Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fremme høyoppløselig avbildning av virussamlinger i væske og is

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63856
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1,4, 5, 6, 1, 7, 8, 2, 9, 1,5,6
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskrives protokoller for å forberede virussamlinger egnet for væske-EM- og kryo-EM-analyse på nanoskala ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi.

Abstract

Interessen for væske-elektronmikroskopi (væske-EM) har skutt i været de siste årene, da forskere nå kan observere sanntidsprosesser på nanoskala. Det er ekstremt ønskelig å koble høyoppløselig kryo-EM-informasjon med dynamiske observasjoner, da mange hendelser oppstår ved raske tidsskalaer - i millisekundområdet eller raskere. Forbedret kunnskap om fleksible strukturer kan også bistå i utformingen av nye reagenser for å bekjempe nye patogener, som SARS-CoV-2. Enda viktigere, å se biologiske materialer i et flytende miljø gir et unikt glimt av deres ytelse i menneskekroppen. Her presenteres nyutviklede metoder for å undersøke nanoskalaegenskapene til virussamlinger i flytende og glassaktig is. For å oppnå dette målet ble veldefinerte prøver brukt som modellsystemer. Side-ved-side-sammenligninger av prøveprepareringsmetoder og representativ strukturinformasjon presenteres. Sub-nanometer funksjoner er vist for strukturer løst i området ~ 3,5-Å-10 Å. Andre nylige resultater som støtter dette komplementære rammeverket inkluderer dynamisk innsikt i vaksinekandidater og antistoffbaserte terapier avbildet i væske. Samlet sett fremmer disse korrelative applikasjonene vår evne til å visualisere molekylær dynamikk, noe som gir en unik kontekst for deres bruk i menneskers helse og sykdom.

Introduction

Biomedisinsk forskning forbedrer vår forståelse av menneskers helse og sykdom gjennom utvikling av ny teknologi. Høyoppløselig bildebehandling forvandler vårt syn på nanoverden - slik at vi kan studere celler og molekyler i utsøkt detalj 1,2,3,4,5. Statisk informasjon om dynamiske komponenter som myke polymerer, proteinsamlinger eller humane virus avslører bare et begrenset øyeblikksbilde av deres komplekse fortelling. For bedre å forstå hvordan molekylære enheter opererer, må deres struktur og funksjon undersøkes i fellesskap.

Nylige fremskritt i produksjonen av materialer som atomisk tynn grafen eller silisiumbaserte mikrochips gir nye muligheter for sanntids strukturfunksjonsanalyse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskop (TEM). Disse materialene kan skape hermetisk forseglede kamre for levende EM-avbildning 6,7,8,9,10,11. Det nye feltet væske-EM, romtemperaturen korrelerer med cryo-EM, gir enestående utsikt over harde eller myke materialer i løsning, slik at forskere samtidig kan studere strukturen og dynamikken til prøven. Væske-EM-applikasjoner inkluderer sanntidsopptak av terapeutiske nanopartikler som interagerer med kreftstamceller, samt endringer i molekylære vanskeligheter med virale patogener12,13,14.

Akkurat som metodologiske fremskritt ansporet oppløsningsrevolusjonen i kryo-EM-feltet, er det behov for nye teknikker og metoder for å utvide bruken av væske-EM som et verktøy med høy gjennomstrømning for det vitenskapelige samfunn. Det overordnede målet med metodene som presenteres her er å strømlinjeforme protokoller for fremstilling av flytende EM-prøver. Begrunnelsen bak de utviklede teknikkene er å ta i bruk nye mikrochipdesign og autoloader-enheter, egnet for både væske- og kryo-EM-datainnsamling (figur 1) 7,14,15,16,17. Samlingene er mekanisk forseglet ved hjelp av standard rutenettklemmer for automatiserte instrumenter, for eksempel Krios, som kan romme flere prøver per økt eller en F200C TEM (figur 2). Denne metoden utvider bruken av høyoppløselig bildebehandling utover standard cryo-EM-applikasjoner som demonstrerer bredere formål for sanntids materialanalyse.

I den aktuelle videoartikkelen presenteres protokoller for tilberedning av virussamlinger i væske med og uten kommersielt tilgjengelige prøveholdere. Ved å bruke den spesialiserte prøveholderen for væske-EM, kan tynne væskeprøver gi strukturell informasjon som kan sammenlignes med kryo-EM-prøver, samt dynamisk innsikt i prøvene. Det er også demonstrert metoder for fremstilling av væskeprøver ved bruk av autoloaderverktøy for rutiner med høy gjennomstrømning. Den største fordelen i forhold til andre teknikker er at automatisert prøveproduksjon gjør at brukeren raskt kan vurdere prøvene sine for optimal tykkelse og elektrondosering før datainnsamling. Denne screeningteknikken identifiserer raskt ideelle områder for sanntidsopptak i væske eller is12,14,18,19. Med henblikk på 3D-strukturbestemmelse kan væske-EM utfylle de veletablerte kryo-EM-metodene implementert i kryo-EM. Lesere som bruker konvensjonelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan vurdere å bruke flytende EM-arbeidsflyter for å gi nye, dynamiske observasjoner av prøvene sine på en måte som utfyller deres nåværende strategier.

Virusprøver som brukes i denne protokollen inkluderer renset adeno-assosiert virus subtype 3 (AAV) oppnådd som gave og dyrket under standardbetingelser12. Det ble også brukt ikke-infeksiøse SARS CoV-2 subvirale samlinger avledet fra serumet til Covid-19-pasienter12 og innhentet fra en kommersiell kilde. Til slutt ble renset simian rotavirus (SA11-stamme) dobbeltlagspartikler (DLP) hentet fra laboratoriet til Dr. Sarah M. McDonald Esstman ved Wake Forest University og dyrket ved hjelp av standardbetingelser 6,17. Programvarepakker som er beskrevet her, er fritt tilgjengelige, og koblingene er gitt i delen Materialtabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lasting av prøveholderen for væske-EM

  1. Rengjør silisiumnitrid (SiN) mikrochips ved å inkubere hver brikke i 150 ml aceton i 2 minutter etterfulgt av inkubasjon i 150 ml metanol i 2 minutter. La flis tørke i laminær luftstrøm.
  2. Plasma rengjør de tørkede sjetongene ved hjelp av et glødutladningsinstrument som opererer under standardforhold på 30 W, 15 mA for 45 s ved bruk av Argon-gass.
  3. Legg en tørr base mikrochip i spissen av prøveholderen. Tilsett ~0,2 μL prøve (0,2-1 mg/ml virussamlinger i 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) til basisbrikken. Etter et inkubasjonstrinn på 1-2 minutter, plasser toppbrikken på den våte basebrikken som inneholder prøven.
  4. Klem forsamlingen sammen for å danne et hermetisk forseglet kabinett, holdt på plass mekanisk av tre messingskruer. Når du forsegler enheten, pump spissen til 10-6 Torr ved hjelp av en turbopumpet tørr pumpestasjon. Holderen er nå klar til å settes inn i TEM.
    MERK: Den valgte holderen har ingen kjølekapasitet og brukes ikke til cryo-EM.

2. Produksjon av mikrochip sandwich forsamlinger

MERK: Ulike SiN- eller silisiumdioksidmikrobrikker (SiO) kan brukes direkte fra de sendte gelpakkene. Karbonbelagte gullgitter kan også brukes direkte som levert.

  1. Plasma rengjør mikrochips og karbongitter ved hjelp av et glødutladningsinstrument som opererer under standardforhold på 30 W, 15 mA for 45 s ved bruk av Argon-gass.
  2. Tilsett ~ 2 μL prøve inneholdt i 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 til en glødutladet mikrochip plassert på en gelpakke. Fjern overflødig oppløsning (~ 50%) ved hjelp av et filterpapir eller en pipette. Etter et inkubasjonstrinn på 1-2 minutter, tilsett det glødutladede karbongitteret til den våte mikrochipen som inneholder prøven.
  3. Klem forsamlingen sammen ved hjelp av en enkelt-tilt prøveholder eller autoloader rutenettklemmer ved romtemperatur for å danne et hermetisk forseglet kabinett. For autolasterklemmene plasserer du sandwichenheten på den nederste C-klipsen, plasserer toppklemmen på toppen av enheten og bruker standard klemmeverktøy for å forsegle enheten sammen.
    MERK: Klemprosedyren som utføres her bruker de samme trinnene som for cryo-EM-gitterklemming, men ved romtemperatur. Klemmede prøver kan lagres i 2 måneder eller lenger før avbildning mens væske opprettholdes i kabinettet. Ingen lekkasjekontroll brukes med en romtemperaturholder eller autoloader.
  4. Prøven er nå klar til å settes inn i TEM. Undersøk prøver plassert i autoloadere under kryoforhold eller ved romtemperatur.

3. Bildeprøver ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop

  1. Væske-EM-avbildning
    1. Last prøveholderen inn i TEM utstyrt med en feltutslippspistol (FEG) og drift ved 200 kV.
    2. Slå på pistolen og juster den eusentriske høyden på mikroskoptrinnet i forhold til prøven ved å bruke wobblerfunksjonen, og vipp prøven fra -15 ° til +15 ° i kolonnen. Denne prosedyren justerer trinnet i Z-retningen for å imøtekomme prøvetykkelsen. Og bidrar til å sikre en nøyaktig forstørrelse under bildeopptak.
    3. Ta opp bilder som langrammede filmer ved hjelp av in situ-pakken integrert med en direkte detektor med en pikselavstand på 6 μm (Video 1 og Video 2). Individuelle bilder kan også registreres ved hjelp av den serielle datainnsamlingsprogramvarepakken20, som implementerer automatiserte bildebehandlingsrutiner. Skaff bilder under lavdoseforhold ved forstørrelser fra 28 000x-92 000x og 40 bilder per sekund.
    4. Juster eksponeringstidene (0,25-1 s) for å minimere stråleskader på prøven. Bruk et defokusområde på -1-4 μm ved den angitte forstørrelsen. Hvis en tykk løsning oppstår, bruk høyere defokuseringsverdier eller velg et annet interesseområde.
    5. Sørg for at løsningen er til stede i prøvene gjennom hele bildesesjonen ved å fokusere elektronstrålen på et offerområde som ikke brukes til datainnsamling, til bobler dannes (supplerende figur 1).
  2. Cryo-EM-avbildning
    1. Legg de klippede EM-nettene eller mikrochipsmørbrødene i TEM utstyrt med FEG og drift ved 300 kV. Slå på pistolen og juster den eusentriske høyden på mikroskoptrinnet, ved hjelp av en lignende prosedyre beskrevet for væske-TEM ovenfor (trinn 3.1.2).
    2. Ta individuelle bilder ved hjelp av enkeltpartikkelanalysesystemet integrert i mikroskopsystemet mens du implementerer automatiserte bildebehandlingsrutiner. Ta opp bilder under lavdoseforhold ved hjelp av enkeltpartikkelanalysen direkte elektrondetektor med en pikselavstand på 14 μm ved en forstørrelse på 59 000x og 40 bilder per sekund.
    3. Bruk et defokusområde på 1-4 μm ved den angitte forstørrelsen. Hvis det påtreffes tykke lag med glasslegeme, bruk høyere defokusverdier, eller velg et annet område for datainnsamling.

4. Dataanalyse og sammenligning av 3 D-struktur

  1. Analyse av adenoassosiert virus (AAV) i flytende og glassaktig is
    1. Behandle filmer for AAV-partikler i væske og is ved hjelp av RELION-3.08 program21 eller annen bildebehandlingsprogramvare22. Utfør bevegelseskorreksjon ved hjelp av MotionCor2 v1.2.3.
    2. Når de er korrigert, trekker du ut partikler ved hjelp av autoplukkingsverktøyet i programvarepakken for programmet. Typiske boksstørrelser er 330 piksler for flytende prøver og 350 piksler for isprøver.
    3. Beregn innledende rekonstruksjoner ved hjelp av C1-symmetri ved hjelp av programmets 3D-innledende modellrutine og / eller ab-initio-modellalternativene i databehandlingsprogramvarepakken. I programmet bruker du en regulariseringsparameter på T = 4 og en pikselstørrelse på 1,01 Å for flytende prøver og 1,13 Å for isprøver.
    4. Bruk en maskeverdi på 300 Å gjennom hele raffineringsprosedyrene. Utfør forbedringsprotokoller i databehandlingsprogramvaren ved hjelp av I1-symmetri for å få flere EM-kart. Forventet strukturell oppløsning kan være i området 4 Å eller bedre. Bruk partikkelekvivalens som implementerer icosahedral symmetri ved 16 800 for væske og 15 240 for is12,14.
      MERK: Oppløsningsestimater er basert på gullstandarden Fourier shell correlation (FSC) kriterier.
    5. Mask EM kart på ~ 250 Å og undersøke resultatene ved hjelp av en molekylær struktur analyse programvarepakke23,24. I figur 3 er skiver vist i trinn på ~5 nm.
    6. Ekstra kapsidprotein (VP1) underenheter fra EM-kartene for sammenligning. Kvantifiser dynamiske endringer mellom EM-strukturer basert på partikkeldiametermålinger (supplerende figur 2), og visualiser deretter ved hjelp av Morph-kartfunksjonen i programvaren.
  2. Analyse av SARS-CoV-2 subvirale enheter i væske
    1. Behandle filmer ved hjelp av RELION-3.08-programmet. Riktig for bildedrift og stråleindusert bevegelse ved hjelp av MotionCor2 v1.2.3. Riktig for kontrastoverføringsfunksjonen (CTF) i mikroskopet.
    2. Bruk verktøyet for automatisk plukking i programmet til å velge virussamlinger med en boksstørrelse på 800 piksler. For beregningseffektivitet kan ekstraherte partikler skaleres til 256 piksler. Få en innledende modell ved hjelp av C1-symmetri i programmet med en regulariseringsparameter på T = 2 og 1,66 Å pikselstørrelse.
    3. Utfør 3D-raffinement i programmet for å få et EM-kart, et eksempel er vist på ~ 8,25 Å i henhold til standard FSC-kriterier (figur 4). Visualiser EM-kart ved hjelp av molekylærstrukturanalyseprogramvaren med skiver økt ved 25 nm som vist i figur 4.
  3. Analyse av rotavirus dobbeltlagspartikler (DLP) i glasslegemet
    1. Behandle filmer for DLP-er for rotavirus ved hjelp av annen bildebehandlingsprogramvare. Bruk MotionCor2 v1.2.3 til å korrigere for drift i bildene. Bruk Patch CTF-estimering for å korrigere for linseeffekter på bildene.
    2. Trekk ut partikler ved hjelp av autoplukkingsverktøyet i programvaren med en boksstørrelse på 950 piksler. Ned-prøve boksen størrelse etter behov for databehandling formål.
    3. Beregn innledende modeller ved hjelp av ab-initio-opsjoner og C1-symmetri . Bruk avgrensningsparametere, inkludert en pikselstørrelse på 1,47 Å og en maskeverdi på 800 Å.
    4. Utfør ytterligere forbedringsrutiner mens du pålegger I1-symmetri. Eksempelresultater inkluderer et 10,15 Å EM-kart, i henhold til gullstandarden FSC-kriteriene. Totalt antall partikler som ble brukt var 2050, noe som tilsvarer 123 000 protomerenheter på grunn av den icosahedrale symmetrioperatoren (figur 5).
    5. Masker endelige kart på ~ 750 Å og visualiser resultater i programvarepakken for molekylær strukturanalyse. Eksempelstykker gjennom EM-kartet er vist i figur 5 i trinn på ~10 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En væske-TEM som opererer ved 200 kV ble brukt til alle væske-EM-avbildningseksperimenter, og en kryo-TEM som opererer ved 300 kV ble brukt til all kryo-EM-datainnsamling. Representative bilder og strukturer av flere virus presenteres for å demonstrere nytten av metodene på tvers av ulike testpersoner. Disse inkluderer rekombinant adeno-assosiert virus subtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale samlinger avledet fra pasientserumet, og simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DLP), SA11-stamme. For det første er sammenligninger vist for den samme AAV-prøven (1 mg/ml) avbildet i væskebufferløsning (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) og i glasslegemet (figur 3A-C; Supplerende figur 2). Væske-EM-prøvene ble fremstilt ved hjelp av SiN-baserte mikrochips og den spesialiserte prøveholderen. Cryo-EM-prøvene ble fremstilt ved hjelp av standard hullete karbongitter og vitrifisert ved hjelp av en toppmoderne prøveprepareringsenhet i flytende etan. De resulterende virusstrukturene hadde lignende totale diametre på ~ 25 nm. En sammenligning av individuelle VP1 kapsidprotomerer viste også konsistente trekk i både flytende og is EM-kart (figur 3D). En forskjell mellom væske-EM- og kryo-EM-dataene var at ytterligere dynamiske strukturer ble observert i væske som ikke var tilstede i kryo-EM-resultatene (figur 3E)12.

Deretter ble undersøkte deaktiverte SARS-CoV-2-prøver (0,25 mg / ml) tilberedt i bufferløsning (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) ved bruk av en ny mikrochip sandwich teknikk 7,14. Den nye teknikken benytter SiN-baserte mikrochips sammen med karbonbelagte gullgitter. I dette preparatet ble væskeprøven klemt mellom de to substratene (figur 2A-C). Sandwichede prøver ble klemmet med en enkelt-tilt prøveholder eller autoloader C-klips som vanligvis brukes i kryo-EM-prøvepreparering. Prøver kan ses umiddelbart i TEM eller lagres ved 4 ° C i 2 måneder eller mer, avhengig av stabiliteten til den biologiske prøven. Utseendet til boblende i væskeprøvene sikrer tilstedeværelsen av væskelaget. Væsketykkelse kan måles ved hjelp av EF-TEM-protokoller som beskrevet12. SARS-CoV-2 subvirale sammenstillinger i væske syntes å ha høy synlig kontrast med hensyn til den omkringliggende væsken (figur 4A, B). Noen partikler viste synlige pigger på virusoverflaten, mens noen partikler mangler pigger eller er sparsomt dekorert med dem (supplerende figur S3). Klassegjennomsnitt og skiver gjennom 8,25 Å-strukturen viste interne trekk i partiklene som består av proteinunderenheter og det virale RNA-genomet (figur 4C). Selv om noen partikler syntes å inneholde C2-symmetri (ved testing av C2-symmetri var partikkelekvivalensen 2,674), var den asymmetriske strukturen ikke mye forskjellig i forhold til symmetrisk struktur.

Til slutt inkluderte analysen rotavirus DLP-er (3 mg/ml; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) i glassaktig is ved manuelt flashfrysende mikrochip-sandwichpreparater til flytende nitrogen. Den samme sandwichteknikken som ble brukt til å produsere flytende EM-prøver ble brukt for frosne hydrerte prøver. Smørbrød ble forseglet med autoloader grid klips og undersøkt ved hjelp av cryo-TEM under standardforhold. Lavforstørrelsesvisninger av de frosne prøvene viste liten eller ingen kubisk eller sekskantet isforurensning, og regioner med tettpakkede DLP-er ble observert gjennom visningsvinduene (figur 5A, B). Bildene ble samlet inn ved hjelp av automatiserte rutiner implementert i EPU-pakken. Klassegjennomsnitt og skiver gjennom 10,15 Å-kartet viste stabile trekk som var konsistente med virale proteinkomponenter og det dobbeltstrengede RNA-genomet (figur 5D,E). Kontrastforskjellen mellom DLP-ene og isbakgrunnen var ikke like synlig sterk i kryo-EM-bildene sammenlignet med væske-EM-prøvene. Mens årsaken til denne interessante effekten fortsatt blir bestemt, er det verdt å merke seg forskjellen da væske-EM kan gi fremtidige fordeler for bildebehandlingssamfunnet.

Figure 1
Figur 1: Teknikker brukt for høyoppløselig avbildning av virus i væske og i is. De to arbeidsflytene fremhever forskjellige metoder for forberedelse av flytende EM-prøver. Det venstre panelet viser en skjematisk fremstilling av en væske-EM-prøveholder. SiN-basen mikrochip inkluderer en matrise (500 μm x 100 μm) av integrerte mikrobrønner (10 μm x 10 μm) som er ~ 150 nm i dybden med en ~ 30 nm tykk membran. Det høyre panelet presenterer et skjema for mikrochipsandwichteknikken, som kan brukes til både væske-EM- og kryo-EM-forskning. Sandwichenhetene bruker en SiN-mikrochip parret med et karbonbelagt TEM-rutenett i gull. Tverrsnitt av forsamlingen indikerer flere bildevinduer fra 250 μm x 250 μm til 50 μm x 50 μm i størrelse med membrantykkelser på henholdsvis 10 nm eller 5 nm. Karbonstøttefilmen er ~ 5 nm tykk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mikrochipsandwichteknikken for flytende EM og kryo-EM . (A) Mikrochipsandwichenheten bruker en SiN-mikrochip parret med et karbonbelagt TEM-rutenett i gull. En glødutladet mikrochip plasseres på en gelpakke og virusprøver tilsettes mikrobrikken. Etter en kort inkubasjonsperiode fjernes overflødig løsning, og sandwichen forsegles med TEM-rutenettet. (B) Microchip sandwich er forseglet i en klippeanordning ved romtemperatur og kan lastes direkte inn i en enkelt-tilt TEM-holder eller et TEM autoloader-system. (C) Tverrsnittstegninger av mikrochip-sandwichmonteringen fremhever dimensjonene til mikrochips og karbonlag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av væske-EM- og kryo-EM-strukturer av AAV. (A) Struktur av AAV i løsning (3.22 Å oppløsning) med fargede radiale tettheter som viser 5 nm skiver gjennom kartet. Skala bar er 5 nm. Imaging beregninger er for datainnsamling ved hjelp av den direkte elektrondetektoren. (B) Struktur av AAV avbildet i is (3,37 Å oppløsning) med fargede radiale tettheter representerer 5 nm skiver gjennom strukturen. Skala bar er 5 nm. Imaging beregninger er for datainnsamling ved hjelp av den direkte elektrondetektoren. (C) En region av interesse viser 5 s og 20 s tidspunkter sammen med Fourier-transformasjoner beregnet på forskjellige tidspunkter. Venstre side viser CTF-estimater, høyre side viser eksperimentelle data. (D) Rotasjonsvisninger av AAV VP1-underenheten ekstrahert fra væske- og isstrukturene. Segmentene ble tolket ved hjelp av krystallstrukturen (PDB-kode 3KIC, A-kjede25). Skalalinjen er 10 Å. (E) Dynamiske verdier i væskestrukturene generert ved hjelp av morph map-funksjonen i molekylærstrukturanalyseprogramvaren og beskrevet i trinn 4.1.6-4.2.3. Fra venstre til høyre viser gjennomsnittlige strukturer fra flere virussamlinger konformasjonsendringer med en tilsvarende ~ 5% diameterendring, målt ved hjelp av EM-data. RMSD-verdier i voxels angir endringer i henhold til fargeskalaen. Figuren er endret fra12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SARS-CoV-2 subvirale sammenstillinger fremstilt i væske ved hjelp av mikrochipsandwichteknikken. (A) Bilde av SARS-CoV-2 subvirale enheter isolert fra serumfraksjoner fra COVID-19-pasienter. Imaging beregninger er for datainnsamling ved hjelp av den direkte elektrondetektoren. Hvite bobler øverst til høyre i bildet er en visuell indikator på at væske er tilstede i prøven. Skalaen er 100 nm. (B) Beregnet Fourier-transformasjon av bildet viser høyoppløselig informasjon i gjensidig rom med liten eller ingen drift i det tilsvarende bildet. Klassegjennomsnitt viser unike egenskaper i virussamlingene som finnes i løsningen. (C) En EM-rekonstruksjon av de subvirale samlingene er vist med fargede radiale tettheter ved 5 nm skiver gjennom kartet. Skala bar er 25 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Rotavirus DLP-er fremstilt i væske ved hjelp av mikrochipsandwichteknikken. (A, B) Lav forstørrelse screening trinn ved hjelp av analyseprogramvaren. Begrensede iskrystaller ble observert, og vindusmembranene var tynne og klare, noe som forenklet områdevalg for datainnsamling. Skalalinjen i (A) er 5 μm og i (B) er 500 nm. (C) Filmer ble anskaffet ved hjelp av den direkte elektrondetektoren i tellemodus i henhold til de angitte bildeberegningene. Skalaen er 50 nm. (D) Fouriertransformasjonsinformasjon indikerer høyoppløselig informasjon som er tilstede i dataene, og klassegjennomsnitt viser sterke egenskaper i det icosahedrale gitteret. Klassegjennomsnitt viser trekk i virussamlingene uten artefakter og i samsvar med andre strukturelle observasjoner 6,15,17. (E) En EM-rekonstruksjon av DLP-ene (10,15 Å-oppløsning) vist med fargede radiale tettheter ved 10 nm skiver gjennom kartet. Skala bar er 15 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Bekrefter tilstedeværelsen av væske i EM-prøver. Bilder med lav forstørrelse av AAV-partikler i oppløsning oppnådd under lavdoseforhold (<10 e- Å-2 s-1) mangler bobler. Ved hjelp av en fokusert stråle på >100 e- Å-2 s-1 viste væskeprøver bobledannelse (svarte piler). Skalaen er 500 nm. Figuren er endret fra12. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Måling av endringer i AAV-dimensjoner i væske. (A) Konturspor av viruspartikler ble anskaffet over en tidsramme på 20 s. Skala bar er 25 nm. (B,C) Tabell og grafiske representasjoner av partikkeldiametermålinger ved 1, 5, 10 og 20 sekunder. Den totale endringen i partikkeldiametre i løpet av 20-tallet var 0,28 % ved en dose på ~1e- Å-2 s-1. (D,E) Signal-til-støy-verdier bestemmes på varierende tidspunkt under filminnhenting. Figuren er endret fra12. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Høyforstørrelsesbilde av pasientavledede SARS-CoV-2-subkomplekser. Heterogene virale samlinger viste tilstedeværelsen av piggproteiner (røde piler) på overflaten av noen partikler. Andre partikler manglet i overflatepigger som merket. Skalaen er 100 nm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Video 1: Sanntidsbilder av AAV i væske. Side-ved-side-sammenligning av et sanntidsopptak av AAV i væske (venstre) og fargede konturspor av partiklene som diffunderer i oppløsning (høyre). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Visualisering av bildesporing i væske. Side-ved-side-sammenligninger av en farget og lavpassfiltrert film av AAV som diffunderer i løsning (venstre) fargede konturspor av partiklene som diffunderer i oppløsning (høyre). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nye muligheter presenteres for å effektivisere dagens væske-EM-arbeidsflyter ved å bruke nye automatiserte verktøy og teknologier tilpasset kryo-EM-feltet. Applikasjoner som involverer den nye mikrochipsandwichteknikken er signifikante med hensyn til andre metoder fordi de muliggjør høyoppløselig bildeanalyse i flytende eller glassaktig is. Et av de mest kritiske trinnene i protokollen er å produsere prøver med den ideelle væsketykkelsen for å visualisere utsøkte detaljer på nanoskalanivå. Ideelle interesseområder identifiseres ved lavere forstørrelser ved å screene hele utvalget før man implementerer rutiner med høy gjennomstrømning for automatisert datainnsamling. Hvis de identifiserte områdene i væske- eller isprøver inneholder stråleskadeartefakter eller virker for tykke til å identifisere individuelle partikler som er visuelt skarpe, bør de utelukkes fra datainnsamlingen. Begrensninger i høyoppløselig datainnsamling inkluderer stråleindusert bevegelse og brownsk bevegelse i væskeprøvene. Cryo-EM-metoder tar sikte på å minimere bevegelse i biologiske prøver; Bevegelseskorreksjonsmetoder er imidlertid beregningsmessig robuste for å redusere disse oppløsningsbegrensende faktorene. Hvis væskeprøvene presenterer langtrekkende drift og termisk ustabilitet, kan tynnere prøver fremstilles ved å fjerne overflødig løsning under prøveprepareringstrinn for å redusere tykkelsen på væskelagene.

Molekylær trengsel blant viruspartikler kan oppstå når prøver brukes i høye konsentrasjoner. Hvis det er flere regioner med overlappende partikler på en måte som begrenser robust datainnsamling, bør inngangsprøven reduseres i konsentrasjon før prøvepreparering. Å ha en passende prøvekonsentrasjon er et avgjørende trinn i protokollen. Bilder som inneholder et overskudd av partikler vil komplisere nedstrøms bildebehandlingsprosedyrer. For rensede viruspartikler er et tilstrekkelig konsentrasjonsområde mellom 0,3-3 mg / ml, avhengig av prøvens dimensjoner og molekylvekt. Større virus (~ 100 nm diameter eller større) krever vanligvis høyere konsentrasjoner enn mindre virus (~ 25 nm diameter eller mindre) for å lykkes med teknikken. En annen faktor å vurdere er nivået der partiklene av interesse holder seg til de glødutladede mikrochipsene. Hvis virusprøven ikke fester seg godt til overflaten, kan det være nødvendig med en større konsentrasjon for tilstrekkelig fremstilling av prøver for flytende EM eller kryo-EM. Alternativt kan prøven i stedet påføres det karbonbelagte gullgitteret med mikrobrikken som lokket på kabinettet. Skulle disse prosedyrene ikke rekruttere tilstrekkelige partikler for datainnsamlingsprosedyrer, kan affinitetsfangstmetoder presentere et levedyktig alternativ26,27,28.

Bruk av visse tilsetningsstoffer som vaskemidler, glyserol, polyetylenglykoler og høye nivåer av sukrose eller glukose bør minimeres eller unngås for avbildning av væske-EM. Disse reagensene kan introdusere gjenstander i bildene, samt føre til overdreven boblende, hydrolyseprodukter og dannelse av frie radikaler på grunn av stråleskader. Slike effekter fører til dempede egenskaper i de avbildede partiklene og begrenser til slutt strukturell oppløsning. En måte å fjerne disse reagensene hvis de brukes i biokjemiske preparater, er gjennom omfattende dialyse til en bufferløsning som mangler tilsetningsstoffene. Disse reagensene må testes og brukes fra sak til sak. Videre, når tilstrekkelige prøver er produsert ved hjelp av mikrochipsandwichteknikken, kan de avbildes med en gang eller lagres ved 4 ° C til de er klare til å undersøke. Lagringstider avhenger av prøvestabilitet.

Samlet sett tillater bruk av væske-EM i kombinasjon med kryo-EM forskere å undersøke biologiske systemer med komplementære bildebehandlingsverktøy. Den nyutviklede mikrochip sandwich-teknikken gir konsistente prøver for TEM-avbildning i væske eller is. Teknikken gir også en enkel måte for forskere å forberede og se prøver uten behov for en kommersiell prøveinnehaver eller vitrifikasjonssystem. I kombinasjon med automatiserte bildeprotokoller kan store mengder data i størrelsesorden tusenvis av bilder per økt hentes per prøve. Pionerarbeidet til Parsons og kolleger 29,30,31,32,33 la grunnlaget for å produsere biologiske prøver i flytende innkapslinger. Protokollene som presenteres her beskriver hvordan state-of-the-art verktøy nå kan gi et spennende middel til å visualisere biologiske makromolekyler gjennom nye øyne. Fremtidige applikasjoner som forventes å være et resultat av å mestre disse teknikkene, når de kombineres med databehandling med høy ytelse, er sanntids mekanistisk innsikt for å forstå struktur-funksjonsforhold i 3D. Væske-EM-feltet kan tjene til å heve forskningen på nye virus som utgjør en trussel mot menneskers helse, kanskje til og med bidra til pandemiske beredskapstiltak. Oppsummert bør bruken av disse protokollene tillate forskere og ingeniører å bedre studere dynamiske prosesser ved atomdetaljer, på tvers av et stort utvalg av prøver som omfatter biovitenskap, medisin og materialforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser. Forfatteren, Madeline J. Dressel-Dukes, er ansatt i Protochips, Inc., og Michael Spilman er ansatt i DirectElectron.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) for å gi renset AAV-3. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health og National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 til D.F.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Tags

Biokjemi utgave 185 transmisjonselektronmikroskopi TEM væske-EM kryo-EM adenoassosiert virus SARS-CoV-2 rotavirus dobbeltlagspartikler DLP-er strukturbiologi
Fremme høyoppløselig avbildning av virussamlinger i væske og is
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiCecco, L. A., Berry, S., Jonaid,… More

DiCecco, L. A., Berry, S., Jonaid, G. M., Solares, M. J., Kaylor, L., Gray, J. L., Bator, C., Dearnaley, W. J., Spilman, M., Dressel-Dukes, M. J., Grandfield, K., McDonald Esstman, S. M., Kelly, D. F. Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice. J. Vis. Exp. (185), e63856, doi:10.3791/63856 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter