Summary
Здесь описаны протоколы для подготовки вирусных сборок, пригодных для жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ анализа на наноуровне с использованием просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Интерес к жидкостно-электронной микроскопии (liquid-EM) резко возрос в последние годы, поскольку ученые теперь могут наблюдать процессы в режиме реального времени на наноуровне. Крайне желательно сочетать крио-ЭМ-информацию высокого разрешения с динамическими наблюдениями, так как многие события происходят в быстрых временных масштабах - в миллисекундном диапазоне или быстрее. Улучшенные знания о гибких структурах также могут помочь в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Что еще более важно, просмотр биологических материалов в жидкой среде дает уникальное представление об их производительности в организме человека. Здесь представлены недавно разработанные методы исследования наноразмерных свойств вирусных сборок в жидком и стекловидном льду. Для достижения этой цели в качестве модельных систем использовались четко определенные образцы. Представлены параллельные сравнения методов пробоподготовки и репрезентативной структурной информации. Субнанометровые особенности показаны для структур, разрешенных в диапазоне ~3,5-Å-10 Å. Другие недавние результаты, которые поддерживают эту дополнительную структуру, включают динамическое понимание кандидатов на вакцину и терапии на основе антител, изображенной в жидкости. В целом, эти коррелятивные приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для их использования в здоровье человека и болезнях.
Introduction
Биомедицинские исследования улучшают наше понимание здоровья человека и болезней путем разработки новых технологий. Визуализация с высоким разрешением трансформирует наш взгляд на наномир, позволяя нам изучать клетки и молекулы в мельчайших деталях 1,2,3,4,5. Статическая информация о динамических компонентах, таких как мягкие полимеры, белковые сборки или человеческие вирусы, показывает лишь ограниченный снимок их сложного повествования. Чтобы лучше понять, как работают молекулярные объекты, их структура и функция должны быть совместно исследованы.
Последние достижения в производстве таких материалов, как атомарно тонкий графен или микрочипы на основе кремния, предоставляют новые возможности для анализа структуры и функции в режиме реального времени с использованием просвечивающих электронных микроскопов (TEM). Эти материалы могут создавать герметично закрытые камеры для живой ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11. Новое поле жидкости-ЭМ, комнатная температура коррелирует с крио-ЭМ, обеспечивает беспрецедентные представления твердых или мягких материалов в растворе, позволяя ученым одновременно изучать структуру и динамику их образца. Приложения Liquid-EM включают записи в реальном времени терапевтических наночастиц, взаимодействующих с раковыми стволовыми клетками, а также изменения в молекулярных тонкостях вирусных патогенов 12,13,14.
Так же, как методологические достижения стимулировали революцию разрешения в области крио-ЭМ, необходимы новые методы и методы для расширения использования жидкой ЭМ в качестве высокопроизводительного инструмента для научного сообщества. Общая цель методов, представленных здесь, заключается в оптимизации протоколов подготовки образцов жидкостной ЭМ. Обоснование разработанных методов заключается в использовании новых конструкций микрочипов и устройств автозагрузки, подходящих как для сбора жидкостных, так и крио-ЭМ данных (рисунок 1)7,14,15,16,17. Сборки механически герметизированы с использованием стандартных сетчатых зажимов для автоматизированных приборов, таких как Krios, которые могут вмещать несколько образцов за сеанс или F200C TEM (рисунок 2). Эта методология расширяет использование изображений с высоким разрешением за пределы стандартных крио-ЭМ-приложений, демонстрируя более широкие цели для анализа материалов в режиме реального времени.
В текущей видеостатье представлены протоколы подготовки вирусных сборок в жидкости с коммерчески доступными держателями образцов и без них. Использование специализированного держателя образцов для жидких ЭМ, тонких жидких образцов может предоставить структурную информацию, сопоставимую с крио-ЭМ-образцами, а также динамическое понимание образцов. Также продемонстрированы методы подготовки жидких образцов с использованием инструментов автозагрузчика для высокопроизводительных процедур. Основным преимуществом по сравнению с другими методами является то, что автоматизированное производство образцов позволяет пользователю быстро оценивать свои образцы для оптимальной толщины и дозировки электронов до сбора данных. Этот метод скрининга быстро определяет идеальные области для записи в реальном времени в жидкости или льду 12,14,18,19. Для целей 3D-определения структуры жидкость-ЭМ может дополнять давно устоявшиеся крио-ЭМ методы, реализованные в крио-ЭМ. Читатели, использующие обычные технологии ТЕА или крио-ЭМ, могут рассмотреть возможность использования рабочих процессов жидкостной ЭМ для обеспечения новых, динамических наблюдений за своими образцами таким образом, чтобы дополнить их текущие стратегии.
Образцы вирусов, используемые в этом протоколе, включают очищенный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), полученный в качестве подарка и культивируемый в стандартных условиях12. Также использовались неинфекционные СУБВИРУСНЫЕ сборки SARS CoV-2, полученные из сыворотки 12 пациентов сCOVID-19 и полученные из коммерческого источника. Наконец, очищенные обезьяньи ротавирус (штамм SA11) двухслойные частицы (DLP) были получены из лаборатории доктора Сары М. Макдональд Эссен в Университете Уэйк Форест и культивированы с использованием стандартных условий 6,17. Пакеты программного обеспечения, описанные здесь, находятся в свободном доступе, а ссылки были предоставлены в разделе «Таблица материалов».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Загрузка держателя образца для жидкости-EM
- Очистите микрочипы нитрида кремния (SiN), инкубируя каждый чип в 150 мл ацетона в течение 2 мин с последующей инкубацией в 150 мл метанола в течение 2 мин. Дайте стружке высохнуть в ламинарном воздушном потоке.
- Плазменная очистка высушенных стружек с помощью тлеющего разрядного прибора, работающего в стандартных условиях 30 Вт, 15 мА в течение 45 с использованием газа аргона.
- Загрузите микрочип сухим основанием в наконечник держателя образца. Добавьте ~0,2 мкл образца (0,2-1 мг/мл вирусных сборок в 50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2) к базовому чипу. После 1-2-минутного этапа инкубации поместите верхний чип на влажную основу чипа, содержащего образец.
- Зажмите узел вместе, чтобы сформировать герметично закрытый корпус, механически удерживаемый на месте тремя латунными винтами. После уплотнения узла прокачайте наконечник до 10-6 Torr с помощью сухой насосной станции с турбонаддувом. Теперь держатель готов к установке в ТЕА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный держатель не имеет возможностей охлаждения и не используется для крио-ЭМ.
2. Производство сэндвич-узлов для микрочипов
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные микрочипы SiN или диоксида кремния (SiO) могут использоваться непосредственно из поставляемых гелевых упаковок. Золотые сетки с углеродным покрытием также могут использоваться непосредственно в поставляемых поставках.
- Плазменная очистка микрочипов и углеродных решеток с помощью прибора тлеющего разряда, работающего в стандартных условиях 30 Вт, 15 мА в течение 45 с с использованием газа аргона.
- Добавить ~2 мкл образца, содержащегося в 50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2 к микрочипу со светящимся разрядом, помещенному на гелевую упаковку. Удалите лишний раствор (~50%) с помощью фильтровальной бумаги или пипетки. После 1-2-минутной стадии инкубации добавьте тлеющую разряженную углеродную сетку к мокрому микрочипу, содержащему образец.
- Зажмите узел вместе с помощью держателя образца с одним наклоном или зажимов сетки автозагрузчика при комнатной температуре, чтобы сформировать герметично закрытый корпус. Для зажимов автопогрузчика поместите сэндвич-узел на нижний C-зажим, поместите верхний зажим поверх узла и используйте стандартный зажимной инструмент для уплотнения сборки вместе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура зажима, выполняемая здесь, использует те же шаги, что и для зажима крио-ЭМ сетки, но при комнатной температуре. Зажатые образцы могут храниться в течение 2 месяцев или дольше до получения изображения при сохранении жидкости в корпусе. Проверка герметичности не используется с держателем образца комнатной температуры или автозагрузчиком. - В настоящее время образец готов к включению в ТЕА. Исследуйте образцы, помещенные в автозагрузчики, в криотехнических условиях или при комнатной температуре.
3. Визуализация образцов с помощью просвечивающего электронного микроскопа
- Жидкостно-ЭМ визуализация
- Загрузите держатель образца в ТЕА, оснащенную полевой эмиссионной пушкой (ФЭГ) и работающую на 200 кВ.
- Включите пистолет и отрегулируйте эйцентрическую высоту ступени микроскопа по отношению к образцу с помощью функции воблера, наклонив образец от -15° до +15° в колонне. Эта процедура регулирует ступень в Z-направлении, чтобы приспособиться к толщине образца. И помогает обеспечить точное увеличение во время записи изображения.
- Записывайте изображения в виде длиннокадровых фильмов с помощью пакета in situ , интегрированного с прямым детектором с интервалом пикселей 6 мкм (Video 1 и Video 2). Отдельные изображения также могут быть записаны с использованием пакета20 программного обеспечения для сбора последовательных данных, реализующего автоматизированные процедуры обработки изображений. Получайте изображения в условиях низких доз с увеличением от 28 000x до 92 000x и 40 кадров в секунду.
- Отрегулируйте время экспозиции (0,25-1 с), чтобы свести к минимуму повреждение луча образца. Используйте диапазон расфокусировки -1-4 мкм при указанном увеличении. При обнаружении толстого раствора используйте более высокие значения расфокусировки или выберите другую интересующую область.
- Убедитесь, что раствор присутствует в образцах на протяжении всего сеанса визуализации, фокусируя электронный пучок на жертвенной области, не используемой для сбора данных, до образования пузырьков (дополнительный рисунок 1).
- Крио-ЭМ визуализация
- Загрузите обрезанные электромагнитные сетки или сэндвичи с микрочипами в ТЭМ, оснащенный FEG и работающий на 300 кВ. Включите пистолет и отрегулируйте эйцентрическую высоту ступени микроскопа, используя аналогичную процедуру, описанную для жидкости-ТЭМ выше (шаг 3.1.2).
- Записывайте отдельные изображения с помощью системы анализа отдельных частиц, интегрированной в систему микроскопа, при реализации автоматизированных процедур визуализации. Записывайте изображения в условиях низкой дозы с помощью прямого электронного детектора анализа одиночных частиц, имеющего расстояние между пикселями 14 мкм при увеличении 59 000x и 40 кадров в секунду.
- Используйте диапазон расфокусировки 1-4 мкм при указанном увеличении. При обнаружении толстых слоев стекловидного льда используйте более высокие значения расфокусировки или выберите другой регион для сбора данных.
4. Анализ данных и сравнение 3D-структур
- Анализ аденоассоциированного вируса (ААВ) в жидком и стекловидном льду
- Обрабатывайте пленки для частиц AAV в жидкости и льду с помощью программы RELION-3.0821 или другого программного обеспечения для обработки изображений22. Выполните коррекцию движения с помощью MotionCor2 v1.2.3.
- После исправления извлекайте частицы с помощью инструмента автоподбора в программном пакете. Типичные размеры коробки составляют 330 пикселей для жидких образцов и 350 пикселей для образцов льда.
- Вычисление начальных реконструкций с использованием симметрии C1 с использованием процедуры начальной 3D-модели программы и/или параметров модели ab-initio в программном пакете для обработки данных. В программе используйте параметр регуляризации T = 4 и размер пикселя 1,01 Å для жидких образцов и 1,13 Å для образцов льда.
- Используйте значение маски 300 Å во время процедур уточнения. Выполняйте протоколы уточнения в программном обеспечении для обработки данных, используя симметрию I1 для получения нескольких электромагнитных карт. Ожидаемое структурное разрешение может находиться в диапазоне 4 Å или выше. Используйте эквивалентность частиц, реализуя икосаэдрическую симметрию при 16 800 для жидкости и 15 240 для льда12,14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценки разрешения основаны на критериях корреляции оболочки Фурье (FSC) золотого стандарта. - Mask EM отображает температуру ~250 Å и исследует результаты с помощью программного пакета для анализа молекулярной структуры23,24. На рисунке 3 срезы показаны с шагом ~5 нм.
- Извлеките субъединицы капсидного белка (VP1) из ЭМ-карт для сравнения. Количественно оцените динамические изменения между ЭМ-структурами на основе измерений диаметра частиц (дополнительный рисунок 2), а затем визуализируйте с помощью функции Morph map в программном обеспечении.
- Анализ субвирусных сборок SARS-CoV-2 в жидкости
- Обрабатывайте фильмы с помощью программы RELION-3.08. Коррекция дрейфа изображения и движения, вызванного лучом, с помощью MotionCor2 v1.2.3. Корректно для контрастной передаточной функции (CTF) микроскопа.
- Используйте инструмент автоподбора в программе для выбора вирусных сборок с размером поля 800 пикселей. Для вычислительной эффективности извлеченные частицы могут быть масштабированы до 256 пикселей. Получение исходной модели с использованием симметрии C1 в программе с параметром регуляризации T = 2 и размером пикселя 1,66 Å.
- Выполните 3D-уточнение в программе для получения ЭМ-карты, пример показан при ~8,25 Å по стандартным критериям FSC (рисунок 4). Визуализируйте ЭМ-карты с помощью программного обеспечения для анализа молекулярной структуры с срезами, увеличенными на 25 нм, как показано на рисунке 4.
- Анализ ротавирусных двухслойных частиц (DLP) в стекловидном льду
- Обрабатывайте фильмы для ротавирусных DLP с помощью другого программного обеспечения для обработки изображений. Используйте MotionCor2 v1.2.3 для коррекции дрейфа в изображениях. Используйте оценку Patch CTF для коррекции эффектов линз на изображениях.
- Извлекайте частицы с помощью инструмента автоподбора в программном обеспечении с размером коробки 950 пикселей. Уменьшите размер коробки по мере необходимости для вычислительных целей.
- Вычисление исходных моделей с использованием параметров ab-initio и симметрии C1. Используйте параметры уточнения, включая размер пикселя 1,47 Å и значение маски 800 Å.
- Выполняйте дополнительные процедуры уточнения, навязывая симметрию I1. Примеры результатов включают карту 10,15 Å EM в соответствии с критериями FSC золотого стандарта. Общее количество использованных частиц составило 2050, что соответствует 123 000 протомерных единиц из-за оператора икосаэдрической симметрии (рисунок 5).
- Маскируйте окончательные карты при ~750 Å и визуализируйте результаты в программном пакете для анализа молекулярной структуры. Примеры срезов через карту EM показаны на рисунке 5 с шагом ~10 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жидкость-ТЭМ, работающая на 200 кВ, использовалась для всех экспериментов по визуализации жидких ЭМ, а крио-ТЭМ, работающий на 300 кВ, использовался для сбора всех крио-ЭМ данных. Репрезентативные изображения и структуры нескольких вирусов представлены, чтобы продемонстрировать полезность методов для различных испытуемых. К ним относятся рекомбинантный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), субвирусные сборки SARS-CoV-2, полученные из сыворотки пациента, и двухслойные частицы ротавируса обезьян (DLP), штамм SA11. Во-первых, проводятся сравнения для одного и того же образца AAV (1 мг/мл), полученного в жидком буферном растворе (50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2) и в стекловидном льду (рисунок 3A-C; Дополнительный рисунок 2). Образцы жидкостной ЭМ были подготовлены с использованием микрочипов на основе SiN и специализированного держателя образца. Крио-ЭМ образцы были подготовлены с использованием стандартных дырявых углеродных решеток и остеклены с использованием современной установки подготовки образцов в жидкий этан. Полученные вирусные структуры имели сходные общие диаметры ~25 нм. Сравнение отдельных протомеров капсида VP1 также показало последовательные особенности как на жидких, так и на ледяных ЭМ-картах (рисунок 3D). Одно из различий между данными liquid-EM и cryo-EM заключалось в том, что в жидкости наблюдались дополнительные динамические структуры, которые отсутствовали в результатах крио-ЭМ (рисунок 3E)12.
Далее исследовали деактивированные образцы SARS-CoV-2 (0,25 мг/мл), приготовленные в буферном растворе (50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2) с использованием новой микрочиповой сэндвич-техники 7,14. Новая техника использует микрочипы на основе SiN вместе с золотыми сетками с углеродным покрытием. При этом препарате жидкий образец зажимали между двумя субстратами (рисунок 2А-С). Зажатые образцы зажимались держателем образца с одним наклоном или С-зажимами автозагрузчика, обычно используемыми в крио-ЭМ-подготовке образцов. Образцы могут быть немедленно просмотрены в ТЕА или храниться при температуре 4°C в течение 2 месяцев или более, в зависимости от стабильности биологического образца. Появление пузырьков в жидких образцах обеспечивает наличие жидкого слоя. Толщина жидкости может быть измерена с использованием протоколов EF-TEM, как описано12. Субвирусные сборки SARS-CoV-2 в жидкости, по-видимому, имели высокий видимый контраст по отношению к окружающей жидкости (рисунок 4A,B). Некоторые частицы демонстрировали видимые шипы на поверхности вируса, в то время как некоторые частицы не имеют шипов или слабо украшены ими (дополнительный рисунок S3). Средние классы и срезы через структуру 8,25 Å показали внутренние особенности внутри частиц, содержащих белковые субъединицы и геном вирусной РНК (рисунок 4C). Хотя некоторые частицы, по-видимому, содержали симметрию C2 (при проверке симметрии C2 эквивалентность частиц составляла 2 674), асимметричная структура не сильно отличалась по сравнению с симметричной структурой.
Наконец, анализ включал ротавирусные DLP (3 мг/мл; 50 мМ HEPES, рН 7,5; 150 мМ NaCl; 10 мМ MgCl2; 10 мМ CaCl2) в стекловидном льду путем ручной заморозки микрочипов в жидкий азот. Тот же метод сэндвича, который использовался для производства жидких ЭМ-образцов, был использован для замороженных гидратированных образцов. Бутерброды были запечатаны зажимами сетки автозагрузчика и исследованы с использованием крио-ТЭМ в стандартных условиях. Виды замороженных образцов с низким увеличением практически не показали кубического или шестиугольного загрязнения льдом, а области плотно упакованных DLP наблюдались во всех смотровых окнах (рисунок 5A, B). Изображения были собраны с использованием автоматизированных процедур, реализованных в пакете EPU. Средние классы и срезы по карте 10,15 Å показали стабильные признаки, согласующиеся с компонентами вирусного белка и двухцепочечным геномом РНК (рисунок 5D, E). Контрастная разница между DLP и ледяным фоном была не такой заметной на крио-ЭМ-изображениях по сравнению с образцами жидкости-ЭМ. Хотя причина этого интересного эффекта все еще определяется, стоит отметить разницу, поскольку жидкий ЭМ может предложить будущие преимущества для сообщества изображений.
Рисунок 1: Методы, используемые для визуализации вирусов с высоким разрешением в жидкости и во льду. В этих двух рабочих процессах выделяются различные методы пробоподготовки жидкости-ЭМ. На левой панели показано схематическое изображение держателя образца жидкости-ЭМ. Базовый микрочип SiN включает в себя массив (500 мкм х 100 мкм) интегрированных микролунок (10 мкм х 10 мкм) глубиной ~150 нм с мембраной толщиной ~30 нм. На правой панели представлена схема техники сэндвича с микрочипом, которая может быть использована как для жидкостно-ЭМ, так и для крио-ЭМ исследований. В сэндвич-сборках используется микрочип SiN в сочетании с золотой сеткой TEM с углеродным покрытием. Поперечное сечение сборки указывает на несколько окон визуализации размером от 250 мкм x 250 мкм до 50 мкм x 50 мкм с толщиной мембраны 10 нм или 5 нм соответственно. Углеродная опорная пленка имеет толщину ~5 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Технология сэндвичей с микрочипами для жидких ЭМ и крио-ЭМ. (А) В сборке сэндвича с микрочипом используется микрочип SiN в паре с золотой сеткой TEM с углеродным покрытием. Микрочип с светящимся разрядом помещается на гелевую упаковку, и образцы вируса добавляются к микрочипу. После короткого инкубационного периода излишки раствора удаляют, а бутерброд запечатывают сеткой ТЭМ. (B) Сэндвич с микрочипом герметизируется в клипсаторном устройстве при комнатной температуре и может быть загружен непосредственно в держатель TEM с одним наклоном или систему автозагрузчика TEM. (C) Чертежи поперечного сечения сэндвич-узла микрочипа подчеркивают размеры микрочипов и углеродного слоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ структур ААВ. (A) Структура AAV в растворе (разрешение 3,22 Å) с цветными радиальными плотностями, показывающими 5 нм срезов через карту. Шкала шкалы составляет 5 нм. Метрики визуализации предназначены для сбора данных с помощью прямого электронного детектора. (B) Структура AAV, изображенная во льду (разрешение 3,37 Å) с цветными радиальными плотностями представляет собой 5 нм срезов через структуру. Шкала шкалы составляет 5 нм. Метрики визуализации предназначены для сбора данных с помощью прямого электронного детектора. (C) Интересующая область показывает точки времени 5 с и 20 с вместе с преобразованиями Фурье, рассчитанными в разных точках времени. Левая сторона показывает оценки CTF, правая сторона показывает экспериментальные данные. (D) Вращательный вид субъединицы AAV VP1, извлеченной из жидких и ледяных структур. Сегменты интерпретировались с использованием кристаллической структуры (PDB-код 3KIC, A chain25). Шкала представляет собой 10 Å. (E) Динамические значения в жидких структурах, генерируемых с помощью функции карты морфов в программном обеспечении для анализа молекулярной структуры и описанных на шаге 4.1.6-4.2.3. Слева направо усредненные структуры из нескольких вирусных сборок показывают конформационные изменения с соответствующим изменением диаметра ~ 5%, измеренным с использованием данных ЭМ. Значения RMSD в вокселях указывают на изменения в соответствии с цветовой шкалой. Рисунок был изменен с12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Субвирусные сборки SARS-CoV-2, приготовленные в жидкости с использованием метода сэндвича с микрочипами. (A) Изображение субвирусных сборок SARS-CoV-2, выделенных из фракций сыворотки крови пациентов с COVID-19. Метрики визуализации предназначены для сбора данных с помощью прямого электронного детектора. Белые пузырьки в правом верхнем углу изображения являются визуальным индикатором того, что жидкость присутствует в образце. Шкала шкалы составляет 100 нм. (B) Рассчитанное преобразование Фурье изображения показывает информацию с высоким разрешением во взаимном пространстве практически без дрейфа в соответствующем изображении. Средние значения классов показывают уникальные особенности вирусных сборок, содержащихся в решении. (C) ЭМ-реконструкция субвирусных сборок показана с цветными радиальными плотностями на 5 нм срезах через карту. Шкала шкалы составляет 25 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Ротавирусные DLP, приготовленные в жидкости с использованием метода сэндвича с микрочипом. (A,B) Этапы скрининга с низким увеличением с использованием программного обеспечения для анализа. Наблюдались ограниченные кристаллы льда, а оконные мембраны были тонкими и четкими, что упрощало выбор площади для сбора данных. Шкала в (A) составляет 5 мкм, а в (B) - 500 нм. (C) Фильмы были получены с использованием прямого электронного детектора в режиме подсчета в соответствии с указанными метриками изображения. Шкала шкалы составляет 50 нм. (D) Информация о преобразовании Фурье указывает на информацию с высоким разрешением, присутствующую в данных, а средние значения классов показывают сильные особенности в икосаэдрической решетке. Средние классы показывают особенности в вирусных сборках, свободные от артефактов и согласующиеся с другими структурными наблюдениями 6,15,17. (E) ЭМ-реконструкция DLP (разрешение 10,15 Å), показанная с цветными радиальными плотностями на 10 нм срезах через карту. Шкала шкалы составляет 15 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Подтверждение наличия жидкости в эм-образцах. Изображения с низким увеличением частиц AAV в растворе, полученном в условиях низкой дозы (<10 e-Å-2 s-1), не имеют пузырьков. Используя сфокусированный пучок >100 e-Å-2 s-1, жидкие образцы показали образование пузырьков (черные стрелки). Шкала шкалы составляет 500 нм. Рисунок был изменен с12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Измерение изменений размеров AAV в жидкости. (A) Контурные следы вирусных частиц были получены в течение 20-х годов. Шкала шкалы составляет 25 нм. (В,С) Табличные и графические представления измерений диаметра частиц за 1, 5, 10 и 20 секунд. Общее изменение диаметров частиц в течение 20 с регистрации составило 0,28% при дозе ~1e-Å-2 s-1. (Д,Д) Значения сигнал-шум определяются в различный момент времени во время съемки фильма. Рисунок был изменен с12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Изображение с высоким увеличением субкомплексов SARS-CoV-2, полученных от пациента. Гетерогенные вирусные сборки показали наличие спайковых белков (красных стрелок) на поверхности некоторых частиц. Другим частицам не хватало поверхностных шипов, как обозначено. Шкала шкалы составляет 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Видео 1: Визуализация AAV в жидкости в режиме реального времени. Параллельное сравнение записи В реальном времени AAV в жидкости (слева) и цветных контурных следов частиц, диффундирующих в растворе (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Визуализация трассировки изображения в жидкости. Параллельные сравнения цветного и низкочастотного фильтрованного ролика AAV, рассеивающегося в растворе (слева) цветных контурных следов частиц, диффундирующих в растворе (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Открываются новые возможности для оптимизации текущих рабочих процессов жидкостной ЭМ за счет использования новых автоматизированных инструментов и технологий, адаптированных из области крио-ЭМ. Приложения, связанные с новой технологией сэндвичей с микрочипами, важны по сравнению с другими методами, поскольку они позволяют проводить анализ изображений с высоким разрешением в жидком или стекловидном льду. Одним из наиболее важных шагов в протоколе является производство образцов с идеальной толщиной жидкости для визуализации изысканных деталей на наноуровне. Идеальные области, представляющие интерес, определяются при меньших увеличениях путем скрининга всей выборки перед внедрением высокопроизводительных процедур для автоматизированного сбора данных. Если идентифицированные области в жидких или ледяных образцах содержат артефакты повреждения пучка или кажутся слишком толстыми, чтобы идентифицировать отдельные частицы, которые визуально четкие, они должны быть исключены из сбора данных. Ограничения в получении данных с высоким разрешением включают движение, индуцированное лучом, и броуновское движение в жидких образцах. Крио-ЭМ методы направлены на минимизацию движения биологических образцов; однако методы коррекции движения являются вычислительно надежными для смягчения этих факторов, ограничивающих разрешение. Если жидкие образцы имеют большой дрейф и термическую нестабильность, более тонкие образцы могут быть получены путем удаления избыточного раствора на этапах подготовки образцов для уменьшения толщины слоев жидкости.
Молекулярная скученность среди вирусных частиц может возникнуть, когда образцы используются в высоких концентрациях. При наличии нескольких областей с перекрывающимися частицами таким образом, чтобы ограничить надежный сбор данных, входной образец должен быть уменьшен в концентрации до подготовки образца. Наличие подходящей концентрации образца является решающим шагом в протоколе. Изображения, содержащие избыток частиц, усложнят последующие процедуры обработки изображений. Для очищенных вирусных частиц адекватный диапазон концентраций составляет 0,3-3 мг/мл, в зависимости от размеров и молекулярной массы образца. Более крупные вирусы (~ 100 нм диаметр или больше) обычно требуют более высоких концентраций, чем более мелкие вирусы (~ 25 нм диаметр или меньше) для успеха метода. Другим фактором, который следует учитывать, является уровень, на котором интересующие частицы прилипают к тлеющим разряженным микрочипам. Если образец вируса плохо прилипает к поверхности, может потребоваться большая концентрация для адекватной подготовки образцов к жидкому ЭМ или крио-ЭМ. Альтернативно, образец может быть нанесен на золотую сетку с углеродным покрытием, а микрочип служит крышкой корпуса. Если в этих процедурах не удастся набрать достаточное количество частиц для процедур сбора данных, то методы захвата аффинити могут представлять собой жизнеспособный вариант 26,27,28.
Использование определенных добавок, таких как моющие средства, глицерин, полиэтиленгликоли и высокие уровни сахарозы или глюкозы, следует свести к минимуму или избегать для визуализации жидкостной ЭМ. Эти реагенты могут вводить артефакты в изображения, а также приводить к чрезмерному пузырьку, продуктам гидролиза и образованию свободных радикалов из-за повреждения пучка. Такие эффекты приводят к приглушенным особенностям в изображенных частицах и в конечном итоге ограничивают структурное разрешение. Одним из способов удаления этих реагентов, если они используются в биохимических препаратах, является обширный диализ в буферный раствор, в котором отсутствуют добавки. Эти реагенты необходимо будет тестировать и использовать в каждом конкретном случае. Кроме того, после того, как достаточное количество образцов было получено с использованием метода сэндвича с микрочипом, они могут быть сразу же визуализированы или сохранены при 4 ° C до тех пор, пока они не будут готовы к исследованию. Время хранения зависит от стабильности образца.
В целом, использование жидкого ЭМ в сочетании с крио-ЭМ позволяет исследователям исследовать биологические системы с помощью дополнительных инструментов визуализации. Недавно разработанная техника сэндвича с микрочипами дает последовательные образцы для визуализации ТЭМ в жидкости или льду. Этот метод также предоставляет исследователям простые средства для подготовки и просмотра образцов без необходимости использования коммерческого держателя образцов или системы витрификации. В сочетании с автоматизированными протоколами визуализации большие объемы данных порядка тысяч изображений за сеанс могут быть получены на образец. Новаторская работа Парсонса и его коллег 29,30,31,32,33 заложила основу для производства биологических образцов в жидких корпусах. Представленные здесь протоколы описывают, как современные инструменты теперь могут обеспечить захватывающие средства для визуализации биологических макромолекул новыми глазами. Будущие приложения, которые, как ожидается, станут результатом освоения этих методов в сочетании с высокопроизводительными вычислениями, представляют собой механистические идеи в реальном времени для понимания отношений структура-функция в 3D. Область жидких ЭМ может способствовать активизации исследований новых вирусов, которые представляют угрозу для здоровья человека, возможно, даже способствуя мерам по обеспечению готовности к пандемии. Таким образом, использование этих протоколов должно позволить ученым и инженерам лучше изучать динамические процессы в атомных деталях, в большом разнообразии образцов, охватывающих науки о жизни, медицину и исследования материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Автор, Мадлен Дрессел-Дьюкс, является сотрудником Protochips, Inc., а Майкл Спилман является сотрудником DirectElectron.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность доктору Луку Х. Ванденберге (Гарвардская медицинская школа, отделение офтальмологии) за предоставление очищенного AAV-3. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения и Национальным институтом рака (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 до D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
