Summary
כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.
Abstract
העניין במיקרוסקופיה של אלקטרונים נוזליים (liquid-EM) הרקיע שחקים בשנים האחרונות כאשר מדענים יכולים כעת לצפות בתהליכים בזמן אמת בקנה מידה ננומטרי. רצוי מאוד להתאים מידע cryo-EM ברזולוציה גבוהה עם תצפיות דינמיות כמו אירועים רבים מתרחשים על צירי זמן מהירים - בטווח של אלפית השנייה או מהר יותר. ידע משופר על מבנים גמישים יכול גם לסייע בתכנון ריאגנטים חדשים כדי להילחם בפתוגנים מתפתחים, כגון SARS-CoV-2. חשוב מכך, צפייה בחומרים ביולוגיים בסביבה נוזלית מספקת הצצה ייחודית לביצועיהם בגוף האדם. מוצגות כאן שיטות שפותחו לאחרונה כדי לחקור את התכונות הננומטריות של מכלולי וירוסים בקרח נוזלי וזגוגי. כדי להשיג מטרה זו, דגימות מוגדרות היטב שימשו כמערכות מודל. מוצגות השוואות זו לצד זו של שיטות הכנת המדגם ומידע מבני מייצג. תכונות תת-ננומטר מוצגות עבור מבנים שנפתרו בטווח של ~3.5-Å-10 Å. תוצאות עדכניות אחרות התומכות במסגרת משלימה זו כוללות תובנות דינמיות של מועמדים לחיסון וטיפולים מבוססי נוגדנים המצולמים בנוזל. באופן כללי, יישומים קורלטיביים אלה מקדמים את היכולת שלנו לדמיין דינמיקה מולקולרית, ומספקים הקשר ייחודי לשימוש בהם בבריאות האדם ובמחלות.
Introduction
המחקר הביו-רפואי משפר את הבנתנו את בריאות האדם ומחלותיו באמצעות פיתוח טכנולוגיות חדשות. הדמיה ברזולוציה גבוהה משנה את השקפתנו על עולם הננו - ומאפשרת לנו לחקור תאים ומולקולות בפירוט רב 1,2,3,4,5. מידע סטטי של רכיבים דינמיים כגון פולימרים רכים, מכלולי חלבונים או וירוסים אנושיים חושף רק תמונת מצב מוגבלת של הנרטיב המורכב שלהם. כדי להבין טוב יותר כיצד ישויות מולקולריות פועלות, יש לחקור במשותף את המבנה והתפקוד שלהן.
ההתקדמות האחרונה בייצור חומרים כגון גרפן דק אטומית או שבבים מבוססי סיליקון מספקת הזדמנויות חדשות לניתוח מבנה-תפקוד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופי אלקטרונים (TEMs). חומרים אלה יכולים ליצור תאים אטומים הרמטית להדמיית EM חיה 6,7,8,9,10,11. התחום החדש של liquid-EM, טמפרטורת החדר בקורלציה לקריו-EM, מספק תצוגות חסרות תקדים של חומרים קשים או רכים בתמיסה, ומאפשר למדענים לחקור בו זמנית את המבנה והדינמיקה של הדגימה שלהם. יישומי Liquid-EM כוללים הקלטות בזמן אמת של ננו-חלקיקים טיפוליים המקיימים אינטראקציה עם תאי גזע סרטניים, כמו גם שינויים במורכבות המולקולרית של פתוגנים נגיפיים12,13,14.
בדיוק כפי שההתקדמות המתודולוגית דרבנה את מהפכת הפתרון בתחום הקריו-EM, יש צורך בטכניקות ושיטות חדשות כדי להרחיב את השימוש ב-liquid-EM ככלי בעל תפוקה גבוהה עבור הקהילה המדעית. המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לייעל את פרוטוקולי ההכנה של דגימות Liquid-EM. הרציונל מאחורי הטכניקות שפותחו הוא שימוש בעיצובי שבבים חדשים ובהתקני טעינה אוטומטית, המתאימים הן לאיסוף נתונים נוזליים והן לאיסוף נתונים קריו-EM (איור 1)7,14,15,16,17. המכלולים אטומים מכנית באמצעות תפסי רשת סטנדרטיים עבור מכשירים אוטומטיים, כגון ה-Krios, שיכולים להכיל דגימות מרובות בכל סשן או F200C TEM (איור 2). מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש בהדמיה ברזולוציה גבוהה מעבר ליישומי cryo-EM סטנדרטיים המדגימים מטרות רחבות יותר לניתוח חומרים בזמן אמת.
במאמר הווידאו הנוכחי מוצגים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים בנוזל עם ובלי מחזיקי דגימה זמינים מסחרית. באמצעות מחזיק הדגימה המיוחד עבור liquid-EM, דגימות נוזליות דקות יכולות לספק מידע מבני הדומה לדגימות cryo-EM, כמו גם תובנות דינמיות של הדגימות. כמו כן הודגמו שיטות להכנת דגימות נוזליות באמצעות כלי autoloader עבור שגרות תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי על פני טכניקות אחרות הוא שייצור דגימות אוטומטי מאפשר למשתמש להעריך במהירות את הדגימות שלו עבור עובי אופטימלי ומינון אלקטרונים לפני איסוף הנתונים. טכניקת סינון זו מזהה במהירות אזורים אידיאליים להקלטות בזמן אמת בנוזל או בקרח12,14,18,19. לצורך קביעת מבנה תלת-ממדי, Liquid-EM עשוי להשלים את שיטות cryo-EM הוותיקות המיושמות ב- cryo-EM. קוראים המשתמשים בטכנולוגיות TEM או cryo-EM קונבנציונליות עשויים לשקול להשתמש בזרימות עבודה של Liquid-EM כדי לספק תצפיות חדשות ודינמיות של הדגימות שלהם באופן המשלים את האסטרטגיות הנוכחיות שלהם.
דגימות וירוסים המשמשות בפרוטוקול זה כוללות תת-סוג וירוס מטוהר הקשור לאדנו 3 (AAV) שהושג במתנה ותורבית בתנאים סטנדרטיים12. כמו כן נעשה שימוש במכלולים תת-ויראליים לא זיהומיים של SARS CoV-2 שמקורם בסרום של חוליCOVID-19 12 והתקבלו ממקור מסחרי. לבסוף, חלקיקים דו-שכבתיים מטוהרים מסוג simian rotavirus (זן SA11) התקבלו ממעבדתה של ד"ר שרה מ. מקדונלד אסתמן באוניברסיטת ווייק פורסט וגודלו בתרבית בתנאים סטנדרטיים 6,17. חבילות התוכנה המתוארות כאן זמינות באופן חופשי והקישורים סופקו בסעיף טבלת חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טעינת מחזיק הדגימה עבור נוזל-EM
- נקו את שבבי הסיליקון ניטריד (SiN) על ידי דגירה של כל שבב ב-150 מ"ל של אצטון למשך 2 דקות ולאחר מכן דגירה ב-150 מ"ל של מתנול למשך 2 דקות. אפשרו לשבבים להתייבש בזרימת אוויר למינרית.
- פלזמה לנקות את השבבים המיובשים באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים סטנדרטיים של 30 W, 15 mA עבור 45 s באמצעות גז ארגון.
- טען שבב בסיס יבש לתוך קצה מחזיק הדגימה. הוסף ~ 0.2 μL של דגימה (0.2-1 מ"ג / מ"ל של מכלולים וירוס ב 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) לשבב הבסיס. לאחר שלב דגירה של 1-2 דקות, הניחו את השבב העליון על שבב הבסיס הרטוב המכיל את הדגימה.
- מהדקים את המכלול יחד ליצירת מארז אטום הרמטית, המוחזק במקומו מכנית על ידי שלושה ברגי פליז. לאחר איטום המכלול, יש לשאוב את הקצה ל-10-6 Torr באמצעות תחנת שאיבה יבשה עם שאיבה טורבו. המחזיק מוכן כעת להכנסתו ל- TEM.
הערה: למחזיק הנבחר אין יכולות קירור והוא אינו משמש ל-cryo-EM.
2. ייצור מכלולי כריך שבב
הערה: ניתן להשתמש בשבבי SiN או צורן דו-חמצני (SiO) שונים ישירות מחבילות הג'ל שנשלחו. רשתות זהב מצופות פחמן עשויות לשמש גם ישירות כפי שסופקו.
- פלזמה לנקות את שבבים ורשתות פחמן באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים סטנדרטיים של 30 W, 15 mA עבור 45 שניות באמצעות גז ארגון.
- הוסף ~ 2 μL של דגימה הכלולה 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 מ"מ NaCl; 10 מ"מ MgCl2; 10 mM CaCl2 לשבב משוחרר זוהר המונח על חבילת ג'ל. הסר תמיסה עודפת (~ 50%) באמצעות נייר סינון או פיפטה. לאחר שלב דגירה של 1-2 דקות, הוסיפו את רשת הפחמן הזוהרת לשבב הרטוב המכיל את הדגימה.
- הידק את המכלול יחד באמצעות מחזיק דגימה בעל הטיה אחת או קליפסים לרשת autoloader בטמפרטורת החדר כדי ליצור מארז אטום הרמטית. עבור מהדקי הטעינה האוטומטית, הנח את מכלול הכריך על תפס C התחתון, הנח את התפס העליון על גבי ההרכבה והשתמש בכלי ההידוק הסטנדרטי כדי לאטום את ההרכבה יחד.
הערה: הליך ההידוק המבוצע כאן משתמש באותם שלבים כמו עבור הידוק רשת cryo-EM, אך בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן דגימות מהודקות במשך חודשיים או יותר לפני ההדמיה תוך שמירה על נוזלים במארז. לא נעשה שימוש בבדיקת דליפה עם מחזיק דגימה בטמפרטורת החדר או עם המטען האוטומטי. - הדגימה מוכנה כעת להחדרה ל- TEM. בדוק דגימות המונחות במטעינים אוטומטיים בתנאי קריו או בטמפרטורת החדר.
3. הדמיית דגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעביר
- הדמיית נוזל-EM
- טען את מחזיק הדגימה ל- TEM המצויד באקדח פליטת שדה (FEG) ופועל ב- 200 kV.
- הפעל את האקדח והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית הנדנדה, הטיית הדגימה מ -15° ל +15° בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון Z כדי להתאים לעובי הדגימה. ומסייע להבטיח הגדלה מדויקת במהלך הקלטת התמונה.
- הקלט תמונות כסרטים בעלי מסגרת ארוכה באמצעות חבילת in situ המשולבת עם גלאי ישיר בעל מרווח פיקסלים של 6 מיקרומטר (וידאו 1 ווידאו 2). ניתן גם להקליט תמונות בודדות באמצעות חבילת התוכנה הטורית לאיסוף נתונים20, המיישמת שגרות הדמיה אוטומטיות. קבל תמונות בתנאים של מינון נמוך בהגדלה הנעה בין 28,000x-92,000x ו- 40 פריימים לשנייה.
- התאם את זמני החשיפה (0.25-1 שניות) כדי למזער את הנזק לקרן הדגימה. השתמש בטווח הפחתה של -1-4 מיקרומטר בהגדלה שצוינה. אם נתקלת בתמיסה עבה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר או בחר אזור עניין אחר.
- ודא שהתמיסה נמצאת בדגימות לאורך כל סשן ההדמיה על-ידי מיקוד קרן האלקטרונים באזור קורבן שאינו משמש לאיסוף נתונים, עד ליצירת בועות (איור משלים 1).
- הדמיית Cryo-EM
- טען את רשתות ה- EM החתוכות או כריכי השבב ל- TEM המצוידים ב- FEG ופועלים ב- 300 kV. הפעל את האקדח והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ, באמצעות הליך דומה שתואר עבור הנוזל-TEM לעיל (שלב 3.1.2).
- הקלט תמונות בודדות באמצעות מערכת ניתוח חלקיקים בודדים המשולבת במערכת המיקרוסקופים תוך יישום שגרות הדמיה אוטומטיות. הקלט תמונות בתנאים של מינון נמוך באמצעות גלאי אלקטרונים ישיר לניתוח חלקיקים בודדים, בעל מרווח פיקסלים של 14 מיקרומטר בהגדלה של 59,000x ו-40 פריימים לשנייה.
- השתמש בטווח הפחתה של 1-4 מיקרומטר בהגדלה שצוינה. אם נתקלות בשכבות עבות של קרח זגוגי, השתמש בערכי הפחתה גבוהים יותר, או בחר אזור אחר לאיסוף נתונים.
4. ניתוח נתונים והשוואות מבנים תלת ממדיות
- ניתוח של נגיף הקשור לאדנו (AAV) בקרח נוזלי וזגוגי
- עבד סרטים עבור חלקיקי AAV בנוזל וקרח באמצעות תוכנית RELION-3.0821 או תוכנת עיבוד תמונה אחרת22. בצע תיקון תנועה באמצעות MotionCor2 v1.2.3.
- לאחר התיקון, חלץ חלקיקים באמצעות כלי הבחירה האוטומטית בחבילת התוכנה של התוכנית. גדלים אופייניים של קופסאות הם 330 פיקסלים לדגימות נוזליות ו-350 פיקסלים לדגימות קרח.
- חשב שחזורים ראשוניים באמצעות סימטריית C1 באמצעות שגרת המודל הראשוני התלת-ממדי של התוכנה ו/או אפשרויות מודל ab-initio בחבילת התוכנה לעיבוד נתונים. בתוכנית, השתמש בפרמטר רגולציית של T = 4 ובגודל פיקסל של 1.01 Å עבור דגימות נוזליות ו- 1.13 Å עבור דגימות קרח.
- השתמש בערך מסיכה של 300 Å לאורך כל הליכי העידון. בצע פרוטוקולי עידון בתוכנת עיבוד הנתונים באמצעות סימטריית I1 כדי לקבל מפות EM מרובות. הרזולוציה המבנית הצפויה עשויה להיות בטווח של 4 Å ומעלה. השתמש בשקילות חלקיקים המיישמת סימטריה איקוסהדרלית ב-16,800 עבור נוזל ו-15,240 עבור קרח12,14.
הערה: אומדני הרזולוציה מבוססים על הקריטריונים של מתאם מעטפת פורייה (FSC) בתקן הזהב. - להסוות מפות EM ב~250 Å ולבחון את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה לניתוח מבנה מולקולרי23,24. באיור 3, פרוסות מוצגות במרווחים של ~5 ננומטר.
- חלץ יחידות משנה של חלבון קפסיד (VP1) ממפות EM לצורך השוואה. כמת שינויים דינמיים בין מבני EM בהתבסס על מדידות קוטר החלקיקים (איור משלים 2), ולאחר מכן הצג באופן חזותי באמצעות פונקציית המפה 'שינוי צורה' בתוכנה.
- ניתוח של מכלולים תת-ויראליים של SARS-CoV-2 בנוזל
- עבד סרטים באמצעות התוכנית RELION-3.08. נכון להיסחפות תמונה ולתנועה הנגרמת על-ידי קרן באמצעות MotionCor2 v1.2.3. נכון עבור פונקציית העברת הניגודיות (CTF) של המיקרוסקופ.
- השתמש בכלי הבחירה האוטומטי בתוכנית כדי לבחור מכלולים ויראליים בגודל קופסה של 800 פיקסלים. ליעילות חישובית, ניתן לשנות את קנה המידה של חלקיקים שחולצו ל-256 פיקסלים. השג מודל ראשוני באמצעות סימטריה C1 בתוכנית עם פרמטר רגולריזציה של T = 2 וגודל פיקסל 1.66 Å.
- בצע חידוד תלת-ממדי בתוכנית כדי לקבל מפת EM, דוגמה מוצגת ב~8.25 Å בהתאם לקריטריונים סטנדרטיים של FSC (איור 4). דמיינו מפות EM באמצעות תוכנת ניתוח המבנה המולקולרי עם פרוסות בנפח של 25 ננומטר, כפי שמודגם באיור 4.
- ניתוח של חלקיקים דו-שכבתיים (DLPs) של נגיף הרוטה בקרח הזגוגי
- עבד סרטים עבור DLPs rotavirus באמצעות תוכנות עיבוד תמונה אחרות. השתמש ב- MotionCor2 v1.2.3 כדי לתקן את הסחף בתמונות. השתמש בהערכת CTF של תיקון כדי לתקן את השפעות העדשה על התמונות.
- חלץ חלקיקים באמצעות כלי הקטיף האוטומטי בתוכנה בגודל קופסה של 950 פיקסלים. הפחת את גודל הקופסה לפי הצורך למטרות מחשוב.
- חשב מודלים ראשוניים באמצעות אפשרויות ab-initio וסימטריית C1. השתמש בפרמטרים של עידון, כולל גודל פיקסלים של 1.47 Å וערך מסיכה של 800 Å.
- בצע שגרות חידוד נוספות תוך כפיית סימטריה I1. תוצאות לדוגמה כוללות מפה של 10.15 Å EM, בהתאם לקריטריונים של FSC בתקן הזהב. סך כל החלקיקים שבהם נעשה שימוש היה 2050, שווה ערך ל-123,000 יחידות פרוטומר הודות לאופרטור הסימטריה האיקוסהדרלית (איור 5).
- מסווה מפות סופיות ב~750 Å והצג באופן חזותי תוצאות בחבילת התוכנה לניתוח מבנה מולקולרי. פרוסות לדוגמה דרך מפת EM מוצגות באיור 5 במרווחים של ~10 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נוזל-TEM הפועל ב-200 קילו-וולט שימש לכל ניסויי ההדמיה של נוזל-EM וקריו-TEM הפועל ב-300 קילו-וולט שימש לכל איסוף הנתונים של cryo-EM. תמונות מייצגות ומבנים של וירוסים מרובים מוצגים כדי להדגים את התועלת של השיטות על פני נבדקים שונים. אלה כוללים תת-סוג נגיף רקומביננטי הקשור לאדנו 3 (AAV), מכלולים תת-נגיפיים של SARS-CoV-2 שמקורם בסרום החולה, וחלקיקים דו-שכבתיים דו-שכבתיים של simian rotavirus (DLPs), זן SA11. ראשית, השוואות מודגמות עבור אותה דגימת AAV (1 מ"ג/מ"ל) שצולמה בתמיסת חיץ נוזלי (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) ובקרח זגוגי (איור 3A-C; תרשים משלים 2). דגימות ה- Liquid-EM הוכנו באמצעות שבבים מבוססי SiN ומחזיק הדגימה המיוחד. דגימות הקריו-EM הוכנו באמצעות רשתות פחמן חוריות סטנדרטיות וטופלו באמצעות יחידת הכנת דגימות משוכללת לאתאן נוזלי. למבני הנגיף שהתקבלו היו קטרים כוללים דומים של ~ 25 ננומטר. השוואה של פרוטומרים בודדים מסוג VP1 capsid הראתה גם תכונות עקביות במפות EM של נוזלים וקרח (איור 3D). הבדל אחד בין נתוני Liquid-EM ו-cryo-EM היה שמבנים דינמיים נוספים נצפו בנוזל שלא היו נוכחים בתוצאות cryo-EM (איור 3E)12.
לאחר מכן, נבדקו דגימות SARS-CoV-2 מושבתות (0.25 מ"ג/מ"ל) שהוכנו בתמיסת חיץ (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) באמצעות טכניקת כריך שבב חדשה 7,14. הטכניקה החדשה משתמשת בשבבים מבוססי SiN יחד עם רשתות זהב מצופות פחמן. בתכשיר זה, דגימת הנוזל הייתה דחוקה בין שני המצעים (איור 2A-C). דגימות דחוקות היו מהודקות עם מחזיק דגימה בעל הטיה אחת או קליפסים C-loader אוטומטי המשמשים בדרך כלל בהכנת דגימות cryo-EM. ניתן לצפות בדגימות באופן מיידי ב- TEM או לאחסן אותן בטמפרטורה של 4°C למשך חודשיים או יותר, בהתאם ליציבות הדגימה הביולוגית. המראה של מבעבע בדגימות הנוזל מבטיח את נוכחותה של שכבת הנוזל. ניתן למדוד את עובי הנוזל באמצעות פרוטוקולי EF-TEM כמתואר12. נראה כי למכלולים תת-נגיפיים של SARS-CoV-2 בנוזל יש ניגודיות גבוהה לעין ביחס לנוזל שמסביב (איור 4A,B). חלק מהחלקיקים הציגו קוצים גלויים על פני הנגיף בעוד שחלק מהחלקיקים חסרים קוצים או מעוטרים בהם בדלילות (איור משלים S3). ממוצעים ופרוסות של מחלקות דרך המבנה של 8.25 Å הראו תכונות פנימיות בתוך החלקיקים המרכיבים תת-יחידות חלבון וגנום הרנ"א הנגיפי (איור 4C). למרות שנראה כי חלק מהחלקיקים מכילים סימטריה C2 (לאחר בדיקת סימטריית C2, שקילות החלקיקים הייתה 2,674), המבנה האסימטרי לא היה שונה בהרבה בהשוואה למבנה הסימטרי.
לבסוף, הניתוח כלל DLPs של רוטה-וירוס (3 מ"ג/מ"ל; 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) בקרח זגוגי על ידי הקפאת הבזק ידנית של תכשירי סנדוויץ' שבב להקפאת הבזק לחנקן נוזלי. אותה טכניקת סנדוויץ' ששימשה לייצור דגימות נוזליות-EM שימשה לדגימות שעברו הידרציה קפואה. סנדוויצ'ים נאטמו עם קליפסים לרשת autoloader ונבדקו באמצעות cryo-TEM בתנאים סטנדרטיים. תצוגות בהגדלה נמוכה של הדגימות הקפואות הראו מעט מאוד זיהום קרח מעוקב או משושה, ואזורים של DLPs צפופים נצפו לאורך חלונות הצפייה (איור 5A,B). התמונות נאספו באמצעות שגרות אוטומטיות שיושמו בחבילת ה-EPU. ממוצעים ופרוסות של מחלקות דרך המפה של 10.15 Å חשפו תכונות יציבות התואמות את רכיבי החלבון הנגיפי ואת גנום הרנ"א הדו-גדילי (איור 5D,E). הבדל הניגודיות בין ה-DLPs לרקע הקרח לא היה חזק באותה מידה בתמונות הקריו-EM בהשוואה לדגימות ה-Liquid-EM. בעוד שהסיבה להשפעה מעניינת זו עדיין נקבעת, ראוי לציין את ההבדל מכיוון ש- liquid-EM עשוי להציע יתרונות עתידיים לקהילת ההדמיה.
איור 1: טכניקות המשמשות להדמיה ברזולוציה גבוהה של נגיפים בנוזל ובקרח. שתי זרימות העבודה מדגישות שיטות שונות להכנת דוגמאות Liquid-EM. הלוח השמאלי מציג ייצוג סכמטי של מחזיק דגימת נוזל-EM. שבב הבסיס SiN כולל מערך (500 μm x 100 μm) של microwells משולבים (10 μm x 10 μm) כי הם ~ 150 ננומטר עומק עם קרום ~ 30 ננומטר עובי. הפאנל הימני מציג שרטוט של טכניקת כריך השבב, אשר יכול לשמש הן למחקר נוזל-EM והן למחקר cryo-EM. מכלולי הכריך משתמשים בשבב SiN בשילוב עם רשת TEM מוזהבת מצופה פחמן. חתך רוחב של המכלול מציין חלונות הדמיה מרובים הנעים בין 250 μm x 250 μm ל 50 μm x 50 μm בגודל עם עובי ממברנה של 10 ננומטר או 5 ננומטר, בהתאמה. סרט תמיכת הפחמן הוא ~ 5 ננומטר עובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: טכניקת כריך השבב עבור נוזל-EM וקריו-EM . (A) מכלול כריך השבב משתמש בשבב SiN בשילוב עם רשת TEM מוזהבת מצופה פחמן. שבב משוחרר זוהר מונח על חבילת ג'ל ודגימות וירוסים מתווספות לשבב. לאחר תקופת דגירה קצרה, פתרון עודף מוסר, ואת הכריך אטום עם רשת TEM. (B) כריך השבב אטום בהתקן גזירה בטמפרטורת החדר וניתן לטעון אותו ישירות למחזיק TEM בעל הטיה אחת או למערכת טעינה אוטומטית של TEM. (C) שרטוטי חתך של מכלול כריך השבב מדגישים את מידות השבבים ושכבת הפחמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השוואה בין מבנים נוזליים-EM וקריו-EM של AAV. (A) מבנה של AAV בתמיסה (רזולוציה של 3.22 Å) עם צפיפות רדיאלית צבעונית המציגה פרוסות של 5 ננומטר דרך המפה. סרגל קנה המידה הוא 5 ננומטר. מדדי הדמיה מיועדים לקליטת נתונים באמצעות גלאי אלקטרונים ישירים. (B) מבנה של AAV שצולם בקרח (רזולוציה של 3.37 Å) עם צפיפות רדיאלית צבעונית מייצג פרוסות של 5 ננומטר דרך המבנה. סרגל קנה המידה הוא 5 ננומטר. מדדי הדמיה מיועדים לקליטת נתונים באמצעות גלאי אלקטרונים ישירים. (C) אזור עניין מציג 5 שניות ו-20 שניות נקודות זמן יחד עם התמרות פורייה המחושבות בנקודות זמן שונות. צד שמאל מראה הערכות CTF, צד ימין מראה את נתוני הניסוי. (D) תצוגות סיבוביות של יחידת המשנה AAV VP1 המופקת ממבני הנוזלים והקרח. המקטעים פורשו באמצעות המבנה הגבישי (קוד PDB 3KIC, שרשרת A25). סרגל קנה המידה הוא 10 Å. (E) ערכים דינמיים במבנים הנוזליים שנוצרו באמצעות פונקציית מפת שינוי הצורה בתוכנת ניתוח המבנה המולקולרי ומתוארים בשלב 4.1.6-4.2.3. משמאל לימין, מבנים ממוצעים ממכלולים מרובים של וירוסים מראים שינויים קונפורמיים עם שינוי מקביל של ~ 5% בקוטר, הנמדד באמצעות נתוני EM. ערכי RMSD בווקסלים מציינים שינויים בהתאם לסולם הצבעים. האיור שונהמ-12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: מכלולים תת-ויראליים של SARS-CoV-2 שהוכנו בנוזל באמצעות טכניקת כריך השבב. (A) תמונה של מכלולים תת-נגיפיים של SARS-CoV-2 שבודדו משברי סרום מחולי COVID-19. מדדי הדמיה מיועדים לקליטת נתונים באמצעות גלאי אלקטרונים ישירים. בועות לבנות בפינה השמאלית העליונה של התמונה הן אינדיקציה חזותית לכך שנוזל נמצא בדגימה. סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר. (B) התמרת פורייה מחושבת של התמונה מציגה מידע ברזולוציה גבוהה במרחב הדדי עם מעט או ללא סחף בתמונה המתאימה. ממוצעי הכיתה מראים תכונות ייחודיות במכלולים הנגיפיים הכלולים בתמיסה. (C) שחזור EM של המכלולים התת-ויראליים מוצג עם צפיפות רדיאלית צבעונית בפרוסות של 5 ננומטר דרך המפה. סרגל קנה המידה הוא 25 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: DLPs של Rotavirus שהוכנו בנוזל באמצעות טכניקת כריך השבב. (A,B) שלבי סינון בהגדלה נמוכה באמצעות תוכנת הניתוח. גבישי קרח מוגבלים נצפו, וקרומי החלונות היו דקים וצלולים, מה שפשט את בחירת השטח לאיסוף נתונים. סרגל קנה המידה ב- (A) הוא 5 מיקרומטר וב- (B) הוא 500 ננומטר. (C) הסרטים נרכשו באמצעות גלאי האלקטרונים הישירים במצב ספירה בהתאם למדדי ההדמיה שצוינו. סרגל קנה המידה הוא 50 ננומטר. (D) מידע התמרת פורייה מציין מידע ברזולוציה גבוהה הקיים בנתונים וממוצעי המחלקות מראים תכונות חזקות בסריג האיקוסהדרלי. ממוצעים מעמדיים מראים תכונות במכלולי הנגיף נטולי ממצאים ותואמים לתצפיות מבניות אחרות 6,15,17. (E) שחזור EM של DLPs (רזולוציה של 10.15 Å) מוצג עם צפיפויות רדיאליות צבעוניות בפרוסות של 10 ננומטר דרך המפה. סרגל קנה המידה הוא 15 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: אישור נוכחות של נוזל בדגימות EM. הגדלה נמוכה של חלקיקי AAV בתמיסה שנרכשה בתנאי מינון נמוך (<10 e- Å-2 s-1) חסרות בועות. באמצעות קרן ממוקדת של >100 e- Å-2 s-1, דגימות נוזליות הראו היווצרות בועות (חיצים שחורים). סרגל קנה המידה הוא 500 ננומטר. האיור שונהמ-12. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: מדידת שינויים בממדי AAV בנוזל. (A) עקבות קווי מתאר של חלקיקי נגיף נרכשו על פני מסגרת זמן של 20 שניות. סרגל קנה המידה הוא 25 ננומטר. (ב,ג) טבלה וייצוגים גרפיים של מדידות קוטר חלקיקים ב-1, 5, 10 ו-20 שניות. השינוי הכולל בקוטר החלקיקים במהלך ההקלטה של 20 שניות היה 0.28% במינון של ~1e- Å-2 s-1. (ד,ה) ערכי אות לרעש נקבעים בנקודות זמן משתנות במהלך רכישת סרטים. האיור שונהמ-12. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: תמונת הגדלה גבוהה של תת-קומפלקסים של SARS-CoV-2 שמקורם בחולה. מכלולים נגיפיים הטרוגניים הראו נוכחות של חלבוני ספייק (חיצים אדומים) על פני השטח של חלקיקים מסוימים. חלקיקים אחרים היו חסרים קוצים על פני השטח כפי שסומנו. סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
וידאו 1: הדמיה בזמן אמת של AAV בנוזל. השוואה זה לצד זה של הקלטה בזמן אמת של AAV בנוזל (משמאל) ועקבות קווי מתאר צבעוניים של החלקיקים המתפזרים בתמיסה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
וידאו 2: הדמיה של מעקב אחר תמונות בנוזל. השוואות זו לצד זו של סרט מסונן צבעוני ונמוך של פיזור AAV בתמיסה (משמאל) עקבות קווי מתאר צבעוניים של החלקיקים המתפזרים בתמיסה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזדמנויות חדשות מוצגות כדי לייעל את זרימות העבודה הנוכחיות של Liquid-EM על-ידי שימוש בכלים וטכנולוגיות אוטומטיים חדשים המותאמים מתחום cryo-EM. יישומים הכרוכים בטכניקת כריך השבב החדשה הם משמעותיים ביחס לשיטות אחרות מכיוון שהם מאפשרים ניתוח הדמיה ברזולוציה גבוהה בקרח נוזלי או זגוגי. אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא ייצור דגימות עם עובי הנוזל האידיאלי כדי לדמיין פרטים מעודנים ברמה הננומטרית. אזורי עניין אידיאליים מזוהים בהגדלה נמוכה יותר על-ידי סינון המדגם כולו לפני יישום שגרות תפוקה גבוהה לאיסוף נתונים אוטומטי. אם האזורים המזוהים בדגימות נוזל או קרח מכילים ממצאים הניזוקים מקרן או נראים עבים מכדי לזהות חלקיקים בודדים שהם חדים מבחינה חזותית, יש להוציא אותם מאיסוף הנתונים. מגבלות בקליטת נתונים ברזולוציה גבוהה כוללות תנועה המושרה על ידי קרן ותנועה בראונית בדגימות הנוזליות. שיטות Cryo-EM שואפות למזער את התנועה בדגימות ביולוגיות; עם זאת, שיטות תיקון תנועה הן חזקות מבחינה חישובית בהפחתת גורמים מגבילי רזולוציה אלה. אם דגימות הנוזל מציגות סחיפה ארוכת טווח וחוסר יציבות תרמית, ניתן להכין דגימות דקות יותר על ידי הסרת תמיסה עודפת במהלך שלבי הכנת הדגימה כדי להקטין את עובי שכבות הנוזל.
צפיפות מולקולרית בין חלקיקי הנגיף עלולה להיווצר כאשר נעשה שימוש בדגימות בריכוזים גבוהים. אם ישנם אזורים מרובים עם חלקיקים חופפים באופן המגביל איסוף נתונים חזק, יש להפחית את ריכוז דגימת הקלט לפני הכנת הדגימה. ריכוז מדגם מתאים הוא שלב מכריע בפרוטוקול. תמונות המכילות עודף חלקיקים יסבכו את הליכי עיבוד התמונה במורד הזרם. עבור חלקיקי נגיף מטוהרים, טווח ריכוז הולם הוא בין 0.3-3 מ"ג/מ"ל, בהתאם לממדים ולמשקל המולקולרי של הדגימה. וירוסים גדולים יותר (~100 ננומטר קוטר ומעלה) דורשים בדרך כלל ריכוזים גבוהים יותר מאשר וירוסים קטנים יותר (~25 ננומטר קוטר או פחות) להצלחת הטכניקה. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא הרמה שבה חלקיקי העניין נצמדים לשבבים הזוהרים. אם דגימת הנגיף אינה נדבקת היטב לפני השטח, ייתכן שיהיה צורך בריכוז גדול יותר כדי להכין כראוי דגימות לנוזל-EM או קריו-EM. לחלופין, ניתן להחיל את הדגימה על רשת הזהב המצופה פחמן, כאשר השבב משמש כמכסה המארז. אם נהלים אלה לא יצליחו לגייס מספיק חלקיקים להליכי איסוף נתונים, שיטות לכידת זיקה עשויות להציג אפשרות מעשית26,27,28.
יש למזער או להימנע משימוש בתוספים מסוימים כגון דטרגנטים, גליצרול, פוליאתילן גליקולים ורמות גבוהות של סוכרוז או גלוקוז לצורך הדמיית נוזל-EM. ריאגנטים אלה עשויים להציג חפצים בתמונות, כמו גם להוביל למבעבע מוגזם, תוצרי הידרוליזה והיווצרות רדיקלים חופשיים עקב נזק לקרן. אפקטים כאלה מובילים לתכונות מושתקות בחלקיקים המצולמים ובסופו של דבר מגבילים את הרזולוציה המבנית. אחת הדרכים להסיר ריאגנטים אלה אם הם משמשים בתכשירים ביוכימיים היא באמצעות דיאליזה נרחבת לתמיסת חיץ ללא התוספים. ריאגנטים אלה יצטרכו להיבדק ולהשתמש בהם על בסיס כל מקרה לגופו. יתר על כן, לאחר שהופקו דגימות מספיקות בטכניקת כריך השבב, ניתן לצלם אותן מיד או לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנות לבדיקה. זמני האחסון תלויים ביציבות הדגימה.
באופן כללי, השימוש ב-liquid-EM בשילוב עם cryo-EM מאפשר לחוקרים לבחון מערכות ביולוגיות בעזרת כלי הדמיה משלימים. טכניקת כריך השבבים שפותחה לאחרונה מניבה דגימות עקביות להדמיית TEM בנוזל או בקרח. הטכניקה גם מספקת אמצעי פשוט לחוקרים להכין ולהציג דגימות ללא צורך במחזיק דגימה מסחרי או במערכת ויטריפיקציה. בשילוב עם פרוטוקולי הדמיה אוטומטיים, ניתן לרכוש כמויות גדולות של נתונים בסדר גודל של אלפי תמונות בכל סשן לכל דגימה. עבודתם החלוצית של פרסונס ועמיתיו 29,30,31,32,33 הניחה את היסודות הבסיסיים לייצור דגימות ביולוגיות במארזים נוזליים. הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים כיצד כלים חדישים יכולים כעת לספק אמצעי מרגש לדמיין מקרומולקולות ביולוגיות דרך עיניים חדשות. יישומים עתידיים שצפויים לנבוע משליטה בטכניקות אלה, בשילוב עם מחשוב בעל ביצועים גבוהים, הם תובנות מכניסטיות בזמן אמת להבנת יחסי מבנה-פונקציה בתלת-ממד. תחום ה-Liquid-EM עשוי לשמש להגברת המחקר על וירוסים חדשים המהווים איום על בריאות האדם, ואולי אף לתרום לאמצעי המוכנות למגפה. לסיכום, השימוש בפרוטוקולים אלה אמור לאפשר למדענים ולמהנדסים לחקור טוב יותר תהליכים דינמיים בפירוט אטומי, על פני מגוון גדול של דגימות המקיפות מדעי החיים, רפואה וחקר חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. המחברת, מדליין ג'יי דרסל-דוקס, היא עובדת של פרוטוצ'יפס בע"מ ומייקל ספילמן הוא עובד של DirectElectron.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר לוק ה. ונדנברגה (בית הספר לרפואה של הרווארד, המחלקה לרפואת עיניים) על אספקת AAV-3 מטוהר. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והמכון הלאומי לסרטן (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 עד D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
