Summary
Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.
Abstract
L'interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide - nell'intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell'intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.
Introduction
La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L'imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un'istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità molecolari, la loro struttura e funzione devono essere studiate congiuntamente.
I recenti progressi nella produzione di materiali come il grafene atomicamente sottile o i microchip a base di silicio offrono nuove opportunità per l'analisi struttura-funzione in tempo reale utilizzando microscopi elettronici a trasmissione (TEM). Questi materiali possono creare camere ermeticamente sigillate per l'imaging EM live 6,7,8,9,10,11. Il nuovo campo di liquido-EM, la temperatura ambiente correlata alla crio-EM, fornisce una visione senza precedenti di materiali duri o morbidi in soluzione, consentendo agli scienziati di studiare simultaneamente la struttura e la dinamica del loro campione. Le applicazioni liquid-EM includono registrazioni in tempo reale di nanoparticelle terapeutiche che interagiscono con le cellule staminali tumorali e cambiamenti nelle complessità molecolari dei patogeni virali12,13,14.
Proprio come i progressi metodologici hanno stimolato la rivoluzione della risoluzione nel campo della crio-EM, sono necessarie nuove tecniche e metodi per estendere l'uso di liquid-EM come strumento ad alto rendimento per la comunità scientifica. L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di semplificare i protocolli di preparazione dei campioni liquidi-EM. La logica alla base delle tecniche sviluppate è quella di impiegare nuovi progetti di microchip e dispositivi di autoloader, adatti sia per la raccolta di dati liquidi che crio-EM (Figura 1) 7,14,15,16,17. I gruppi sono sigillati meccanicamente utilizzando clip a griglia standard per strumenti automatizzati, come Krios, che possono ospitare più campioni per sessione o un TEM F200C (Figura 2). Questa metodologia espande l'uso dell'imaging ad alta risoluzione oltre le applicazioni crio-EM standard, dimostrando scopi più ampi per l'analisi dei materiali in tempo reale.
Nell'attuale articolo video, vengono presentati i protocolli per la preparazione di assemblaggi di virus in liquido con e senza portacampioni disponibili in commercio. Utilizzando il portacampioni specializzato per liquido-EM, i campioni liquidi sottili possono fornire informazioni strutturali paragonabili ai campioni crio-EM, nonché approfondimenti dinamici dei campioni. Vengono inoltre dimostrati metodi per la preparazione di campioni liquidi utilizzando strumenti di caricamento automatico per routine ad alta produttività. Il vantaggio principale rispetto ad altre tecniche è che la produzione automatizzata di campioni consente all'utente di valutare rapidamente i propri campioni per lo spessore e il dosaggio di elettroni ottimali prima della raccolta dei dati. Questa tecnica di screening identifica rapidamente le aree ideali per le registrazioni in tempo reale in liquido o ghiaccio12,14,18,19. Ai fini della determinazione della struttura 3D, liquid-EM può integrare i metodi crio-EM di lunga data implementati nella crio-EM. I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l'utilizzo di flussi di lavoro liquid-EM per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie.
I campioni di virus utilizzati in questo protocollo includono il sottotipo 3 del virus adeno-associato purificato (AAV) ottenuto come dono e coltivato in condizioni standard12. Sono stati utilizzati anche assemblaggi subvirali non infettivi di SARS CoV-2 derivati dal siero di pazienti COVID-1912 e ottenuti da una fonte commerciale. Infine, le particelle purificate a doppio strato (DLP) del rotavirus delle scimmie (ceppo SA11) sono state ottenute dal laboratorio della dottoressa Sarah M. McDonald Esstman presso la Wake Forest University e coltivate utilizzando condizioni standard 6,17. I pacchetti software qui descritti sono disponibili gratuitamente e i collegamenti sono stati forniti nella sezione Tabella dei materiali.
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Protocol
1. Caricamento del portacampioni per liquid-EM
- Pulire i microchip di nitruro di silicio (SiN) incubando ciascun chip in 150 ml di acetone per 2 minuti, seguito dall'incubazione in 150 ml di metanolo per 2 minuti. Lasciare asciugare i trucioli nel flusso d'aria laminare.
- Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.
- Caricare un microchip a base asciutta nella punta del supporto del campione. Aggiungere ~0,2 μL di campione (0,2-1 mg/ml di gruppi virali in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) al chip di base. Dopo una fase di incubazione di 1-2 minuti, posizionare il chip superiore sul chip di base umido contenente il campione.
- Bloccare insieme il gruppo per formare un involucro ermeticamente sigillato, tenuto in posizione meccanicamente da tre viti in ottone. Dopo aver sigillato il gruppo, pompare la punta a 10-6 Torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbopompata. Il supporto è ora pronto per essere inserito nel TEM.
NOTA: Il supporto di selezione non ha capacità di raffreddamento e non viene utilizzato per crio-EM.
2. Produzione di assemblaggi sandwich con microchip
NOTA: Diversi microchip SiN o biossido di silicio (SiO) possono essere utilizzati direttamente dalle confezioni di gel spedite. Le griglie d'oro rivestite in carbonio possono anche essere utilizzate direttamente come fornite.
- Pulire al plasma i microchip e le griglie di carbonio utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.
- Aggiungere ~ 2 μL di campione contenuto in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 su un microchip a scarica luminosa posto su un impacco di gel. Rimuovere la soluzione in eccesso (~ 50%) utilizzando una carta da filtro o una pipetta. Dopo una fase di incubazione di 1-2 minuti, aggiungere la griglia di carbonio scaricata a bagliore al microchip umido contenente il campione.
- Fissare insieme il gruppo utilizzando un portacampioni a inclinazione singola o clip a griglia con caricatore automatico a temperatura ambiente per formare un involucro ermeticamente sigillato. Per i morsetti del caricatore automatico, posizionare il gruppo sandwich sulla clip a C inferiore, posizionare la clip superiore sulla parte superiore del gruppo e utilizzare lo strumento di serraggio standard per sigillare il gruppo.
NOTA: La procedura di serraggio eseguita qui utilizza gli stessi passaggi del bloccaggio della griglia crio-EM, ma a temperatura ambiente. I campioni bloccati possono essere conservati per 2 mesi o più prima dell'imaging mantenendo il liquido nell'involucro. Non viene utilizzato alcun controllo delle perdite con un portacampioni a temperatura ambiente o con il caricatore automatico. - Il campione è ora pronto per essere inserito nel TEM. Esaminare i campioni posti in caricatori automatici in condizioni criogeniche o a temperatura ambiente.
3. Imaging di campioni utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione
- Imaging liquido-EM
- Caricare il portacampioni nel TEM dotato di una pistola a emissione di campo (FEG) e funzionante a 200 kV.
- Accendere la pistola e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione oscillante, inclinando il campione da -15° a +15° nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione Z per adattarsi allo spessore del campione. E aiuta a garantire un ingrandimento accurato durante la registrazione delle immagini.
- Registra le immagini come filmati a fotogrammi lunghi utilizzando il pacchetto in situ integrato con un rilevatore diretto con una spaziatura dei pixel di 6 μm (Video 1 e Video 2). Le singole immagini possono anche essere registrate utilizzando il pacchetto software di raccolta dati seriale20, implementando routine di imaging automatizzate. Acquisisci immagini in condizioni di basso dosaggio con ingrandimenti compresi tra 28.000x-92.000x e 40 fotogrammi al secondo.
- Regolare i tempi di esposizione (0,25-1 s) per ridurre al minimo i danni del fascio al campione. Utilizzare un intervallo di sfocatura di -1-4 μm all'ingrandimento specificato. Se viene rilevata una soluzione spessa, utilizzare valori di sfocatura più elevati o selezionare un'area di interesse diversa.
- Assicurarsi che la soluzione sia presente nei campioni durante tutta la sessione di imaging focalizzando il fascio di elettroni su un'area sacrificale non utilizzata per la raccolta dei dati, fino a quando non si formano bolle (Figura supplementare 1).
- Imaging crio-EM
- Caricare le griglie EM tagliate o i sandwich con microchip nel TEM dotato di un FEG e funzionante a 300 kV. Accendere la pistola e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio, usando una procedura simile descritta per il TEM liquido sopra (passo 3.1.2).
- Registra singole immagini utilizzando il sistema di analisi delle singole particelle integrato nel sistema del microscopio implementando routine di imaging automatizzate. Registra immagini in condizioni di basse dosi utilizzando il rilevatore di elettroni diretti con analisi a singola particella con una spaziatura dei pixel di 14 μm con un ingrandimento di 59.000x e 40 fotogrammi al secondo.
- Utilizzare un intervallo di sfocatura di 1-4 μm all'ingrandimento specificato. Se si incontrano spessi strati di ghiaccio vitreo, utilizzare valori di sfocatura più elevati o selezionare una regione diversa per la raccolta dei dati.
4. Analisi dei dati e confronti di strutture 3D
- Analisi del virus adeno-associato (AAV) nel ghiaccio liquido e vitreo
- Elaborare filmati per particelle AAV in liquido e ghiaccio utilizzando il programma RELION-3.0821 o altro software di elaborazione delle immagini22. Eseguire la correzione del movimento utilizzando MotionCor2 v1.2.3.
- Una volta corrette, estrarre le particelle utilizzando lo strumento di auto-picking nel pacchetto software del programma. Le dimensioni tipiche delle scatole sono 330 pixel per i campioni liquidi e 350 pixel per i campioni di ghiaccio.
- Calcola le ricostruzioni iniziali utilizzando la simmetria C1 utilizzando la routine del modello iniziale 3D del programma e / o le opzioni del modello ab-initio nel pacchetto software di elaborazione dati. Nel programma, utilizzare un parametro di regolarizzazione di T = 4 e una dimensione dei pixel di 1,01 Å per i campioni liquidi e 1,13 Å per i campioni di ghiaccio.
- Utilizzare un valore maschera di 300 Å durante le procedure di perfezionamento. Eseguire protocolli di perfezionamento nel software di elaborazione dati utilizzando la simmetria I1 per ottenere più mappe EM. La risoluzione strutturale prevista può essere compresa tra 4 Å e superiore. Utilizzare l'equivalenza delle particelle implementando la simmetria icosaedrica a 16.800 per il liquido e 15.240 per il ghiaccio12,14.
NOTA: le stime della risoluzione si basano sui criteri di correlazione del guscio di Fourier (FSC) gold standard. - Mascherare le mappe EM a ~250 Å ed esaminare i risultati utilizzando un pacchetto software di analisi della struttura molecolare23,24. Nella Figura 3, le sezioni sono mostrate con incrementi di ~5 nm.
- Estrarre le subunità della proteina del capside (VP1) dalle mappe EM per il confronto. Quantificare i cambiamenti dinamici tra le strutture EM in base alle misurazioni del diametro delle particelle (Figura supplementare 2) e quindi visualizzarli utilizzando la funzione di mappa Morph nel software.
- Analisi di assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 in liquido
- Elabora filmati utilizzando il programma RELION-3.08. Correzione della deriva dell'immagine e del movimento indotto dal fascio utilizzando MotionCor2 v1.2.3. Correggere la funzione di trasferimento del contrasto (CTF) del microscopio.
- Utilizzare lo strumento di selezione automatica nel programma per selezionare assemblaggi virali con una dimensione della casella di 800 pixel. Per l'efficienza computazionale, le particelle estratte possono essere ridimensionate a 256 pixel. Ottenere un modello iniziale utilizzando la simmetria C1 nel programma con un parametro di regolarizzazione di T = 2 e 1,66 Å dimensione pixel.
- Eseguire il perfezionamento 3D nel programma per ottenere una mappa EM, un esempio è mostrato a ~ 8,25 Å secondo i criteri FSC standard (Figura 4). Visualizza le mappe EM utilizzando il software di analisi della struttura molecolare con fette incrementate a 25 nm, come dimostrato nella Figura 4.
- Analisi delle particelle a doppio strato di rotavirus (DLP) nel ghiaccio vitreo
- Elabora filmati per DLP di rotavirus utilizzando altri software di elaborazione delle immagini. Utilizzare MotionCor2 v1.2.3 per correggere la deriva nelle immagini. Utilizzate la stima CTF della patch per correggere gli effetti dell'obiettivo sulle immagini.
- Estrai le particelle utilizzando lo strumento di prelievo automatico nel software con una dimensione della scatola di 950 pixel. Eseguire il down-sampling delle dimensioni della scatola in base alle esigenze informatiche.
- Calcola i modelli iniziali usando le opzioni ab-initio e la simmetria C1. Usa i parametri di perfezionamento, tra cui una dimensione in pixel di 1,47 Å e un valore di maschera di 800 Å.
- Esegui routine di perfezionamento aggiuntive imponendo la simmetria I1. I risultati di esempio includono una mappa EM di 10,15 Å, secondo i criteri FSC gold standard. Le particelle totali utilizzate erano 2050, che equivale a 123.000 unità protomeriche a causa dell'operatore di simmetria icosaedrica (Figura 5).
- Maschera le mappe finali a ~ 750 Å e visualizza i risultati nel pacchetto software di analisi della struttura molecolare. Le sezioni di esempio attraverso la mappa EM sono mostrate nella Figura 5 con incrementi di ~10 nm.
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Representative Results
Un TEM liquido funzionante a 200 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti di imaging liquid-EM e un crio-TEM funzionante a 300 kV è stato utilizzato per tutta la raccolta di dati crio-EM. Vengono presentate immagini rappresentative e strutture di più virus per dimostrare l'utilità dei metodi in vari soggetti del test. Questi includono il virus adeno-associato ricombinante sottotipo 3 (AAV), gli assemblaggi subvirali SARS-CoV-2 derivati dal siero del paziente e le particelle a doppio strato (DLP) del rotavirus delle scimmie, ceppo SA11. In primo luogo, i confronti sono dimostrati per lo stesso campione AAV (1 mg/ml) ripreso in soluzione tampone liquida (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) e in ghiaccio vitreo (Figura 3A-C; Figura supplementare 2). I campioni liquid-EM sono stati preparati utilizzando microchip a base di SiN e il supporto specializzato per campioni. I campioni crio-EM sono stati preparati utilizzando griglie di carbonio holey standard e vetrificati utilizzando un'unità di preparazione dei campioni all'avanguardia in etano liquido. Le strutture virali risultanti avevano diametri complessivi simili di ~ 25 nm. Un confronto tra i singoli protomeri del capside VP1 ha anche mostrato caratteristiche coerenti nelle mappe EM sia liquide che ghiacciate (Figura 3D). Una differenza tra i dati liquido-EM e crio-EM è stata che sono state osservate strutture dinamiche aggiuntive nel liquido che non erano presenti nei risultati crio-EM (Figura 3E)12.
Successivamente, sono stati esaminati campioni di SARS-CoV-2 disattivati (0,25 mg/ml) preparati in soluzione tampone (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) utilizzando una nuova tecnica a sandwich con microchip 7,14. La nuova tecnica impiega microchip basati su SiN insieme a griglie d'oro rivestite di carbonio. In questa preparazione, il campione liquido è stato inserito tra i due substrati (Figura 2A-C). I campioni a sandwich sono stati bloccati con un supporto per campioni a inclinazione singola o clip a C con caricatore automatico comunemente usati nella preparazione del campione crio-EM. I campioni possono essere visualizzati immediatamente nel TEM o conservati a 4°C per 2 mesi o oltre, a seconda della stabilità del campione biologico. L'aspetto del gorgogliamento nei campioni liquidi garantisce la presenza dello strato liquido. Lo spessore del liquido può essere misurato utilizzando i protocolli EF-TEM come descritto12. Gli assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 nel liquido sembravano avere un elevato contrasto visibile rispetto al liquido circostante (Figura 4A,B). Alcune particelle mostravano picchi visibili sulla superficie del virus, mentre alcune particelle sono prive di punte o sono scarsamente decorate con esse (Figura supplementare S3). Le medie di classe e le sezioni attraverso la struttura 8,25 Å hanno mostrato caratteristiche interne all'interno delle particelle che comprendono le subunità proteiche e il genoma dell'RNA virale (Figura 4C). Sebbene alcune particelle sembrassero contenere simmetria C2 (dopo aver testato la simmetria C2, l'equivalenza delle particelle era 2.674), la struttura asimmetrica non differiva molto rispetto alla struttura simmetrica.
Infine, l'analisi ha incluso DLP di rotavirus (3 mg/ml; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) in ghiaccio vitreo mediante congelamento manuale di preparati sandwich con microchip in azoto liquido. La stessa tecnica a sandwich utilizzata per produrre campioni liquidi-EM è stata impiegata per campioni congelati idratati. I sandwich sono stati sigillati con clip a griglia del caricatore automatico ed esaminati utilizzando il cryo-TEM in condizioni standard. Le viste a basso ingrandimento dei campioni congelati hanno mostrato poca o nessuna contaminazione cubica o esagonale del ghiaccio e regioni di DLP densamente imballate sono state osservate in tutte le finestre di visualizzazione (Figura 5A, B). Le immagini sono state raccolte utilizzando routine automatizzate implementate nel pacchetto EPU. Le medie di classe e le sezioni attraverso la mappa 10.15 Å hanno rivelato caratteristiche stabili coerenti con i componenti della proteina virale e il genoma dell'RNA a doppio filamento (Figura 5D,E). La differenza di contrasto tra i DLP e lo sfondo di ghiaccio non era così visibilmente forte nelle immagini crio-EM rispetto ai campioni liquidi-EM. Mentre la causa di questo interessante effetto è ancora in fase di determinazione, vale la pena notare la differenza in quanto liquid-EM può offrire vantaggi futuri per la comunità di imaging.
Figura 1: Tecniche utilizzate per l'imaging ad alta risoluzione di virus in liquido e nel ghiaccio. I due flussi di lavoro evidenziano diversi metodi di preparazione dei campioni liquidi-EM. Il pannello di sinistra mostra una rappresentazione schematica di un portacampioni liquido-EM. Il microchip di base SiN include un array (500 μm x 100 μm) di micropozzetti integrati (10 μm x 10 μm) che sono ~150 nm di profondità con una membrana spessa ~30 nm. Il pannello di destra presenta uno schema della tecnica a sandwich di microchip, che può essere utilizzata sia per la ricerca liquido-EM che crio-EM. I gruppi sandwich utilizzano un microchip SiN abbinato a una griglia TEM in oro rivestita di carbonio. Una sezione trasversale dell'assieme indica più finestre di imaging che vanno da 250 μm x 250 μm a 50 μm x 50 μm di dimensioni con spessori di membrana di 10 nm o 5 nm, rispettivamente. Il film di supporto in carbonio ha uno spessore di ~ 5 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La tecnica del microchip sandwich per liquido-EM e crio-EM . (A) L'assemblaggio sandwich del microchip utilizza un microchip SiN abbinato a una griglia TEM d'oro rivestita di carbonio. Un microchip scaricato a bagliore viene posto su un pacchetto di gel e campioni di virus vengono aggiunti al microchip. Dopo un breve periodo di incubazione, la soluzione in eccesso viene rimossa e il sandwich viene sigillato con la griglia TEM. (B) Il sandwich con microchip è sigillato in un dispositivo di clipping a temperatura ambiente e può essere caricato direttamente in un supporto TEM a inclinazione singola o in un sistema di caricatore automatico TEM. (C) I disegni della sezione trasversale dell'assemblaggio sandwich del microchip evidenziano le dimensioni dei microchip e dello strato di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Confronto delle strutture liquido-EM e crio-EM di AAV. (A) Struttura di AAV in soluzione (risoluzione 3,22 Å) con densità radiali colorate che mostrano fette di 5 nm attraverso la mappa. La barra della scala è 5 nm. Le metriche di imaging sono per l'acquisizione dei dati utilizzando il rilevatore elettronico diretto. (B) La struttura dell'AAV ripresa nel ghiaccio (risoluzione 3,37 Å) con densità radiali colorate rappresenta fette di 5 nm attraverso la struttura. La barra della scala è 5 nm. Le metriche di imaging sono per l'acquisizione dei dati utilizzando il rilevatore elettronico diretto. (C) Una regione di interesse mostra 5 s e 20 s punti temporali insieme a trasformate di Fourier calcolate in diversi punti temporali. Il lato sinistro mostra le stime CTF, il lato destro mostra i dati sperimentali. (D) Viste rotazionali della subunità AAV VP1 estratta dalle strutture liquide e ghiacciate. I segmenti sono stati interpretati utilizzando la struttura cristallina (codice PDB 3KIC, catena A25). La barra della scala è 10 Å. (E) Valori dinamici nelle strutture liquide generate utilizzando la funzione morph map nel software di analisi della struttura molecolare e descritti nei punti 4.1.6-4.2.3. Da sinistra a destra, le strutture mediate di più gruppi di virus mostrano cambiamenti conformazionali con una corrispondente variazione del diametro del ~ 5%, misurata utilizzando i dati EM. I valori RMSD nei voxel indicano cambiamenti in base alla scala dei colori. La figura è stata modificata da12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 preparati in liquido utilizzando la tecnica del sandwich con microchip. (A) Immagine di assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 isolati da frazioni sieriche di pazienti COVID-19. Le metriche di imaging sono per l'acquisizione dei dati utilizzando il rilevatore elettronico diretto. Le bolle bianche nell'angolo in alto a destra dell'immagine sono un indicatore visivo della presenza di liquido nel campione. La barra della scala è 100 nm. (B) La trasformata di Fourier calcolata dell'immagine mostra informazioni ad alta risoluzione nello spazio reciproco con poca o nessuna deriva nell'immagine corrispondente. Le medie di classe mostrano caratteristiche uniche negli assemblaggi virali contenuti nella soluzione. (C) Una ricostruzione EM degli assemblaggi subvirali è mostrata con densità radiali colorate a fette di 5 nm attraverso la mappa. La barra della scala è 25 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: DLP di rotavirus preparati in liquido utilizzando la tecnica del sandwich con microchip. (A,B) Fasi di screening a basso ingrandimento utilizzando il software di analisi. Sono stati osservati cristalli di ghiaccio limitati e le membrane delle finestre erano sottili e chiare, semplificando la selezione dell'area per l'acquisizione dei dati. La barra di scala in (A) è 5 μm e in (B) è 500 nm. (C) I filmati sono stati acquisiti utilizzando il rivelatore elettronico diretto in modalità di conteggio secondo le metriche di imaging indicate. La barra della scala è 50 nm. (D) Le informazioni sulla trasformata di Fourier indicano informazioni ad alta risoluzione presenti nei dati e le medie di classe mostrano forti caratteristiche nel reticolo icosaedrico. Le medie di classe mostrano caratteristiche negli assemblaggi di virus privi di artefatti e coerenti con altre osservazioni strutturali 6,15,17. (E) Una ricostruzione EM dei DLP (risoluzione 10,15 Å) mostrata con densità radiali colorate a fette di 10 nm attraverso la mappa. La barra della scala è 15 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Conferma della presenza di liquido nei campioni EM. Le immagini a basso ingrandimento di particelle AAV in soluzione acquisite in condizioni di bassa dose (<10 e- Å-2 s-1) mancano di bolle. Utilizzando un fascio focalizzato di >100 e- Å-2 s-1, i campioni liquidi hanno mostrato la formazione di bolle (frecce nere). La barra della scala è 500 nm. Il dato è stato modificato da12. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Misurazione delle variazioni delle dimensioni AAV nel liquido. (A) Tracce di contorno di particelle virali sono state acquisite in un arco di tempo di 20 s. La barra della scala è 25 nm. (B,C) Tabella e rappresentazioni grafiche delle misure del diametro delle particelle a 1, 5, 10 e 20 secondi. La variazione complessiva dei diametri delle particelle durante la registrazione di 20 s è stata dello 0,28% alla dose di ~1e- Å-2 s-1. (D,E) Valori segnale-rumore determinati in momenti variabili durante l'acquisizione del filmato. Il dato è stato modificato da12. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Immagine ad alto ingrandimento dei sottocomplessi SARS-CoV-2 derivati dal paziente. Gruppi virali eterogenei hanno mostrato la presenza di proteine spike (frecce rosse) sulla superficie di alcune particelle. Altre particelle mancavano nei picchi superficiali come etichettato. La barra della scala è 100 nm. Clicca qui per scaricare questo file.
Video 1: Imaging in tempo reale di AAV in liquido. Confronto affiancato di una registrazione in tempo reale di AAV in liquido (a sinistra) e tracce di contorno colorate delle particelle che si diffondono in soluzione (a destra). Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Visualizzazione del tracciamento delle immagini in liquido. Confronti affiancati di un filmato filtrato colorato e passa-basso di AAV che diffonde in soluzione (a sinistra) tracce di contorno colorate delle particelle che si diffondono in soluzione (a destra). Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l'analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a livello di nanoscala. Le regioni di interesse ideali vengono identificate a ingrandimenti inferiori esaminando l'intero campione prima di implementare routine ad alto throughput per la raccolta automatica dei dati. Se le regioni identificate in campioni di liquido o ghiaccio contengono artefatti che danneggiano il fascio o appaiono troppo spesse per identificare singole particelle visivamente nitide, dovrebbero essere escluse dalla raccolta dei dati. Le limitazioni nell'acquisizione dei dati ad alta risoluzione includono il movimento indotto dal fascio e il movimento browniano nei campioni liquidi. I metodi Cryo-EM mirano a ridurre al minimo il movimento nei campioni biologici; Tuttavia, i metodi di correzione del movimento sono computazionalmente robusti nel mitigare questi fattori limitanti la risoluzione. Se i campioni liquidi presentano deriva a lungo raggio e instabilità termica, i campioni più sottili possono essere preparati rimuovendo la soluzione in eccesso durante le fasi di preparazione del campione per ridurre lo spessore degli strati liquidi.
L'affollamento molecolare tra le particelle virali può verificarsi quando i campioni vengono utilizzati ad alte concentrazioni. Se ci sono più regioni con particelle sovrapposte in modo da limitare la raccolta robusta dei dati, il campione di input deve essere ridotto in concentrazione prima della preparazione del campione. Avere una concentrazione di campione adeguata è un passo cruciale nel protocollo. Le immagini che contengono un eccesso di particelle complicheranno le procedure di elaborazione delle immagini a valle. Per le particelle virali purificate, un intervallo di concentrazione adeguato è compreso tra 0,3-3 mg/ml, a seconda delle dimensioni e del peso molecolare del campione. I virus più grandi (~ 100 nm di diametro o superiore) richiedono in genere concentrazioni più elevate rispetto ai virus più piccoli (~ 25 nm di diametro o inferiore) per il successo della tecnica. Un altro fattore da considerare è il livello al quale le particelle di interesse aderiscono ai microchip scaricati a bagliore. Se il campione di virus non aderisce bene alla superficie, potrebbe essere necessaria una maggiore concentrazione per preparare adeguatamente i campioni per liquido-EM o crio-EM. In alternativa, il campione può invece essere applicato alla griglia d'oro rivestita di carbonio con il microchip che funge da coperchio della custodia. Se queste procedure non riescono a reclutare particelle sufficienti per le procedure di raccolta dei dati, i metodi di acquisizione dell'affinità possono presentare un'opzione praticabile26,27,28.
L'uso di alcuni additivi come detergenti, glicerolo, glicoli polietilenici e alti livelli di saccarosio o glucosio deve essere ridotto al minimo o evitato per l'imaging liquido-EM. Questi reagenti possono introdurre artefatti nelle immagini e portare a gorgogliamento eccessivo, prodotti di idrolisi e formazione di radicali liberi a causa di danni al fascio. Tali effetti portano a caratteristiche attenuate nelle particelle visualizzate e, in ultima analisi, limitano la risoluzione strutturale. Un modo per rimuovere questi reagenti se vengono utilizzati in preparazioni biochimiche è attraverso un'ampia dialisi in una soluzione tampone priva degli additivi. Questi reagenti dovranno essere testati e utilizzati caso per caso. Inoltre, una volta che un numero sufficiente di campioni è stato prodotto utilizzando la tecnica del sandwich con microchip, possono essere immediatamente ripresi o conservati a 4 °C fino al momento dell'esame. I tempi di conservazione dipendono dalla stabilità del campione.
Nel complesso, l'utilizzo di liquid-EM in combinazione con crio-EM consente ai ricercatori di esaminare i sistemi biologici con strumenti di imaging complementari. La nuova tecnica a sandwich con microchip produce campioni consistenti per l'imaging TEM in liquido o ghiaccio. La tecnica fornisce anche un mezzo semplice per i ricercatori per preparare e visualizzare i campioni senza la necessità di un portacampioni commerciale o di un sistema di vetrificazione. In combinazione con i protocolli di imaging automatizzati, è possibile acquisire grandi quantità di dati nell'ordine di migliaia di immagini per sessione per campione. Il lavoro pionieristico di Parsons e colleghi 29,30,31,32,33 ha gettato le basi per la produzione di campioni biologici in recinti liquidi. I protocolli qui presentati descrivono come strumenti all'avanguardia possano ora fornire un mezzo entusiasmante per visualizzare macromolecole biologiche attraverso nuovi occhi. Le applicazioni future che dovrebbero derivare dalla padronanza di queste tecniche, se abbinate al calcolo ad alte prestazioni, sono intuizioni meccanicistiche in tempo reale per comprendere le relazioni struttura-funzione in 3D. Il campo dei mercati emergenti liquidi può servire a elevare la ricerca su nuovi virus che rappresentano una minaccia per la salute umana, forse anche contribuendo alle misure di preparazione alla pandemia. In sintesi, l'uso di questi protocolli dovrebbe consentire a scienziati e ingegneri di studiare meglio i processi dinamici a dettagli atomici, attraverso una grande varietà di campioni che comprendono le scienze della vita, la medicina e la ricerca sui materiali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. L'autrice, Madeline J. Dressel-Dukes, è un dipendente di Protochips, Inc. e Michael Spilman è un dipendente di DirectElectron.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Dipartimento di Oftalmologia) per aver fornito AAV-3 purificato. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dal National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
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