Summary
ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
液体電子顕微鏡(液体EM)への関心は、科学者がナノスケールでリアルタイムのプロセスを観察できるようになったため、近年急上昇しています。高解像度のクライオEM情報と動的観測を組み合わせることは、ミリ秒以上の速いタイムスケールで多くのイベントが発生するため、非常に望ましいです。柔軟な構造に関する知識の向上は、SARS-CoV-2などの新たな病原体と戦うための新しい試薬の設計にも役立ちます。さらに重要なことに、流動環境で生物学的材料を見ると、人体におけるそれらの性能を垣間見ることができます。ここでは、液体およびガラス質氷中のウイルス集合体のナノスケールの特性を調べるために新しく開発された方法を示します。この目標を達成するために、明確に定義されたサンプルがモデルシステムとして使用されました。サンプル調製方法と代表的な構造情報を並べて比較します。サブナノメートルの特徴は、~3.5-Å-10 Åの範囲で分解された構造について示されています。この補完的なフレームワークをサポートする他の最近の結果には、ワクチン候補の動的な洞察と液体で画像化された抗体ベースの治療法が含まれます。全体として、これらの相関アプリケーションは、分子動力学を視覚化する能力を向上させ、人間の健康と病気での使用に関する独自のコンテキストを提供します。
Introduction
生物医学研究は、新技術の開発を通じて人間の健康と病気についての理解を深めます。高解像度イメージングは、ナノワールドに対する私たちの見方を変えており、細胞や分子を絶妙な詳細で研究することを可能にします1,2,3,4,5。ソフトポリマー、タンパク質集合体、ヒトウイルスなどの動的コンポーネントの静的な情報は、それらの複雑な物語の限られたスナップショットしか明らかにしません。分子実体がどのように機能するかをよりよく理解するためには、それらの構造と機能を共同で調査する必要があります。
原子レベルで薄いグラフェンやシリコンベースのマイクロチップなどの材料の製造における最近の進歩は、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用したリアルタイムの構造機能解析の新しい機会を提供します。これらの材料は、ライブEMイメージング6、7、8、9、10、11用の密閉チャンバーを作成できます。室温がクライオEMと相関する液体EMの新しい分野は、溶液中の硬質または軟質材料の前例のないビューを提供し、科学者が標本の構造とダイナミクスを同時に研究することを可能にします。液体EMアプリケーションには、癌幹細胞と相互作用する治療用ナノ粒子のリアルタイム記録や、ウイルス病原体の分子的複雑さの変化が含まれます12,13,14。
方法論の進歩がクライオEM分野の分解能革命に拍車をかけたように、科学界のハイスループットツールとしての液体EMの使用を拡大するには、新しい技術と方法が必要です。ここで紹介する方法の全体的な目標は、液体EM試料調製プロトコルを合理化することです。開発された技術の背後にある理論的根拠は、液体とクライオEMの両方のデータ収集に適した新しいマイクロチップ設計とオートローダーデバイスを採用することです(図1)7、14、15、16、17。アセンブリは、セッションごとに複数のサンプルを収容できるKriosやF200C TEMなどの自動機器用の標準グリッドクリップを使用して機械的にシールされています(図2)。この方法論は、標準的なクライオEMアプリケーションを超えて高解像度イメージングの使用を拡大し、リアルタイムの材料分析のより広い目的を実証します。
現在のビデオ記事では、市販の検体ホルダーの有無にかかわらず、液体中のウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルが提示されています。液体EM専用の試料ホルダーを使用することで、薄い液体試料は、クライオEM試料に匹敵する構造情報と、試料の動的な洞察を得ることができます。また、ハイスループットルーチン用のオートローダーツールを使用して液体試料を準備する方法も実証されています。他の技術に対する主な利点は、自動試料作製により、データ収集前にサンプルの最適な厚さと電子投与量を迅速に評価できることです。このスクリーニング技術は、液体または氷中のリアルタイム記録に理想的な領域を迅速に特定します12、14、18、19。3D構造決定の目的で、液体EMは、クライオEMで実装されている長年のクライオEMメソッドを補完する可能性があります。従来のTEMまたはクライオEM技術を採用している読者は、液体EMワークフローを使用して、現在の戦略を補完する方法でサンプルの新しい動的観察を提供することを検討できます。
このプロトコルで使用されるウイルスサンプルには、ギフトとして取得され、標準条件下で培養された精製アデノ随伴ウイルスサブタイプ3(AAV)が含まれます12。また、COVID-19患者の血清12に由来し、市販の供給源から入手した非感染性SARS CoV-2サブウイルスアセンブリも使用されました。最後に、精製されたサルロタウイルス(SA11株)二重層粒子(DLP)をウェイクフォレスト大学のSarah M. McDonald Esstman博士の研究室から入手し、標準条件6,17を用いて培養した。ここで説明するソフトウェアパッケージは無料で入手でき、リンクは「材料表」セクションにあります。
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Protocol
1. 液体EM用試料ホルダーの装填
- 窒化ケイ素(SiN)マイクロチップを洗浄するには、各チップを150 mLのアセトン中で2分間インキュベートした後、150 mLのメタノール中で2分間インキュベートします。層流で切りくずを乾燥させます。
- プラズマは、アルゴンガスを使用して30 W、15 mA、45秒間の標準条件下で動作するグロー放電装置を使用して、乾燥したチップを洗浄します。
- ドライベースマイクロチップを試料ホルダーの先端に装填します。~0.2 μLのサンプル(50 mM HEPES、pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM MgCl 2、10 mM CaCl2中のウイルス集合体0.2-1 mg/mL)をベースチップに追加します。1〜2分のインキュベーションステップに続いて、サンプルを含むウェットベースチップ上にトップチップを置きます。
- アセンブリをクランプして密閉されたエンクロージャを形成し、3本の真ちゅう製のネジで機械的に固定します。アセンブリを密封したら、ターボポンプ式ドライポンプステーションを使用してチップを10-6Torr までポンプで送ります。これで、ホルダーをTEMに挿入する準備が整いました。
注意: セレクトホルダーには冷却機能がなく、クライオEMには使用されません。
2. マイクロチップサンドイッチアッセンブリーの製造
注:出荷されたゲルパックから直接、さまざまなSiNまたは二酸化ケイ素(SiO)マイクロチップを使用できます。カーボンコーティングされた金グリッドは、供給されたとおりに直接使用することもできます。
- プラズマは、アルゴンガスを使用して30 W、15 mAの標準条件下で45秒間動作するグロー放電装置を使用して、マイクロチップとカーボングリッドを洗浄します。
- 50 mM HEPES、pH 7.5に含まれるサンプルを~2 μL添加します。150 mM NaCl;10 mM MgCl2;10mMCaCl2をゲルパック上に載せてグロー放電したマイクロチップとする。ろ紙またはピペットを使用して余分な溶液(~50%)を除去します。1〜2分のインキュベーションステップに続いて、グロー放電されたカーボングリッドをサンプルを含むウェットマイクロチップに追加します。
- シングルチルト試験片ホルダーまたはオートローダーグリッドクリップを使用してアセンブリを室温でクランプし、密閉されたエンクロージャを形成します。オートローダークランプの場合は、サンドイッチアセンブリを下部のCクリップに配置し、上部のクリップをアセンブリの上に置き、標準のクランプツールを使用してアセンブリを一緒にシールします。
注意: ここで実行されるクランプ手順は、クライオEMグリッドクランプと同じ手順を使用しますが、室温で行います。クランプされたサンプルは、エンクロージャ内の液体を維持したまま、イメージングの前に2か月以上保存できます。室温の試験片ホルダーやオートローダーではリークチェックは行われません。 - これで、試料をTEMに挿入する準備が整いました。低温条件下または室温でオートローダーに入れられたサンプルを調べます。
3. 透過型電子顕微鏡による試料のイメージング
- 液体電子顕微鏡イメージング
- フィールドエミッションガン(FEG)を装備し、200kVで動作するTEMに試料ホルダーを装填します。
- ガンの電源を入れ、ワブラー機能を使用して顕微鏡ステージのユーセントリック高さを調整し、カラム内のサンプルを-15°から+15°に傾けます。この手順では、サンプルの厚さに合わせてステージをZ方向に調整します。また、画像記録中に正確な倍率を確保するのに役立ちます。
- 画素間隔6μmのダイレクトディテクタを内蔵した in situ パッケージ(動画1、 動画2)で長額動画として記録します。個々の画像はまた、自動画像化ルーチンを実装するシリアルデータ収集ソフトウェアパッケージ20を使用して記録され得る。低線量条件下で、28,000倍から92,000倍の範囲の倍率と毎秒40フレームの画像を取得します。
- 露光時間(0.25〜1秒)を調整して、試験片へのビーム損傷を最小限に抑えます。指定された倍率で-1〜4μmの焦点ずれ範囲を使用してください。濃厚な溶液が検出された場合は、より高い焦点ぼけ値を使用するか、別の関心領域を選択します。
- 気泡が形成されるまで、データ収集に使用されない犠牲領域に電子ビームを集中させることにより、イメージングセッション全体を通して溶液がサンプルに存在することを確認します(補足図1)。
- クライオ電子顕微鏡イメージング
- クリップされたEMグリッドまたはマイクロチップサンドイッチをFEGを装備し、300kVで動作するTEMにロードします。ガンの電源を入れ、上記の液体TEMで説明したのと同様の手順を使用して、顕微鏡ステージのユーセントリック高さを調整します(ステップ3.1.2)。
- 顕微鏡システムに統合された単粒子分析システムを使用して個々の画像を記録し、自動イメージングルーチンを実装します。画素間隔14μmの単粒子分析直接電子検出器を用いて、倍率59,000倍、毎秒40フレームで低線量条件下で画像を記録します。
- 指定された倍率で1〜4μmの焦点ずれ範囲を使用してください。ガラス質の氷の厚い層に遭遇した場合は、より高い焦点ぼけ値を使用するか、データ収集のために別の領域を選択します。
4. データ解析と3次元構造比較
- 液体およびガラス質氷中のアデノ随伴ウイルス(AAV)の分析
- RELION−3.08プログラム21 または他の画像処理ソフトウェア22を使用して、液体および氷中のAAV粒子に対するムービーを処理する。モーションコア2 v1.2.3を使用してモーション補正を実行します。
- 修正したら、プログラムソフトウェアパッケージの自動ピッキングツールを使用してパーティクルを抽出します。一般的な箱のサイズは、液体試料の場合は330ピクセル、氷試料の場合は350ピクセルです。
- プログラムの3D初期モデルルーチンおよび/またはデータ処理ソフトウェアパッケージの ab-initio モデルオプションを使用して、C1対称を使用して初期再構成を計算します。プログラムでは、正則化パラメータを T = 4、液体標本の場合は 1.01 Å、氷標本の場合は 1.13 Å のピクセル サイズを使用します。
- 絞り込み手順全体で 300 Å のマスク値を使用します。I1対称性を使用してデータ処理ソフトウェアで改良プロトコルを実行し、複数のEMマップを取得します。期待される構造分解能は、4 Å以上の範囲であり得る。液体の場合は16,800、氷の場合は15,240で正二十面体対称性を実装する粒子等価を使用します12,14。
注:分解能の推定値は、ゴールドスタンダードのフーリエシェル相関(FSC)基準に基づいています。 - ~250 ÅでEMマップをマスクし、分子構造解析ソフトウェアパッケージ23,24を使用して結果を調べます。図 3 では、スライスは ~5 nm の増分で示されています。
- 比較のためにEMマップからカプシドタンパク質(VP1)サブユニットを抽出します。粒子径の測定値に基づいてEM構造の動的変化を定量化し(補足図2)、ソフトウェアのモーフマップ機能を使用して視覚化します。
- 液体中のSARS-CoV-2サブウイルス集合体の分析
- RELION-3.08プログラムを使用してムービーを処理します。MotionCor2 v1.2.3を使用して、画像のドリフトとビーム誘起モーションを修正します。顕微鏡のコントラスト伝達関数(CTF)を修正します。
- プログラムのオートピッキングツールを使用して、ボックスサイズが800ピクセルのウイルスアセンブリを選択します。計算効率を上げるために、抽出されたパーティクルは256ピクセルに再スケーリングできます。プログラムでC1対称性を使用して、正則化パラメータがT = 2、ピクセルサイズが1.66 Åの初期モデルを取得します。
- プログラムで3Dリファインを実行してEMマップを取得し、標準のFSC基準に従って~8.25 Åに例を示します(図4)。 図4に示すように、分子構造解析ソフトウェアを使用して、スライスを25 nmでインクリメントしたEMマップを視覚化します。
- ガラス質氷中のロタウイルス二重層粒子(DLP)の分析
- 他の画像処理ソフトウェアを使用してロタウイルスDLPの動画を処理します。MotionCor2 v1.2.3を使用して、画像のドリフトを補正します。パッチCTF推定を使用して、画像に対するレンズ効果を補正します。
- ソフトウェアのオートピッキングツールを使用して、ボックスサイズが950ピクセルのパーティクルを抽出します。コンピューティングの目的で必要に応じてボックスサイズをダウンサンプリングします。
- ab-initioオプションとC1対称性を使用して初期モデルを計算します。1.47 Å のピクセル サイズと 800 Å のマスク値を含む細分化パラメーターを使用します。
- I1対称性を課しながら、追加の改良ルーチンを実行します。結果の例には、ゴールドスタンダードのFSC基準に従った10.15 Å EMマップが含まれています。使用された粒子の総数は2050で、これは二十面体対称演算子による123,000プロトマーユニットに相当します(図5)。
- ~750 Åで最終マップをマスクし、分子構造解析ソフトウェアパッケージで結果を視覚化します。EMマップのスライスの例を~10nm刻みで 図5 に示します。
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Representative Results
すべての液体EMイメージング実験には200 kVで動作する液体TEMを使用し、すべてのクライオEMデータ収集には300 kVで動作するクライオTEMを使用しました。複数のウイルスの代表的な画像と構造を提示して、さまざまな被験者にわたる方法の有用性を実証します。これらには、組換えアデノ随伴ウイルスサブタイプ3(AAV)、患者血清に由来するSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリ、およびサルロタウイルス二重層粒子(DLP)、SA11株が含まれます。まず、液体緩衝溶液(50 mM HEPES、pH 7.5;150 mM NaCl;10 mM MgCl2;10 mM CaCl2)およびガラス質氷中で画像化された同じAAVサンプル(1 mg/mL)についての比較が実証されます(図3A-C;補足図2)。液体EMサンプルは、SiNベースのマイクロチップと特殊なサンプルホルダーを使用して準備されました。クライオEMサンプルは、標準的なホールカーボングリッドを使用して調製され、最先端の試料準備ユニットを使用して液体エタンにガラス化されました。得られたウイルス構造は、~25nmの同様の全直径を有していた。個々のVP1キャプシドプロトマーの比較でも、液体EMマップと氷EMマップの両方で一貫した特徴が示されました(図3D)。液体電子顕微鏡データとクライオ電子顕微鏡データの1つの違いは、クライオ電子顕微鏡の結果には存在しなかった追加の動的構造が液体中に観察されたことです(図3E)12。
次に、新しいマイクロチップサンドイッチ技術7,14を使用して、緩衝溶液(50 mM HEPES、pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2)で調製したSARS-CoV-2サンプル(0.25 mg / mL)を不活性化しました7,14。新しい技術は、炭素コーティングされた金グリッドとともにSiNベースのマイクロチップを採用しています。この調製では、液体サンプルを2つの基板の間に挟んだ(図2A-C)。サンドイッチされた試料は、クライオEM試料調製で一般的に使用されるシングルチルト試料ホルダーまたはオートローダーCクリップでクランプされました。試料は、生体試料の安定性に応じて、TEMですぐに観察することも、4°Cで2ヶ月以上保存することもできます。液体サンプル中のバブリングの出現は、液体層の存在を確実にする。液厚は、12に記載されるEF−TEMプロトコルを用いて測定することができる。液体中のSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリは、周囲の液体に対して高い可視コントラストを有するように見えた(図4A、B)。一部の粒子はウイルス表面に目に見えるスパイクを示しましたが、一部の粒子はスパイクがないか、スパイクでまばらに装飾されています(補足図S3)。クラス平均および8.25 Å構造を通るスライスは、タンパク質サブユニットおよびウイルスRNAゲノムを含む粒子内の内部特徴を示した(図4C)。一部の粒子はC2対称性を含むように見えたが(C2対称性を試験したところ、粒子当量は2,674であった)、非対称構造は対称構造と比較してそれほど異ならなかった。
最後に、マイクロチップサンドイッチ製剤を液体窒素に手動で瞬間凍結することにより、ガラス質氷中のロタウイルスDLP(3 mg/mL; 50 mM HEPES、pH 7.5、150 mM NaCl、10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2)を分析しました。液体EMサンプルの製造に使用されたのと同じサンドイッチ技術が、凍結水和標本にも採用されました。サンドイッチをオートローダーグリッドクリップで密封し、標準条件下でクライオTEMを使用して検査しました。凍結標本の低倍率ビューでは、立方体または六角形の氷の汚染はほとんどまたはまったくなく、表示ウィンドウ全体で密集したDLPの領域が観察されました(図5A、B)。画像は、EPUパッケージに実装された自動ルーチンを使用して収集されました。クラス平均と10.15 Åマップのスライスは、ウイルスタンパク質成分と二本鎖RNAゲノムと一致する安定した特徴を明らかにしました(図5D、E)。DLPと氷の背景のコントラストの違いは、液体EMサンプルと比較して、クライオEM画像では目に見えて強くありませんでした。この興味深い効果の原因はまだ決定されていませんが、液体EMがイメージングコミュニティに将来の利点を提供する可能性があるため、違いに注目する価値があります。
図1:液体および氷中のウイルスの高解像度イメージングに使用される技術。 2つのワークフローは、異なる液体EMサンプル調製方法を強調しています。左パネルは、液体EM試料ホルダーの概略図を示しています。SiNベースのマイクロチップには、~150 nmの深さのマイクロウェル(10 μm x 10 μm)のアレイ(500 μm x 100 μm)が含まれており、深さは~150 nmで、厚さは~30 nmです。右のパネルは、液体EMとクライオEMの両方の研究に使用できるマイクロチップサンドイッチ技術の概略図を示しています。サンドイッチアセンブリは、カーボンコーティングされた金TEMグリッドとペアになったSiNマイクロチップを使用します。アセンブリの断面は、250 μm x 250 μmから50 μm x 50 μmのサイズの範囲の複数のイメージングウィンドウを示し、膜の厚さはそれぞれ10 nmまたは5 nmです。カーボン支持膜の厚さは~5nmである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:液体EMおよびクライオEM用のマイクロチップサンドイッチ技術 。 (A)マイクロチップサンドイッチアセンブリは、炭素被覆金TEMグリッドとペアになったSiNマイクロチップを使用します。グロー放電されたマイクロチップをゲルパックに置き、ウイルスサンプルをマイクロチップに追加します。短いインキュベーション期間の後、余分な溶液を取り除き、サンドイッチをTEMグリッドで密封します。(B)マイクロチップサンドイッチは室温でクリッピング装置に密封され、シングルチルトTEMホルダーまたはTEMオートローダーシステムに直接ロードできます。(C)マイクロチップサンドイッチアセンブリの断面図は、マイクロチップとカーボン層の寸法を強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:AAVの液体EM構造とクライオEM構造の比較。 (A)溶液中のAAVの構造(分解能3.22 Å)で、マップ全体に5 nmのスライスを示す色付きの半径密度があります。スケールバーは5nmである。イメージングメトリクスは、直接電子検出器を使用したデータ収集用です。(B)色付きの放射状密度を持つ氷(3.37 Å分解能)で画像化されたAAVの構造は、構造全体の5 nmスライスを表します。スケールバーは5nmである。イメージングメトリクスは、直接電子検出器を使用したデータ収集用です。(C)関心領域は、異なる時点で計算されたフーリエ変換とともに、5秒および20秒の時点を示します。左側はCTF推定値を示し、右側は実験データを示す。(D)液体および氷構造から抽出されたAAV VP1サブユニットの回転図。セグメントは、結晶構造(PDBコード3KIC、A鎖25)を用いて解釈した。スケールバーは10 Åです。 (E)分子構造解析ソフトウェアのモルフマップ機能を使用して生成され、ステップ4.1.6〜4.2.3で説明されている液体構造の動的値。左から右に、複数のウイルスアセンブリからの平均構造は、EMデータを使用して測定された、対応する~5%の直径変化を伴う構造変化を示しています。ボクセル単位の RMSD 値は、カラー スケールに応じた変化を示します。図は12から変更されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マイクロチップサンドイッチ技術を使用して液体で調製されたSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリ 。 (A)COVID-19患者の血清画分から分離されたSARS-CoV-2サブウイルスアセンブリの画像。イメージングメトリクスは、直接電子検出器を使用したデータ収集用です。画像の右上隅にある白い泡は、サンプルに液体が存在することを視覚的に示しています。スケールバーは100nmである。(B)計算された画像のフーリエ変換は、対応する画像にほとんどまたはまったくドリフトのない逆数空間での高解像度情報を示しています。クラス平均は、溶液に含まれるウイルス集合体の固有の特徴を示します。(C)サブウイルスアセンブリのEM再構成は、マップ全体で5 nmスライスで色付きの放射状密度で示されています。スケールバーは25nmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マイクロチップサンドイッチ法を用いて液体中で調製されたロタウイルスDLP。 (A,B)解析ソフトウェアを用いた低倍率スクリーニングステップ。限られた氷の結晶が観察され、窓の膜は薄くて透明であり、データ取得のための領域選択を簡素化しました。(A)のスケールバーは5μm、(B)のスケールバーは500nmです。(C)動画は、指示されたイメージングメトリックに従って、カウントモードで直接電子検出器を使用して取得されました。スケールバーは50nmである。(D)フーリエ変換情報はデータに存在する高分解能情報を示し、クラス平均は二十面体格子に強い特徴を示します。クラス平均は、アーティファクトがなく、他の構造的観察と一致するウイルスアセンブリの特徴を示しています6、15、17。(E)DLPのEM再構成(10.15 Å分解能)を、マップ上の10 nmスライスで色付きの放射状密度で示します。スケールバーは15nmである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:EMサンプル中の液体の存在を確認する。低線量条件(<10 e-Å-2 s-1)で取得した溶液中のAAV粒子の低倍率画像には気泡がありません。>100 e-Å-2 s-1の集束ビームを用いて、液体サンプルは気泡形成を示した(黒い矢印)。スケールバーは500nmです。図は12から変更されました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:液体中のAAV寸法の変化の測定。(A)ウイルス粒子の輪郭トレースは、20秒の時間枠にわたって取得されました。スケールバーは25nmです。(B,C)1、5、10、および20秒での粒子径測定値の表とグラフ表示。20秒記録中の粒子径の全体的な変化は、~1e-Å-2 s-1の用量で0.28%であった。(D,E)動画取り込み中のさまざまな時点で決定される信号対雑音比の値。図は12から変更されました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:患者由来のSARS-CoV-2サブ複合体の高倍率画像。 不均一なウイルス集合体は、いくつかの粒子の表面にスパイクタンパク質(赤い矢印)の存在を示した。他の粒子は、標識された表面スパイクに欠けていた。スケールバーは100nmである。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:液体中のAAVのリアルタイムイメージング。 液体中のAAVのリアルタイム記録(左)と溶液中で拡散する粒子の色付き輪郭トレース(右)を並べて比較。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:液体中の画像トレースの視覚化。 溶液中で拡散するAAVの着色されたフィルタ処理された動画とローパスフィルタされた動画を並べて比較(左)溶液中で拡散する粒子の着色輪郭トレース(右)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
クライオEM分野から適応された新しい自動化ツールと技術を使用することにより、現在の液体EMワークフローを合理化する新しい機会が提示されます。新しいマイクロチップサンドイッチ技術を含むアプリケーションは、液体またはガラス質の氷中での高解像度のイメージング分析を可能にするため、他の方法に関して重要です。プロトコルの最も重要なステップの1つは、ナノスケールレベルで絶妙な詳細を視覚化するための理想的な液体厚さの標本を作成することです。理想的な関心領域は、自動データ収集のためのハイスループットルーチンを実装する前にサンプル全体をスクリーニングすることにより、低倍率で特定されます。液体または氷の標本で特定された領域にビーム損傷アーティファクトが含まれている場合、または視覚的に鮮明な個々の粒子を識別できないほど厚すぎると思われる場合は、データ収集から除外する必要があります。高分解能データ取得の制限には、液体サンプルのビーム誘起運動とブラウン運動が含まれます。クライオEM法は、生物学的サンプルの動きを最小限に抑えることを目的としています。ただし、モーション補正方法は、これらの解像度制限要因を軽減するのに計算的に堅牢です。液体サンプルが長距離ドリフトおよび熱不安定性を示す場合、サンプル調製ステップ中に過剰な溶液を除去して液体層の厚さを減少させることにより、より薄いサンプルを調製することができる。
ウイルス粒子間の分子クラウディングは、サンプルを高濃度で使用すると発生する可能性があります。粒子が重なり合う領域が複数あり、堅牢なデータ収集が制限されている場合は、サンプル調製の前に入力サンプルの濃度を下げる必要があります。適切なサンプル濃度を持つことは、プロトコルの重要なステップです。過剰な粒子を含む画像は、下流の画像処理手順を複雑にします。精製されたウイルス粒子の場合、適切な濃度範囲は、サンプルの寸法と分子量に応じて、0.3〜3 mg / mLです。より大きなウイルス(直径~100 nm以上)は、通常、この技術を成功させるために、小さなウイルス(直径~25 nm以下)よりも高い濃度を必要とします。考慮すべき別の要因は、関心のある粒子がグロー放電されたマイクロチップに付着するレベルです。ウイルスサンプルが表面にうまく付着しない場合は、液体EMまたはクライオEM用の検体を適切に準備するために、より高い濃度が必要になる場合があります。あるいは、サンプルを代わりに、マイクロチップをエンクロージャーの蓋として機能するカーボンコーティングされた金グリッドに適用することもできます。これらの手順がデータ収集手順のために十分な粒子を動員できない場合、親和性捕捉法は実行可能な選択肢を提示し得る26、27、28。
液体電子顕微鏡イメージングでは、洗剤、グリセロール、ポリエチレングリコール、高レベルのスクロースまたはグルコースなどの特定の添加剤の使用を最小限に抑えるか、避ける必要があります。これらの試薬は、画像にアーティファクトを導入するだけでなく、ビーム損傷による過度のバブリング、加水分解生成物、およびフリーラジカル形成につながる可能性があります。このような効果により、画像化された粒子の特徴がミュートされ、最終的に構造分解能が制限されます。これらの試薬が生化学的調製物に使用されている場合、これらの試薬を除去する1つの方法は、添加剤を含まない緩衝液への広範な透析によるものです。これらの試薬は、ケースバイケースでテストして使用する必要があります。さらに、マイクロチップサンドイッチ技術を使用して十分な標本が作成されたら、すぐに画像化することも、検査の準備ができるまで4°Cで保存することもできます。保管時間はサンプルの安定性に依存します。
全体として、液体電子顕微鏡をクライオ電子顕微鏡と組み合わせて使用 することで、研究者は補完的なイメージングツールを使用して生物学的システムを調べることができます。新開発のマイクロチップサンドイッチ技術は、液体または氷中でのTEMイメージング用の一貫したサンプルを生成します。この技術はまた、研究者が市販のサンプルホルダーやガラス化システムを必要とせずに標本を調製および表示するための簡単な手段を提供します。自動イメージングプロトコルと組み合わせることで、セッションごとに数千の画像オーダーの大量のデータを標本ごとに取得できます。パーソンズと同僚29,30,31,32,33の先駆的な研究は、液体エンクロージャーで生物学的標本を作成するための基礎を築きました。ここで紹介するプロトコルは、最先端のツールが新しい目を通して生体高分子を視覚化するためのエキサイティングな手段をどのように提供できるかを説明しています。これらの技術を習得することで期待される将来のアプリケーションは、ハイパフォーマンスコンピューティングと組み合わせると、3Dで構造と関数の関係を理解するためのリアルタイムのメカニズムの洞察になります。液体電子顕微鏡分野は、人間の健康を脅かす新型ウイルスの研究を高め、パンデミック対策にも貢献する可能性があります。要約すると、これらのプロトコルを使用することで、科学者やエンジニアは、ライフサイエンス、医学、材料研究を含む多種多様なサンプルにわたって、原子の詳細で動的プロセスをより適切に研究できるようになります。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。著者のMadeline J. Dressel-DukesはProtochips, Inc.の従業員であり、Michael SpilmanはDirectElectronの従業員です。
Acknowledgments
著者らは、Luk H. Vandenberghe博士(ハーバード大学医学部眼科)が精製AAV-3を提供したことを称賛しています。この研究は、国立衛生研究所および国立がん研究所(R01CA193578、R01CA227261、R01CA219700からD.F.K.)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
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