Summary
Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.
Abstract
O interesse na microscopia líquida-eletrônica (EM-líquido) disparou nos últimos anos, já que os cientistas agora podem observar processos em tempo real em nanoescala. É extremamente desejável emparelhar informações crio-EM de alta resolução com observações dinâmicas, pois muitos eventos ocorrem em escalas de tempo rápidas - na faixa de milissegundos ou mais rápido. Um melhor conhecimento de estruturas flexíveis também pode ajudar no projeto de novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Mais importante ainda, a visualização de materiais biológicos em um ambiente fluido fornece um vislumbre único de seu desempenho no corpo humano. Apresentamos aqui métodos recém-desenvolvidos para investigar as propriedades em nanoescala de conjuntos de vírus em gelo líquido e vítreo. Para atingir esse objetivo, amostras bem definidas foram utilizadas como sistemas modelo. Comparações lado a lado dos métodos de preparação de amostras e informações estruturais representativas são apresentadas. Características sub-nanômetros são mostradas para estruturas resolvidas na faixa de ~3,5-Å-10 Å. Outros resultados recentes que apoiam essa estrutura complementar incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas e terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. No geral, essas aplicações correlativas avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para seu uso na saúde e na doença humanas.
Introduction
A pesquisa biomédica melhora nossa compreensão da saúde e da doença humanas através do desenvolvimento de novas tecnologias. A imagem de alta resolução está transformando nossa visão do nanomundo - permitindo-nos estudar células e moléculas em detalhes requintados 1,2,3,4,5. Informações estáticas de componentes dinâmicos, como polímeros moles, conjuntos de proteínas ou vírus humanos, revelam apenas um instantâneo limitado de sua narrativa complexa. Para entender melhor como as entidades moleculares operam, sua estrutura e função devem ser investigadas em conjunto.
Avanços recentes na produção de materiais como grafeno atomicamente fino ou microchips à base de silício oferecem novas oportunidades para análise estrutura-função em tempo real usando microscópios eletrônicos de transmissão (METs). Esses materiais podem criar câmaras hermeticamente seladas para imagens EM ao vivo 6,7,8,9,10,11. O novo campo de EM-líquido, o correlato de temperatura ambiente com o crio-EM, fornece visões sem precedentes de materiais duros ou macios em solução, permitindo que os cientistas estudem simultaneamente a estrutura e a dinâmica de sua amostra. As aplicações de EM líquido incluem registros em tempo real de nanopartículas terapêuticas interagindo com células-tronco cancerígenas, bem como mudanças nos meandros moleculares de patógenos virais12,13,14.
Assim como os avanços metodológicos estimularam a revolução da resolução no campo da crio-EM, novas técnicas e métodos são necessários para ampliar o uso do líquido-EM como uma ferramenta de alto rendimento para a comunidade científica. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é simplificar os protocolos de preparação de amostras líquidas-EM. A lógica por trás das técnicas desenvolvidas é empregar novos projetos de microchips e dispositivos de carregador automático, adequados para a coleta de dados líquidos e crio-EM (Figura 1)7,14,15,16,17. Os conjuntos são selados mecanicamente usando clipes de grade padrão para instrumentos automatizados, como o Krios, que pode acomodar várias amostras por sessão ou um TEM F200C (Figura 2). Essa metodologia expande o uso de imagens de alta resolução para além das aplicações padrão de crio-EM, demonstrando propósitos mais amplos para análise de materiais em tempo real.
No presente artigo em vídeo, são apresentados protocolos para a preparação de conjuntos de vírus em líquido com e sem suportes de espécimes comercialmente disponíveis. Usando o suporte de amostra especializado para EM-líquido, espécimes líquidos finos podem fornecer informações estruturais comparáveis às amostras crio-EM, bem como insights dinâmicos dos espécimes. Também são demonstrados métodos para preparar amostras líquidas usando ferramentas de carregador automático para rotinas de alto rendimento. A principal vantagem sobre outras técnicas é que a produção automatizada de amostras permite que o usuário avalie rapidamente suas amostras quanto à espessura ideal e dosagem de elétrons antes da coleta de dados. Essa técnica de triagem identifica rapidamente áreas ideais para gravações em tempo real em líquido ou gelo12,14,18,19. Para fins de determinação da estrutura 3D, o líquido-EM pode complementar os métodos crio-EM estabelecidos há muito tempo implementados no crio-EM. Os leitores que empregam tecnologias convencionais de TEM ou crio-EM podem considerar o uso de fluxos de trabalho líquido-EM para fornecer observações novas e dinâmicas de suas amostras de uma maneira que complemente suas estratégias atuais.
As amostras de vírus utilizadas neste protocolo incluem o vírus adenoassociado purificado subtipo 3 (AAV) obtido como presente e cultivado em condições padrão12. Também foram utilizados conjuntos subvirais não infecciosos do SARS CoV-2 derivados do soro de pacientes com COVID-1912 e obtidos de fonte comercial. Finalmente, partículas purificadas de dupla camada (DLPs) do rotavírus símio (cepa SA11) foram obtidas do laboratório da Dra. Sarah M. McDonald Esstman na Wake Forest University e cultivadas usando condições padrão 6,17. Os pacotes de software descritos aqui estão disponíveis gratuitamente e os links foram fornecidos na seção Tabela de Materiais.
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Protocol
1. Carregamento do suporte do provete para o líquido-EM
- Limpe os microchips de nitreto de silício (SiN) incubando cada chip em 150 mL de acetona por 2 min seguido de incubação em 150 mL de metanol por 2 min. Deixe os cavacos secarem em fluxo de ar laminar.
- Limpe a plasma os cavacos secos usando um instrumento de descarga de brilho operando sob condições padrão de 30 W, 15 mA por 45 s usando gás argônio.
- Coloque um microchip de base seca na ponta do suporte da amostra. Adicione ~0,2 μL de amostra (0,2-1 mg/mL de conjuntos de vírus em 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) ao chip base. Após uma etapa de incubação de 1-2 minutos, coloque o chip superior no chip de base úmida que contém a amostra.
- Aperte o conjunto para formar um invólucro hermeticamente fechado, mantido no lugar mecanicamente por três parafusos de latão. Ao selar o conjunto, bombeie a ponta para 10-6 Torr usando uma estação de bombeamento seco turbo-bombeada . O suporte está agora pronto para ser inserido no TEM.
NOTA: O suporte seleto não tem capacidades de arrefecimento e não é utilizado para crio-EM.
2. Produção de conjuntos sanduíche de microchips
NOTA: Diferentes microchips de SiN ou dióxido de silício (SiO) podem ser usados diretamente das embalagens de gel enviadas. Grades de ouro revestidas de carbono também podem ser usadas diretamente como fornecidas.
- O plasma limpa os microchips e as grades de carbono usando um instrumento de descarga de brilho operando sob condições padrão de 30 W, 15 mA para 45 s usando gás argônio.
- Adicionar ~2 μL de amostra contida em HEPES de 50 mM, pH 7,5; NaCl de 150 mM; 10 mM MgCl2; CaCl2 de 10 mM para um microchip descarregado por brilho colocado em uma embalagem de gel. Remova o excesso de solução (~50%) usando um papel de filtro ou uma pipeta. Após uma etapa de incubação de 1-2 minutos, adicione a grade de carbono descarregada por brilho ao microchip úmido que contém a amostra.
- Aperte o conjunto usando um suporte de amostra de inclinação única ou clipes de grade do carregador automático à temperatura ambiente para formar um gabinete hermeticamente fechado. Para as braçadeiras do carregador automático, coloque o conjunto sanduíche no clipe C inferior, coloque o clipe superior na parte superior do conjunto e use a ferramenta de fixação padrão para selar o conjunto.
NOTA: O procedimento de fixação realizado aqui usa as mesmas etapas que para o clampeamento de grade crio-EM, mas à temperatura ambiente. As amostras presas podem ser armazenadas por 2 meses ou mais antes da imagem, mantendo o líquido no recinto. Nenhuma verificação de vazamento é usada com um suporte de amostra de temperatura ambiente ou o carregador automático. - O espécime está agora pronto para ser inserido no TEM. Examine as amostras colocadas em carregadores automáticos sob condições criogênicas ou à temperatura ambiente.
3. Espécimes de imagem usando um microscópio eletrônico de transmissão
- Imagem Liquid-EM
- Carregar o suporte do espécime no MET equipado com um canhão de emissão de campo (FEG) e operando a 200 kV.
- Ligue a pistola e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação ao espécime usando a função oscilante, inclinando a amostra de -15° a +15° na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção Z para acomodar a espessura da amostra. E ajuda a garantir uma ampliação precisa durante a gravação da imagem.
- Grave imagens como filmes de moldura longa usando o pacote in situ integrado com um detector direto com um espaçamento de pixels de 6 μm (Vídeo 1 e Vídeo 2). Imagens individuais também podem ser gravadas usando o pacote de software de coleta de dados seriais20, implementando rotinas de imagem automatizadas. Adquira imagens em condições de baixa dose em ampliações que variam de 28.000x-92.000x e 40 quadros por segundo.
- Ajuste os tempos de exposição (0,25-1 s) para minimizar os danos do feixe à amostra. Use um intervalo de desfocagem de -1-4 μm na ampliação especificada. Se uma solução espessa for encontrada, use valores de desfocagem mais altos ou selecione uma região diferente de interesse.
- Certifique-se de que a solução esteja presente nas amostras durante toda a sessão de imagem, concentrando o feixe de elétrons em uma área de sacrifício não usada para coleta de dados, até que as bolhas sejam formadas (Figura 1 Suplementar).
- Imagem crio-EM
- Carregue as grades EM cortadas ou sanduíches de microchip no TEM equipado com um FEG e operando a 300 kV. Ligue a pistola e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio, usando um procedimento semelhante descrito para o líquido-TEM acima (etapa 3.1.2).
- Grave imagens individuais usando o sistema de análise de partículas únicas integrado ao sistema de microscópio enquanto implementa rotinas de imagem automatizadas. Grave imagens em condições de baixa dose usando o detector de elétrons diretos de análise de partícula única com um espaçamento de pixels de 14 μm a uma ampliação de 59.000x e 40 quadros por segundo.
- Use um intervalo de desfocagem de 1-4 μm na ampliação especificada. Se forem encontradas camadas espessas de gelo vítreo, use valores de desfocagem mais altos ou selecione uma região diferente para a coleta de dados.
4. Análise de dados e comparações de estruturas 3D
- Análise do vírus adenoassociado (AAV) em gelo líquido e vítreo
- Processe filmes para partículas AAV em líquido e gelo usando o programa RELION-3.0821 ou outro software de processamento de imagem22. Execute a correção de movimento usando o MotionCor2 v1.2.3.
- Uma vez corrigido, extraia partículas usando a ferramenta de seleção automática no pacote de software do programa. Os tamanhos típicos das caixas são de 330 pixels para espécimes líquidos e 350 pixels para espécimes de gelo.
- Calcule as reconstruções iniciais usando a simetria C1 usando a rotina do modelo inicial 3D do programa e/ou as opções do modelo ab-initio no pacote de software de processamento de dados. No programa, use um parâmetro de regularização de T = 4 e um tamanho de pixel de 1,01 Å para espécimes líquidos e 1,13 Å para espécimes de gelo.
- Use um valor de máscara de 300 Å durante os procedimentos de refinamento. Execute protocolos de refinamento no software de processamento de dados usando simetria I1 para obter vários mapas EM. A resolução estrutural esperada pode estar na faixa de 4 Å ou melhor. Use equivalência de partículas implementando simetria icosaédrica em 16.800 para líquido e 15.240 para gelo12,14.
NOTA: As estimativas de resolução são baseadas nos critérios de correlação de casca de Fourier (FSC) padrão-ouro. - Mascarar mapas EM a ~250 Å e examinar os resultados usando um pacote de software de análise de estrutura molecular23,24. Na Figura 3, as fatias são mostradas em incrementos de ~5 nm.
- Extraia as subunidades da proteína do capsídeo (VP1) dos mapas EM para comparação. Quantifique as mudanças dinâmicas entre as estruturas EM com base nas medições do diâmetro das partículas (Figura 2 Suplementar) e, em seguida, visualize usando a função Morph map no software.
- Análise de conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 em líquido
- Processe filmes usando o programa RELION-3.08. Correto para desvio de imagem e movimento induzido por feixe usando MotionCor2 v1.2.3. Correto para a função de transferência de contraste (CTF) do microscópio.
- Use a ferramenta de seleção automática no programa para selecionar montagens virais com um tamanho de caixa de 800 pixels. Para eficiência computacional, as partículas extraídas podem ser redimensionadas para 256 pixels. Obtenha um modelo inicial usando simetria C1 no programa com um parâmetro de regularização de T = 2 e tamanho de pixel 1,66 Å.
- Execute o refinamento 3D no programa para obter um mapa EM, um exemplo é mostrado em ~ 8,25 Å de acordo com os critérios padrão do FSC (Figura 4). Visualize mapas EM usando o software de análise de estrutura molecular com fatias incrementadas a 25 nm, conforme demonstrado na Figura 4.
- Análise de partículas de dupla camada de rotavírus (DLPs) em gelo vítreo
- Processe filmes para DLPs de rotavírus usando outro software de processamento de imagem. Use o MotionCor2 v1.2.3 para corrigir desvios nas imagens. Use a estimativa do Patch CTF para corrigir os efeitos da lente nas imagens.
- Extraia partículas usando a ferramenta de seleção automática no software com um tamanho de caixa de 950 pixels. Reduza a amostra do tamanho da caixa conforme necessário para fins de computação.
- Calcule os modelos iniciais usando opções ab-initio e simetria C1. Use parâmetros de refinamento, incluindo um tamanho de pixel de 1,47 Å e um valor de máscara de 800 Å.
- Execute rotinas de refinamento adicionais enquanto impõe simetria I1. Os resultados do exemplo incluem um mapa EM de 10,15 Å, de acordo com os critérios do FSC padrão-ouro. O total de partículas utilizadas foi de 2050, o que equivale a 123.000 unidades de protômeros devido ao operador de simetria icosaédrica (Figura 5).
- Mascare os mapas finais em ~750 Å e visualize os resultados no pacote de software de análise de estrutura molecular. Fatias de exemplo através do mapa EM são mostradas na Figura 5 em incrementos de ~10 nm.
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Representative Results
Um TEM líquido operando a 200 kV foi utilizado para todos os experimentos de imagem de EM líquido e um TEM crio-TEM operando a 300 kV foi usado para toda a coleta de dados de crio-EM. Imagens representativas e estruturas de vários vírus são apresentadas para demonstrar a utilidade dos métodos em vários sujeitos de teste. Estes incluem vírus adenoassociado recombinante subtipo 3 (AAV), SARS-CoV-2 sub-conjuntos virais derivados do soro do paciente e partículas de dupla camada de rotavírus símio (DLPs), cepa SA11. Primeiramente, comparações são demonstradas para a mesma amostra de AAV (1 mg/mL) fotografada em solução tampão líquida (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) e em gelo vítreo (Figura 3A-C; Figura 2 suplementar). As amostras de EM líquido foram preparadas utilizando microchips à base de SiN e o suporte especializado do espécime. As amostras de crio-EM foram preparadas usando grades de carbono holey padrão e vitrificadas usando uma unidade de preparação de espécimes de última geração em etano líquido. As estruturas virais resultantes tinham diâmetros totais semelhantes de ~25 nm. Uma comparação de protômeros individuais de capsídeos VP1 também mostrou características consistentes em mapas EM líquidos e de gelo (Figura 3D). Uma diferença entre os dados de líquido-EM e crio-EM foi que estruturas dinâmicas adicionais foram observadas em líquido que não estavam presentes nos resultados de crio-EM (Figura 3E)12.
Em seguida, foram examinadas amostras desativadas de SARS-CoV-2 (0,25 mg/mL) preparadas em solução tampão (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) utilizando uma nova técnica de sanduíche de microchip 7,14. A nova técnica emprega microchips à base de SiN, juntamente com grades de ouro revestidas de carbono. Neste preparo, a amostra líquida foi colocada entre os dois substratos (Figura 2A-C). Os espécimes ensanduichados foram fixados com um suporte de amostra de inclinação única ou clipes C de carregador automático comumente usados na preparação de amostras de crio-EM. As amostras podem ser visualizadas imediatamente no ETM ou armazenadas a 4°C durante 2 meses ou mais, dependendo da estabilidade da amostra biológica. O aparecimento de borbulhamento nas amostras líquidas garante a presença da camada líquida. A espessura do líquido pode ser medida usando protocolos EF-TEM, conforme descrito12. Os conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 em líquido pareciam ter alto contraste visível em relação ao líquido circundante (Figura 4A,B). Algumas partículas exibiram picos visíveis na superfície do vírus, enquanto algumas partículas não possuem picos ou são esparsamente decoradas com eles (Figura Suplementar S3). As médias de classe e os cortes através da estrutura de 8,25 Å mostraram características internas dentro das partículas que compõem as subunidades proteicas e o genoma do RNA viral (Figura 4C). Embora algumas partículas parecessem conter simetria C2 (ao testar a simetria C2, a equivalência de partículas era de 2.674), a estrutura assimétrica não diferiu muito em comparação com a estrutura simétrica.
Finalmente, a análise incluiu DLPs de rotavírus (3 mg/mL; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) em gelo vítreo por congelamento manual de preparações de sanduíche de microchip em nitrogênio líquido. A mesma técnica de sanduíche utilizada para a produção de amostras líquidas-EM foi empregada para espécimes congelados-hidratados. Os sanduíches foram selados com grampos de grade do carregador automático e examinados usando o crio-TEM em condições padrão. Vistas de baixa ampliação dos espécimes congelados mostraram pouca ou nenhuma contaminação por gelo cúbico ou hexagonal e regiões de DLPs densamente compactadas foram observadas em todas as janelas de visualização (Figura 5A,B). As imagens foram coletadas por meio de rotinas automatizadas implementadas no pacote EPU. As médias de classe e fatias através do mapa de 10,15 Å revelaram características estáveis consistentes com componentes de proteínas virais e o genoma de RNA de fita dupla (Figura 5D,E). A diferença de contraste entre as DLPs e o fundo de gelo não foi tão visivelmente forte nas imagens crio-EM em comparação com as amostras líquidas-EM. Embora a causa desse efeito interessante ainda esteja sendo determinada, vale a pena notar a diferença, pois o líquido-EM pode oferecer vantagens futuras para a comunidade de imagens.
Figura 1: Técnicas utilizadas para imagens de alta resolução de vírus em líquido e em gelo. Os dois fluxos de trabalho destacam diferentes métodos de preparação de amostras de líquido-EM. O painel esquerdo mostra uma representação esquemática de um suporte de amostra líquido-EM. O microchip base SiN inclui uma matriz (500 μm x 100 μm) de micropoços integrados (10 μm x 10 μm) que são ~150 nm de profundidade com uma membrana de ~30 nm de espessura. O painel direito apresenta um esquema da técnica sanduíche de microchip, que pode ser usada tanto para pesquisas de EM líquido quanto de crio-EM. Os conjuntos de sanduíche usam um microchip SiN emparelhado com uma grade TEM de ouro revestida de carbono. Uma seção transversal do conjunto indica várias janelas de imagem que variam de 250 μm x 250 μm a 50 μm x 50 μm de tamanho com espessuras de membrana de 10 nm ou 5 nm, respectivamente. O filme de suporte de carbono tem ~ 5 nm de espessura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A técnica de sanduíche de microchip para EM líquido e crio-EM. (A) O conjunto de sanduíche de microchip usa um microchip SiN emparelhado com uma grade TEM de ouro revestida de carbono. Um microchip descarregado por brilho é colocado em um pacote de gel e amostras de vírus são adicionadas ao microchip. Após um breve período de incubação, o excesso de solução é removido e o sanduíche é selado com a grade TEM. (B) O sanduíche de microchip é selado em um dispositivo de corte à temperatura ambiente e pode ser carregado diretamente em um suporte TEM de inclinação única ou em um sistema de carregador automático TEM. (C) Desenhos de seção transversal do conjunto sanduíche de microchip destacam as dimensões dos microchips e da camada de carbono. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação das estruturas líquido-EM e crio-EM do AAV. (A) Estrutura do AAV em solução (resolução de 3,22 Å) com densidades radiais coloridas mostrando fatias de 5 nm através do mapa. A barra de escala é de 5 nm. As métricas de imagem são para aquisição de dados usando o detector direto de elétrons. (B) A estrutura do AAV fotografado em gelo (resolução de 3,37 Å) com densidades radiais coloridas representa fatias de 5 nm através da estrutura. A barra de escala é de 5 nm. As métricas de imagem são para aquisição de dados usando o detector direto de elétrons. (C) Uma região de interesse mostra pontos de tempo de 5 s e 20 s, juntamente com transformadas de Fourier calculadas em diferentes pontos de tempo. O lado esquerdo mostra as estimativas de CTF, o lado direito mostra os dados experimentais. (D) Vistas rotacionais da subunidade AAV VP1 extraída das estruturas líquidas e de gelo. Os segmentos foram interpretados utilizando-se a estrutura cristalina (código PDB 3KIC, cadeia A25). A barra de escala é de 10 Å. (E) Valores dinâmicos nas estruturas líquidas gerados usando a função de mapa morfológico no software de análise de estrutura molecular e descritos na etapa 4.1.6-4.2.3. Da esquerda para a direita, as estruturas médias de vários conjuntos de vírus mostram mudanças conformacionais com uma variação de diâmetro correspondente de ~5%, medida usando dados EM. Os valores de RMSD em voxels indicam mudanças de acordo com a escala de cores. A figura foi modificada de12. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 preparados em líquido usando a técnica de sanduíche de microchip. (A) Imagem de conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 isolados de frações séricas de pacientes com COVID-19. As métricas de imagem são para aquisição de dados usando o detector direto de elétrons. Bolhas brancas no canto superior direito da imagem são um indicador visual de que o líquido está presente na amostra. A barra de escala é de 100 nm. (B) A transformada de Fourier calculada da imagem mostra informações de alta resolução no espaço recíproco com pouca ou nenhuma deriva na imagem correspondente. As médias de classe mostram características exclusivas nos assemblies virais contidos na solução. (C) Uma reconstrução EM dos conjuntos subvirais é mostrada com densidades radiais coloridas a fatias de 5 nm através do mapa. A barra de escala é de 25 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: DLPs de rotavírus preparados em líquido usando a técnica de sanduíche de microchip. (A,B) Etapas de triagem de baixa ampliação usando o software de análise. Cristais de gelo limitados foram observados, e as membranas das janelas eram finas e claras, simplificando a seleção de área para aquisição de dados. A barra de escala em (A) é de 5 μm e em (B) é de 500 nm. (C) Os filmes foram adquiridos utilizando-se o detector direto de elétrons em modo de contagem de acordo com as métricas de imagem indicadas. A barra de escala é de 50 nm. (D) As informações da transformada de Fourier indicam informações de alta resolução presentes nos dados e as médias de classe mostram características fortes na rede icosaédrica. As médias de classes mostram características nos conjuntos de vírus livres de artefatos e consistentes com outras observações estruturais 6,15,17. (E) Uma reconstrução EM dos DLPs (resolução de 10,15 Å) mostrados com densidades radiais coloridas a fatias de 10 nm através do mapa. A barra de escala é de 15 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Confirmando a presença de líquido em amostras EM. Imagens de baixa ampliação de partículas de AAV em solução adquiridas em condições de baixa dose (<10 e- Å-2 s-1) carecem de bolhas. Usando um feixe focado de >100 e- Å-2 s-1, amostras líquidas mostraram formação de bolhas (setas pretas). A barra de escala é de 500 nm. A figura foi modificada de12. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar: Medição de alterações nas dimensões do AAV em líquido. (A) Vestígios de contorno de partículas virais foram adquiridos ao longo de um período de tempo de 20 s. A barra de escala é de 25 nm. (B,C) Tabela e representações gráficas das medidas de diâmetro de partículas em 1, 5, 10 e 20 segundos. A mudança geral nos diâmetros das partículas durante o registro de 20 s foi de 0,28% na dose de ~1e- Å-2 s-1. (D,E) Valores de sinal-ruído determinados em diferentes pontos de tempo durante a aquisição do filme. A figura foi modificada de12. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 3 suplementar: Imagem de alta ampliação dos subcomplexos SARS-CoV-2 derivados do paciente. Assembleias virais heterogêneas mostraram a presença de proteínas spike (setas vermelhas) na superfície de algumas partículas. Outras partículas estavam faltando em picos de superfície como rotulado. A barra de escala é de 100 nm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo 1: Imagem em tempo real do AAV em líquido. Comparação lado a lado de um registro em tempo real de AAV em líquido (esquerda) e traços coloridos de contorno das partículas que se difundem em solução (direita). Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Visualização do rastreamento de imagens em líquido. Comparações lado a lado de um filme filtrado colorido e passa-baixas de AAV difundindo em solução (esquerda) traços de contorno coloridos das partículas que se difundem em solução (direita). Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Novas oportunidades são apresentadas para agilizar os fluxos de trabalho atuais de EM líquido usando novas ferramentas e tecnologias automatizadas adaptadas do campo crio-EM. As aplicações que envolvem a nova técnica de sanduíche de microchip são significativas em relação a outros métodos, pois permitem a análise de imagens de alta resolução em gelo líquido ou vítreo. Uma das etapas mais críticas do protocolo é a produção de espécimes com a espessura líquida ideal para visualizar detalhes requintados no nível de nanoescala. As regiões ideais de interesse são identificadas em ampliações mais baixas, examinando toda a amostra antes de implementar rotinas de alto rendimento para coleta automatizada de dados. Se as regiões identificadas em espécimes líquidos ou de gelo contiverem artefatos de dano ao feixe ou parecerem muito espessas para identificar partículas individuais visualmente nítidas, elas devem ser excluídas da coleta de dados. As limitações na aquisição de dados de alta resolução incluem o movimento induzido pelo feixe e o movimento browniano nas amostras líquidas. Os métodos Cryo-EM visam minimizar o movimento em amostras biológicas; no entanto, os métodos de correção de movimento são computacionalmente robustos na mitigação desses fatores limitantes de resolução. Se as amostras líquidas apresentarem deriva de longo alcance e instabilidade térmica, as amostras mais finas podem ser preparadas removendo o excesso de solução durante as etapas de preparação da amostra para diminuir a espessura das camadas líquidas.
O aglomeração molecular entre partículas virais pode ocorrer quando as amostras são usadas em altas concentrações. Se existirem várias regiões com partículas sobrepostas de uma forma que limite a recolha de dados robusta, a amostra de entrada deve ser reduzida em concentração antes da preparação da amostra. Ter uma concentração de amostra adequada é um passo crucial no protocolo. Imagens que contenham um excesso de partículas complicarão os procedimentos de processamento de imagem a jusante. Para as partículas virais purificadas, um intervalo de concentração adequado é entre 0,3-3 mg/mL, dependendo das dimensões e do peso molecular da amostra. Vírus maiores (~ 100 nm de diâmetro ou maior) normalmente requerem concentrações mais altas do que os vírus menores (~ 25 nm de diâmetro ou menos) para o sucesso da técnica. Outro fator a considerar é o nível em que as partículas de interesse aderem aos microchips descarregados de brilho. Se a amostra do vírus não aderir bem à superfície, uma concentração maior pode ser necessária para preparar adequadamente os espécimes para EM líquido ou crio-EM. Alternativamente, a amostra pode ser aplicada à grade de ouro revestida de carbono com o microchip servindo como tampa do invólucro. Caso esses procedimentos não consigam recrutar partículas suficientes para os procedimentos de coleta de dados, os métodos de captura por afinidade podem apresentar uma opção viável26,27,28.
O uso de certos aditivos, como detergentes, glicerol, polietilenoglicóis e altos níveis de sacarose ou glicose, deve ser minimizado ou evitado para imagens líquidas EM. Esses reagentes podem introduzir artefatos nas imagens, bem como levar a borbulhamento excessivo, produtos de hidrólise e formação de radicais livres devido a danos no feixe. Tais efeitos levam a características silenciadas nas partículas fotografadas e, em última análise, limitam a resolução estrutural. Uma maneira de remover esses reagentes se eles forem usados em preparações bioquímicas é através de diálise extensiva em uma solução tampão sem os aditivos. Esses reagentes precisarão ser testados e usados caso a caso. Além disso, uma vez que tenham sido produzidos espécimes suficientes usando a técnica de sanduíche de microchip, eles podem ser fotografados imediatamente ou armazenados a 4 °C até estarem prontos para serem examinados. Os tempos de armazenamento dependem da estabilidade da amostra.
No geral, o uso de líquido-EM em combinação com crio-EM permite que os pesquisadores examinem sistemas biológicos com ferramentas de imagem complementares. A recém-desenvolvida técnica de sanduíche de microchip produz amostras consistentes para imagens MET em líquido ou gelo. A técnica também fornece um meio simples para os pesquisadores prepararem e visualizarem espécimes sem a necessidade de um suporte de amostra comercial ou sistema de vitrificação. Em combinação com protocolos de imagem automatizados, grandes quantidades de dados na ordem de milhares de imagens por sessão podem ser adquiridas por espécime. O trabalho pioneiro de Parsons e colegas 29,30,31,32,33 lançou as bases fundamentais para a produção de espécimes biológicos em recintos líquidos. Os protocolos apresentados aqui descrevem como as ferramentas de última geração podem agora fornecer um meio empolgante de visualizar macromoléculas biológicas através de novos olhos. Aplicações futuras que se espera que resultem do domínio dessas técnicas, quando emparelhadas com computação de alto desempenho, são insights mecanicistas em tempo real para entender as relações estrutura-função em 3D. O campo do EM líquido pode servir para elevar a pesquisa sobre novos vírus que representam uma ameaça à saúde humana, talvez até contribuindo para medidas de preparação para a pandemia. Em resumo, o uso desses protocolos deve permitir que cientistas e engenheiros estudem melhor os processos dinâmicos em detalhes atômicos, em uma grande variedade de amostras, abrangendo ciências da vida, medicina e pesquisa de materiais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. A autora, Madeline J. Dressel-Dukes, é funcionária da Protochips, Inc. e Michael Spilman é funcionário da DirectElectron.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Departamento de Oftalmologia) por fornecer AAV-3 purificado. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Instituto Nacional do Câncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
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