Summary
Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.
Abstract
El interés en la microscopía de electrones líquidos (EM líquido) se ha disparado en los últimos años, ya que los científicos ahora pueden observar procesos en tiempo real a nanoescala. Es extremadamente deseable combinar la información crio-EM de alta resolución con observaciones dinámicas, ya que muchos eventos ocurren en escalas de tiempo rápidas, en el rango de milisegundos o más rápido. Un mejor conocimiento de las estructuras flexibles también puede ayudar en el diseño de nuevos reactivos para combatir patógenos emergentes, como el SARS-CoV-2. Más importante aún, ver materiales biológicos en un ambiente fluido proporciona una visión única de su rendimiento en el cuerpo humano. Aquí se presentan métodos recientemente desarrollados para investigar las propiedades a nanoescala de los ensamblajes de virus en hielo líquido y vítreo. Para lograr este objetivo, se utilizaron muestras bien definidas como sistemas modelo. Se presentan comparaciones lado a lado de los métodos de preparación de muestras e información estructural representativa. Las características subnanométricas se muestran para estructuras resueltas en el rango de ~ 3.5-Å-10 Å. Otros resultados recientes que respaldan este marco complementario incluyen información dinámica de candidatos a vacunas y terapias basadas en anticuerpos fotografiadas en líquido. En general, estas aplicaciones correlativas mejoran nuestra capacidad de visualizar la dinámica molecular, proporcionando un contexto único para su uso en la salud y la enfermedad humanas.
Introduction
La investigación biomédica mejora nuestra comprensión de la salud humana y la enfermedad a través del desarrollo de nuevas tecnologías. Las imágenes de alta resolución están transformando nuestra visión del nanomundo, permitiéndonos estudiar células y moléculas con exquisito detalle 1,2,3,4,5. La información estática de componentes dinámicos como polímeros blandos, ensamblajes de proteínas o virus humanos revela solo una instantánea limitada de su compleja narrativa. Para comprender mejor cómo operan las entidades moleculares, su estructura y función deben investigarse conjuntamente.
Los avances recientes en la producción de materiales como el grafeno atómicamente delgado o los microchips basados en silicio brindan nuevas oportunidades para el análisis estructura-función en tiempo real utilizando microscopios electrónicos de transmisión (TEM). Estos materiales pueden crear cámaras herméticamente selladas para imágenes EM en vivo 6,7,8,9,10,11. El nuevo campo de EM líquido, la temperatura ambiente correlacionada con la crio-EM, proporciona vistas sin precedentes de materiales duros o blandos en solución, lo que permite a los científicos estudiar simultáneamente la estructura y la dinámica de su muestra. Las aplicaciones de EM líquida incluyen registros en tiempo real de nanopartículas terapéuticas que interactúan con células madre cancerosas, así como cambios en las complejidades moleculares de los patógenos virales12,13,14.
Así como los avances metodológicos estimularon la revolución de la resolución en el campo de la crioelectroEM, se necesitan nuevas técnicas y métodos para extender el uso de la electroEM líquida como una herramienta de alto rendimiento para la comunidad científica. El objetivo general de los métodos presentados aquí es simplificar los protocolos de preparación de muestras EM líquidas. La razón detrás de las técnicas desarrolladas es emplear nuevos diseños de microchips y dispositivos de carga automática, adecuados para la recolección de datos líquidos y crioelectromagnéticos (Figura 1)7,14,15,16,17. Los conjuntos se sellan mecánicamente utilizando clips de rejilla estándar para instrumentos automatizados, como el Krios, que puede acomodar múltiples muestras por sesión o un TEM F200C (Figura 2). Esta metodología amplía el uso de imágenes de alta resolución más allá de las aplicaciones crio-EM estándar, lo que demuestra propósitos más amplios para el análisis de materiales en tiempo real.
En el artículo de video actual, se presentan protocolos para preparar ensamblajes de virus en líquido con y sin portamuestras disponibles comercialmente. Utilizando el portamuestras especializado para EM líquido, las muestras líquidas delgadas pueden proporcionar información estructural comparable a las muestras crio-EM, así como información dinámica de las muestras. También se demuestran métodos para preparar muestras líquidas utilizando herramientas de carga automática para rutinas de alto rendimiento. La principal ventaja sobre otras técnicas es que la producción automatizada de muestras permite al usuario evaluar rápidamente sus muestras para el grosor óptimo y la dosificación de electrones antes de la recopilación de datos. Esta técnica de cribado identifica rápidamente las zonas ideales para grabaciones en tiempo real en líquido o hielo12,14,18,19. A efectos de la determinación de la estructura 3D, la EM líquida puede complementar los métodos crioelectromagnéticos establecidos desde hace mucho tiempo implementados en la crioelectroemia. Los lectores que emplean tecnologías TEM o crio-EM convencionales pueden considerar el uso de flujos de trabajo de EM líquida para proporcionar observaciones nuevas y dinámicas de sus muestras de una manera que complemente sus estrategias actuales.
Las muestras de virus utilizadas en este protocolo incluyen el virus adenoasociado purificado subtipo 3 (AAV) obtenido como regalo y cultivado en condiciones estándar12. También se utilizaron ensamblajes subvirales no infecciosos del SARS CoV-2 derivados del suero de pacientes con COVID-1912 y obtenidos de una fuente comercial. Finalmente, se obtuvieron partículas de doble capa (DLP) purificadas del rotavirus simio (cepa SA11) del laboratorio de la Dra. Sarah M. McDonald Esstman de la Universidad de Wake Forest y se cultivaron utilizando condiciones estándar 6,17. Los paquetes de software descritos aquí están disponibles gratuitamente y los enlaces se han proporcionado en la sección Tabla de materiales.
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Protocol
1. Carga del portamuestras para líquido-EM
- Limpie los microchips de nitruro de silicio (SiN) incubando cada chip en 150 ml de acetona durante 2 minutos, seguido de la incubación en 150 ml de metanol durante 2 minutos. Deje que las virutas se sequen en el flujo de aire laminar.
- Limpie con plasma las virutas secas utilizando un instrumento de descarga incandescente que funcione en condiciones estándar de 30 W, 15 mA durante 45 s utilizando gas argón.
- Cargue un microchip de base seca en la punta del portamuestras. Agregue ~0.2 μL de muestra (0.2-1 mg/mL de ensamblajes de virus en 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) al chip base. Después de un paso de incubación de 1-2 minutos, coloque el chip superior en el chip base húmedo que contiene la muestra.
- Sujete el conjunto para formar un recinto herméticamente sellado, mantenido en su lugar mecánicamente por tres tornillos de latón. Al sellar el conjunto, bombee la punta a 10-6 Torr utilizando una estación de bombeo en seco turbobombeada. El soporte ahora está listo para ser insertado en el TEM.
NOTA: El soporte de selección no tiene capacidades de refrigeración y no se utiliza para crio-EM.
2. Producción de conjuntos de sándwiches de microchip
NOTA: Se pueden usar diferentes microchips de SiN o dióxido de silicio (SiO) directamente desde los paquetes de gel enviados. Las rejillas de oro recubiertas de carbono también se pueden usar directamente como se suministran.
- El plasma limpia los microchips y las rejillas de carbono utilizando un instrumento de descarga incandescente que funciona en condiciones estándar de 30 W, 15 mA durante 45 s utilizando gas argón.
- Añadir ~2 μL de muestra contenida en 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM de CaCl2 a un microchip descargado con brillo colocado en un paquete de gel. Retire el exceso de solución (~50%) con un papel de filtro o una pipeta. Después de un paso de incubación de 1-2 minutos, agregue la rejilla de carbono descargada de brillo al microchip húmedo que contiene la muestra.
- Sujete el conjunto con un portamuestras de inclinación simple o clips de rejilla de cargador automático a temperatura ambiente para formar una carcasa herméticamente sellada. Para las abrazaderas del cargador automático, coloque el conjunto sándwich en el clip C inferior, coloque el clip superior en la parte superior del conjunto y utilice la herramienta de sujeción estándar para sellar el conjunto.
NOTA: El procedimiento de sujeción realizado aquí utiliza los mismos pasos que para la sujeción de rejilla crio-EM, pero a temperatura ambiente. Las muestras sujetas se pueden almacenar durante 2 meses o más antes de la obtención de imágenes mientras se mantiene el líquido en el recinto. No se utiliza ninguna comprobación de fugas con un portamuestras a temperatura ambiente o el cargador automático. - La muestra ahora está lista para ser insertada en el TEM. Examine las muestras colocadas en cargadores automáticos en condiciones criogénicas o a temperatura ambiente.
3. Obtención de imágenes de muestras con un microscopio electrónico de transmisión
- Imágenes EM líquidas
- Cargue el portamuestras en el TEM equipado con una pistola de emisión de campo (FEG) y funcionando a 200 kV.
- Encienda la pistola y ajuste la altura eucéntrica de la platina del microscopio con respecto a la muestra utilizando la función wobbler, inclinando la muestra de -15° a +15° en la columna. Este procedimiento ajusta la etapa en la dirección Z para acomodar el grosor de la muestra. Y ayuda a garantizar un aumento preciso durante la grabación de imágenes.
- Grabe imágenes como vídeos de fotograma largo utilizando el paquete in situ integrado con un detector directo con un espaciado de píxeles de 6 μm (Video 1 y Video 2). Las imágenes individuales también se pueden grabar utilizando el paquete de software de recopilación de datos en serie20, implementando rutinas de imágenes automatizadas. Adquiera imágenes en condiciones de baja dosis con aumentos que van desde 28.000x-92.000x y 40 fotogramas por segundo.
- Ajuste los tiempos de exposición (0,25-1 s) para minimizar el daño del haz a la muestra. Utilice un rango de desenfoque de -1-4 μm con el aumento especificado. Si se encuentra una solución espesa, utilice valores de desenfoque más altos o seleccione una región de interés diferente.
- Asegúrese de que la solución esté presente en las muestras durante toda la sesión de imágenes enfocando el haz de electrones en un área de sacrificio que no se utiliza para la recopilación de datos, hasta que se formen burbujas (Figura complementaria 1).
- Imágenes crio-EM
- Cargue las rejillas EM recortadas o los sándwiches de microchip en el TEM equipado con un FEG y funcionando a 300 kV. Encienda la pistola y ajuste la altura eucéntrica de la platina del microscopio, utilizando un procedimiento similar descrito anteriormente para el TEM líquido (paso 3.1.2).
- Grabe imágenes individuales utilizando el sistema de análisis de partículas individuales integrado en el sistema de microscopio mientras implementa rutinas de imágenes automatizadas. Grabe imágenes en condiciones de baja dosis utilizando el detector de electrones directo de análisis de partículas individuales con un espaciado de píxeles de 14 μm con un aumento de 59,000x y 40 cuadros por segundo.
- Utilice un rango de desenfoque de 1-4 μm con el aumento especificado. Si se encuentran capas gruesas de hielo vítreo, use valores de desenfoque más altos o seleccione una región diferente para la recopilación de datos.
4. Análisis de datos y comparaciones de estructuras 3D
- Análisis de virus adenoasociados (AAV) en hielo líquido y vítreo
- Procese películas para partículas AAV en líquido y hielo utilizando el programa RELION-3.0821 u otro software de procesamiento de imágenes22. Realice la corrección de movimiento con MotionCor2 v1.2.3.
- Una vez corregido, extraiga las partículas utilizando la herramienta de selección automática en el paquete de software del programa. Los tamaños típicos de caja son 330 píxeles para muestras líquidas y 350 píxeles para muestras de hielo.
- Calcule las reconstrucciones iniciales utilizando la simetría C1 utilizando la rutina de modelo inicial 3D del programa y/o las opciones de modelo ab-initio en el paquete de software de procesamiento de datos. En el programa, utilice un parámetro de regularización de T = 4 y un tamaño de píxel de 1,01 Å para muestras líquidas y 1,13 Å para muestras de hielo.
- Utilice un valor de máscara de 300 Å durante los procedimientos de refinamiento. Realice protocolos de refinamiento en el software de procesamiento de datos utilizando la simetría I1 para obtener múltiples mapas EM. La resolución estructural esperada puede estar en el rango de 4 Å o mejor. Utilice la equivalencia de partículas implementando simetría icosaédrica a 16.800 para líquido y 15.240 para hielo12,14.
NOTA: Las estimaciones de resolución se basan en los criterios de correlación de conchas de Fourier (FSC) estándar de oro. - Enmascare mapas EM a ~250 Å y examine los resultados utilizando un paquete de software de análisis de estructura molecular23,24. En la Figura 3, los sectores se muestran en incrementos de ~5 nm.
- Extraiga las subunidades de proteína de la cápside (VP1) de los mapas EM para comparar. Cuantifique los cambios dinámicos entre las estructuras EM basándose en las mediciones del diámetro de partícula (Figura complementaria 2) y luego visualice utilizando la función de mapa de transformación en el software.
- Análisis de ensamblajes subvirales de SARS-CoV-2 en líquido
- Procese películas utilizando el programa RELION-3.08. Corrija la desviación de la imagen y el movimiento inducido por el haz con MotionCor2 v1.2.3. Corregir la función de transferencia de contraste (CTF) del microscopio.
- Utilice la herramienta de selección automática en el programa para seleccionar ensamblajes virales con un tamaño de caja de 800 píxeles. Para una eficiencia computacional, las partículas extraídas se pueden reescalar a 256 píxeles. Obtenga un modelo inicial utilizando simetría C1 en el programa con un parámetro de regularización de T = 2 y un tamaño de píxel de 1,66 Å.
- Realice el refinamiento 3D en el programa para obtener un mapa EM, un ejemplo se muestra en ~ 8.25 Å de acuerdo con los criterios estándar FSC (Figura 4). Visualice mapas EM utilizando el software de análisis de estructura molecular con cortes incrementados a 25 nm como se muestra en la Figura 4.
- Análisis de partículas de doble capa (DLP) de rotavirus en hielo vítreo
- Procese películas para DLP de rotavirus utilizando otro software de procesamiento de imágenes. Utilice MotionCor2 v1.2.3 para corregir la desviación en las imágenes. Utilice la estimación de parche CTF para corregir los efectos de la lente en las imágenes.
- Extraiga partículas utilizando la herramienta de selección automática en el software con un tamaño de caja de 950 píxeles. Reduzca el tamaño de la caja según sea necesario para fines informáticos.
- Calcule modelos iniciales utilizando opciones ab-initio y simetría C1. Utilice parámetros de refinamiento que incluyan un tamaño de píxel de 1,47 Å y un valor de máscara de 800 Å.
- Realice rutinas de refinamiento adicionales mientras impone la simetría I1. Los resultados de ejemplo incluyen un mapa EM de 10.15 Å, de acuerdo con los criterios FSC estándar de oro. Las partículas totales utilizadas fueron 2050, lo que equivale a 123.000 unidades de protómero debido al operador de simetría icosaédrica (Figura 5).
- Enmascare los mapas finales a ~750 Å y visualice los resultados en el paquete de software de análisis de estructura molecular. Los segmentos de ejemplo a través del mapa EM se muestran en la Figura 5 en incrementos de ~ 10 nm.
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Representative Results
Se utilizó un TEM líquido que operaba a 200 kV para todos los experimentos de imágenes de EM líquida y un TEM criogénico que funcionaba a 300 kV para toda la recopilación de datos de crioEM. Se presentan imágenes y estructuras representativas de múltiples virus para demostrar la utilidad de los métodos en varios sujetos de prueba. Estos incluyen el virus adenoasociado recombinante subtipo 3 (AAV), los conjuntos subvirales del SARS-CoV-2 derivados del suero del paciente y las partículas de doble capa (DLP) del rotavirus simio, cepa SA11. En primer lugar, se demuestran comparaciones para la misma muestra de AAV (1 mg/ml) fotografiada en solución tampón líquida (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) y en hielo vítreo (Figura 3A-C; Figura complementaria 2). Las muestras de EM líquido se prepararon utilizando microchips a base de SiN y el portamuestras especializado. Las muestras crio-EM se prepararon utilizando rejillas de carbono perforadas estándar y se vitrificaron utilizando una unidad de preparación de muestras de última generación en etano líquido. Las estructuras virales resultantes tenían diámetros generales similares de ~ 25 nm. Una comparación de los protómeros individuales de la cápside VP1 también mostró características consistentes en los mapas EM líquidos y de hielo (Figura 3D). Una diferencia entre los datos de EM líquida y crioEM fue que se observaron estructuras dinámicas adicionales en líquido que no estaban presentes en los resultados de crioEM (Figura 3E)12.
A continuación, se examinaron muestras desactivadas de SARS-CoV-2 (0,25 mg/ml) preparadas en solución tampón (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) utilizando una nueva técnica de sándwich de microchip 7,14. La nueva técnica emplea microchips a base de SiN junto con rejillas de oro recubiertas de carbono. En esta preparación, la muestra líquida se intercaló entre los dos sustratos (Figura 2A-C). Las muestras intercaladas se sujetaron con un portamuestras de inclinación simple o clips C de cargador automático comúnmente utilizados en la preparación de muestras crio-EM. Las muestras pueden verse inmediatamente en el TEM o almacenarse a 4 ° C durante 2 meses o más, dependiendo de la estabilidad de la muestra biológica. La aparición de burbujeo en las muestras líquidas asegura la presencia de la capa líquida. El espesor del líquido se puede medir utilizando los protocolos EF-TEM como se describe12. Los ensamblajes subvirales del SARS-CoV-2 en líquido parecían tener un alto contraste visible con respecto al líquido circundante (Figura 4A, B). Algunas partículas muestran picos visibles en la superficie del virus, mientras que algunas partículas carecen de picos o están escasamente decoradas con ellos (Figura suplementaria S 3). Los promedios de clase y los cortes a través de la estructura de 8.25 Å mostraron características internas dentro de las partículas que comprenden subunidades de proteínas y el genoma del ARN viral (Figura 4C). Aunque algunas partículas parecían contener simetría C2 (al probar la simetría C2, la equivalencia de partículas fue 2.674), la estructura asimétrica no difería mucho en comparación con la estructura simétrica.
Finalmente, el análisis incluyó DLP de rotavirus (3 mg/mL; 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) en hielo vítreo mediante preparación de sándwich de microchip de congelación manual en nitrógeno líquido. La misma técnica de sándwich utilizada para producir muestras líquidas de EM se empleó para especímenes hidratados congelados. Los sándwiches se sellaron con clips de rejilla de cargador automático y se examinaron utilizando el crio-TEM en condiciones estándar. Las vistas de bajo aumento de los especímenes congelados mostraron poca o ninguna contaminación cúbica o hexagonal del hielo y se observaron regiones de DLP densamente empaquetadas a lo largo de las ventanas de visualización (Figura 5A, B). Las imágenes se recolectaron utilizando rutinas automatizadas implementadas en el paquete EPU. Los promedios de clase y los cortes a través del mapa de 10.15 Å revelaron características estables consistentes con los componentes de las proteínas virales y el genoma de ARN bicatenario (Figura 5D, E). La diferencia de contraste entre los DLP y el fondo de hielo no fue tan visiblemente fuerte en las imágenes crio-EM en comparación con las muestras de EM líquida. Si bien la causa de este interesante efecto aún se está determinando, vale la pena señalar la diferencia, ya que la EM líquida puede ofrecer ventajas futuras para la comunidad de imágenes.
Figura 1: Técnicas utilizadas para obtener imágenes de alta resolución de virus en líquido y hielo. Los dos flujos de trabajo destacan diferentes métodos de preparación de muestras de EM líquido. El panel izquierdo muestra una representación esquemática de un portamuestras EM líquido. El microchip base de SiN incluye una matriz (500 μm x 100 μm) de micropocillos integrados (10 μm x 10 μm) que tienen ~150 nm de profundidad con una membrana de ~30 nm de espesor. El panel derecho presenta un esquema de la técnica del sándwich de microchip, que se puede utilizar tanto para la investigación de EM líquida como para la crioelectroEM. Los ensamblajes sándwich utilizan un microchip de SiN emparejado con una rejilla TEM de oro recubierta de carbono. La sección transversal del conjunto indica múltiples ventanas de imágenes que van desde 250 μm x 250 μm a 50 μm x 50 μm de tamaño con espesores de membrana de 10 nm o 5 nm, respectivamente. La película de soporte de carbono tiene ~ 5 nm de espesor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La técnica del sándwich de microchip para EM líquido y crio-EM. (A) El conjunto de sándwich de microchip utiliza un microchip de SiN emparejado con una rejilla TEM de oro recubierta de carbono. Se coloca un microchip descargado con brillo en un paquete de gel y se agregan muestras de virus al microchip. Después de un breve período de incubación, se elimina el exceso de solución y el sándwich se sella con la rejilla TEM. (B) El sándwich de microchip está sellado en un dispositivo de recorte a temperatura ambiente y se puede cargar directamente en un soporte TEM de una sola inclinación o en un sistema de cargador automático TEM. (C) Los dibujos de sección transversal del conjunto sándwich de microchip resaltan las dimensiones de los microchips y la capa de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de estructuras líquidas-EM y crio-EM de AAV. (A) Estructura de AAV en solución (resolución de 3.22 Å) con densidades radiales coloreadas que muestran cortes de 5 nm a través del mapa. La barra de escala es de 5 nm. Las métricas de imágenes son para la adquisición de datos utilizando el detector directo de electrones. (B) La estructura de AAV fotografiada en hielo (resolución de 3.37 Å) con densidades radiales coloreadas representa cortes de 5 nm a través de la estructura. La barra de escala es de 5 nm. Las métricas de imágenes son para la adquisición de datos utilizando el detector directo de electrones. (C) Una región de interés muestra puntos de tiempo de 5 s y 20 s junto con transformadas de Fourier calculadas en diferentes puntos de tiempo. El lado izquierdo muestra las estimaciones de CTF, el lado derecho muestra los datos experimentales. (D) Vistas rotacionales de la subunidad AAV VP1 extraída de las estructuras líquidas y de hielo. Los segmentos se interpretaron utilizando la estructura cristalina (código PDB 3KIC, cadena A25). La barra de escala es de 10 Å. (E) Valores dinámicos en las estructuras líquidas generadas utilizando la función de mapa de morfología en el software de análisis de estructura molecular y descritas en el paso 4.1.6-4.2.3. De izquierda a derecha, las estructuras promediadas de múltiples ensamblajes de virus muestran cambios conformacionales con un cambio de diámetro correspondiente de ~ 5%, medido utilizando datos EM. Los valores RMSD en vóxeles indican cambios según la escala de color. La cifra ha sido modificada de12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ensamblajes subvirales del SARS-CoV-2 preparados en líquido utilizando la técnica del sándwich de microchip. (A) Imagen de ensamblajes subvirales de SARS-CoV-2 aislados de fracciones séricas de pacientes con COVID-19. Las métricas de imágenes son para la adquisición de datos utilizando el detector directo de electrones. Las burbujas blancas en la esquina superior derecha de la imagen son un indicador visual de que hay líquido presente en la muestra. La barra de escala es de 100 nm. (B) La transformada de Fourier calculada de la imagen muestra información de alta resolución en el espacio recíproco con poca o ninguna deriva en la imagen correspondiente. Los promedios de clase muestran características únicas en los ensamblajes virales contenidos en la solución. (C) Se muestra una reconstrucción EM de los ensamblajes subvirales con densidades radiales coloreadas a cortes de 5 nm a través del mapa. La barra de escala es de 25 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: DLP de rotavirus preparados en líquido utilizando la técnica del sándwich de microchip. (A,B) Pasos de cribado de bajo aumento utilizando el software de análisis. Se observaron cristales de hielo limitados y las membranas de las ventanas eran delgadas y claras, simplificando la selección del área para la adquisición de datos. La barra de escala en (A) es de 5 μm y en (B) es de 500 nm. (C) Las películas se adquirieron utilizando el detector de electrones directo en modo de conteo de acuerdo con las métricas de imagen indicadas. La barra de escala es de 50 nm. (D) La información de la transformada de Fourier indica información de alta resolución presente en los datos y los promedios de clase muestran características fuertes en la red icosaédrica. Los promedios de clase muestran características en los conjuntos de virus libres de artefactos y consistentes con otras observaciones estructurales 6,15,17. (E) Una reconstrucción EM de los DLP (resolución de 10.15 Å) mostrada con densidades radiales coloreadas a cortes de 10 nm a través del mapa. La barra de escala es de 15 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Confirmación de la presencia de líquido en muestras EM. Las imágenes de bajo aumento de partículas de AAV en solución adquiridas en condiciones de baja dosis (<10 e- Å-2 s-1) carecen de burbujas. Usando un haz enfocado de >100 e-Å-2 s-1, las muestras líquidas mostraron formación de burbujas (flechas negras). La barra de escala es de 500 nm. La cifra ha sido modificada de12. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Medición de cambios en las dimensiones de AAV en líquido. (A) Las trazas de contorno de partículas de virus se adquirieron durante un período de tiempo de 20 s. La barra de escala es de 25 nm. (B,C) Tablas y representaciones gráficas de las mediciones del diámetro de las partículas a 1, 5, 10 y 20 segundos. El cambio general en los diámetros de las partículas durante el registro de 20 s fue del 0,28% a una dosis de ~1e- Å-2 s-1. (D,E) Valores de señal a ruido determinados en un punto de tiempo variable durante la adquisición de películas. La cifra ha sido modificada de12. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Imagen de gran aumento de subcomplejos de SARS-CoV-2 derivados de pacientes. Los ensamblajes virales heterogéneos mostraron la presencia de proteínas de espiga (flechas rojas) en la superficie de algunas partículas. Otras partículas carecían de picos superficiales como se etiquetaron. La barra de escala es de 100 nm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video 1: Imágenes en tiempo real de AAV en líquido. Comparación lado a lado de un registro en tiempo real de AAV en líquido (izquierda) y trazas de contorno coloreadas de las partículas que se difunden en solución (derecha). Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Visualización del trazado de imágenes en líquido. Comparaciones lado a lado de una película filtrada coloreada y de paso bajo de AAV que se difunde en solución (izquierda) trazas de contorno coloreadas de las partículas que se difunden en solución (derecha). Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Se presentan nuevas oportunidades para agilizar los flujos de trabajo actuales de EM líquida mediante el uso de nuevas herramientas automatizadas y tecnologías adaptadas del campo crioelectromagnético. Las aplicaciones que involucran la nueva técnica de sándwich de microchip son significativas con respecto a otros métodos porque permiten el análisis de imágenes de alta resolución en hielo líquido o vítreo. Uno de los pasos más críticos en el protocolo es producir especímenes con el espesor de líquido ideal para visualizar detalles exquisitos a nivel de nanoescala. Las regiones ideales de interés se identifican con aumentos más bajos mediante la selección de toda la muestra antes de implementar rutinas de alto rendimiento para la recopilación automatizada de datos. Si las regiones identificadas en muestras líquidas o de hielo contienen artefactos dañados por el haz o parecen demasiado gruesas para identificar partículas individuales que son visualmente nítidas, deben excluirse de la recopilación de datos. Las limitaciones en la adquisición de datos de alta resolución incluyen el movimiento inducido por el haz y el movimiento browniano en las muestras líquidas. Los métodos crio-EM tienen como objetivo minimizar el movimiento en muestras biológicas; Sin embargo, los métodos de corrección de movimiento son computacionalmente robustos para mitigar estos factores limitantes de resolución. Si las muestras líquidas presentan deriva de largo alcance e inestabilidad térmica, se pueden preparar muestras más delgadas eliminando el exceso de solución durante los pasos de preparación de la muestra para disminuir el espesor de las capas líquidas.
El apiñamiento molecular entre las partículas de virus puede producirse cuando las muestras se utilizan en altas concentraciones. Si hay varias regiones con partículas superpuestas de una manera que limita la recopilación de datos robustos, la muestra de entrada debe reducirse en concentración antes de la preparación de la muestra. Tener una concentración de muestra adecuada es un paso crucial en el protocolo. Las imágenes que contienen un exceso de partículas complicarán los procedimientos de procesamiento de imágenes posteriores. Para partículas de virus purificadas, un rango de concentración adecuado está entre 0,3-3 mg / ml, dependiendo de las dimensiones y el peso molecular de la muestra. Los virus más grandes (~ 100 nm de diámetro o más) generalmente requieren concentraciones más altas que los virus más pequeños (~ 25 nm de diámetro o menos) para el éxito de la técnica. Otro factor a considerar es el nivel en el que las partículas de interés se adhieren a los microchips descargados por el resplandor. Si la muestra de virus no se adhiere bien a la superficie, puede ser necesaria una mayor concentración para preparar adecuadamente las muestras para EM líquido o crio-EM. Alternativamente, la muestra se puede aplicar a la rejilla de oro recubierta de carbono con el microchip que sirve como tapa de la carcasa. Si estos procedimientos no logran reclutar suficientes partículas para los procedimientos de recolección de datos, los métodos de captura de afinidad pueden presentar una opción viable26,27,28.
El uso de ciertos aditivos como detergentes, glicerol, polietilenglicoles y altos niveles de sacarosa o glucosa debe minimizarse o evitarse para imágenes de EM líquido. Estos reactivos pueden introducir artefactos en las imágenes, así como conducir a burbujeo excesivo, productos de hidrólisis y formación de radicales libres debido al daño del haz. Tales efectos conducen a características silenciadas en las partículas fotografiadas y, en última instancia, limitan la resolución estructural. Una forma de eliminar estos reactivos si se usan en preparaciones bioquímicas es a través de diálisis extensa en una solución tampón que carece de los aditivos. Estos reactivos deberán probarse y usarse caso por caso. Además, una vez que se han producido suficientes muestras utilizando la técnica del sándwich de microchip, se pueden obtener imágenes de inmediato o almacenarlas a 4 ° C hasta que estén listas para examinar. Los tiempos de almacenamiento dependen de la estabilidad de la muestra.
En general, el uso de EM líquido en combinación con crio-EM permite a los investigadores examinar sistemas biológicos con herramientas de imagen complementarias. La técnica de sándwich de microchip recientemente desarrollada produce muestras consistentes para imágenes TEM en líquido o hielo. La técnica también proporciona un medio simple para que los investigadores preparen y vean muestras sin la necesidad de un portamuestras comercial o un sistema de vitrificación. En combinación con protocolos de imágenes automatizados, se pueden adquirir grandes cantidades de datos del orden de miles de imágenes por sesión por muestra. El trabajo pionero de Parsons y colegas 29,30,31,32,33 sentó las bases para producir especímenes biológicos en recintos líquidos. Los protocolos presentados aquí describen cómo las herramientas de vanguardia ahora pueden proporcionar un medio emocionante para visualizar macromoléculas biológicas a través de nuevos ojos. Las aplicaciones futuras que se espera que resulten del dominio de estas técnicas, cuando se combinan con la computación de alto rendimiento, son información mecanicista en tiempo real para comprender las relaciones estructura-función en 3D. El campo de EM líquido puede servir para elevar la investigación sobre nuevos virus que representan una amenaza para la salud humana, tal vez incluso contribuyendo a las medidas de preparación para pandemias. En resumen, el uso de estos protocolos debería permitir a los científicos e ingenieros estudiar mejor los procesos dinámicos con detalle atómico, a través de una gran variedad de muestras que abarcan ciencias de la vida, medicina e investigación de materiales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. La autora, Madeline J. Dressel-Dukes, es empleada de Protochips, Inc. y Michael Spilman es empleado de DirectElectron.
Acknowledgments
Los autores reconocen al Dr. Luk H. Vandenberghe (Escuela de Medicina de Harvard, Departamento de Oftalmología) por proporcionar AAV-3 purificado. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Nacional del Cáncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
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