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Biochemistry

액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63856
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1,4, 5, 6, 1, 7, 8, 2, 9, 1,5,6
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University
* These authors contributed equally

Summary

여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

과학자들이 이제 나노 스케일에서 실시간 프로세스를 관찰할 수 있게 되면서 액체 전자 현미경(액체-EM)에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 급증했습니다. 많은 이벤트가 밀리초 범위 또는 더 빠른 시간 척도에서 발생하므로 고분해능 Cryo-EM 정보를 동적 관찰과 페어링하는 것이 매우 바람직합니다. 유연한 구조에 대한 향상된 지식은 SARS-CoV-2와 같은 신종 병원체와 싸우기 위한 새로운 시약의 설계에도 도움이 될 수 있습니다. 더 중요한 것은 유체 환경에서 생물학적 물질을 보는 것이 인체에서의 성능을 독특하게 엿볼 수 있다는 것입니다. 여기에 액체 및 유리질 얼음에서 바이러스 어셈블리의 나노 스케일 특성을 조사하기 위해 새로 개발 된 방법이 제시됩니다. 이 목표를 달성하기 위해 잘 정의된 샘플이 모델 시스템으로 사용되었습니다. 샘플 준비 방법과 대표적인 구조 정보의 나란히 비교가 제시됩니다. 서브 나노 미터 특징은 ~ 3.5-Å-10 Å 범위에서 분해 된 구조에 대해 표시됩니다. 이 보완적인 프레임워크를 뒷받침하는 다른 최근 결과에는 백신 후보에 대한 동적 통찰력과 액체로 이미지화된 항체 기반 치료법이 포함됩니다. 전반적으로 이러한 상관 응용 프로그램은 분자 역학을 시각화하는 능력을 향상시켜 인간의 건강과 질병에서 사용할 수 있는 고유한 컨텍스트를 제공합니다.

Introduction

생물 의학 연구는 새로운 기술 개발을 통해 인간의 건강과 질병에 대한 이해를 향상시킵니다. 고해상도 이미징은 나노 세계에 대한 우리의 관점을 변화시키고 있으며, 세포와 분자를정교하게 1,2,3,4,5 연구할 수 있게 해줍니다. 연질 폴리머, 단백질 어셈블리 또는 인간 바이러스와 같은 동적 구성 요소의 정적 정보는 복잡한 내러티브의 제한된 스냅 샷 만 보여줍니다. 분자 개체가 어떻게 작동하는지 더 잘 이해하려면 구조와 기능을 공동으로 조사해야 합니다.

원자적으로 얇은 그래핀 또는 실리콘 기반 마이크로칩과 같은 재료 생산의 최근 발전은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 실시간 구조 기능 분석을 위한 새로운 기회를 제공합니다. 이러한 재료는 라이브 EM 이미징 6,7,8,9,10,11을 위해 밀폐된 챔버를 생성할 수 있습니다. Cryo-EM과 상관 관계가 있는 실온인 액체-EM의 새로운 분야는 용액의 단단하거나 부드러운 물질에 대한 전례 없는 보기를 제공하여 과학자들이 시편의 구조와 역학을 동시에 연구할 수 있도록 합니다. Liquid-EM 애플리케이션에는 암 줄기 세포와 상호 작용하는 치료용 나노입자의 실시간 기록과 바이러스 병원체12,13,14의 분자 복잡성 변화가 포함됩니다.

방법론적 발전이 Cryo-EM 분야의 분해능 혁명에 박차를 가한 것처럼, 과학계를 위한 고처리량 도구로서 액체-EM의 사용을 확장하기 위해서는 새로운 기술과 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 액체-EM 시편 준비 프로토콜을 간소화하는 것입니다. 개발된 기술의 이면에 있는 이론적 근거는 액체 및 극저온 EM 데이터 수집 모두에 적합한 새로운 마이크로칩 설계 및 오토로더 장치를 사용하는 것입니다(그림 1)7,14,15,16,17. 어셈블리는 세션당 여러 샘플을 수용할 수 있는 Krios 또는 F200C TEM과 같은 자동화 기기용 표준 그리드 클립을 사용하여 기계적으로 밀봉됩니다(그림 2). 이 방법론은 표준 Cryo-EM 애플리케이션을 넘어 고해상도 이미징의 사용을 확장하여 실시간 재료 분석의 더 넓은 목적을 보여줍니다.

현재 비디오 기사에서는 상업적으로 이용 가능한 표본 홀더가 있거나없는 액체로 바이러스 어셈블리를 준비하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 액체-EM용 특수 시편 홀더를 사용하면 얇은 액체 시편은 Cryo-EM 샘플에 필적하는 구조 정보와 시편의 동적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 고처리량 루틴을 위해 자동 로더 도구를 사용하여 액체 표본을 준비하는 방법도 시연됩니다. 다른 기술에 비해 가장 큰 장점은 자동화된 시편 생산을 통해 사용자가 데이터 수집 전에 최적의 두께와 전자 선량에 대해 샘플을 신속하게 평가할 수 있다는 것입니다. 이 스크리닝 기술은 액체 또는 얼음12,14,18,19에서 실시간 기록에 이상적인 영역을 신속하게 식별합니다. 3D 구조 측정을 위해 액체-EM은 Cryo-EM에 구현된 오랫동안 확립된 Cryo-EM 분석법을 보완할 수 있습니다. 기존 TEM 또는 Cryo-EM 기술을 사용하는 독자는 현재 전략을 보완하는 방식으로 샘플에 대한 새롭고 역동적인 관찰을 제공하기 위해 액체-EM 워크플로우를 사용하는 것을 고려할 수 있습니다.

이 프로토콜에 사용되는 바이러스 샘플은 기증으로 수득되고 표준 조건12 하에서 배양된 정제된 아데노-관련 바이러스 서브타입 3 (AAV)을 포함한다. 또한 COVID-19 환자12의 혈청에서 파생되고 상업적 출처에서 얻은 비감염성 SARS CoV-2 하위 바이러스 어셈블리도 사용되었습니다. 마지막으로, 정제된 유인원 로타바이러스(SA11 균주) 이중층 입자(DLP)를 웨이크 포레스트 대학의 Sarah M. McDonald Esstman 박사의 실험실에서 얻고 표준 조건 6,17을 사용하여 배양했습니다. 여기에 설명된 소프트웨어 패키지는 무료로 사용할 수 있으며 링크는 재료 표 섹션에 제공되었습니다.

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Protocol

1. 액체-EM용 시편 홀더 적재

  1. 각 칩을 150mL의 아세톤에서 2분 동안 인큐베이션한 후 150mL의 메탄올에서 2분 동안 인큐베이션하여 질화규소(SiN) 마이크로칩을 세척합니다. 층류 기류에서 칩을 건조시킵니다.
  2. 아르곤 가스를 사용하여 30W, 15mA의 표준 조건에서 45초 동안 작동하는 글로우 방전 기기를 사용하여 건조된 칩을 플라즈마 청소합니다.
  3. 건조베이스 마이크로 칩을 시편 홀더의 팁에 넣습니다. ~0.2μL의 샘플(50mM hepes, pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 10mM CaCl2에서 0.2-1mg/mL의 바이러스 어셈블리)을 기본 칩에 추가합니다. 1-2분 인큐베이션 단계 후에, 샘플을 함유하는 습식 베이스 칩 상에 탑 칩을 놓는다.
  4. 어셈블리를 함께 고정하여 3개의 황동 나사로 기계적으로 제자리에 고정되는 밀폐된 인클로저를 형성합니다. 어셈블리를 밀봉하면 터보 펌핑 건식 펌핑 스테이션을 사용하여 팁을 10-6Torr 로 펌핑합니다. 이제 홀더를 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다.
    알림: 셀렉트 홀더에는 냉각 기능이 없으며 Cryo-EM에는 사용되지 않습니다.

2. 마이크로칩 샌드위치 어셈블리 생산

알림: 다른 SiN 또는 이산화규소(SiO) 마이크로칩은 배송된 젤 팩에서 직접 사용할 수 있습니다. 탄소 코팅 금 그리드는 제공된 대로 직접 사용할 수도 있습니다.

  1. 플라즈마는 아르곤 가스를 사용하여 30W, 15mA의 표준 조건에서 45초 동안 작동하는 글로우 방전 기기를 사용하여 마이크로칩과 탄소 그리드를 청소합니다.
  2. 50 mM hepes, pH 7.5에 포함 된 ~ 2 μL의 샘플을 추가하십시오. 150 mM NaCl; 10 mMMgCl2; 10 mMCaCl2 내지 글로우 방전된 마이크로칩을 겔 팩 위에 놓았다. 여과지 또는 피펫을 사용하여 과도한 용액(~50%)을 제거합니다. 1-2분 인큐베이션 단계 후에, 글로우 방전된 탄소 그리드를 샘플을 함유하는 습윤 마이크로칩에 첨가한다.
  3. 실온에서 단일 틸트 시편 홀더 또는 자동 장전 장치 그리드 클립을 사용하여 어셈블리를 함께 고정하여 밀폐된 인클로저를 형성합니다. 자동 로더 클램프의 경우 샌드위치 어셈블리를 하단 C-클립에 놓고 상단 클립을 어셈블리 상단에 놓고 표준 클램핑 도구를 사용하여 어셈블리를 함께 밀봉합니다.
    알림: 여기에서 수행되는 클램핑 절차는 Cryo-EM 그리드 클램핑과 동일한 단계를 사용하지만 실온에서 사용됩니다. 클램핑된 샘플은 인클로저에 액체를 유지하면서 이미징 전에 2개월 이상 보관할 수 있습니다. 누출 검사는 실온 시편 홀더 또는 자동 로더와 함께 사용되지 않습니다.
  4. 이제 시편을 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다. 극저온 조건 또는 실온에서 오토로더에 배치된 샘플을 검사합니다.

3. 투과전자현미경을 이용한 표본 이미징

  1. 액체-EM 이미징
    1. 시편 홀더를 전계 방출 건(FEG)이 장착되고 200kV에서 작동하는 TEM에 로드합니다.
    2. 건을 켜고 워블러 기능을 사용하여 표본에 대한 현미경 스테이지의 유센트릭 높이를 조정하고 컬럼에서 샘플을 -15°에서 +15°로 기울입니다. 이 절차는 샘플 두께를 수용하기 위해 Z 방향으로 스테이지를 조정합니다. 또한 이미지 녹화 중에 정확한 배율을 보장합니다.
    3. 픽셀 간격이 6μm인 직접 검출기와 통합된 in situ 패키지를 사용하여 이미지를 긴 프레임 동영상으로 녹화합니다(비디오 1 및 비디오 2). 개별 이미지는 또한 자동 이미징 루틴을 구현하는 직렬 데이터 수집 소프트웨어 패키지(20)를 사용하여 기록될 수 있다. 저선량 조건에서 초당 28,000x-92,000x 및 40프레임 범위의 배율로 이미지를 획득합니다.
    4. 노출 시간(0.25-1초)을 조정하여 시편에 대한 빔 손상을 최소화합니다. 지정된 배율에서 -1-4 μm의 디포커스 범위를 사용합니다. 두꺼운 솔루션이 발견되면 더 높은 디포커스 값을 사용하거나 다른 관심 영역을 선택합니다.
    5. 기포가 형성될 때까지 데이터 수집에 사용되지 않는 희생 영역에 전자빔을 집중시켜 이미징 세션 전반에 걸쳐 용액이 샘플에 존재하는지 확인합니다(보충 그림 1).
  2. 초저온 EM 이미징
    1. 잘린 EM 그리드 또는 마이크로칩 샌드위치를 FEG가 장착되고 300kV에서 작동하는 TEM에 로드합니다. 건을 켜고 위의 liquid-TEM에 대해 설명한 것과 유사한 절차를 사용하여 현미경 스테이지의 유센트릭 높이를 조정합니다(3.1.2단계).
    2. 현미경 시스템에 통합된 단일 입자 분석 시스템을 사용하여 개별 이미지를 기록하는 동시에 자동화된 이미징 루틴을 구현합니다. 59,000x 배율 및 초당 40프레임에서 14μm의 픽셀 간격을 갖는 단일 입자 분석 직접 전자 검출기를 사용하여 저선량 조건에서 이미지를 기록합니다.
    3. 지정된 배율에서 1-4μm의 디포커스 범위를 사용합니다. 두꺼운 유리질 얼음 층이 발견되면 더 높은 디포커스 값을 사용하거나 데이터 수집을 위해 다른 영역을 선택합니다.

4. 데이터 분석 및 3D 구조 비교

  1. 액체 및 유리체 얼음에서 아데노 관련 바이러스(AAV) 분석
    1. RELION-3.08 프로그램(21 ) 또는 다른 화상 처리 소프트웨어(22)를 사용하여 액체 및 얼음 내의 AAV 입자에 대한 무비 처리. MotionCor2 v1.2.3을 사용하여 모션 보정을 수행합니다.
    2. 수정되면 프로그램 소프트웨어 패키지의 자동 선택 도구를 사용하여 입자를 추출합니다. 일반적인 상자 크기는 액체 표본의 경우 330픽셀이고 얼음 표본의 경우 350픽셀입니다.
    3. 프로그램의 3D 초기 모델 루틴 및/또는 데이터 처리 소프트웨어 패키지의 ab-initio 모델 옵션을 사용하여 C1 대칭을 사용하여 초기 재구성을 계산합니다. 프로그램에서 정규화 파라미터 T = 4를 사용하고 픽셀 크기를 액체 표본의 경우 1.01Å, 얼음 표본의 경우 1.13Å로 사용합니다.
    4. 미세 조정 절차 전체에서 마스크 값 300 Å를 사용합니다. I1 대칭을 사용하여 데이터 처리 소프트웨어에서 구체화 프로토콜을 수행하여 여러 EM 맵을 얻습니다. 예상되는 구조적 분해능은 4 Å 이상의 범위 일 수 있습니다. 액체의 경우 16,800, 얼음의 경우 15,240에서 정사면체 대칭을 구현하는 입자 동등성을 사용합니다12,14.
      참고: 예상 해상도는 금 표준 푸리에 쉘 상관 관계(FSC) 기준을 기반으로 합니다.
    5. ~250 Å에서 마스크 EM 맵핑하고 분자 구조 분석 소프트웨어 패키지23,24를 사용하여 결과를 검사합니다. 그림 3에서 슬라이스는 ~5nm 단위로 표시됩니다.
    6. 비교를 위해 EM 맵에서 캡시드 단백질(VP1) 서브유닛을 추출합니다. 입경 측정을 기반으로 EM 구조 간의 동적 변화를 정량화한 다음(보충 그림 2) 소프트웨어에서 Morph map 함수를 사용하여 시각화합니다.
  2. 액체의 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리 분석
    1. RELION-3.08 프로그램을 사용하여 동영상을 처리합니다. MotionCor2 v1.2.3을 사용하여 이미지 드리프트 및 빔 유도 모션을 수정합니다. 현미경의 대비 전달 함수(CTF)에 대해 수정합니다.
    2. 프로그램의 자동 선택 도구를 사용하여 상자 크기가 800픽셀인 바이러스 어셈블리를 선택합니다. 계산 효율성을 위해 추출된 파티클을 256픽셀로 다시 스케일링할 수 있습니다. 프로그램에서 정규화 파라미터가 T = 2이고 픽셀 크기가 1.66Å인 C1 대칭을 사용하여 초기 모델을 얻습니다.
    3. EM 맵을 얻기 위해 프로그램에서 3D 미세 조정을 수행하면 표준 FSC 기준에 따라 ~ 8.25 Å에 예가 나와 있습니다 (그림 4). 그림 4와 같이 25nm에서 슬라이스가 증가한 분자 구조 분석 소프트웨어를 사용하여 EM 맵을 시각화합니다.
  3. 유리체 얼음의 로타 바이러스 이중층 입자 (DLP) 분석
    1. 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 로타바이러스 DLP용 동영상을 처리합니다. MotionCor2 v1.2.3을 사용하여 이미지의 드리프트를 수정합니다. 패치 CTF 추정을 사용하여 이미지의 렌즈 효과를 수정합니다.
    2. 소프트웨어에서 자동 선택 도구를 사용하여 상자 크기가 950픽셀인 입자를 추출합니다. 계산을 위해 필요에 따라 상자 크기를 다운 샘플링합니다.
    3. ab-initio 옵션과 C1 대칭을 사용하여 초기 모델을 계산합니다. 픽셀 크기 1.47Å 및 마스크 값 800Å를 포함한 미세 조정 매개변수를 사용합니다.
    4. I1 대칭을 적용하면서 추가 미세 조정 루틴을 수행합니다. 예제 결과에는 금 표준 FSC 기준에 따른 10.15 Å EM 맵이 포함됩니다. 사용된 총 입자는 2050개였으며, 이는 정사면체 대칭 연산자로 인해 123,000개의 프로토머 단위에 해당합니다(그림 5).
    5. ~750 Å에서 최종 맵을 마스킹하고 분자 구조 분석 소프트웨어 패키지에서 결과를 시각화합니다. EM 맵을 통한 예제 슬라이스는 그림 5 에 ~10nm 단위로 표시됩니다.

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Representative Results

모든 액체-EM 이미징 실험에는 200kV에서 작동하는 액체-TEM을 사용하였고, 모든 Cryo-EM 데이터 수집에는 300kV에서 작동하는 cryo-TEM을 사용하였다. 여러 바이러스의 대표적인 이미지와 구조를 제시하여 다양한 테스트 대상에 걸쳐 방법의 유용성을 입증합니다. 여기에는 재조합 아데노 관련 바이러스 아형 3(AAV), 환자 혈청에서 유래한 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리, 유인원 로타바이러스 이중층 입자(DLP), SA11 균주가 포함됩니다. 먼저, 액체 완충액(50mM Hepes, pH 7.5; 150mM NaCl; 10mM MgCl2; 10mM CaCl2) 및 유리체 얼음(그림 3A-C; 보충 그림 2). 액체-EM 샘플은 SiN 기반 마이크로칩과 특수 시편 홀더를 사용하여 준비되었습니다. Cryo-EM 샘플은 표준 구멍이 뚫린 탄소 그리드를 사용하여 준비되었으며 최첨단 샘플 준비 장치를 사용하여 액체 에탄으로 유리화되었습니다. 생성 된 바이러스 구조는 ~ 25 nm의 유사한 전체 직경을 가졌다. 개별 VP1 캡시드 프로토머의 비교는 또한 액체 및 얼음 EM 맵 모두에서 일관된 특징을 보여주었습니다(그림 3D). 액체-EM과 Cryo-EM 데이터의 한 가지 차이점은 Cryo-EM 결과(그림 3E)12에 존재하지 않는 액체에서 추가적인 동적 구조가 관찰되었다는 것입니다.

다음으로, 새로운 마이크로칩 샌드위치 기술 7,14를 사용하여 완충액(50mM Hepes, pH7.5; 150mM NaCl; 10mM MgCl2; 10mM CaCl2)에서 제조된 비활성화된 SARS-CoV-2 샘플(0.25mg/mL)을 검사하였다. 새로운 기술은 탄소 코팅 금 그리드와 함께 SiN 기반 마이크로 칩을 사용합니다. 이 준비에서, 액체 샘플을 두 기판 사이에 끼웠다 (그림 2A-C). 샌드위치된 시편은 Cryo-EM 샘플 준비에 일반적으로 사용되는 단일 틸트 시편 홀더 또는 오토로더 C-클립으로 클램핑되었습니다. 샘플은 TEM에서 즉시 보거나 생물학적 표본의 안정성에 따라 4 ° C에서 2 개월 이상 보관할 수 있습니다. 액체 샘플에서 버블 링의 출현은 액체 층의 존재를 보장합니다. 액체 두께는12에 설명된 바와 같이 EF-TEM 프로토콜을 사용하여 측정할 수 있습니다. 액체의 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리는 주변 액체에 대해 높은 가시 대비를 갖는 것으로 나타났습니다(그림 4A,B). 일부 입자는 바이러스 표면에 눈에 띄는 스파이크를 표시하는 반면 일부 입자는 스파이크가 없거나 스파이크로 드물게 장식되어 있습니다(보충 그림S 3). 8.25 Å 구조를 통한 클래스 평균 및 절편은 단백질 서브유닛 및 바이러스 RNA 게놈을 포함하는 입자 내의 내부 특징을 나타내었다(도 4C). 일부 입자는 C2 대칭을 포함하는 것으로 나타났지만(C2 대칭을 테스트했을 때 입자 동등성은 2,674), 비대칭 구조는 대칭 구조와 비교하여 크게 다르지 않았습니다.

마지막으로, 분석에는 마이크로칩 샌드위치 제제를 액체 질소로 수동으로 급속 냉동하여 유리체 얼음에서 로타바이러스 DLP(3mg/mL; 50mM hepes, pH 7.5; 150mM NaCl; 10mM MgCl2; 10mMCaCl2)가 포함되었습니다. 액체-EM 샘플을 생산하는 데 사용된 것과 동일한 샌드위치 기술이 동결 수화된 표본에 사용되었습니다. 샌드위치는 오토로더 그리드 클립으로 밀봉하고 표준 조건에서 cryo-TEM을 사용하여 검사했습니다. 얼어 붙은 표본의 저배율 뷰는 입방체 또는 육각형 얼음 오염이 거의 또는 전혀 나타나지 않았으며보기 창 전체에서 조밀하게 포장 된 DLP 영역이 관찰되었습니다 (그림 5A, B). 이미지는 EPU 패키지에 구현된 자동화된 루틴을 사용하여 수집되었습니다. 10.15 Å 맵을 통한 클래스 평균 및 슬라이스는 바이러스 단백질 구성 요소 및 이중 가닥 RNA 게놈과 일치하는 안정적인 특징을 나타냈습니다(그림 5D, E). DLP와 얼음 배경 간의 대비 차이는 액체-EM 샘플에 비해 Cryo-EM 이미지에서 눈에 띄게 강하지 않았습니다. 이 흥미로운 효과의 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 liquid-EM이 이미징 커뮤니티에 미래의 이점을 제공할 수 있으므로 차이점에 주목할 가치가 있습니다.

Figure 1
그림 1: 액체 및 얼음에 있는 바이러스의 고해상도 이미징에 사용되는 기술. 두 워크플로우는 서로 다른 액체-EM 시료 전처리 방법을 강조합니다. 왼쪽 패널은 액체-EM 시편 홀더의 개략도를 보여줍니다. SiN 기본 마이크로 칩에는 ~ 500nm 두께의 멤브레인으로 ~ 100nm 깊이의 통합 마이크로 웰 (10μm x 100μm) 어레이 (30μm x 30μm)가 포함되어 있습니다. 오른쪽 패널은 액체-EM 및 Cryo-EM 연구에 모두 사용할 수 있는 마이크로칩 샌드위치 기술의 개략도를 보여줍니다. 샌드위치 어셈블리는 탄소 코팅 금 TEM 그리드와 쌍을 이루는 SiN 마이크로칩을 사용합니다. 어셈블리의 단면은 멤브레인 두께가 각각 10nm 또는 5nm인 250μm x 250μm에서 50μm x 50μm 크기의 여러 이미징 창을 나타냅니다. 탄소 지지 필름의 두께는 ~5nm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 액체-EM 및 Cryo-EM을 위한 마이크로칩 샌드위치 기술. (A) 마이크로칩 샌드위치 어셈블리는 탄소-코팅된 금 TEM 그리드와 쌍을 이루는 SiN 마이크로칩을 사용한다. 글로우 방전 된 마이크로 칩을 젤 팩 위에 놓고 바이러스 샘플을 마이크로 칩에 첨가합니다. 짧은 배양 기간 후, 과량의 용액을 제거하고, 샌드위치를 TEM 그리드로 밀봉한다. (B) 마이크로칩 샌드위치는 실온에서 클리핑 장치에 밀봉되어 있으며 단일 틸트 TEM 홀더 또는 TEM 자동 로더 시스템에 직접 로드할 수 있습니다. (c) 마이크로칩 샌드위치 조립체의 단면 도면은 마이크로칩 및 탄소층의 치수를 강조한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: AAV의 액체-EM 및 Cryo-EM 구조 비교. (A) 맵을 통해 5nm 슬라이스를 보여주는 컬러 방사형 밀도를 가진 용액(3.22Å 해상도)에서 AAV의 구조. 스케일 바는 5nm입니다. 이미징 메트릭은 직접 전자 검출기를 사용한 데이터 수집을 위한 것입니다. (B) 컬러 방사형 밀도의 얼음 (3.37 Å 해상도)에서 이미징 된 AAV의 구조는 구조를 통해 5nm 슬라이스를 나타냅니다. 스케일 바는 5nm입니다. 이미징 메트릭은 직접 전자 검출기를 사용한 데이터 수집을 위한 것입니다. (C) 관심 영역은 서로 다른 시점에서 계산 된 푸리에 변환과 함께 5 초 및 20 초 시점을 보여줍니다. 왼쪽은 CTF 추정치를, 오른쪽은 실험 데이터를 보여줍니다. (D) 액체 및 얼음 구조에서 추출된 AAV VP1 서브유닛의 회전 도. 세그먼트는 결정 구조(PDB 코드 3KIC, A 사슬25)를 이용하여 해석하였다. 스케일 바는 10 Å입니다. (E) 분자 구조 분석 소프트웨어에서 모프 맵 기능을 사용하여 생성된 액체 구조의 동적 값이며 단계 4.1.6-4.2.3에 설명되어 있습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 여러 바이러스 어셈블리의 평균 구조는 EM 데이터를 사용하여 측정한 해당 ~5% 직경 변화와 함께 구조적 변화를 보여줍니다. 복셀 단위의 RMSD 값은 색상 스케일에 따른 변화를 나타냅니다. 이 그림은12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 마이크로칩 샌드위치 기술을 사용하여 액체로 제조된 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리. (A) COVID-19 환자의 혈청 분획에서 분리된 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리의 이미지. 이미징 메트릭은 직접 전자 검출기를 사용한 데이터 수집을 위한 것입니다. 이미지의 오른쪽 상단 모서리에 있는 흰색 거품은 샘플에 액체가 있음을 나타내는 시각적 표시기입니다. 스케일 바는 100nm입니다. (B) 이미지의 계산 된 푸리에 변환은 해당 이미지에서 드리프트가 거의 또는 전혀없는 상호 공간에서 고해상도 정보를 보여줍니다. 클래스 평균은 용액에 포함된 바이러스 어셈블리에서 고유한 기능을 보여줍니다. (C) 하위 바이러스 어셈블리의 EM 재구성은지도를 통해 5nm 슬라이스에서 컬러 방사형 밀도로 표시됩니다. 스케일 바는 25nm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 마이크로칩 샌드위치 기술을 사용하여 액체로 제조된 로타바이러스 DLP. (A,B) 분석 소프트웨어를 사용한 저배율 스크리닝 단계. 제한된 얼음 결정이 관찰되었고 창 멤브레인이 얇고 투명하여 데이터 수집을 위한 영역 선택이 단순화되었습니다. (A)의 스케일 바는 5μm이고 (B)의 스케일 바는 500nm입니다. (C) 영화는 표시된 이미징 메트릭에 따라 카운팅 모드에서 직접 전자 검출기를 사용하여 획득되었습니다. 스케일 바는 50nm입니다. (D) 푸리에 변환 정보는 데이터에 존재하는 고해상도 정보를 나타내며 클래스 평균은 정사면체 격자에서 강력한 특징을 보여줍니다. 클래스 평균은 아티팩트가 없고 다른 구조적 관찰 6,15,17과 일치하는 바이러스 어셈블리의 특징을 보여줍니다. (E) 맵을 통해 10nm 슬라이스에서 컬러 방사형 밀도로 표시된 DLP(10.15Å 해상도)의 EM 재구성. 스케일 바는 15nm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: EM 샘플에서 액체의 존재 확인. 저선량 조건(<10 e- Å-2 s-1)에서 획득한 용액 내 AAV 입자의 저배율 이미지에는 기포가 없습니다. >100 e-Å-2s-1의 집속 빔을 사용하여 액체 샘플은 기포 형성을 나타냈습니다(검은색 화살표). 스케일 바는 500nm입니다. 이 수치는12에서 수정되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 액체의 AAV 치수 변화 측정. (A) 바이러스 입자의 윤곽 흔적은 20 초 동안 획득되었습니다. 스케일 바는 25nm입니다. (ᄃ,씨) 1, 5, 10 및 20초에서의 입자 직경 측정의 표 및 그래픽 표현. 20 초 기록 동안 입자 직경의 전체 변화는 ~ 1e- Å-2 s-1의 용량에서 0.28 %였다. (D,E) 동영상 획득 중 다양한 시점에서 결정되는 신호 대 잡음비 값입니다. 이 수치는12에서 수정되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 환자 유래 SARS-CoV-2 하위 복합체의 고배율 이미지. 이질적인 바이러스 어셈블리는 일부 입자의 표면에 스파이크 단백질 (빨간색 화살표)의 존재를 보여주었습니다. 다른 입자는 표시된 표면 스파이크가 부족했습니다. 스케일 바는 100nm입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 1: 액체에서 AAV의 실시간 이미징. 액체에서 AAV의 실시간 기록(왼쪽)과 용액에서 확산되는 입자의 컬러 윤곽 흔적(오른쪽)을 나란히 비교합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 2: 액체의 이미지 추적 시각화. 용액에서 확산되는 AAV의 컬러 및 저역 통과 필터링 필름의 나란히 비교(왼쪽) 용액에서 확산되는 입자의 컬러 윤곽 흔적(오른쪽). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

Cryo-EM 분야에서 채택된 새로운 자동화 도구 및 기술을 사용하여 현재 액체-EM 워크플로우를 간소화할 수 있는 새로운 기회가 제시됩니다. 새로운 마이크로칩 샌드위치 기술과 관련된 응용 분야는 액체 또는 유리질 얼음에서 고해상도 이미징 분석을 가능하게 하기 때문에 다른 방법과 관련하여 중요합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 나노 스케일 수준에서 정교한 세부 사항을 시각화하기 위해 이상적인 액체 두께의 시편을 생산하는 것입니다. 이상적인 관심 영역은 자동화된 데이터 수집을 위한 고처리량 루틴을 구현하기 전에 전체 샘플을 스크리닝하여 더 낮은 배율로 식별됩니다. 액체 또는 얼음 표본에서 확인된 영역에 빔 손상 아티팩트가 포함되어 있거나 시각적으로 선명한 개별 입자를 식별하기에 너무 두꺼워 보이는 경우 데이터 수집에서 제외해야 합니다. 고해상도 데이터 수집의 한계에는 액체 샘플에서 빔 유도 운동과 브라운 운동이 포함됩니다. Cryo-EM 분석법은 생물학적 시료의 움직임을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 그러나 모션 보정 방법은 이러한 해상도 제한 요소를 완화하는 데 계산적으로 강력합니다. 액체 샘플이 장거리 드리프트 및 열 불안정성을 존재하는 경우, 액체 층의 두께를 감소시키기 위해 샘플 준비 단계 동안 과량의 용액을 제거함으로써 더 얇은 샘플을 제조할 수 있다.

바이러스 입자 간의 분자 밀집은 샘플을 고농도로 사용할 때 발생할 수 있습니다. 강력한 데이터 수집을 제한하는 방식으로 입자가 겹치는 여러 영역이 있는 경우 샘플 준비 전에 입력 샘플의 농도를 줄여야 합니다. 적절한 시료 농도를 갖는 것은 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 과도한 입자가 포함된 이미지는 다운스트림 이미지 처리 절차를 복잡하게 만듭니다. 정제된 바이러스 입자의 경우 적절한 농도 범위는 샘플의 크기와 분자량에 따라 0.3-3mg/mL입니다. 더 큰 바이러스(~100nm 직경 이상)는 일반적으로 기술의 성공을 위해 더 작은 바이러스(~25nm 직경 이하)보다 더 높은 농도가 필요합니다. 고려해야 할 또 다른 요소는 관심 입자가 글로우 방전 마이크로 칩에 부착되는 수준입니다. 바이러스 샘플이 표면에 잘 부착되지 않으면 액체-EM 또는 Cryo-EM용 샘플을 적절하게 준비하기 위해 더 높은 농도가 필요할 수 있습니다. 대안적으로, 샘플은 대신 인클로저의 뚜껑으로서 기능하는 마이크로칩과 함께 탄소-코팅된 금 그리드에 적용될 수 있다. 이들 절차가 데이터 수집 절차를 위한 충분한 입자를 모집하지 못하는 경우, 친화성 캡처 방법은 실행 가능한 옵션(26,27,28)을 제시할 수 있다.

액체-EM 이미징을 위해 세제, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 높은 수준의 자당 또는 포도당과 같은 특정 첨가제의 사용을 최소화하거나 피해야 합니다. 이러한 시약은 이미지에 인공물을 도입할 수 있을 뿐만 아니라 빔 손상으로 인한 과도한 버블링, 가수분해 생성물 및 자유 라디칼 형성을 유발할 수 있습니다. 이러한 효과는 이미징된 입자의 특징을 음소거하고 궁극적으로 구조적 해상도를 제한합니다. 이러한 시약이 생화학 적 제제에 사용되는 경우 제거하는 한 가지 방법은 첨가제가없는 완충 용액으로 광범위한 투석을 실시하는 것입니다. 이러한 시약은 사례별로 테스트하고 사용해야 합니다. 또한 마이크로칩 샌드위치 기술을 사용하여 충분한 표본이 생성되면 즉시 이미징하거나 검사할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 보관 시간은 시료 안정성에 따라 다릅니다.

전반적으로 액체-EM을 Cryo-EM과 함께 사용하면 연구원들이 보완적인 이미징 도구로 생물학적 시스템을 검사할 수 있습니다. 새로 개발된 마이크로칩 샌드위치 기술은 액체 또는 얼음에서 TEM 이미징을 위한 일관된 샘플을 생성합니다. 이 기술은 또한 연구자가 상용 시료 홀더 또는 유리화 시스템 없이도 표본을 준비하고 볼 수 있는 간단한 수단을 제공합니다. 자동화된 이미징 프로토콜과 함께, 세션당 수천 개의 이미지 정도의 많은 양의 데이터가 표본당 획득될 수 있다. Parsons와 동료 29,30,31,32,33의 선구적인 작업은 액체 인클로저에서 생물학적 표본을 생산하기위한 토대를 마련했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 최첨단 도구가 이제 새로운 눈을 통해 생물학적 거대 분자를 시각화하는 흥미로운 수단을 제공 할 수있는 방법을 설명합니다. 고성능 컴퓨팅과 함께 사용할 때 이러한 기술을 마스터함으로써 얻을 것으로 예상되는 미래의 응용 프로그램은 3D의 구조-기능 관계를 이해하기 위한 실시간 기계론적 통찰력입니다. Liquid-EM 분야는 인체 건강에 위협이 되는 새로운 바이러스에 대한 연구를 향상시키는 역할을 할 수 있으며, 아마도 전염병 대비 조치에 기여할 수도 있습니다. 요약하면, 이러한 프로토콜을 사용하면 과학자와 엔지니어가 생명 과학, 의학 및 재료 연구를 포괄하는 다양한 샘플에서 원자 세부 사항에서 동적 프로세스를 더 잘 연구할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다. 저자 인 Madeline J. Dressel-Dukes는 Protochips, Inc.의 직원이며 Michael Spilman은 DirectElectron의 직원입니다.

Acknowledgments

저자는 정제 된 AAV-3를 제공 한 Luk H. Vandenberghe 박사 (하버드 의과 대학 안과학과)를 인정합니다. 이 연구는 국립 보건원과 국립 암 연구소 (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700에서 DFK까지)의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

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References

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