Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Främja högupplöst avbildning av virusaggregat i vätska och is

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63856
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,3, 1,4, 1,4, 5, 6, 1, 7, 8, 2, 9, 1,5,6
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University
* These authors contributed equally

Summary

Här beskrivs protokoll för att förbereda virusaggregat som är lämpliga för vätske-EM- och kryo-EM-analys på nanoskala med hjälp av transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

Intresset för vätskeelektronmikroskopi (liquid-EM) har skjutit i höjden de senaste åren när forskare nu kan observera realtidsprocesser på nanonivå. Det är extremt önskvärt att para ihop högupplöst kryo-EM-information med dynamiska observationer eftersom många händelser inträffar vid snabba tidsskalor - i millisekundområdet eller snabbare. Förbättrad kunskap om flexibla strukturer kan också hjälpa till vid utformningen av nya reagenser för att bekämpa nya patogener, såsom SARS-CoV-2. Ännu viktigare är att titta på biologiska material i en flytande miljö ger en unik glimt av deras prestanda i människokroppen. Här presenteras nyutvecklade metoder för att undersöka egenskaperna hos virussammansättningar i nanoskala i flytande och glasartad is. För att uppnå detta mål användes väldefinierade prover som modellsystem. Sida vid sida jämförelser av provberedningsmetoder och representativ strukturell information presenteras. Subnanometerfunktioner visas för strukturer upplösta i intervallet ~ 3,5-Å-10 Å. Andra nya resultat som stöder detta kompletterande ramverk inkluderar dynamiska insikter om vaccinkandidater och antikroppsbaserade terapier avbildade i vätska. Sammantaget främjar dessa korrelativa applikationer vår förmåga att visualisera molekylär dynamik, vilket ger ett unikt sammanhang för deras användning i människors hälsa och sjukdom.

Introduction

Biomedicinsk forskning förbättrar vår förståelse av människors hälsa och sjukdomar genom utveckling av ny teknik. Högupplöst avbildning förändrar vår syn på nanovärlden - vilket gör att vi kan studera celler och molekyler i utsökt detalj 1,2,3,4,5. Statisk information om dynamiska komponenter som mjuka polymerer, proteinsammansättningar eller mänskliga virus avslöjar endast en begränsad ögonblicksbild av deras komplexa berättelse. För att bättre förstå hur molekylära enheter fungerar måste deras struktur och funktion undersökas gemensamt.

De senaste framstegen inom produktionen av material som atomärt tunn grafen eller kiselbaserade mikrochips ger nya möjligheter till strukturfunktionsanalys i realtid med hjälp av transmissionselektronmikroskop (TEM). Dessa material kan skapa hermetiskt tillslutna kammare för levande EM-avbildning 6,7,8,9,10,11. Det nya fältet vätske-EM, rumstemperaturen korrelerar med kryo-EM, ger oöverträffade vyer av hårda eller mjuka material i lösning, vilket gör det möjligt för forskare att samtidigt studera strukturen och dynamiken i deras prov. Liquid-EM-applikationer inkluderar realtidsinspelningar av terapeutiska nanopartiklar som interagerar med cancerstamceller samt förändringar i molekylära komplikationer av virala patogener12,13,14.

Precis som metodologiska framsteg stimulerade upplösningsrevolutionen inom kryo-EM-fältet, behövs nya tekniker och metoder för att utöka användningen av vätske-EM som ett verktyg med hög genomströmning för det vetenskapliga samfundet. Det övergripande målet med de metoder som presenteras här är att effektivisera vätske-EM-provberedningsprotokoll. Motiveringen bakom de utvecklade teknikerna är att använda nya mikrochipdesigner och autoloader-enheter, lämpliga för både vätske- och kryo-EM-datainsamling (figur 1) 7,14,15,16,17. Enheterna förseglas mekaniskt med hjälp av standardnätklämmor för automatiserade instrument, såsom Krios, som rymmer flera prover per session eller en F200C TEM (figur 2). Denna metod utökar användningen av högupplöst avbildning utöver vanliga kryo-EM-applikationer som visar bredare syften för materialanalys i realtid.

I den aktuella videoartikeln presenteras protokoll för beredning av virusaggregat i vätska med och utan kommersiellt tillgängliga provhållare. Med hjälp av den specialiserade provhållaren för vätske-EM kan tunna vätskeprover ge strukturell information jämförbar med kryo-EM-prover, liksom dynamiska insikter från proverna. Dessutom demonstreras metoder för att förbereda flytande prover med hjälp av autoloaderverktyg för rutiner med hög genomströmning. Den stora fördelen jämfört med andra tekniker är att automatiserad provproduktion gör det möjligt för användaren att snabbt bedöma sina prover för optimal tjocklek och elektrondosering före datainsamling. Denna screeningteknik identifierar snabbt idealiska områden för realtidsinspelningar i vätska eller is12,14,18,19. För bestämning av 3D-struktur kan vätske-EM komplettera de sedan länge etablerade kryo-EM-metoder som implementerats i kryo-EM. Läsare som använder konventionell TEM- eller kryo-EM-teknik kan överväga att använda vätske-EM-arbetsflöden för att ge nya, dynamiska observationer av sina prover på ett sätt som kompletterar deras nuvarande strategier.

Virusprover som används i detta protokoll inkluderar renat adenoassocierat virus subtyp 3 (AAV) erhållet som gåva och odlat under standardförhållanden12. Dessutom användes icke-infektiösa SARS CoV-2 subvirala sammansättningar härledda från serumet hos COVID-19-patienter12 och erhållna från en kommersiell källa. Slutligen erhölls renade simian rotavirus (SA11-stam) dubbelskiktade partiklar (DLP) från laboratoriet för Dr. Sarah M. McDonald Esstman vid Wake Forest University och odlades med standardförhållanden 6,17. Programvarupaket som beskrivs här är fritt tillgängliga och länkarna har tillhandahållits i avsnittet Materialförteckning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lastning av provhållaren för vätske-EM

  1. Rengör kiselnitrid (SiN) mikrochips genom att inkubera varje chip i 150 ml aceton i 2 minuter följt av inkubation i 150 ml metanol i 2 min. Låt flisen torka i laminärt luftflöde.
  2. Plasma rengör de torkade flisarna med hjälp av ett glödurladdningsinstrument som arbetar under standardförhållanden på 30 W, 15 mA i 45 s med argongas.
  3. Ladda ett torrt basmikrochip i spetsen på provhållaren. Tillsätt ~0,2 μL prov (0,2-1 mg/ml virusaggregat i 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) till baschipet. Efter ett inkubationssteg på 1–2 minuter placerar du det övre chipet på det våta baschip som innehåller provet.
  4. Kläm ihop enheten till ett hermetiskt tillslutet hölje, som hålls på plats mekaniskt av tre mässingsskruvar. Vid tätning av enheten, pumpa spetsen till 10-6 Torr med en turbopumpad torrpumpstation. Hållaren är nu redo att sättas in i TEM.
    OBS: Urvalshållaren har inga kylfunktioner och används inte för kryo-EM.

2. Produktion av mikrochip sandwichaggregat

OBS: Olika SiN- eller kiseldioxid (SiO) mikrochips kan användas direkt från de medföljande gelförpackningarna. Kolbelagda guldgaller kan också användas direkt som levererade.

  1. Plasma rengör mikrochips och kolgaller med hjälp av ett glödurladdningsinstrument som arbetar under standardförhållanden på 30 W, 15 mA i 45 s med argongas.
  2. Tillsätt ~2 μL prov i 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 till ett glödurladdat mikrochip placerat på en gelförpackning. Ta bort överflödig lösning (~ 50%) med ett filterpapper eller en pipett. Efter ett inkubationssteg på 1–2 minuter skall det glödande kolgallret tillsättas till det våta mikrochip som innehåller provet.
  3. Kläm ihop enheten med hjälp av en provhållare med en lutning eller autoloader-rutnätklämmor vid rumstemperatur för att bilda ett hermetiskt tillslutet hölje. För autolastarklämmorna, placera sandwichenheten på den nedre C-klämman, placera den övre klämman ovanpå enheten och använd standardklämman för att täta enheten tillsammans.
    OBS: Klämproceduren som utförs här använder samma steg som för kryo-EM-nätklämning, men vid rumstemperatur. Fastspända prover kan förvaras i 2 månader eller längre före avbildning samtidigt som vätska hålls i höljet. Ingen läckagekontroll används med en rumstemperaturprovhållare eller autoladdaren.
  4. Provet är nu klart att föras in i TEM. Undersök prover som placerats i autoladdare under kryoförhållanden eller vid rumstemperatur.

3. Bildprover med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop

  1. Flytande EM-avbildning
    1. Ladda provhållaren i den transoperabilitetsanordning som är utrustad med en fältemissionspistol (FEG) och som arbetar med 200 kV.
    2. Slå på pistolen och justera mikroskopstegets eucentriska höjd i förhållande till provet genom att använda wobblerfunktionen och luta provet från -15 ° till +15 ° i kolonnen. Denna procedur justerar steget i Z-riktningen för att rymma provtjockleken. Och hjälper till att säkerställa en korrekt förstoring under bildinspelning.
    3. Spela in bilder som långramade filmer med hjälp av in situ-paketet integrerat med en direktdetektor med ett pixelavstånd på 6 μm (Video 1 och Video 2). Enskilda bilder kan också spelas in med hjälp av programvarupaketet för seriell datainsamling20, som implementerar automatiserade bildrutiner. Skaffa bilder under lågdosförhållanden vid förstoringar från 28 000 x till 92 000x och 40 bilder per sekund.
    4. Justera exponeringstiderna (0,25-1 s) för att minimera strålskador på provet. Använd ett oskärpområde på -1-4 μm vid den angivna förstoringen. Om en tjock lösning påträffas, använd högre oskärpvärden eller välj en annan region av intresse.
    5. Se till att lösningen finns i proverna under hela avbildningssessionen genom att fokusera elektronstrålen på ett offerområde som inte används för datainsamling tills bubblor bildas (kompletterande figur 1).
  2. Cryo-EM-avbildning
    1. Ladda de klippta EM-gallren eller mikrochipsmörgåsarna i TEM utrustad med en FEG och arbetar vid 300 kV. Slå på pistolen och justera mikroskopstegets eucentriska höjd med hjälp av en liknande procedur som beskrivs för vätske-TEM ovan (steg 3.1.2).
    2. Spela in enskilda bilder med hjälp av det enda partikelanalyssystemet integrerat i mikroskopsystemet samtidigt som du implementerar automatiserade bildrutiner. Spela in bilder under lågdosförhållanden med hjälp av den direkta elektrondetektorn för enpartikelanalys med ett pixelavstånd på 14 μm vid en förstoring på 59 000x och 40 bilder per sekund.
    3. Använd ett oskärpområde på 1-4 μm vid den angivna förstoringen. Om tjocka lager av glasaktig is påträffas använder du högre oskärpevärden eller väljer ett annat område för datainsamling.

4. Dataanalys och 3 D-strukturjämförelser

  1. Analys av adenoassocierat virus (AAV) i flytande och glasaktig is
    1. Bearbeta filmer för AAV-partiklar i vätska och is med RELION-3.08 program21 eller annan bildbehandlingsprogramvara22. Utför rörelsekorrigering med MotionCor2 v1.2.3.
    2. När de har korrigerats, extrahera partiklar med hjälp av verktyget för automatisk plockning i programprogramvarupaketet. Typiska lådstorlekar är 330 pixlar för flytande prover och 350 pixlar för isprover.
    3. Beräkna initiala rekonstruktioner med hjälp av C1-symmetri med hjälp av programmets 3D-initiala modellrutin och/eller ab-initio-modellalternativen i programvarupaketet för databehandling. I programmet använder du en regulariseringsparameter på T = 4 och en pixelstorlek på 1,01 Å för flytande prover och 1,13 Å för isprover.
    4. Använd ett maskvärde på 300 Å under hela förfiningsprocedurerna. Utför förfiningsprotokoll i databehandlingsprogramvaran med I1-symmetri för att få flera EM-kartor. Förväntad strukturell upplösning kan ligga i intervallet 4 Å eller bättre. Använd partikelekvivalens som implementerar ikosaedrisk symmetri vid 16 800 för vätska och 15 240 för is12,14.
      OBS: Resolutionsuppskattningar baseras på Fourier shell correlation (FSC) -kriterier (guldstandard).
    5. Maskera EM-kartor vid ~ 250 Å och undersök resultat med hjälp av ett mjukvarupaket för molekylär strukturanalys23,24. I bild 3 visas segment i steg om ~5 nm.
    6. Extrahera kapsidprotein (VP1) underenheter från EM-kartorna för jämförelse. Kvantifiera dynamiska förändringar mellan EM-strukturer baserat på partikeldiametermätningarna (kompletterande figur 2) och visualisera sedan med hjälp av morfkartfunktionen i programvaran.
  2. Analys av SARS-CoV-2 subvirala enheter i vätska
    1. Bearbeta filmer med RELION-3.08-programmet. Korrigera för bildavdrift och strålinducerad rörelse med MotionCor2 v1.2.3. Korrekt för mikroskopets kontrastöverföringsfunktion (CTF).
    2. Använd verktyget för automatisk plockning i programmet för att välja virala sammansättningar med en lådstorlek på 800 pixlar. För beräkningseffektivitet kan extraherade partiklar skalas om till 256 pixlar. Skaffa en initial modell med C1-symmetri i programmet med en regulariseringsparameter på T = 2 och 1,66 Å pixelstorlek.
    3. Utför 3D-förfining i programmet för att få en EM-karta, ett exempel visas på ~ 8,25 Å enligt standard FSC-kriterier (figur 4). Visualisera EM-kartor med hjälp av programvaran för molekylär strukturanalys med segment som ökas vid 25 nm som visas i figur 4.
  3. Analys av rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLP) i glasaktig is
    1. Bearbeta filmer för rotavirus-DLP:er med andra bildbehandlingsprogram. Använd MotionCor2 v1.2.3 för att korrigera för avdrift i bilderna. Använd Patch CTF-uppskattning för att korrigera för linseffekter på bilderna.
    2. Extrahera partiklar med hjälp av verktyget för automatisk plockning i programvaran med en lådstorlek på 950 pixlar. Nedprova lådans storlek efter behov för beräkningsändamål.
    3. Beräkna initiala modeller med hjälp av ab-initio-alternativ och C1-symmetri . Använd förfiningsparametrar, inklusive en pixelstorlek på 1,47 Å och ett maskvärde på 800 Å.
    4. Utför ytterligare förfiningsrutiner samtidigt som du inför I1-symmetri. Exempel på resultat inkluderar en 10.15 Å EM-karta, enligt FSC-kriterierna för guldstandard. Totalt antal partiklar som användes var 2050, vilket motsvarar 123 000 protomerenheter på grund av den ikosaedriska symmetrioperatorn (figur 5).
    5. Maskera slutliga kartor vid ~ 750 Å och visualisera resultat i mjukvarupaketet för molekylär strukturanalys. Exempelsegment genom EM-kartan visas i bild 5 i steg om ~10 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vätske-TEM som arbetar vid 200 kV användes för alla vätske-EM-avbildningsexperiment och en kryo-TEM som arbetar vid 300 kV användes för all kryo-EM-datainsamling. Representativa bilder och strukturer av flera virus presenteras för att demonstrera nyttan av metoderna hos olika försökspersoner. Dessa inkluderar rekombinant adenoassocierad virussubtyp 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirala enheter härledda från patientserumet och simian rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLP), SA11-stam. Först demonstreras jämförelser för samma AAV-prov (1 mg/ml) som avbildas i flytande buffertlösning (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) och i glasaktig is (figur 3A-C; Kompletterande figur 2). De flytande EM-proverna framställdes med användning av SiN-baserade mikrochips och den specialiserade provhållaren. Kryo-EM-proverna framställdes med användning av vanliga håliga kolnät och förglasades med användning av en toppmodern provberedningsenhet till flytande etan. De resulterande virusstrukturerna hade liknande totala diametrar på ~ 25 nm. En jämförelse av enskilda VP1-kapsidprotomerer visade också konsekventa egenskaper i både vätske- och is-EM-kartor (figur 3D). En skillnad mellan vätske-EM- och kryo-EM-data var att ytterligare dynamiska strukturer observerades i vätska som inte fanns i kryo-EM-resultaten (figur 3E)12.

Därefter undersöktes inaktiverade SARS-CoV-2-prover (0,25 mg/ml) beredda i buffertlösning (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) med en ny mikrochip-sandwichteknik 7,14. Den nya tekniken använder SiN-baserade mikrochips tillsammans med kolbelagda guldgaller. I denna beredning var vätskeprovet inklämt mellan de två substraten (figur 2A-C). Inklämda exemplar klämdes fast med en enda lutningsprovhållare eller autoloader C-clips som vanligtvis används vid kryo-EM-provberedning. Proverna kan ses omedelbart i TEM eller förvaras vid 4 °C i 2 månader eller längre, beroende på det biologiska provets stabilitet. Utseendet av bubblande i vätskeproverna säkerställer närvaron av vätskeskiktet. Vätsketjocklek kan mätas med hjälp av EF-TEM-protokoll enligt beskrivningen12. SARS-CoV-2 subvirala enheter i vätska tycktes ha hög synlig kontrast med avseende på den omgivande vätskan (figur 4A, B). Vissa partiklar visade synliga spikar på virusytan medan vissa partiklar saknar spikar eller är glest dekorerade med dem (kompletterande figur S3). Klassmedelvärden och skivor genom 8,25 Å-strukturen visade interna egenskaper i partiklarna som består av proteinunderenheter och det virala RNA-genomet (figur 4C). Även om vissa partiklar tycktes innehålla C2-symmetri (vid testning av C2-symmetri var partikelekvivalensen 2 674), skilde sig den asymmetriska strukturen inte mycket i jämförelse med symmetrisk struktur.

Slutligen inkluderade analysen rotavirus-DLPs (3 mg/ml; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) i glasaktig is genom manuellt blixtfrysning av mikrochipsmörgåspreparat till flytande kväve. Samma sandwichteknik som användes för att producera vätske-EM-prover användes för frysta hydratiserade prover. Smörgåsar förseglades med autoloader-gallerklämmor och undersöktes med kryo-TEM under standardförhållanden. Vyer med låg förstoring av de frusna proverna visade liten eller ingen kubisk eller sexkantig isförorening och regioner med tätt packade DLP observerades i hela visningsfönstren (figur 5A,B). Bilder samlades in med hjälp av automatiserade rutiner som implementerades i EPU-paketet. Klassmedelvärden och skivor genom 10.15 Å-kartan avslöjade stabila egenskaper som överensstämmer med virala proteinkomponenter och det dubbelsträngade RNA-genomet (figur 5D,E). Kontrastskillnaden mellan DLP: erna och isbakgrunden var inte lika synligt stark i kryo-EM-bilderna jämfört med vätske-EM-proverna. Medan orsaken till denna intressanta effekt fortfarande bestäms är det värt att notera skillnaden eftersom vätske-EM kan erbjuda framtida fördelar för bildsamhället.

Figure 1
Figur 1: Tekniker som används för högupplöst avbildning av virus i vätska och i is. De två arbetsflödena belyser olika metoder för beredning av vätske-EM-prov. Den vänstra panelen visar en schematisk representation av en vätske-EM-provhållare. SiN-basmikrochipet innehåller en matris (500 μm x 100 μm) integrerade mikrobrunnar (10 μm x 10 μm) som är ~ 150 nm djupgående med ett ~ 30 nm tjockt membran. Den högra panelen presenterar ett schema över mikrochip-sandwichtekniken, som kan användas för både vätske-EM och kryo-EM-forskning. Sandwichaggregaten använder ett SiN-mikrochip parat med ett kolbelagt TEM-guldnät. Tvärsnittet av enheten indikerar flera bildfönster som sträcker sig från 250 μm x 250 μm till 50 μm x 50 μm i storlek med membrantjocklekar på 10 nm respektive 5 nm. Kolstödfilmen är ~ 5 nm tjock. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Microchip-sandwichtekniken för liquid-EM och cryo-EM. (A) Microchip-sandwichenheten använder ett SiN-mikrochip parat med ett kolbelagt TEM-guld-rutnät. Ett glödande urladdat mikrochip placeras på ett gelpaket och virusprover läggs till mikrochipet. Efter en kort inkubationsperiod avlägsnas överskottslösningen och smörgåsen förseglas med TEM-gallret. (B) Mikrochipsmörgåsen förseglas i en klippanordning vid rumstemperatur och kan laddas direkt i en TEM-hållare med en lutning eller ett TEM-autoloader-system. (C) Tvärsnittsritningar av mikrochipsmörgåsenheten markerar måtten på mikrochipsen och kolskiktet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Jämförelse av vätske-EM- och kryo-EM-strukturer av AAV. (A) Struktur av AAV i lösning (3,22 Å upplösning) med färgade radiella densiteter som visar 5 nm skivor genom kartan. Skalfältet är 5 nm. Bildmätvärden är för datainsamling med hjälp av den direkta elektrondetektorn. (B) Strukturen hos AAV avbildad i is (3,37 Å upplösning) med färgade radiella densiteter representerar 5 nm skivor genom strukturen. Skalfältet är 5 nm. Bildmätvärden är för datainsamling med hjälp av den direkta elektrondetektorn. (C) Ett intresseområde visar 5 s och 20 s tidpunkter tillsammans med Fouriertransformationer beräknade vid olika tidpunkter. Vänster sida visar CTF-uppskattningar, höger sida visar experimentella data. (D) Rotationsvyer av AAV VP1-underenheten extraherad från vätske- och isstrukturerna. Segmenten tolkades med hjälp av kristallstrukturen (PDB-kod 3KIC, A-kedja25). Skalstrecket är 10 Å. (E) Dynamiska värden i vätskestrukturerna som genereras med hjälp av morfkartfunktionen i programvaran för molekylstrukturanalys och som beskrivs i steg 4.1.6-4.2.3. Från vänster till höger visar genomsnittliga strukturer från flera virussammansättningar konformationsförändringar med motsvarande ~ 5% diameterförändring, mätt med EM-data. RMSD-värden i voxlar indikerar förändringar enligt färgskalan. Siffran har modifierats från12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: SARS-CoV-2 subvirala enheter framställda i vätska med hjälp av mikrochipsmörgåstekniken. (A) Bild av SARS-CoV-2 subvirala enheter isolerade från serumfraktioner från COVID-19-patienter. Bildmätvärden är för datainsamling med hjälp av den direkta elektrondetektorn. Vita bubblor i bildens övre högra hörn är en visuell indikator på att vätska finns i provet. Skalfältet är 100 nm. (B) Beräknad Fouriertransform av bilden visar högupplöst information i ömsesidigt utrymme med liten eller ingen drift i motsvarande bild. Klassmedelvärden visar unika egenskaper i de virala sammansättningarna som ingår i lösningen. (C) En EM-rekonstruktion av de subvirala enheterna visas med färgade radiella densiteter vid 5 nm skivor genom kartan. Skalfältet är 25 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Rotavirus DLPs framställda i vätska med hjälp av mikrochipsmörgåstekniken. (A,B) Screeningsteg med låg förstoring med hjälp av analysprogramvaran. Begränsade iskristaller observerades och fönstermembranen var tunna och klara, vilket förenklade valet av område för datainsamling. Skalstrecket i (A) är 5 μm och i (B) är 500 nm. (C) Filmer förvärvades med hjälp av den direkta elektrondetektorn i räkningsläge enligt de angivna bildmätvärdena. Skalfältet är 50 nm. (D) Fouriertransforminformation indikerar högupplöst information som finns i data och klassmedelvärden visar starka egenskaper i det ikosaedriska gitteret. Klassmedelvärden visar funktioner i virussammansättningarna som är fria från artefakter och överensstämmer med andra strukturella observationer 6,15,17. (E) En EM-rekonstruktion av DLP:erna (10,15 Å upplösning) som visas med färgade radiella densiteter vid 10 nm skivor genom kartan. Skalfältet är 15 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Bekräfta närvaron av vätska i EM-prover. Lågförstoringsbilder av AAV-partiklar i lösning som erhållits under lågdosförhållanden (<10 e- Å-2 s-1) saknar bubblor. Med hjälp av en fokuserad stråle på >100 e- Å-2 s-1 visade vätskeprover bubbelbildning (svarta pilar). Skalfältet är 500 nm. Siffran har ändrats från12. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Mätning av förändringar i AAV-dimensioner i vätska. (A) Konturspår av viruspartiklar förvärvades under en tidsram på 20 s. Skalfältet är 25 nm. (B,C) Tabell och grafiska representationer av partikeldiametermätningar vid 1, 5, 10 och 20 sekunder. Den totala förändringen i partikeldiametrar under 20 s-registreringen var 0,28% vid en dos av ~ 1e- Å-2 s-1. (D,E) Signal-till-brus-värden bestäms vid varierande tidpunkt under filmförvärv. Siffran har ändrats från12. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Bild med hög förstoring av patient-härledda SARS-CoV-2-delkomplex. Heterogena virala sammansättningar visade närvaron av spikproteiner (röda pilar) på ytan av vissa partiklar. Andra partiklar saknades i ytspikar som märkta. Skalfältet är 100 nm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Video 1: Realtidsavbildning av AAV i vätska. Jämförelse sida vid sida av en realtidsregistrering av AAV i vätska (vänster) och färgade konturspår av partiklarna som diffunderar i lösning (höger). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: Visualisering av bildspårning i vätska. Jämförelser sida vid sida av en färgad och lågpassfiltrerad film av AAV som diffunderar i lösning (vänster) färgade konturspår av partiklarna som diffunderar i lösning (höger). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nya möjligheter presenteras för att effektivisera nuvarande vätske-EM-arbetsflöden genom att använda nya automatiserade verktyg och tekniker anpassade från kryo-EM-fältet. Tillämpningar som involverar den nya mikrochip-sandwichtekniken är betydelsefulla i förhållande till andra metoder eftersom de möjliggör högupplöst bildanalys i flytande eller glasartad is. Ett av de mest kritiska stegen i protokollet är att producera prover med den ideala vätsketjockleken för att visualisera utsökta detaljer på nanonivå. Ideala regioner av intresse identifieras vid lägre förstoringar genom att screena hela provet innan man implementerar rutiner med hög genomströmning för automatiserad datainsamling. Om de identifierade områdena i vätske- eller isprover innehåller strålskadade artefakter eller verkar för tjocka för att identifiera enskilda partiklar som är visuellt skarpa, bör de uteslutas från datainsamling. Begränsningar i högupplöst datainsamling inkluderar strålinducerad rörelse och brownsk rörelse i vätskeproverna. Cryo-EM-metoder syftar till att minimera rörelse i biologiska prover; Rörelsekorrigeringsmetoder är dock beräkningsmässigt robusta för att mildra dessa upplösningsbegränsande faktorer. Om vätskeproverna uppvisar långdistansdrift och termisk instabilitet kan tunnare prover beredas genom att avlägsna överskottslösning under provberedningsstegen för att minska vätskeskiktens tjocklek.

Molekylär trängsel bland viruspartiklar kan uppstå när prover används i höga koncentrationer. Om det finns flera regioner med överlappande partiklar på ett sätt som begränsar robust datainsamling, bör det ingående provet minskas i koncentration före provberedning. Att ha en lämplig provkoncentration är ett viktigt steg i protokollet. Bilder som innehåller ett överskott av partiklar kommer att komplicera nedströms bildbehandlingsprocedurer. För renade viruspartiklar är ett adekvat koncentrationsintervall mellan 0,3 och 3 mg/ml, beroende på provets mått och molekylvikt. Större virus (~ 100 nm diameter eller högre) kräver vanligtvis högre koncentrationer än mindre virus (~ 25 nm diameter eller mindre) för att tekniken ska lyckas. En annan faktor att tänka på är den nivå där partiklarna av intresse fäster vid de glödutladdade mikrochipsen. Om virusprovet inte fäster väl vid ytan kan en större koncentration behövas för att på ett adekvat sätt förbereda prover för vätske-EM eller kryo-EM. Alternativt kan provet istället appliceras på det kolbelagda guldgallret med mikrochipet som lock på höljet. Om dessa förfaranden inte lyckas rekrytera tillräckligt med partiklar för datainsamlingsförfaranden kan affinitetsinsamlingsmetoder utgöra ett genomförbart alternativ26,27,28.

Användningen av vissa tillsatser såsom tvättmedel, glycerol, polyetylenglykoler och höga nivåer av sackaros eller glukos bör minimeras eller undvikas för flytande EM-avbildning. Dessa reagenser kan införa artefakter i bilderna samt leda till överdriven bubbling, hydrolysprodukter, och fria radikaler bildning på grund av strålskador. Sådana effekter leder till dämpade funktioner i de avbildade partiklarna och begränsar i slutändan strukturell upplösning. Ett sätt att avlägsna dessa reagenser om de används i biokemiska preparat är genom omfattande dialys till en buffertlösning som saknar tillsatser. Dessa reagenser måste testas och användas från fall till fall. När tillräckligt många exemplar har framställts med hjälp av sandwichtekniken med mikrochip kan de dessutom avbildas direkt eller förvaras vid 4 °C tills de är klara att undersökas. Lagringstiderna beror på provets stabilitet.

Sammantaget tillåter användning av flytande EM i kombination med kryo-EM forskare att undersöka biologiska system med kompletterande bildverktyg. Den nyutvecklade mikrochipsmörgåstekniken ger konsekventa prover för TEM-avbildning i vätska eller is. Tekniken ger också ett enkelt sätt för forskare att förbereda och visa prover utan behov av en kommersiell provhållare eller förglasningssystem. I kombination med automatiserade bildprotokoll kan stora mängder data i storleksordningen tusentals bilder per session förvärvas per prov. Parsons och kollegorna 29,30,31,32,33s pionjärarbete lade grunden för att producera biologiska prover i flytande höljen. Protokollen som presenteras här beskriver hur toppmoderna verktyg nu kan ge ett spännande sätt att visualisera biologiska makromolekyler genom nya ögon. Framtida tillämpningar som förväntas bli resultatet av att behärska dessa tekniker, när de paras ihop med högpresterande databehandling, är mekanistiska insikter i realtid för att förstå struktur-funktionsrelationer i 3D. Vätske-EM-fältet kan tjäna till att höja forskningen om nya virus som utgör ett hot mot människors hälsa, kanske till och med bidrar till pandemiberedskapsåtgärder. Sammanfattningsvis bör användningen av dessa protokoll göra det möjligt för forskare och ingenjörer att bättre studera dynamiska processer vid atomdetaljer, över ett stort antal prover som omfattar biovetenskap, medicin och materialforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Författaren, Madeline J. Dressel-Dukes, är anställd hos Protochips, Inc.

Acknowledgments

Författarna erkänner Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Institutionen för oftalmologi) för att tillhandahålla renad AAV-3. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health och National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 till D.F.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Tags

Biokemi utgåva 185 transmissionselektronmikroskopi TEM vätske-EM kryo-EM adenoassocierat virus SARS-CoV-2 rotavirus dubbelskiktade partiklar DLP strukturbiologi
Främja högupplöst avbildning av virusaggregat i vätska och is
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiCecco, L. A., Berry, S., Jonaid,… More

DiCecco, L. A., Berry, S., Jonaid, G. M., Solares, M. J., Kaylor, L., Gray, J. L., Bator, C., Dearnaley, W. J., Spilman, M., Dressel-Dukes, M. J., Grandfield, K., McDonald Esstman, S. M., Kelly, D. F. Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice. J. Vis. Exp. (185), e63856, doi:10.3791/63856 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter