuse zu bilden, das mechanisch von drei Messingschrauben gehalten wird. Nach dem Versiegeln der Baugruppe pumpen Sie die Spitze mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf 10-6 Torr. Die Halterung ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden.
HINWEIS: Der ausgewählte Halter hat keine Kühlfunktionen und wird nicht für Kryo-EM verwendet.
2. Herstellung von Mikrochip-Sandwichbaugruppen
HINWEIS: Verschiedene SiN- oder Siliziumdioxid (SiO)-Mikrochips können direkt aus den mitgelieferten Gelpacks verwendet werden. Kohlenstoffbeschichtete Goldgitter können auch direkt im Lieferumfang verwendet werden.
- Plasma reinigt die Mikrochips und Kohlenstoffgitter mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas arbeitet.
- Fügen Sie ~ 2 μL der Probe hinzu, die in 50 mM HEPES enthalten ist, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 zu einem Glim-entladenen Mikrochip auf einer Gelpackung. Entfernen Sie überschüssige Lösung (~ 50%) mit einem Filterpapier oder einer Pipette. Nach einem 1-2-minütigen Inkubationsschritt fügen Sie das Glimment-entladene Kohlenstoffgitter zu dem nassen Mikrochip hinzu, der die Probe enthält.
- Klemmen Sie die Baugruppe mit einem Einzelneigeprobenhalter oder Autoloader-Gitterclips bei Raumtemperatur zusammen, um ein hermetisch dichtes Gehäuse zu bilden. Legen Sie bei den automatischen Ladeklemmen die Sandwichbaugruppe auf den unteren C-Clip, legen Sie den oberen Clip auf die Baugruppe und verwenden Sie das Standardspannwerkzeug, um die Baugruppe zusammen zu versiegeln.
HINWEIS: Der hier durchgeführte Klemmvorgang verwendet die gleichen Schritte wie beim Kryo-EM-Gitterspannen, jedoch bei Raumtemperatur. Geklemmte Proben können vor der Bildgebung 2 Monate oder länger gelagert werden, während Flüssigkeit im Gehäuse gehalten wird. Mit einem Probenhalter bei Raumtemperatur oder dem Autoloader wird keine Dichtheitsprüfung durchgeführt. - Die Probe ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden. Untersuchen Sie Proben, die in Autoloadern unter Kryobedingungen oder bei Raumtemperatur platziert werden.
3. Bildgebende Proben mit einem Transmissionselektronenmikroskop
- Flüssig-EM-Bildgebung
- Legen Sie den Probenhalter in das TEM, das mit einer Feldemissionspistole (FEG) ausgestattet ist und mit 200 kV arbeitet.
- Schalten Sie die Pistole ein und stellen Sie die euzentrische Höhe des Mikroskoptisches in Bezug auf die Probe ein, indem Sie die Wobbler-Funktion verwenden, wobei die Probe in der Säule von -15° auf +15° geneigt wird. Bei diesem Verfahren wird der Tisch in Z-Richtung angepasst, um die Probendicke aufzunehmen. Und sorgt für eine genaue Vergrößerung während der Bildaufnahme.
- Nehmen Sie Bilder als Langfilme auf, indem Sie das In-situ-Paket verwenden, das mit einem direkten Detektor mit einem Pixelabstand von 6 μm (Video 1 und Video 2) integriert ist. Einzelne Bilder können auch unter Verwendung des seriellen Datenerfassungssoftwarepakets20 aufgezeichnet werden, wobei automatisierte Bildgebungsroutinen implementiert werden. Nehmen Sie Bilder unter niedrig dosierten Bedingungen mit Vergrößerungen von 28.000x bis 92.000x und 40 Bildern pro Sekunde auf.
- Stellen Sie die Belichtungszeiten (0,25-1 s) ein, um Strahlschäden an der Probe zu minimieren. Verwenden Sie einen Defokussierungsbereich von -1-4 μm bei der angegebenen Vergrößerung. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird, verwenden Sie höhere Defokussierungswerte oder wählen Sie einen anderen Bereich von Interesse aus.
- Stellen Sie sicher, dass die Lösung während der gesamten Bildgebungssitzung in den Proben vorhanden ist, indem Sie den Elektronenstrahl auf einen Opferbereich fokussieren, der nicht für die Datenerfassung verwendet wird, bis Blasen gebildet werden (ergänzende Abbildung 1).
- Kryo-EM-Bildgebung
- Laden Sie die abgeschnittenen EM-Gitter oder Mikrochip-Sandwiches in das TEM, das mit einem FEG ausgestattet ist und mit 300 kV arbeitet. Schalten Sie die Pistole ein und stellen Sie die euzentrische Höhe des Mikroskoptisches mit einem ähnlichen Verfahren ein, das oben für das Flüssigkeits-TEM beschrieben wurde (Schritt 3.1.2).
- Zeichnen Sie einzelne Bilder mit dem im Mikroskopsystem integrierten Einzelpartikelanalysesystem auf und implementieren Sie automatisierte Bildgebungsroutinen. Nehmen Sie Bilder unter niedrig dosierten Bedingungen mit dem Einzelpartikelanalyse-Direktelektronendetektor mit einem Pixelabstand von 14 μm bei einer Vergrößerung von 59.000x und 40 Bildern pro Sekunde auf.
- Verwenden Sie einen Defokussierungsbereich von 1-4 μm bei der angegebenen Vergrößerung. Wenn dicke Schichten von Glaseis gefunden werden, verwenden Sie höhere Unschärfewerte, oder wählen Sie eine andere Region für die Datenerfassung aus.
4. Datenanalyse und 3D-Strukturvergleiche
- Analyse von Adeno-assoziierten Viren (AAV) in flüssigem und glasigem Eis
- Verarbeiten von Filmen für AAV-Partikel in Flüssigkeit und Eis mit dem Programm RELION-3.0821 oder einer anderen Bildverarbeitungssoftware22. Führen Sie eine Bewegungskorrektur mit MotionCor2 v1.2.3 durch.
- Nach der Korrektur extrahieren Sie Partikel mit dem Auto-Picking-Tool im Programmsoftwarepaket. Typische Kartongrößen sind 330 Pixel für flüssige Proben und 350 Pixel für Eisproben.
- Berechnen Sie anfängliche Rekonstruktionen unter Verwendung der C1-Symmetrie unter Verwendung der 3D-Anfangsmodellroutine des Programms und/oder der ab-initio-Modelloptionen im Datenverarbeitungssoftwarepaket. Verwenden Sie im Programm einen Regularisierungsparameter von T = 4 und eine Pixelgröße von 1,01 Å für flüssige Proben und 1,13 Å für Eisproben.
- Verwenden Sie während der gesamten Verfeinerungsprozedur einen Maskenwert von 300 Å. Führen Sie Verfeinerungsprotokolle in der Datenverarbeitungssoftware unter Verwendung der I1-Symmetrie durch, um mehrere EM-Karten zu erhalten. Die erwartete strukturelle Auflösung kann im Bereich von 4 Å oder besser liegen. Verwenden Sie die Partikeläquivalenz, die die ikosaedrische Symmetrie bei 16.800 für Flüssigkeit und 15.240 für Eis12,14 implementiert.
HINWEIS: Auflösungsschätzungen basieren auf den Goldstandard-FSC-Kriterien (Fourier Shell Correlations). - Maskieren Sie EM-Karten bei ~250 Å und untersuchen Sie die Ergebnisse mit einem Molekularstrukturanalyse-Softwarepaket23,24. In Abbildung 3 sind die Slices in Schritten von ~5 nm dargestellt.
- Extrahieren Sie Kapsidprotein (VP1) Untereinheiten aus den EM-Karten zum Vergleich. Quantifizieren Sie dynamische Änderungen zwischen EM-Strukturen basierend auf den Partikeldurchmessermessungen (ergänzende Abbildung 2) und visualisieren Sie sie dann mit der Morph-Map-Funktion in der Software.
- Analyse subviraler SARS-CoV-2-Anordnungen in flüssigen Flüssigkeiten
- Verarbeiten Sie Filme mit dem Programm RELION-3.08. Korrigiert für Bilddrift und strahlinduzierte Bewegung mit MotionCor2 v1.2.3. Korrekt für die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) des Mikroskops.
- Verwenden Sie das Auto-Picking-Tool im Programm, um virale Assemblies mit einer Boxgröße von 800 Pixeln auszuwählen. Für die Recheneffizienz können extrahierte Partikel auf 256 Pixel skaliert werden. Erhalten Sie ein erstes Modell unter Verwendung der C1-Symmetrie im Programm mit einem Regularisierungsparameter von T = 2 und 1,66 Å Pixelgröße.
- Führen Sie eine 3D-Verfeinerung im Programm durch, um eine EM-Karte zu erhalten, ein Beispiel wird bei ~ 8,25 Å nach Standard-FSC-Kriterien gezeigt (Abbildung 4). Visualisieren Sie EM-Karten mit der Molekularstrukturanalysesoftware mit Scheiben, die bei 25 nm inkrementiert sind, wie in Abbildung 4 gezeigt.
- Analyse von Rotavirus-Doppelschichtpartikeln (DLPs) im Glaseis
- Verarbeiten Sie Filme für Rotavirus-DLPs mit anderer Bildverarbeitungssoftware. Verwenden Sie MotionCor2 v1.2.3, um Abweichungen in den Bildern zu korrigieren. Verwenden Sie die Patch-CTF-Schätzung, um Linseneffekte auf den Bildern zu korrigieren.
- Extrahieren Sie Partikel mit dem Auto-Picking-Tool in der Software mit einer Boxgröße von 950 Pixeln. Berechnen Sie die Boxgröße nach Bedarf für Computerzwecke.
- Berechnen Sie erste Modelle mit ab-initio-Optionen und C1-Symmetrie . Verwenden Sie Verfeinerungsparameter wie eine Pixelgröße von 1,47 Å und einen Maskenwert von 800 Å.
- Führen Sie zusätzliche Verfeinerungsroutinen durch, während Sie die I1-Symmetrie auferlegen. Zu den Beispielergebnissen gehört eine 10,15 Å EM-Karte gemäß den Goldstandard-FSC-Kriterien. Die Gesamtzahl der verwendeten Partikel betrug 2050, was aufgrund des ikosaedrischen Symmetrieoperators 123.000 Protomereinheiten entspricht (Abbildung 5).
- Maskieren Sie endgültige Karten bei ~750 Å und visualisieren Sie die Ergebnisse im Softwarepaket für die Molekularstrukturanalyse. Beispielschnitte durch die EM-Karte sind in Abbildung 5 in Schritten von ~10 nm dargestellt.
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Representative Results
Ein Liquid-TEM mit 200 kV wurde für alle Liquid-EM-Bildgebungsexperimente und ein Kryo-TEM mit 300 kV für die gesamte Kryo-EM-Datenerfassung verwendet. Repräsentative Bilder und Strukturen mehrerer Viren werden präsentiert, um den Nutzen der Methoden bei verschiedenen Testpersonen zu demonstrieren. Dazu gehören rekombinante adeno-assoziierte Virus-Subtyp 3 (AAV), SARS-CoV-2-subvirale Anordnungen, die aus dem Patientenserum abgeleitet sind, und Affenrotavirus-Doppelschichtpartikel (DLPs), SA11-Stamm. Zunächst werden Vergleiche für dieselbe AAV-Probe (1 mg/ml) demonstriert, die in flüssiger Pufferlösung (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) und in Glaseis (Abbildung 3A-C; Ergänzende Abbildung 2). Die Flüssig-EM-Proben wurden mit SiN-basierten Mikrochips und dem speziellen Probenhalter präpariert. Die Kryo-EM-Proben wurden unter Verwendung von Standard-löchrigen Kohlenstoffgittern vorbereitet und mit einer hochmodernen Probenvorbereitungseinheit zu flüssigem Ethan verglast. Die resultierenden Virusstrukturen hatten ähnliche Gesamtdurchmesser von ~25 nm. Ein Vergleich einzelner VP1-Kapsid-Protomer zeigte ebenfalls konsistente Merkmale sowohl in Flüssigkeits- als auch in Eis-EM-Karten (Abbildung 3D). Ein Unterschied zwischen den Flüssigkeits-EM- und Kryo-EM-Daten bestand darin, dass zusätzliche dynamische Strukturen in Flüssigkeiten beobachtet wurden, die in den Kryo-EM-Ergebnissen nicht vorhanden waren (Abbildung 3E)12.
Als nächstes wurden deaktivierte SARS-CoV-2-Proben (0,25 mg/ml) untersucht, die in Pufferlösung (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) unter Verwendung einer neuen Mikrochip-Sandwichtechnik 7,14 hergestellt wurden. Die neue Technik verwendet SiN-basierte Mikrochips zusammen mit kohlenstoffbeschichteten Goldgittern. Bei dieser Präparation wurde die flüssige Probe zwischen den beiden Substraten eingeklemmt (Abbildung 2A-C). Sandwichproben wurden mit einem Single-Tilt-Probenhalter oder Autoloader-C-Clips geklemmt, die üblicherweise in der Kryo-EM-Probenvorbereitung verwendet werden. Die Proben können sofort im TEM eingesehen oder bei 4°C für 2 Monate oder darüber hinaus gelagert werden, abhängig von der Stabilität der biologischen Probe. Das Auftreten von Blubbern in den flüssigen Proben sorgt für das Vorhandensein der Flüssigkeitsschicht. Die Flüssigkeitsdicke kann mit EF-TEM-Protokollen gemessen werden, wie12 beschrieben. Subvirale SARS-CoV-2-Anordnungen in Flüssigkeit schienen einen hohen sichtbaren Kontrast zur umgebenden Flüssigkeit aufzuweisen (Abbildung 4A,B). Einige Partikel zeigten sichtbare Spikes auf der Virusoberfläche, während andere Partikel keine Spikes aufweisen oder spärlich mit ihnen verziert sind (ergänzende Abbildung S3). Klassendurchschnitte und Schnitte durch die 8,25-Å-Struktur zeigten interne Merkmale innerhalb der Partikel, die Proteinuntereinheiten und das virale RNA-Genom umfassten (Abbildung 4C). Obwohl einige Partikel C2-Symmetrie zu enthalten schienen (beim Testen der C2-Symmetrie betrug die Partikeläquivalenz 2.674), unterschied sich die asymmetrische Struktur im Vergleich zur symmetrischen Struktur nicht wesentlich.
Schließlich umfasste die Analyse Rotavirus-DLPs (3 mg/ml; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) in Glaseis durch manuelles Schockgefrieren von Mikrochip-Sandwichpräparaten zu flüssigem Stickstoff. Die gleiche Sandwichtechnik, die zur Herstellung von flüssigen EM-Proben verwendet wurde, wurde für gefrorene hydratisierte Proben verwendet. Sandwiches wurden mit Autoloader-Gitterclips versiegelt und mit dem Kryo-TEM unter Standardbedingungen untersucht. Ansichten der gefrorenen Exemplare mit geringer Vergrößerung zeigten wenig bis keine kubische oder hexagonale Eiskontamination und Regionen mit dicht gepackten DLPs wurden in den Sichtfenstern beobachtet (Abbildung 5A, B). Die Bilder wurden mithilfe automatisierter Routinen gesammelt, die im EPU-Paket implementiert sind. Klassendurchschnitte und Schnitte durch die 10,15-Å-Karte zeigten stabile Merkmale, die mit viralen Proteinkomponenten und dem doppelsträngigen RNA-Genom übereinstimmen (Abbildung 5D,E). Der Kontrastunterschied zwischen den DLPs und dem Eishintergrund war in den Kryo-EM-Bildern im Vergleich zu den Flüssig-EM-Proben nicht so stark ausgeprägt. Während die Ursache für diesen interessanten Effekt noch ermittelt wird, ist der Unterschied erwähnenswert, da flüssige EM zukünftige Vorteile für die Bildgebungsgemeinschaft bieten kann.
Abbildung 1: Techniken zur hochauflösenden Bildgebung von Viren in Flüssigkeit und Eis. Die beiden Arbeitsabläufe heben unterschiedliche Methoden zur Probenvorbereitung für flüssige EM hervor. Das linke Bild zeigt eine schematische Darstellung eines Flüssigkeits-EM-Probenhalters. Der SiN-Basismikrochip enthält ein Array (500 μm x 100 μm) integrierter Mikrowells (10 μm x 10 μm), die ~150 nm tief sind und eine ~30 nm dicke Membran aufweisen. Das rechte Bild zeigt ein Schema der Mikrochip-Sandwichtechnik, die sowohl für die Flüssig-EM- als auch für die Kryo-EM-Forschung verwendet werden kann. Die Sandwichbaugruppen verwenden einen SiN-Mikrochip, der mit einem kohlenstoffbeschichteten goldenen TEM-Gitter gepaart ist. Ein Querschnitt der Baugruppe zeigt mehrere Abbildungsfenster von 250 μm x 250 μm bis 50 μm x 50 μm Größe mit Membrandicken von 10 nm bzw. 5 nm. Der Carbon-Trägerfilm ist ~5 nm dick. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Mikrochip-Sandwichtechnik für Flüssig-EM und Kryo-EM. (A) Die Mikrochip-Sandwichbaugruppe verwendet einen SiN-Mikrochip, der mit einem kohlenstoffbeschichteten goldenen TEM-Gitter gepaart ist. Ein Glimment-entladener Mikrochip wird auf eine Gelpackung gelegt und Virusproben werden dem Mikrochip hinzugefügt. Nach einer kurzen Inkubationszeit wird überschüssige Lösung entfernt und das Sandwich mit dem TEM-Gitter versiegelt. (B) Das Mikrochip-Sandwich wird in einer Clipvorrichtung bei Raumtemperatur versiegelt und kann direkt in einen TEM-Halter mit einer Neigung oder ein TEM-Autoloader-System geladen werden. (C) Querschnittszeichnungen der Mikrochip-Sandwichbaugruppe heben die Abmessungen der Mikrochips und der Kohlenstoffschicht hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich von Flüssig-EM- und Kryo-EM-Strukturen von AAV. (A) Struktur von AAV in Lösung (3,22 Å Auflösung) mit farbigen radialen Dichten mit 5 nm Schnitten durch die Karte. Der Maßstabsbalken ist 5 nm. Bildgebende Metriken dienen der Datenerfassung mit dem direkten Elektronendetektor. (B) Die Struktur von AAV, die in Eis abgebildet wurde (3,37 Å Auflösung) mit farbigen radialen Dichten stellt 5 nm Scheiben durch die Struktur dar. Der Maßstabsbalken ist 5 nm. Bildgebende Metriken dienen der Datenerfassung mit dem direkten Elektronendetektor. (C) Eine Region von Interesse zeigt 5 s und 20 s Zeitpunkte zusammen mit Fourier-Transformationen, die zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet werden. Die linke Seite zeigt die CTF-Schätzungen, die rechte Seite zeigt die experimentellen Daten. (D) Rotationsansichten der AAV VP1-Untereinheit, die aus den Flüssigkeits- und Eisstrukturen extrahiert wurde. Die Segmente wurden anhand der Kristallstruktur interpretiert (PDB-Code 3KIC, A-Kette25). Der Maßstabsbalken beträgt 10 Å. (E) Dynamische Werte in den flüssigen Strukturen, die mit der Morphmap-Funktion in der Molekularstrukturanalysesoftware erzeugt und in Schritt 4.1.6-4.2.3 beschrieben werden. Von links nach rechts zeigen gemittelte Strukturen aus mehreren Virusanordnungen Konformationsänderungen mit einer entsprechenden Durchmesseränderung von ~5%, gemessen anhand von EM-Daten. RMSD-Werte in Voxeln zeigen Änderungen entsprechend der Farbskala an. Die Abbildung wurde von12 geändert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: subvirale SARS-CoV-2-Anordnungen, die in Flüssigkeit mit der Mikrochip-Sandwich-Technik hergestellt wurden. (A) Bild von subviralen SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus Serumfraktionen von COVID-19-Patienten isoliert wurden. Bildgebende Metriken dienen der Datenerfassung mit dem direkten Elektronendetektor. Weiße Blasen in der oberen rechten Ecke des Bildes sind ein visueller Indikator dafür, dass Flüssigkeit in der Probe vorhanden ist. Der Maßstabsbalken ist 100 nm. (B) Die berechnete Fourier-Transformation des Bildes zeigt hochauflösende Informationen im reziproken Raum mit wenig bis gar keiner Drift im entsprechenden Bild. Klassendurchschnitte zeigen einzigartige Merkmale in den in der Lösung enthaltenen viralen Anordnungen. (C) Eine EM-Rekonstruktion der subviralen Anordnungen wird mit farbigen radialen Dichten bei 5 nm-Scheiben durch die Karte dargestellt. Der Maßstabsbalken ist 25 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Rotavirus-DLPs, die in Flüssigkeit mit der Mikrochip-Sandwich-Technik hergestellt wurden. (A,B) Screening-Schritte mit geringer Vergrößerung unter Verwendung der Analysesoftware. Es wurden begrenzte Eiskristalle beobachtet, und die Fenstermembranen waren dünn und klar, was die Bereichsauswahl für die Datenerfassung vereinfachte. Der Maßstabsbalken in (A) beträgt 5 μm und in (B) 500 nm. (C) Filme wurden mit dem direkten Elektronendetektor im Zählmodus gemäß den angegebenen Bildmetriken aufgenommen. Der Maßstabsbalken ist 50 nm. (D) Fourier-Transformationsinformationen zeigen hochauflösende Informationen an, die in den Daten vorhanden sind, und Klassendurchschnitte zeigen starke Merkmale im ikosaedrischen Gitter. Klassendurchschnitte zeigen Merkmale in den Virusassemblys, die frei von Artefakten sind und mit anderen strukturellen Beobachtungen übereinstimmen 6,15,17. (E) Eine EM-Rekonstruktion der DLPs (10,15 Å Auflösung), dargestellt mit farbigen radialen Dichten bei 10 nm Schnitten durch die Karte. Der Maßstabsbalken ist 15 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Bestätigung des Vorhandenseins von Flüssigkeit in EM-Proben. Niedrig vergrößerte Bilder von AAV-Partikeln in Lösung, die unter niedrig dosierten Bedingungen (<10 e- Å-2 s-1) aufgenommen wurden, haben keine Blasen. Unter Verwendung eines fokussierten Strahls von >100 e- Å-2 s-1 zeigten flüssige Proben Blasenbildung (schwarze Pfeile). Der Maßstabsbalken beträgt 500 nm. Die Abbildung wurde von12 geändert.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Messung von Änderungen der AAV-Abmessungen in Flüssigkeiten. (A) Konturspuren von Viruspartikeln wurden über einen Zeitraum von 20 s erfasst. Der Maßstabsbalken ist 25 nm. (B,C) Tabelle und grafische Darstellungen von Partikeldurchmessermessungen bei 1, 5, 10 und 20 Sekunden. Die Gesamtänderung der Partikeldurchmesser während der 20-s-Aufnahme betrug 0,28% bei einer Dosis von ~1e- Å-2 s-1. (D,E) Signal-Rausch-Werte, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Filmaufnahme bestimmt werden. Die Abbildung wurde von12 geändert.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Hochvergrößernde Aufnahme von patientenabgeleiteten SARS-CoV-2-Subkomplexen. Heterogene virale Anordnungen zeigten das Vorhandensein von Spike-Proteinen (rote Pfeile) auf der Oberfläche einiger Partikel. Anderen Partikeln fehlten die markierten Oberflächenspitzen. Der Maßstabsbalken ist 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Video 1: Echtzeit-Bildgebung von AAV in Flüssigkeit. Direkter Vergleich einer Echtzeitaufzeichnung von AAV in Flüssigkeit (links) und farbigen Konturspuren der in Lösung diffundierenden Partikel (rechts). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Visualisierung der Bildverfolgung in Flüssigkeit. Side-by-Side-Vergleiche eines farbigen und tiefpassgefilterten Films von AAV, das in Lösung diffundiert (links) farbige Konturspuren der in Lösung diffundierenden Partikel (rechts). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Es werden neue Möglichkeiten zur Optimierung der aktuellen Liquid-EM-Arbeitsabläufe durch den Einsatz neuer automatisierter Tools und Technologien aus dem Kryo-EM-Bereich eröffnet. Anwendungen mit der neuen Mikrochip-Sandwichtechnik sind im Vergleich zu anderen Methoden von Bedeutung, da sie eine hochauflösende bildgebende Analyse in flüssigem oder glasigem Eis ermöglichen. Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist die Herstellung von Proben mit der idealen Flüssigkeitsdicke, um exquisite Details auf Nanoebene zu visualisieren. Ideale Regionen von Interesse werden bei niedrigeren Vergrößerungen identifiziert, indem die gesamte Probe gescreent wird, bevor Hochdurchsatzroutinen für die automatisierte Datenerfassung implementiert werden. Sollten die identifizierten Regionen in Flüssigkeits- oder Eisproben Strahlschadensartefakte enthalten oder zu dick erscheinen, um einzelne Partikel zu identifizieren, die visuell scharf sind, sollten sie von der Datenerhebung ausgeschlossen werden. Einschränkungen bei der hochauflösenden Datenerfassung sind die strahlinduzierte Bewegung und die Brownsche Bewegung in den flüssigen Proben. Kryo-EM-Methoden zielen darauf ab, Bewegungen in biologischen Proben zu minimieren; Bewegungskorrekturmethoden sind jedoch rechnerisch robust bei der Minderung dieser auflösungsbegrenzenden Faktoren. Wenn die flüssigen Proben eine weiträumige Drift und thermische Instabilität aufweisen, können dünnere Proben hergestellt werden, indem überschüssige Lösung während der Probenvorbereitungsschritte entfernt wird, um die Dicke der Flüssigkeitsschichten zu verringern.
Molekulare Verdrängung zwischen Viruspartikeln kann entstehen, wenn Proben in hohen Konzentrationen verwendet werden. Wenn es mehrere Bereiche mit überlappenden Partikeln gibt, die eine robuste Datenerhebung einschränken, sollte die Konzentration der Eingangsprobe vor der Probenvorbereitung reduziert werden. Eine geeignete Probenkonzentration ist ein entscheidender Schritt im Protokoll. Bilder, die einen Überschuss an Partikeln enthalten, erschweren nachgelagerte Bildverarbeitungsverfahren. Für gereinigte Viruspartikel liegt ein ausreichender Konzentrationsbereich zwischen 0,3-3 mg/ml, abhängig von den Abmessungen und dem Molekulargewicht der Probe. Größere Viren (~ 100 nm Durchmesser oder mehr) erfordern typischerweise höhere Konzentrationen als kleinere Viren (~ 25 nm Durchmesser oder weniger) für den Erfolg der Technik. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist das Niveau, bei dem die interessierenden Partikel an den glühentladenen Mikrochips haften. Wenn die Virusprobe nicht gut an der Oberfläche haftet, kann eine höhere Konzentration erforderlich sein, um die Proben ausreichend auf flüssige EM oder Kryo-EM vorzubereiten. Alternativ kann die Probe stattdessen auf das kohlenstoffbeschichtete Goldgitter aufgebracht werden, wobei der Mikrochip als Deckel des Gehäuses dient. Sollten diese Verfahren nicht genügend Partikel für Datenerhebungsverfahren rekrutieren, können Affinitätserfassungsmethoden eine praktikable Option darstellen26,27,28.
Die Verwendung bestimmter Zusatzstoffe wie Reinigungsmittel, Glycerin, Polyethylenglykole und hohe Mengen an Saccharose oder Glukose sollte für die Flüssig-EM-Bildgebung minimiert oder vermieden werden. Diese Reagenzien können Artefakte in die Bilder einbringen und zu übermäßigem Blubbern, Hydrolyseprodukten und der Bildung freier Radikale aufgrund von Strahlschäden führen. Solche Effekte führen zu gedämpften Merkmalen in den abgebildeten Partikeln und begrenzen letztlich die strukturelle Auflösung. Eine Möglichkeit, diese Reagenzien zu entfernen, wenn sie in biochemischen Präparaten verwendet werden, ist die umfangreiche Dialyse in eine Pufferlösung, der die Zusatzstoffe fehlen. Diese Reagenzien müssen von Fall zu Fall getestet und verwendet werden. Sobald genügend Proben mit der Mikrochip-Sandwich-Technik hergestellt wurden, können sie sofort abgebildet oder bei 4 °C gelagert werden, bis sie zur Untersuchung bereit sind. Die Lagerzeiten hängen von der Probenstabilität ab.
Insgesamt ermöglicht die Verwendung von Flüssig-EM in Kombination mit Kryo-EM den Forschern, biologische Systeme mit komplementären Bildgebungswerkzeugen zu untersuchen. Die neu entwickelte Mikrochip-Sandwichtechnik liefert konsistente Proben für die TEM-Bildgebung in Flüssigkeit oder Eis. Die Technik bietet Forschern auch eine einfache Möglichkeit, Proben vorzubereiten und zu betrachten, ohne dass ein kommerzieller Probenhalter oder ein Vitrifikationssystem erforderlich ist. In Kombination mit automatisierten Bildgebungsprotokollen können große Datenmengen in der Größenordnung von Tausenden von Bildern pro Sitzung pro Probe erfasst werden. Die Pionierarbeit von Parsons und Kollegen 29,30,31,32,33 legte den Grundstein für die Herstellung biologischer Proben in Flüssigkeitsgehäusen. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben, wie modernste Werkzeuge nun ein spannendes Mittel darstellen können, um biologische Makromoleküle mit neuen Augen sichtbar zu machen. Zukünftige Anwendungen, die sich aus der Beherrschung dieser Techniken ergeben sollen, wenn sie mit High-Performance-Computing kombiniert werden, sind mechanistische Echtzeit-Erkenntnisse zum Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen in 3D. Der Bereich der flüssigen EM kann dazu dienen, die Erforschung neuartiger Viren, die eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen, zu verbessern und möglicherweise sogar zu Pandemievorsorgemaßnahmen beizutragen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung dieser Protokolle es Wissenschaftlern und Ingenieuren ermöglichen sollte, dynamische Prozesse im atomaren Detail über eine Vielzahl von Proben, die Biowissenschaften, Medizin und Materialforschung umfassen, besser zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Die Autorin, Madeline J. Dressel-Dukes, ist eine Angestellte von Protochips, Inc. und Michael Spilman ist ein Mitarbeiter von DirectElectron.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Abteilung für Augenheilkunde) für die Bereitstellung von gereinigtem AAV-3. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health und dem National Cancer Institute unterstützt (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 an D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
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