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Biochemistry

तरल और बर्फ में वायरस असेंबली की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को आगे बढ़ाना

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63856
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1,4, 5, 6, 1, 7, 8, 2, 9, 1,5,6
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University
* These authors contributed equally

Summary

यहां ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नैनोस्केल पर तरल-ईएम और क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए उपयुक्त वायरस असेंबली तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

Abstract

तरल-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (तरल-ईएम) में रुचि हाल के वर्षों में आसमान छू रही है क्योंकि वैज्ञानिक अब नैनोस्केल पर वास्तविक समय प्रक्रियाओं का निरीक्षण कर सकते हैं। गतिशील अवलोकनों के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम जानकारी को जोड़ना बेहद वांछनीय है क्योंकि कई घटनाएं तेजी से टाइमस्केल पर होती हैं - मिलीसेकंड रेंज में या तेजी से। लचीली संरचनाओं का बेहतर ज्ञान सार्स-सीओवी-2 जैसे उभरते रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए नए अभिकर्मकों के डिजाइन में भी सहायता कर सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, एक तरल वातावरण में जैविक सामग्री देखना मानव शरीर में उनके प्रदर्शन की एक अनूठी झलक प्रदान करता है। यहां प्रस्तुत तरल और विट्रीयस बर्फ में वायरस असेंबली के नैनोस्केल गुणों की जांच करने के लिए नए विकसित तरीके हैं। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, अच्छी तरह से परिभाषित नमूने मॉडल सिस्टम के रूप में उपयोग किए गए थे। नमूना तैयार करने के तरीकों और प्रतिनिधि संरचनात्मक जानकारी की साइड-बाय-साइड तुलना प्रस्तुत की जाती है। उप-नैनोमीटर विशेषताओं को ~ 3.5-ए -10 ए की सीमा में हल की गई संरचनाओं के लिए दिखाया गया है। इस पूरक ढांचे का समर्थन करने वाले अन्य हालिया परिणामों में वैक्सीन उम्मीदवारों की गतिशील अंतर्दृष्टि और तरल में चित्रित एंटीबॉडी-आधारित उपचार शामिल हैं। कुल मिलाकर, ये सहसंबंधी अनुप्रयोग आणविक गतिशीलता की कल्पना करने की हमारी क्षमता को आगे बढ़ाते हैं, मानव स्वास्थ्य और बीमारी में उनके उपयोग के लिए एक अद्वितीय संदर्भ प्रदान करते हैं।

Introduction

बायोमेडिकल अनुसंधान नई प्रौद्योगिकियों के विकास के माध्यम से मानव स्वास्थ्य और बीमारी की हमारी समझ में सुधार करता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग नैनोवर्ल्ड के बारे में हमारे दृष्टिकोण को बदल रही है - हमें कोशिकाओं और अणुओं का उत्कृष्ट विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है 1,2,3,4,5। नरम पॉलिमर, प्रोटीन असेंबली या मानव वायरस जैसे गतिशील घटकों की स्थिर जानकारी उनकी जटिल कथा का केवल एक सीमित स्नैपशॉट प्रकट करती है। आणविक संस्थाओं के संचालन को बेहतर ढंग से समझने के लिए, उनकी संरचना और कार्य की संयुक्त रूप से जांच की जानी चाहिए।

परमाणु रूप से पतले ग्राफीन या सिलिकॉन-आधारित माइक्रोचिप्स जैसी सामग्रियों के उत्पादन में हालिया प्रगति ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग करके वास्तविक समय संरचना-कार्य विश्लेषण के लिए नए अवसर प्रदान करती है। ये सामग्री लाइव ईएम इमेजिंग 6,7,8,9,10,11 के लिए हर्मेटिक रूप से सील किए गए कक्ष बना सकती हैं। तरल-ईएम का नया क्षेत्र, कमरे का तापमान क्रायो-ईएम से संबंधित है, समाधान में कठोर या नरम सामग्री के अभूतपूर्व दृश्य प्रदान करता है, जिससे वैज्ञानिकों को एक साथ अपने नमूने की संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। तरल-ईएम अनुप्रयोगों में कैंसर स्टेम कोशिकाओं के साथ बातचीत करने वाले चिकित्सीय नैनोकणों की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग के साथ-साथ वायरल रोगजनकों 12,13,14 की आणविक पेचीदगियों में परिवर्तन शामिल हैं।

जिस तरह पद्धतिगत प्रगति ने क्रायो-ईएम क्षेत्र में संकल्प क्रांति को प्रेरित किया, वैज्ञानिक समुदाय के लिए उच्च-थ्रूपुट टूल के रूप में तरल-ईएम के उपयोग का विस्तार करने के लिए नई तकनीकों और विधियों की आवश्यकता है। यहां प्रस्तुत विधियों का समग्र लक्ष्य तरल-ईएम नमूना तैयारी प्रोटोकॉल को सुव्यवस्थित करना है। विकसित तकनीकों के पीछे तर्क नए माइक्रोचिप डिजाइन और ऑटोलोडर उपकरणों को नियोजित करना है, जो तरल और क्रायो-ईएम डेटा संग्रह (चित्रा 1) 7,14,15,16,17 दोनों के लिए उपयुक्त हैं। असेंबली को स्वचालित उपकरणों के लिए मानक ग्रिड क्लिप का उपयोग करके यांत्रिक रूप से सील किया जाता है, जैसे कि क्रिओस, जो प्रति सत्र कई नमूनों या एफ 200 सी टीईएम (चित्रा 2) को समायोजित कर सकता है। यह पद्धति मानक क्रायो-ईएम अनुप्रयोगों से परे उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के उपयोग का विस्तार करती है जो वास्तविक समय सामग्री विश्लेषण के लिए व्यापक उद्देश्यों का प्रदर्शन करती है।

वर्तमान वीडियो लेख में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नमूना धारकों के साथ और बिना तरल में वायरस असेंबली तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। तरल-ईएम के लिए विशेष नमूना धारक का उपयोग करके, पतले तरल नमूने क्रायो-ईएम नमूनों के साथ-साथ नमूनों की गतिशील अंतर्दृष्टि के बराबर संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा उच्च-थ्रूपुट दिनचर्या के लिए ऑटोलोडर उपकरणों का उपयोग करके तरल नमूने तैयार करने के तरीके भी प्रदर्शित किए गए हैं। अन्य तकनीकों पर प्रमुख लाभ यह है कि स्वचालित नमूना उत्पादन उपयोगकर्ता को डेटा संग्रह से पहले इष्टतम मोटाई और इलेक्ट्रॉन खुराक के लिए अपने नमूनों का जल्दी से आकलन करने की अनुमति देता है। यह स्क्रीनिंग तकनीक तरल या बर्फ 12,14,18,19 में वास्तविक समय रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श क्षेत्रों की पहचान करती है। 3 डी संरचना निर्धारण के प्रयोजनों के लिए, तरल-ईएम क्रायो-ईएम में लागू लंबे समय से स्थापित क्रायो-ईएम विधियों का पूरक हो सकता है। पारंपरिक टीईएम या क्रायो-ईएम प्रौद्योगिकियों को नियोजित करने वाले पाठक अपने नमूनों के नए, गतिशील अवलोकन प्रदान करने के लिए तरल-ईएम वर्कफ़्लो का उपयोग करने पर विचार कर सकते हैं जो उनकी वर्तमान रणनीतियों को पूरक करता है।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले वायरस के नमूनों में शुद्ध एडेनो से जुड़े वायरस उपप्रकार 3 (एएवी) शामिल हैं जो उपहार के रूप में प्राप्त किए जाते हैं और मानकशर्तों 12 के तहत सुसंस्कृत होते हैं। इसके अलावा गैर-संक्रामक सार्स सीओवी-2 उप-वायरल असेंबली का भी इस्तेमाल किया गया, जो कोविड-19रोगियों के सीरम से प्राप्त और एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था। अंत में, शुद्ध सिमियन रोटावायरस (एसए 11 स्ट्रेन) डबल-लेयर्ड कण (डीएलपी) वेक फॉरेस्ट यूनिवर्सिटी में डॉ सारा एम मैकडॉनल्ड एस्टमैन की प्रयोगशाला से प्राप्त किए गए और मानक स्थितियों 6,17 का उपयोग करके सुसंस्कृत किए गए। यहां वर्णित सॉफ्टवेयर पैकेज स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं और लिंक सामग्री की तालिका अनुभाग में प्रदान किए गए हैं।

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Protocol

1. तरल-ईएम के लिए नमूना धारक लोड करना

  1. सिलिकॉन नाइट्राइड (एसआईएन) माइक्रोचिप्स को 2 मिनट के लिए 150 एमएल एसीटोन में इंजेक्ट करके और 2 मिनट के लिए 150 एमएल मेथनॉल में इनक्यूबेशन करके साफ करें। चिप्स को लैमिनार एयरफ्लो में सूखने दें।
  2. प्लाज्मा आर्गन गैस का उपयोग करके 45 सेकंड के लिए 30 डब्ल्यू, 15 एमए की मानक स्थितियों के तहत संचालित चमक-निर्वहन उपकरण का उपयोग करके सूखे चिप्स को साफ करता है।
  3. नमूना धारक के सिरे में एक शुष्क आधार माइक्रोचिप लोड करें। बेस चिप में ~ 0.2 μL नमूना (50 mM HEPES में वायरस असेंबली का 0.2-1 mg/mL, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) जोड़ें। 1-2 मिनट इनक्यूबेशन चरण के बाद, नमूने वाले गीले बेस चिप पर शीर्ष चिप रखें।
  4. असेंबली को एक साथ दबाकर एक जड़ी-बूटियों से सील किया गया बाड़ा बनाया जाता है, जिसे यांत्रिक रूप से तीन पीतल के स्क्रू द्वारा रखा जाता है। असेंबली को सील करने पर, टर्बो-पंप ्ड ड्राई पंपिंग स्टेशन का उपयोग करके टिप को 10-6 टॉर तक पंप करें। धारक अब टीईएम में डालने के लिए तैयार है।
    नोट: चयनित धारक के पास कोई शीतलन क्षमता नहीं है और क्रायो-ईएम के लिए उपयोग नहीं किया जाता है।

2. माइक्रोचिप सैंडविच असेंबली का उत्पादन

नोट: विभिन्न एसआईएन या सिलिकॉन डाइऑक्साइड (एसआईओ) माइक्रोचिप्स का उपयोग सीधे भेजे गए जेल पैक से किया जा सकता है। कार्बन-लेपित सोने के ग्रिड का उपयोग सीधे आपूर्ति के रूप में भी किया जा सकता है।

  1. प्लाज्मा आर्गन गैस का उपयोग करके 30 डब्ल्यू, 15 एमए की मानक स्थितियों के तहत संचालित चमक निर्वहन उपकरण का उपयोग करके माइक्रोचिप्स और कार्बन ग्रिड को साफ करता है।
  2. 50 mM HEPES, pH 7.5 में निहित नमूने के ~ 2 μL जोड़ें; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 एक जेल पैक पर रखी गई चमक-डिस्चार्ज माइक्रोचिप के लिए। फ़िल्टर पेपर या पिपेट का उपयोग करके अतिरिक्त समाधान (~ 50%) निकालें। 1-2 मिनट इनक्यूबेशन चरण के बाद, नमूने वाले गीले माइक्रोचिप में चमक-डिस्चार्ज कार्बन ग्रिड जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान पर एकल-झुकाव नमूना धारक या ऑटोलोडर ग्रिड क्लिप का उपयोग करके असेंबली को एक साथ दबाएं ताकि एक हेर्मेटिक सील बाड़ा बनाया जा सके। ऑटो-लोडर क्लैंप के लिए, सैंडविच असेंबली को नीचे सी-क्लिप पर रखें, शीर्ष क्लिप को असेंबली के शीर्ष पर रखें और असेंबली को एक साथ सील करने के लिए मानक क्लैंपिंग टूल का उपयोग करें।
    नोट: यहां की गई क्लैंपिंग प्रक्रिया क्रायो-ईएम ग्रिड क्लैंपिंग के लिए समान चरणों का उपयोग करती है, लेकिन कमरे के तापमान पर। घेरे में तरल बनाए रखते हुए इमेजिंग से पहले क्लैंप किए गए नमूने 2 महीने या उससे अधिक समय तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। कमरे के तापमान नमूना धारक या ऑटोलोडर के साथ कोई रिसाव जांच का उपयोग नहीं किया जाता है।
  4. नमूना अब टीईएम में डालने के लिए तैयार है। क्रायो स्थितियों के तहत या कमरे के तापमान पर ऑटोलोडर में रखे गए नमूनों की जांच करें।

3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करइमेजिंग नमूने

  1. तरल-ईएम इमेजिंग
    1. नमूना धारक को फील्ड-उत्सर्जन बंदूक (एफईजी) से लैस टीईएम में लोड करें और 200 केवी पर काम करें।
    2. बंदूक चालू करें और वॉबलर फ़ंक्शन का उपयोग करके नमूने के संबंध में माइक्रोस्कोप चरण की यूसेंट्रिक ऊंचाई को समायोजित करें, कॉलम में नमूने को -15 ° से +15 ° तक झुकाएं। यह प्रक्रिया नमूना मोटाई को समायोजित करने के लिए जेड-दिशा में चरण को समायोजित करती है। और छवि रिकॉर्डिंग के दौरान एक सटीक आवर्धन सुनिश्चित करने में मदद करता है।
    3. 6 μm (वीडियो 1 और वीडियो 2) की पिक्सेल रिक्ति वाले प्रत्यक्ष डिटेक्टर के साथ एकीकृत सीटू पैकेज का उपयोग करके लंबे फ्रेम वाली फिल्मों के रूप में छवियों को रिकॉर्ड करें। स्वचालित इमेजिंग रूटीन को लागू करते हुए सीरियल डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर पैकेज20 का उपयोग करके व्यक्तिगत छवियों को भी रिकॉर्ड किया जा सकता है। 28,000x-92,000x और 40 फ्रेम प्रति सेकंड तक के आवर्धन पर कम खुराक की स्थिति में छवियां प्राप्त करें।
    4. नमूने को बीम क्षति को कम करने के लिए एक्सपोज़र समय (0.25-1 एस) समायोजित करें। निर्दिष्ट आवर्धन पर -1-4 μm की एक डीफोकस रेंज का उपयोग करें। यदि एक मोटा समाधान सामने आता है, तो उच्च डीफोकस मानों का उपयोग करें या रुचि के एक अलग क्षेत्र का चयन करें।
    5. सुनिश्चित करें कि समाधान पूरे इमेजिंग सत्र में नमूनों में मौजूद है, जब तक कि बुलबुले नहीं बनते (पूरक चित्रा 1)।
  2. क्रायो-ईएम इमेजिंग
    1. एफईजी से लैस और 300 केवी पर काम करने वाले टीईएम में स्लिप्ड ईएम ग्रिड या माइक्रोचिप सैंडविच लोड करें। बंदूक चालू करें और माइक्रोस्कोप चरण की यूसेंट्रिक ऊंचाई को समायोजित करें, ऊपर तरल-टीईएम के लिए वर्णित एक समान प्रक्रिया का उपयोग करें (चरण 3.1.2)।
    2. स्वचालित इमेजिंग दिनचर्या को लागू करते समय माइक्रोस्कोप प्रणाली के भीतर एकीकृत एकल कण विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके व्यक्तिगत छवियों को रिकॉर्ड करें। एकल कण विश्लेषण प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके कम खुराक की स्थिति में छवियों को रिकॉर्ड करें जिसमें 59,000x और 40 फ्रेम प्रति सेकंड के आवर्धन पर 14 μm की पिक्सेल रिक्ति होती है।
    3. निर्दिष्ट आवर्धन पर 1-4 μm की एक डीफोकस रेंज का उपयोग करें। यदि विट्रीस बर्फ की मोटी परतों का सामना करना पड़ता है, तो उच्च डीफोकस मानों का उपयोग करें, या डेटा संग्रह के लिए एक अलग क्षेत्र का चयन करें।

4. डेटा विश्लेषण और 3 डी संरचना तुलना

  1. तरल और विट्रीयस बर्फ में एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) का विश्लेषण
    1. RELYON-3.08 प्रोग्राम 21 या अन्य छविप्रसंस्करण सॉफ्टवेयर 22 का उपयोग करके तरल और बर्फ में एएवी कणों के लिए फिल्में संसाधित करें। MotionCor2 v1.2.3 का उपयोग करके गति सुधार करें।
    2. एक बार सही हो जाने के बाद, प्रोग्राम सॉफ्टवेयर पैकेज में ऑटो-पिकिंग टूल का उपयोग करके कणों को निकालें। विशिष्ट बॉक्स आकार तरल नमूनों के लिए 330 पिक्सेल और बर्फ के नमूनों के लिए 350 पिक्सेल हैं।
    3. प्रोग्राम के 3 डी प्रारंभिक मॉडल रूटीन और / या डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पैकेज में एब-इनीओ मॉडल विकल्पों का उपयोग करके सी 1 समरूपता का उपयोग करके प्रारंभिक पुनर्निर्माण की गणना करें। कार्यक्रम में, तरल नमूनों के लिए टी = 4 के नियमितीकरण पैरामीटर और 1.01 ए के पिक्सेल आकार और बर्फ के नमूनों के लिए 1.13 ए का उपयोग करें।
    4. शोधन प्रक्रियाओं के दौरान 300 ° के मास्क मूल्य का उपयोग करें। एकाधिक ईएम मानचित्र प्राप्त करने के लिए I1 समरूपता का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर में परिशोधन प्रोटोकॉल निष्पादित करें। अपेक्षित संरचनात्मक संकल्प 4 ° या बेहतर की सीमा में हो सकता है। तरल के लिए 16,800 और बर्फ 12,14 के लिए 15,240 पर इकोसाहेड्रल समरूपता को लागू करने वाले कण समतुल्यता का उपयोग करें।
      नोट: समाधान अनुमान स्वर्ण-मानक फूरियर शेल सहसंबंध (एफएससी) मानदंडों पर आधारित हैं।
    5. मास्क ईएम ~ 250 ए पर मैप करता है और आणविक संरचना विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज23,24 का उपयोग करके परिणामों की जांच करता है। चित्रा 3 में, स्लाइस ~ 5 एनएम की वृद्धि में दिखाए गए हैं।
    6. तुलना के लिए ईएम मानचित्रों से कैप्सिड प्रोटीन (वीपी 1) सबयूनिट्स निकालें। कण व्यास माप (पूरक चित्रा 2) के आधार पर ईएम संरचनाओं के बीच गतिशील परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करें, और फिर सॉफ्टवेयर में मॉर्फ मैप फ़ंक्शन का उपयोग करके कल्पना करें।
  2. तरल में सार्स-सीओवी-2 उप-वायरल असेंबली का विश्लेषण
    1. RELYON-3.08 प्रोग्राम का उपयोग कर के फिल्में संसाधित करें। मोशनकोर 2 v1.2.3 का उपयोग करके छवि बहाव और बीम-प्रेरित गति के लिए सही है। माइक्रोस्कोप के कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) के लिए सही है।
    2. 800 पिक्सेल के बॉक्स आकार के साथ वायरल असेंबली का चयन करने के लिए प्रोग्राम में ऑटो-पिकिंग टूल का उपयोग करें। कम्प्यूटेशनल दक्षता के लिए, निकाले गए कणों को 256 पिक्सेल में पुन: स्केल किया जा सकता है। टी = 2 और 1.66 ए पिक्सेल आकार के नियमितीकरण पैरामीटर के साथ कार्यक्रम में सी 1 समरूपता का उपयोग करके एक प्रारंभिक मॉडल प्राप्त करें।
    3. ईएम मानचित्र प्राप्त करने के लिए कार्यक्रम में 3 डी शोधन करें, एक उदाहरण मानक एफएससी मानदंड (चित्रा 4) के अनुसार ~ 8.25 ए पर दिखाया गया है। आणविक संरचना विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ईएम मानचित्रों की कल्पना करें, जिसमें स्लाइस 25 एनएम पर बढ़े हुए हैं जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है।
  3. विट्रीस बर्फ में रोटावायरस डबल-लेयर्ड कणों (डीएलपी) का विश्लेषण
    1. अन्य छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कररोटावायरस डीएलपी के लिए फिल्में संसाधित करें। छवियों में बहाव को सही करने के लिए MotionCor2 v1.2.3 का उपयोग करें। छवियों पर लेंस प्रभाव को सही करने के लिए पैच सीटीएफ अनुमान का उपयोग करें।
    2. 950 पिक्सेल के बॉक्स आकार के साथ सॉफ्टवेयर में ऑटो-पिकिंग टूल का उपयोग करके कणों को निकालें। कंप्यूटिंग उद्देश्यों के लिए आवश्यकतानुसार बॉक्स आकार का डाउन-सैंपल करें।
    3. प्रारंभिक विकल्पों और सी 1 समरूपता का उपयोग करके प्रारंभिक मॉडल की गणना करें। 1.47 A के पिक्सेल आकार और 800 A के मुखौटा मूल्य सहित परिशोधन मापदंडों का उपयोग करें।
    4. आई 1 समरूपता लागू करते समय अतिरिक्त शोधन दिनचर्या का प्रदर्शन करें। उदाहरण के परिणामों में स्वर्ण-मानक एफएससी मानदंडों के अनुसार, 10.15 ए ईएम मानचित्र शामिल है। उपयोग किए गए कुल कण 2050 थे, जो इकोसाहेड्रल समरूपता ऑपरेटर (चित्रा 5) के कारण 123,000 प्रोटोमर इकाइयों के बराबर है।
    5. ~ 750 A पर अंतिम मानचित्र ों को मास्क करें और आणविक संरचना विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज में परिणामों की कल्पना करें। ईएम मानचित्र के माध्यम से उदाहरण स्लाइस ~ 10 एनएम की वृद्धि में चित्रा 5 में दिखाए गए हैं।

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Representative Results

200 केवी पर संचालित एक तरल-टीईएम का उपयोग सभी तरल-ईएम इमेजिंग प्रयोगों के लिए किया गया था और सभी क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए 300 केवी पर संचालित क्रायो-टीईएम का उपयोग किया गया था। विभिन्न परीक्षण विषयों में विधियों की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए कई वायरस की प्रतिनिधि छवियां और संरचनाएं प्रस्तुत की जाती हैं। इनमें पुनः संयोजक एडेनो से जुड़े वायरस उपप्रकार 3 (एएवी), रोगी सीरम से प्राप्त सार्स-सीओवी-2 उप-वायरल असेंबली और सिमियन रोटावायरस डबल-लेयर्ड पार्टिकल्स (डीएलपी), एसए 11 स्ट्रेन शामिल हैं। सबसे पहले, तरल बफर समाधान (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) और विट्रीस बर्फ (चित्रा 3A-C; चित्रा 3A-C; चित्र 3A-C) में चित्रित एक हीAAV नमूने (1 mg/mL) के लिए तुलना का प्रदर्शन किया जाता है। पूरक चित्र 2)। तरल-ईएम नमूने एसआईएन-आधारित माइक्रोचिप्स और विशेष नमूना धारक का उपयोग करके तैयार किए गए थे। क्रायो-ईएम नमूने मानक छिद्रित कार्बन ग्रिड का उपयोग करके तैयार किए गए थे और तरल ईथेन में अत्याधुनिक नमूना तैयारी इकाई का उपयोग करके विट्रीफाइड किए गए थे। परिणामस्वरूप वायरस संरचनाओं में ~ 25 एनएम के समान समग्र व्यास थे। व्यक्तिगत वीपी 1 कैप्सिड प्रोटोमर्स की तुलना ने तरल और बर्फ ईएम मानचित्र (चित्रा 3 डी) दोनों में लगातार विशेषताएं दिखाईं। तरल-ईएम और क्रायो-ईएम डेटा के बीच एक अंतर यह था कि तरल में अतिरिक्त गतिशील संरचनाएं देखी गईं जो क्रायो-ईएम परिणामों (चित्रा 3 ई) 12 में मौजूद नहीं थीं।

इसके बाद, एक नई माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक 7,14 का उपयोग करके बफर समाधान (50 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5; 150 एमएम एनएसीएल; 10 एमएम एमजीसीएल 2; 10 एमएम सीएसीएल 2) में तैयार किए गए सार्स-सीओवी-2 नमूनों (0.25 मिलीग्राम/एमएल) को निष्क्रिय कर दिया गया। नई तकनीक कार्बन-लेपित सोने के ग्रिड के साथ एसआईएन-आधारित माइक्रोचिप्स का उपयोग करती है। इस तैयारी में, तरल नमूना दो सब्सट्रेट्स (चित्रा 2 ए-सी) के बीच सैंडविच किया गया था। सैंडविच नमूनों को एकल-झुकाव नमूना धारक या ऑटोलोडर सी-क्लिप के साथ दबाया गया था जो आमतौर पर क्रायो-ईएम नमूना तैयार करने में उपयोग किया जाता था। नमूने को टीईएम में तुरंत देखा जा सकता है या जैविक नमूने की स्थिरता के आधार पर 2 महीने या उससे आगे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। तरल नमूनों में बुदबुदाहट की उपस्थिति तरल परत की उपस्थिति सुनिश्चित करती है। तरल मोटाई को ईएफ-टीईएम प्रोटोकॉल का उपयोग करके मापा जा सकता है जैसा कि12 वर्णित है। तरल में सार्स-सीओवी-2 उप-वायरल असेंबली में आसपास के तरल के संबंध में उच्च दृश्यमान विपरीत दिखाई देता है (चित्रा 4 ए, बी)। कुछ कणों ने वायरस की सतह पर दिखाई देने वाले स्पाइक्स प्रदर्शित किए, जबकि कुछ कणों में स्पाइक्स की कमी है या उनके साथ विरल रूप से सजाया गया है (पूरक चित्रा एस3)। 8.25 ए संरचना के माध्यम से वर्ग औसत और स्लाइस ने प्रोटीन सबयूनिट्स और वायरल आरएनए जीनोम (चित्रा 4 सी) वाले कणों के भीतर आंतरिक विशेषताओं को दिखाया। यद्यपि कुछ कणों में सी 2 समरूपता दिखाई दी (सी 2 समरूपता का परीक्षण करने पर, कण समतुल्यता 2,674 थी), असममित संरचना सममित संरचना की तुलना में बहुत भिन्न नहीं थी।

अंत में, विश्लेषण में रोटावायरस डीएलपी (3 मिलीग्राम / एमएल; 50 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5; 150 एमएम एनएसीएल; 10 एमएम एमजीसीएल2; 10 एमएम सीएसीएल2) शामिल थे। तरल-ईएम नमूने का उत्पादन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही सैंडविच तकनीक जमे हुए-हाइड्रेटेड नमूनों के लिए नियोजित की गई थी। सैंडविच को ऑटोलोडर ग्रिड क्लिप के साथ सील किया गया था और मानक परिस्थितियों में क्रायो-टीईएम का उपयोग करके जांच की गई थी। जमे हुए नमूनों के कम-आवर्धन दृश्यों ने बहुत कम घन या हेक्सागोनल बर्फ संदूषण दिखाया और घने पैक वाले डीएलपी के क्षेत्रों को देखने वाली खिड़कियों में देखा गया (चित्रा 5 ए, बी)। ईपीयू पैकेज में लागू स्वचालित दिनचर्या का उपयोग करके छवियां एकत्र की गईं। 10.15 ए मानचित्र के माध्यम से वर्ग औसत और स्लाइस ने वायरल प्रोटीन घटकों और डबल-फंसे आरएनए जीनोम (चित्रा 5 डी, ई) के अनुरूप स्थिर विशेषताओं का खुलासा किया। तरल-ईएम नमूनों की तुलना में क्रायो-ईएम छवियों में डीएलपी और बर्फ की पृष्ठभूमि के बीच अंतर स्पष्ट रूप से मजबूत नहीं था। हालांकि इस दिलचस्प प्रभाव का कारण अभी भी निर्धारित किया जा रहा है, यह अंतर को ध्यान देने योग्य है क्योंकि तरल-ईएम इमेजिंग समुदाय के लिए भविष्य के फायदे प्रदान कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: तरल और बर्फ में वायरस के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकें। दो वर्कफ़्लो विभिन्न तरल-ईएम नमूना तैयारी विधियों को उजागर करते हैं। बायां पैनल एक तरल-ईएम नमूना धारक का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है। एसआईएन बेस माइक्रोचिप में एकीकृत माइक्रोवेल (10 μm x 100 μm) की एक सरणी (500 μm x 100 μm) शामिल है जो ~ 30 nm मोटी झिल्ली के साथ ~ 150 nm गहराई में हैं। दाहिना पैनल माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक का एक योजनाबद्ध प्रस्तुत करता है, जिसका उपयोग तरल-ईएम और क्रायो-ईएम अनुसंधान दोनों के लिए किया जा सकता है। सैंडविच असेंबली कार्बन-लेपित गोल्ड टीईएम ग्रिड के साथ जोड़े गए एसआईएन माइक्रोचिप का उपयोग करती है। असेंबली के क्रॉस-सेक्शन में कई इमेजिंग विंडो इंगित करती हैं जो क्रमशः 10 एनएम या 5 एनएम की झिल्ली मोटाई के साथ आकार में 250 μm x 250 μm से 50 μm तक होती हैं। कार्बन समर्थन फिल्म ~ 5 एनएम मोटी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) माइक्रोचिप सैंडविच असेंबली कार्बन-लेपित गोल्ड टीईएम ग्रिड के साथ जोड़े गए एसआईएन माइक्रोचिप का उपयोग करती है। एक चमक-डिस्चार्ज माइक्रोचिप को जेल पैक पर रखा जाता है और वायरस के नमूने माइक्रोचिप में जोड़े जाते हैं। एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन अवधि के बाद, अतिरिक्त समाधान हटा दिया जाता है, और सैंडविच को टीईएम ग्रिड के साथ सील कर दिया जाता है। (बी) माइक्रोचिप सैंडविच को कमरे के तापमान पर एक क्लिपिंग डिवाइस में सील किया जाता है और इसे सीधे एकल-झुकाव टीईएम धारक या टीईएम ऑटोलोडर सिस्टम में लोड किया जा सकता है। (सी) माइक्रोचिप सैंडविच असेंबली के क्रॉस-सेक्शन चित्र माइक्रोचिप्स और कार्बन परत के आयामों को उजागर करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एएवी के तरल-ईएम और क्रायो-ईएम संरचनाओं की तुलना। (ए) रंगीन रेडियल घनत्व के साथ समाधान (3.22 ए रिज़ॉल्यूशन) में एएवी की संरचना मानचित्र के माध्यम से 5 एनएम स्लाइस दिखाती है। स्केल बार 5 एनएम है। इमेजिंग मैट्रिक्स प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के लिए हैं। (बी) रंगीन रेडियल घनत्व के साथ बर्फ (3.37 ए रिज़ॉल्यूशन) में चित्रित एएवी की संरचना संरचना के माध्यम से 5 एनएम स्लाइस का प्रतिनिधित्व करती है। स्केल बार 5 एनएम है। इमेजिंग मैट्रिक्स प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के लिए हैं। (C) रुचि का एक क्षेत्र अलग-अलग समय बिंदुओं पर गणना किए गए फूरियर परिवर्तनों के साथ 5 s और 20 s समय बिंदुओं को दर्शाता है। बाईं ओर सीटीएफ अनुमान दिखाता है, दाईं ओर प्रयोगात्मक डेटा दिखाता है। (डी) तरल और बर्फ संरचनाओं से निकाले गए एएवी वीपी 1 सबयूनिट के घूर्णी दृश्य। खंडों की व्याख्या क्रिस्टल संरचना (पीडीबी कोड 3केआईसी, ए चेन25) का उपयोग करके की गई थी। (ई) आणविक संरचना विश्लेषण सॉफ्टवेयर में मॉर्फ मैप फ़ंक्शन का उपयोग करके उत्पन्न तरल संरचनाओं में गतिशील मान और चरण 4.1.6-4.2.3 में वर्णित है। बाएं से दाएं, कई वायरस असेंबली से औसत संरचनाएं ईएम डेटा का उपयोग करके मापा जाने वाले ~ 5% व्यास परिवर्तन के साथ विरूपण परिवर्तन दिखाती हैं। वोक्सेल में आरएमएसडी मान रंग पैमाने के अनुसार परिवर्तन का संकेत देते हैं। चित्रको 12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सार्स-सीओवी-2 उप-वायरल असेंबली माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक का उपयोग करके तरल में तैयार की जाती है। (ए) सीओवीआईडी -19 रोगियों के सीरम अंशों से अलग सार्स-सीओवी -2 उप-वायरल असेंबली की छवि। इमेजिंग मैट्रिक्स प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के लिए हैं। छवि के ऊपरी-दाएं कोने में सफेद बुलबुले एक दृश्य संकेतक हैं कि नमूने में तरल मौजूद है। स्केल बार 100 एनएम है। (बी) छवि का गणना फूरियर ट्रांसफॉर्म पारस्परिक स्थान में उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी दिखाता है जिसमें संबंधित छवि में बहुत कम या कोई बहाव नहीं होता है। क्लास औसत समाधान में निहित वायरल असेंबली में अद्वितीय विशेषताएं दिखाते हैं। (सी) उप-वायरल असेंबली का एक ईएम पुनर्निर्माण मानचित्र के माध्यम से 5 एनएम स्लाइस पर रंगीन रेडियल घनत्व के साथ दिखाया गया है। स्केल बार 25 एनएम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक का उपयोग करके तरल में तैयार रोटावायरस डीएलपी। (ए, बी) विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कम आवर्धन स्क्रीनिंग चरण। सीमित बर्फ क्रिस्टल देखे गए, और खिड़की झिल्ली पतली और स्पष्ट थी, जो डेटा अधिग्रहण के लिए क्षेत्र चयन को सरल बनाती थी। (ए) में स्केल बार 5 μm है और (B) में 500 nm है। (सी) संकेतित इमेजिंग मैट्रिक्स के अनुसार गिनती मोड में प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके फिल्में हासिल की गईं। स्केल बार 50 एनएम है। (डी) फूरियर ट्रांसफॉर्म जानकारी डेटा में मौजूद उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी को इंगित करती है और वर्ग औसत इकोसाहेड्रल जाली में मजबूत विशेषताएं दिखाते हैं। वर्ग औसत कलाकृतियों से मुक्त और अन्य संरचनात्मक टिप्पणियों 6,15,17 के अनुरूप वायरस असेंबली में विशेषताएं दिखाते हैं। (ई) मानचित्र के माध्यम से 10 एनएम स्लाइस पर रंगीन रेडियल घनत्व के साथ दिखाए गए डीएलपी (10.15 ए रिज़ॉल्यूशन) का ईएम पुनर्निर्माण। स्केल बार 15 एनएम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: ईएम नमूनों में तरल की उपस्थिति की पुष्टि करना। कम खुराक की स्थिति (<10 ई-ए-2 एस-1) के तहत प्राप्त समाधान में एएवी कणों की कम-आवर्धन छवियों में बुलबुले की कमी होती है। >100 ई-ए-2 एस-1 के केंद्रित बीम का उपयोग करते हुए, तरल नमूनों ने बुलबुला गठन (काले तीर) दिखाया। स्केल बार 500 एनएम है। चित्र12 से संशोधित किया गया है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: तरल में एएवी आयामों में परिवर्तन को मापना। (क) वायरस कणों के समोच्च निशान 20 सेकंड की समय सीमा में प्राप्त किए गए थे। स्केल बार 25 एनएम है। (बी, सी) 1, 5, 10 और 20 सेकंड में कण व्यास माप की तालिका और ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। 20 एस रिकॉर्डिंग के दौरान कण व्यास में समग्र परिवर्तन ~ 1 ई- ए -2 एस -1 की खुराक पर 0.28% था। (D, E) फिल्म अधिग्रहण के दौरान अलग-अलग समय बिंदु पर निर्धारित सिग्नल-टू-शोर मान। चित्र12 से संशोधित किया गया है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: रोगी-व्युत्पन्न सार्स-सीओवी-2 उप-परिसरों की उच्च-आवर्धन छवि। हेटरोजेनस वायरल असेंबली ने कुछ कणों की सतह पर स्पाइक प्रोटीन (लाल तीर) की उपस्थिति दिखाई। लेबल के रूप में अन्य कणों में सतह स्पाइक्स की कमी थी। स्केल बार 100 एनएम है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: तरल में एएवी की वास्तविक समय इमेजिंग। तरल (बाएं) में एएवी की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग की साइड-बाय-साइड तुलना और समाधान (दाएं) में अलग होने वाले कणों के रंगीन समोच्च निशान। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: तरल में छवि अनुरेखण का विज़ुअलाइज़ेशन। एएवी की रंगीन और कम-पास फ़िल्टर की गई फिल्म की साइड-बाय-साइड तुलना समाधान (दाएं) में अलग-अलग कणों के रंगीन समोच्च निशान (बाएं) में भिन्न होती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

क्रायो-ईएम क्षेत्र से अनुकूलित नए स्वचालित उपकरणों और प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके वर्तमान तरल-ईएम वर्कफ़्लो को सुव्यवस्थित करने के लिए नए अवसर प्रस्तुत किए जाते हैं। नई माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक से जुड़े अनुप्रयोग अन्य तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे तरल या विट्रियस बर्फ में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग विश्लेषण को सक्षम करते हैं। प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक नैनोस्केल स्तर पर उत्तम विवरणों की कल्पना करने के लिए आदर्श तरल मोटाई वाले नमूने तैयार करना है। स्वचालित डेटा संग्रह के लिए उच्च-थ्रूपुट रूटीन को लागू करने से पहले पूरे नमूने की स्क्रीनिंग करके कम आवर्धन पर रुचि के आदर्श क्षेत्रों की पहचान की जाती है। यदि तरल या बर्फ के नमूनों में पहचाने गए क्षेत्रों में बीम-क्षति कलाकृतियां होती हैं या व्यक्तिगत कणों की पहचान करने के लिए बहुत मोटी दिखाई देती हैं जो दृष्टि से कुरकुरा हैं, तो उन्हें डेटा संग्रह से बाहर रखा जाना चाहिए। उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा अधिग्रहण में सीमाओं में तरल नमूनों में बीम-प्रेरित आंदोलन और ब्राउनियन गति शामिल है। क्रायो-ईएम विधियों का उद्देश्य जैविक नमूनों में गति को कम करना है; हालांकि, गति सुधार विधियां इन संकल्प-सीमित कारकों को कम करने में कम्प्यूटेशनल रूप से मजबूत हैं। यदि तरल नमूने लंबी दूरी के बहाव और थर्मल अस्थिरता पेश करते हैं, तो तरल परतों की मोटाई को कम करने के लिए नमूना तैयार करने के चरणों के दौरान अतिरिक्त समाधान को हटाकर पतले नमूने तैयार किए जा सकते हैं।

वायरस कणों के बीच आणविक भीड़ का परिणाम तब हो सकता है जब नमूने उच्च सांद्रता पर उपयोग किए जाते हैं। यदि अतिव्यापी कणों के साथ कई क्षेत्र हैं जो मजबूत डेटा संग्रह को सीमित करते हैं, तो नमूना तैयार करने से पहले इनपुट नमूने को एकाग्रता में कम किया जाना चाहिए। एक उपयुक्त नमूना एकाग्रता होना प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। जिन छवियों में कणों की अधिकता होती है, वे डाउनस्ट्रीम छवि प्रसंस्करण प्रक्रियाओं को जटिल करेंगे। शुद्ध वायरस कणों के लिए, नमूने के आयाम और आणविक भार के आधार पर पर्याप्त एकाग्रता सीमा 0.3-3 मिलीग्राम / एमएल के बीच है। बड़े वायरस (~ 100 एनएम व्यास या अधिक) को आमतौर पर तकनीक की सफलता के लिए छोटे वायरस (~ 25 एनएम व्यास या उससे कम) की तुलना में उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। विचार करने के लिए एक और कारक वह स्तर है जिस पर ब्याज के कण चमक-निर्वहन माइक्रोचिप्स का पालन करते हैं। यदि वायरस का नमूना सतह पर अच्छी तरह से पालन नहीं करता है, तो तरल-ईएम या क्रायो-ईएम के लिए पर्याप्त रूप से नमूने तैयार करने के लिए अधिक एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, नमूना इसके बजाय कार्बन-लेपित गोल्ड ग्रिड पर लागू किया जा सकता है जिसमें माइक्रोचिप बाड़े के ढक्कन के रूप में कार्य करता है। यदि ये प्रक्रियाएं डेटा संग्रह प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त कणों की भर्ती करने में विफल रहती हैं, तो आत्मीयता कैप्चर विधियां एक व्यवहार्य विकल्प 26,27,28 पेश कर सकती हैं।

डिटर्जेंट, ग्लिसरॉल, पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल्स और सुक्रोज या ग्लूकोज के उच्च स्तर जैसे कुछ एडिटिव्स के उपयोग को तरल-ईएम इमेजिंग के लिए कम से कम या टाला जाना चाहिए। ये अभिकर्मक छवियों में कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं और साथ ही बीम क्षति के कारण अत्यधिक बुदबुदाहट, हाइड्रोलिसिस उत्पादों और मुक्त कण गठन का कारण बन सकते हैं। इस तरह के प्रभाव ों से छवि वाले कणों में म्यूट विशेषताएं होती हैं और अंततः संरचनात्मक संकल्प सीमित हो जाती हैं। इन अभिकर्मकों को हटाने का एक तरीका यदि जैव रासायनिक तैयारी में उपयोग किया जाता है, तो व्यापक डायलिसिस के माध्यम से एक बफर समाधान में एडिटिव्स की कमी होती है। इन अभिकर्मकों को केस-दर-केस आधार पर परीक्षण और उपयोग करने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, एक बार माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक का उपयोग करके पर्याप्त नमूने तैयार हो जाने के बाद, उन्हें तुरंत चित्रित किया जा सकता है या जांच के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। भंडारण समय नमूना स्थिरता पर निर्भर करता है।

कुल मिलाकर, क्रायो-ईएम के साथ संयोजन में तरल-ईएम का उपयोग करने से शोधकर्ताओं को पूरक इमेजिंग उपकरणों के साथ जैविक प्रणालियों की जांच करने की अनुमति मिलती है। नव विकसित माइक्रोचिप सैंडविच तकनीक तरल या बर्फ में टीईएम इमेजिंग के लिए लगातार नमूने देती है। तकनीक शोधकर्ताओं को वाणिज्यिक नमूना धारक या विटिफिकेशन सिस्टम की आवश्यकता के बिना नमूने तैयार करने और देखने के लिए एक सरल साधन भी प्रदान करती है। स्वचालित इमेजिंग प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में, प्रति सत्र हजारों छवियों के क्रम में बड़ी मात्रा में डेटा प्रति नमूना प्राप्त किया जा सकता है। पार्सन्स और सहयोगियों 29,30,31,32,33 के अग्रणी काम ने तरल बाड़ों में जैविक नमूने बनाने के लिए मूलभूत आधार तैयार किया। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बताते हैं कि अत्याधुनिक उपकरण अब नई आंखों के माध्यम से जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की कल्पना करने के लिए एक रोमांचक साधन प्रदान कर सकते हैं। भविष्य के अनुप्रयोग जो इन तकनीकों में महारत हासिल करने से उत्पन्न होने की उम्मीद करते हैं, जब उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग के साथ जोड़ा जाता है, तो 3 डी में संरचना-फ़ंक्शन संबंधों को समझने के लिए वास्तविक समय यांत्रिक अंतर्दृष्टि हैं। तरल-ईएम क्षेत्र नए वायरस पर शोध को बढ़ाने का काम कर सकता है जो मानव स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा करते हैं, शायद महामारी की तैयारी के उपायों में भी योगदान देते हैं। सारांश में, इन प्रोटोकॉल के उपयोग से वैज्ञानिकों और इंजीनियरों को जीवन विज्ञान, चिकित्सा और सामग्री अनुसंधान को शामिल करने वाले नमूनों की एक बड़ी विविधता में परमाणु विस्तार पर गतिशील प्रक्रियाओं का बेहतर अध्ययन करने की अनुमति मिलनी चाहिए।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं। ड्रेसेल-ड्यूक्स, प्रोटोचिप्स, इंक के कर्मचारी हैं और माइकल स्पिलमैन डायरेक्टइलेक्ट्रॉन के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

लेखक शुद्ध एएवी -3 प्रदान करने के लिए डॉ लुक एच वांडेनबर्ग (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, ओप्थाल्मोलॉजी विभाग) को स्वीकार करते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 से D.F.K.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

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References

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