Summary
Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Sıvı-elektron mikroskobuna (sıvı-EM) olan ilgi, bilim adamlarının artık nano ölçekte gerçek zamanlı süreçleri gözlemleyebildikleri için son yıllarda fırladı. Yüksek çözünürlüklü kriyo-EM bilgisinin dinamik gözlemlerle eşleştirilmesi son derece arzu edilir, çünkü birçok olay hızlı zaman ölçeklerinde meydana gelir - milisaniye aralığında veya daha hızlı. Esnek yapılar hakkında gelişmiş bilgi, SARS-CoV-2 gibi ortaya çıkan patojenlerle mücadele etmek için yeni reaktiflerin tasarımına da yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, biyolojik materyalleri akışkan bir ortamda görüntülemek, insan vücudundaki performanslarına benzersiz bir bakış sağlar. Burada, sıvı ve vitreus buzundaki virüs gruplarının nano ölçekli özelliklerini araştırmak için yeni geliştirilen yöntemler sunulmaktadır. Bu amaca ulaşmak için, model sistemler olarak iyi tanımlanmış örnekler kullanılmıştır. Numune hazırlama yöntemlerinin yan yana karşılaştırmaları ve temsili yapısal bilgiler sunulmaktadır. Alt nanometre özellikleri, ~ 3.5-Å-10 şaralığında çözülen yapılar için gösterilmiştir. Bu tamamlayıcı çerçeveyi destekleyen diğer yeni sonuçlar, aşı adaylarının dinamik içgörülerini ve sıvı içinde görüntülenen antikor bazlı tedavileri içermektedir. Genel olarak, bu korelasyon uygulamaları, moleküler dinamikleri görselleştirme yeteneğimizi geliştirerek, insan sağlığı ve hastalıklarında kullanımları için benzersiz bir bağlam sağlar.
Introduction
Biyomedikal araştırmalar, yeni teknolojilerin geliştirilmesi yoluyla insan sağlığı ve hastalıkları hakkındaki anlayışımızı geliştirir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, nanodünyaya bakışımızı dönüştürüyor - hücreleri ve moleküllerizarif ayrıntılarla 1,2,3,4,5 olarak incelememize izin veriyor. Yumuşak polimerler, protein düzenekleri veya insan virüsleri gibi dinamik bileşenlerin statik bilgileri, karmaşık anlatılarının yalnızca sınırlı bir görüntüsünü ortaya koymaktadır. Moleküler varlıkların nasıl çalıştığını daha iyi anlamak için, yapıları ve işlevleri ortaklaşa araştırılmalıdır.
Atomik olarak ince grafen veya silikon bazlı mikroçipler gibi malzemelerin üretimindeki son gelişmeler, iletim elektron mikroskoplarını (TEM'ler) kullanarak gerçek zamanlı yapı-fonksiyon analizi için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu malzemeler, canlı EM görüntüleme 6,7,8,9,10,11 için hermetik olarak kapatılmış odalar oluşturabilir. Oda sıcaklığının kriyo-EM ile ilişkili olduğu yeni sıvı-EM alanı, çözeltideki sert veya yumuşak malzemelerin benzeri görülmemiş görüntülerini sunarak, bilim adamlarının numunelerinin yapısını ve dinamiklerini aynı anda incelemelerine olanak tanır. Sıvı-EM uygulamaları, kanser kök hücreleri ile etkileşime giren terapötik nanopartiküllerin gerçek zamanlı kayıtlarını ve viral patojenlerin moleküler karmaşıklıklarındaki değişiklikleri içerir12,13,14.
Metodolojik ilerlemelerin kriyo-EM alanındaki çözünürlük devrimini teşvik etmesi gibi, sıvı-EM'nin bilimsel topluluk için yüksek verimli bir araç olarak kullanımını genişletmek için yeni tekniklere ve yöntemlere ihtiyaç vardır. Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, sıvı-EM numune hazırlama protokollerini kolaylaştırmaktır. Geliştirilen tekniklerin arkasındaki mantık, hem sıvı hem de kriyo-EM veri toplama için uygun yeni mikroçip tasarımları ve otomatik yükleyici cihazlar kullanmaktır (Şekil 1)7,14,15,16,17. Montajlar, seans başına birden fazla numuneyi veya bir F200C TEM'i barındırabilen Krios gibi otomatik cihazlar için standart ızgara klipsleri kullanılarak mekanik olarak kapatılmıştır (Şekil 2). Bu metodoloji, gerçek zamanlı malzeme analizi için daha geniş amaçlar gösteren standart kriyo-EM uygulamalarının ötesinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımını genişletir.
Mevcut video makalesinde, ticari olarak temin edilebilen numune tutucuları olan ve olmayan sıvı içinde virüs montajlarının hazırlanması için protokoller sunulmaktadır. Sıvı-EM için özel numune tutucuyu kullanan ince sıvı numuneler, kriyo-EM numuneleriyle karşılaştırılabilir yapısal bilgilerin yanı sıra numunelerin dinamik içgörülerini de sağlayabilir. Ayrıca, yüksek verimli rutinler için otomatik yükleyici araçlarını kullanarak sıvı numuneleri hazırlama yöntemleri de gösterilmiştir. Diğer tekniklere göre en büyük avantajı, otomatik numune üretiminin, kullanıcının veri toplamadan önce numunelerini optimum kalınlık ve elektron dozu için hızlı bir şekilde değerlendirmesine izin vermesidir. Bu tarama tekniği, sıvı veya buz12,14,18,19'daki gerçek zamanlı kayıtlar için ideal alanları hızlı bir şekilde tanımlar. 3D yapı tayini amacıyla, sıvı-EM, kriyo-EM'de uygulanan köklü kriyo-EM yöntemlerini tamamlayabilir. Geleneksel TEM veya kriyo-EM teknolojilerini kullanan okuyucular, numunelerinin mevcut stratejilerini tamamlayacak şekilde yeni, dinamik gözlemlerini sağlamak için sıvı-EM iş akışlarını kullanmayı düşünebilirler.
Bu protokolde kullanılan virüs örnekleri, hediye olarak elde edilen ve standart koşullar altında kültürlenen saflaştırılmış adeno ilişkili virüs alt tip 3'ü (AAV) içerir12. Ayrıca, COVID-19 hastalarının serumundan türetilen ve ticari bir kaynaktan elde edilen bulaşıcı olmayan SARSCoV-2 alt viral derlemeleri de kullanılmıştır. Son olarak, saflaştırılmış simian rotavirüs (SA11 suşu) çift katmanlı parçacıklar (DLP'ler) Wake Forest Üniversitesi'ndeki Dr. Sarah M. McDonald Esstman'ın laboratuvarından elde edildi ve standart koşullar 6,17 kullanılarak kültürlendi. Burada açıklanan yazılım paketleri ücretsiz olarak mevcuttur ve bağlantılar Malzeme Tablosu bölümünde verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sıvı-EM için numune tutucunun yüklenmesi
- Silikon nitrür (SiN) mikroçiplerini, her bir çipi 2 dakika boyunca 150 mL asetonda inkübe ederek ve ardından 2 dakika boyunca 150 mL metanol içinde inkübasyonla temizleyin. Talaşların laminer hava akımında kurumasını bekleyin.
- Plazma, Argon gazı kullanarak 30 W, 45 s için 15 mA standart koşullar altında çalışan bir kızdırma deşarj cihazı kullanarak kurutulmuş cipsleri temizler.
- Numune tutucunun ucuna kuru tabanlı bir mikroçip yükleyin. Baz çipe ~0,2 μL numune (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl 2'de0,2-1 mg/mL virüs tertibatları) ekleyin. 1-2 dakikalık bir inkübasyon adımını takiben, üst çipi numuneyi içeren ıslak taban yongasına yerleştirin.
- Üç pirinç vida ile mekanik olarak yerinde tutulan, hava geçirmez şekilde kapatılmış bir muhafaza oluşturmak için tertibatı birbirine kenetleyin. Montajı kapattıktan sonra, turbo pompalı kuru pompa istasyonu kullanarak ucu 10-6 Torr'a pompalayın. Tutucu artık TEM'e takılmaya hazırdır.
NOT: Seçme tutucunun soğutma kapasitesi yoktur ve kriyo-EM için kullanılmaz.
2. Mikroçipli sandviç montajlarının üretimi
NOT: Farklı SiN veya silikon dioksit (SiO) mikroçipleri doğrudan sevk edilen jel paketlerinden kullanılabilir. Karbon kaplı altın ızgaralar da doğrudan tedarik edildiği gibi kullanılabilir.
- Plazma, Argon gazı kullanarak 45 s için 30 W, 15 mA standart koşullar altında çalışan bir kızdırma tahliye cihazı kullanarak mikroçipleri ve karbon ızgaralarını temizler.
- 50 mM HEPES, pH 7,5'te bulunan ~2 μL numune ekleyin; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2, bir jel paketi üzerine yerleştirilen parıltılı deşarjlı bir mikroçipe. Fazla çözeltiyi (~%50) filtre kağıdı veya pipet kullanarak çıkarın. 1-2 dakikalık bir inkübasyon adımını takiben, parıltılı boşaltılmış karbon ızgarasını numuneyi içeren ıslak mikroçipe ekleyin.
- Hermetik olarak kapatılmış bir muhafaza oluşturmak için oda sıcaklığında tek eğimli bir numune tutucu veya otomatik yükleyici ızgara klipsleri kullanarak tertibatı birbirine kenetleyin. Otomatik yükleyici kelepçeleri için, sandviç tertibatı alt C-klipsine yerleştirin, üst klipsi montajın üstüne yerleştirin ve montajı birbirine kapatmak için standart sıkıştırma aletini kullanın.
NOT: Burada gerçekleştirilen sıkıştırma prosedürü, kriyo-EM ızgara kelepçeleme ile aynı adımları kullanır, ancak oda sıcaklığında. Kelepçelenmiş numuneler, görüntülemeden önce muhafazadaki sıvı korunurken 2 ay veya daha uzun süre saklanabilir. Oda sıcaklığında numune tutucu veya otomatik yükleyici ile sızıntı kontrolü yapılmaz. - Örnek şimdi TEM'e yerleştirilmeye hazırdır. Otomatik yükleyicilere yerleştirilen numuneleri kriyo koşullarında veya oda sıcaklığında inceleyin.
3. İletim elektron mikroskobu kullanarak numunelerin görüntülenmesi
- Sıvı-EM görüntüleme
- Numune tutucuyu, bir alan emisyon tabancası (FEG) ile donatılmış ve 200 kV'ta çalışan TEM'e yükleyin.
- Tabancayı açın ve yalpalama fonksiyonunu kullanarak mikroskop aşamasının ösentrik yüksekliğini numuneye göre ayarlayın, numuneyi sütunda -15 ° ila +15 ° arasında eğin. Bu prosedür, numune kalınlığına uyum sağlamak için aşamayı Z yönünde ayarlar. Ve görüntü kaydı sırasında doğru bir büyütme sağlamaya yardımcı olur.
- 6 μm piksel aralığına sahip doğrudan dedektörle entegre edilmiş yerinde paketi kullanarak görüntüleri uzun kareli filmler olarak kaydedin (Video 1 ve Video 2). Tek tek görüntüler, otomatik görüntüleme rutinleri uygulayan seri veri toplama yazılım paketi20 kullanılarak da kaydedilebilir. Düşük doz koşulları altında, saniyede 28.000x-92.000x ve 40 kare arasında değişen büyütmelerde görüntüler elde edin.
- Numuneye ışın hasarını en aza indirmek için pozlama sürelerini (0,25-1 sn) ayarlayın. Belirtilen büyütmede -1-4 μm'lik bir bulanıklaştırma aralığı kullanın. Kalın bir çözümle karşılaşılırsa, daha yüksek bulanıklaştırma değerleri kullanın veya farklı bir ilgi alanı seçin.
- Elektron ışınını, kabarcıklar oluşana kadar veri toplama için kullanılmayan kurban edilen bir alana odaklayarak görüntüleme oturumu boyunca örneklerde çözeltinin bulunduğundan emin olun (Ek Şekil 1).
- Kriyo-EM görüntüleme
- Kırpılmış EM ızgaralarını veya mikroçipli sandviçleri FEG ile donatılmış ve 300 kV'ta çalışan TEM'e yükleyin. Tabancayı açın ve yukarıdaki sıvı-TEM için açıklanan benzer bir prosedürü kullanarak mikroskop aşamasının ösentrik yüksekliğini ayarlayın (adım 3.1.2).
- Otomatik görüntüleme rutinlerini uygularken mikroskop sistemine entegre edilmiş tek parçacık analiz sistemini kullanarak tek tek görüntüleri kaydedin. Saniyede 59.000x ve 40 kare büyütmede 14 μm piksel aralığına sahip tek parçacık analizi doğrudan elektron dedektörünü kullanarak düşük doz koşullarında görüntüleri kaydedin.
- Belirtilen büyütmede 1-4 μm'lik bir bulanıklaştırma aralığı kullanın. Kalın vitreus buz katmanlarıyla karşılaşılırsa, daha yüksek bulanıklaştırma değerleri kullanın veya veri toplama için farklı bir bölge seçin.
4. Veri analizi ve 3 boyutlu yapı karşılaştırmaları
- Sıvı ve vitreus buzunda adeno ilişkili virüsün (AAV) analizi
- RELION-3.08 program 21 veya başka bir görüntü işleme yazılımı22 kullanarak sıvı ve buzdaki AAV parçacıkları için filmleriişleyin. MotionCor2 v1.2.3'ü kullanarak hareket düzeltmesi gerçekleştirin.
- Düzeltildikten sonra, program yazılım paketindeki otomatik toplama aracını kullanarak parçacıkları ayıklayın. Tipik kutu boyutları sıvı numuneler için 330 piksel ve buz örnekleri için 350 pikseldir.
- Programın 3B başlangıç modeli rutinini ve/veya veri işleme yazılım paketindeki ab-initio model seçeneklerini kullanarak C1 simetrisini kullanarak ilk rekonstrüksiyonları hesaplayın. Programda, sıvı numuneler için T = 4 ve piksel boyutu 1.01 şve buz örnekleri için 1.13 şbir düzenlileştirme parametresi kullanın.
- İyileştirme prosedürleri boyunca 300 şmaske değeri kullanın. Birden fazla EM haritası elde etmek için I1 simetrisini kullanarak veri işleme yazılımında iyileştirme protokolleri gerçekleştirin. Beklenen yapısal çözünürlük 4 şveya daha iyi aralığında olabilir. Sıvı için 16.800'de ve buz12.14 için 15.240'ta ikosahedral simetri uygulayan parçacık eşdeğerliğini kullanın.
NOT: Çözünürlük tahminleri altın standart Fourier kabuk korelasyonu (FSC) kriterlerine dayanmaktadır. - EM haritalarını ~ 250 Å'de maskeleyin ve moleküler yapı analizi yazılım paketi23,24 kullanarak sonuçları inceleyin. Şekil 3'te, dilimler ~5 nm'lik artışlarla gösterilmiştir.
- Karşılaştırma için EM haritalarından kapsid proteini (VP1) alt birimlerini çıkarın. Parçacık çapı ölçümlerine dayanarak EM yapıları arasındaki dinamik değişiklikleri ölçün (Ek Şekil 2) ve ardından yazılımdaki Morph harita işlevini kullanarak görselleştirin.
- Sıvı halde SARS-CoV-2 sub-viral gruplarının analizi
- RELION-3.08 programını kullanarak filmleri işleyin. MotionCor2 v1.2.3 kullanarak görüntü kayması ve ışın kaynaklı hareket için doğru. Mikroskopun kontrast transfer fonksiyonu (CTF) için doğru.
- 800 piksel kutu boyutuna sahip viral montajları seçmek için programdaki otomatik toplama aracını kullanın. Hesaplama verimliliği için, çıkarılan parçacıklar 256 piksele yeniden ölçeklendirilebilir. Programda C1 simetrisini kullanarak T = 2 ve 1,66 şpiksel boyutunda bir düzenlileştirme parametresine sahip bir başlangıç modeli elde edin.
- Bir EM haritası elde etmek için programda 3D iyileştirme gerçekleştirin, standart FSC kriterlerine göre ~ 8.25 Å'de bir örnek gösterilmiştir (Şekil 4). EM haritalarını, Şekil 4'te gösterildiği gibi 25 nm'de artırılmış dilimlerle moleküler yapı analiz yazılımını kullanarak görselleştirin.
- Vitröz buzda rotavirüs çift katmanlı parçacıklarının (DLP'ler) analizi
- Diğer görüntü işleme yazılımlarını kullanarak rotavirüs DLP'leri için filmleri işleyin. Görüntülerdeki sapmayı düzeltmek için MotionCor2 v1.2.3 sürümünü kullanın. Görüntüler üzerindeki lens efektlerini düzeltmek için Patch CTF tahminini kullanın.
- Yazılımdaki otomatik toplama aracını kullanarak 950 piksel kutu boyutuna sahip parçacıkları ayıklayın. Bilgi işlem amacıyla kutu boyutunu gerektiği gibi alt örnekleyin.
- Ab-initio seçeneklerini ve C1 simetrisini kullanarak ilk modelleri hesaplayın. 1,47 şpiksel boyutu ve 800 şmaske değeri dahil olmak üzere iyileştirme parametrelerini kullanın.
- I1 simetrisini uygularken ek iyileştirme rutinleri gerçekleştirin. Örnek sonuçlar, altın standart FSC kriterlerine göre 10,15 şEM haritasını içerir. Kullanılan toplam partiküller 2050 idi ve bu da ikosahedral simetri operatörü nedeniyle 123.000 protomer birimine eşittir (Şekil 5).
- Son haritaları ~ 750 Å'de maskeleyin ve sonuçları moleküler yapı analizi yazılım paketinde görselleştirin. EM haritasındaki örnek dilimler Şekil 5'te ~10 nm'lik artışlarla gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm sıvı-EM görüntüleme deneyleri için 200 kV'ta çalışan bir sıvı-TEM ve tüm kriyo-EM veri toplama için 300 kV'ta çalışan bir kriyo-TEM kullanılmıştır. Çoklu virüslerin temsili görüntüleri ve yapıları, çeşitli test deneklerinde yöntemlerin yararlılığını göstermek için sunulmuştur. Bunlar arasında rekombinant adeno ilişkili virüs alt tip 3 (AAV), hasta serumundan türetilen SARS-CoV-2 alt viral düzenekleri ve simian rotavirüs çift katmanlı parçacıkları (DLP'ler), SA11 suşu bulunur. İlk olarak, sıvı tampon çözeltisinde (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) ve vitreus buzda (Şekil 3A-C; Ek Şekil 2). Sıvı-EM örnekleri, Sin bazlı mikroçipler ve özel numune tutucu kullanılarak hazırlandı. Kriyo-EM numuneleri standart delikli karbon ızgaralar kullanılarak hazırlandı ve son teknoloji ürünü bir numune hazırlama ünitesi kullanılarak sıvı etan içine vitrifiye edildi. Ortaya çıkan virüs yapıları, ~ 25 nm'lik benzer genel çaplara sahipti. Bireysel VP1 kapsid protomerlerinin karşılaştırılması da hem sıvı hem de buz EM haritalarında tutarlı özellikler göstermiştir (Şekil 3D). Sıvı-EM ve kriyo-EM verileri arasındaki bir fark, kriyo-EM sonuçlarında bulunmayan sıvıda ek dinamik yapıların gözlenmesidir (Şekil 3E)12.
Daha sonra, incelenen, yeni bir mikroçipli sandviç tekniği7,14 kullanılarak tampon çözeltisinde (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl 2) hazırlanan deaktive edilmiş SARS-CoV-2 örnekleri (0.25 mg / mL) ile incelendi. Yeni teknik, karbon kaplı altın ızgaralarla birlikte Sin bazlı mikroçipler kullanıyor. Bu preparatta, sıvı numune iki substrat arasına sıkıştırıldı (Şekil 2A-C). Sandviçlenmiş numuneler, kriyo-EM numune hazırlamada yaygın olarak kullanılan tek eğimli numune tutucu veya otomatik yükleyici C-klipsleri ile kelepçelendi. Numuneler hemen TEM'de görüntülenebilir veya biyolojik numunenin stabilitesine bağlı olarak 2 ay veya daha uzun süre 4 ° C'de saklanabilir. Sıvı numunelerde köpürme görünümü, sıvı tabakanın varlığını sağlar. Sıvı kalınlığı, tarif edildiği gibi EF-TEM protokolleri kullanılarak ölçülebilir12. Sıvıdaki SARS-CoV-2 sub-viral gruplarının çevreleyen sıvıya göre yüksek görünür kontrasta sahip olduğu görülmüştür (Şekil 4A,B). Bazı parçacıklar virüs yüzeyinde görünür sivri uçlar gösterirken, bazı parçacıklar sivri uçlardan yoksundur veya onlarla seyrek olarak dekore edilmiştir (Ek Şekil S3). 8.25 şyapısı boyunca sınıf ortalamaları ve dilimler, protein alt birimlerini ve viral RNA genomunu içeren parçacıkların iç özelliklerini göstermiştir (Şekil 4C). Bazı parçacıkların C2 simetrisi içerdiği görülse de (C2 simetrisini test ettikten sonra, parçacık eşdeğerliği 2.674 idi), asimetrik yapı simetrik yapıya kıyasla çok farklı değildi.
Son olarak, analiz, vitreus buzunda rotavirüs DLP'lerini (3 mg / mL; 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) sıvı azot içine manuel olarak dondurucu mikroçip sandviç preparatları ile içeriyordu. Dondurulmuş hidratlanmış numuneler için sıvı-EM numuneleri üretmek için kullanılan aynı sandviç tekniği kullanılmıştır. Sandviçler otomatik yükleyici ızgara klipsleri ile kapatıldı ve standart koşullar altında kriyo-TEM kullanılarak incelendi. Dondurulmuş örneklerin düşük büyütmeli görüntüleri, kübik veya altıgen buz kontaminasyonunu çok az veya hiç göstermedi ve görüntüleme pencereleri boyunca yoğun olarak paketlenmiş DLP'lerin bölgeleri gözlendi (Şekil 5A, B). Görüntüler, EPU paketinde uygulanan otomatik rutinler kullanılarak toplandı. 10.15 şharitasındaki sınıf ortalamaları ve dilimler, viral protein bileşenleri ve çift sarmallı RNA genomu ile tutarlı kararlı özellikler ortaya koymuştur (Şekil 5D, E). DLP'ler ve buz arka planı arasındaki kontrast farkı, kriyo-EM görüntülerinde sıvı-EM örneklerine kıyasla gözle görülür şekilde güçlü değildi. Bu ilginç etkinin nedeni hala belirlenmekte olsa da, sıvı-EM görüntüleme topluluğu için gelecekteki avantajlar sunabileceğinden farka dikkat çekmek önemlidir.
Şekil 1: Sıvı ve buz içindeki virüslerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için kullanılan teknikler. İki iş akışı, farklı sıvı-EM numune hazırlama yöntemlerini vurgular. Sol panel, bir sıvı-EM numune tutucusunun şematik bir temsilini gösterir. SiN baz mikroçipi, ~30 nm kalınlığında bir membran ile ~150 nm derinliğinde bir dizi (500 μm x 100 μm) entegre mikro kuyucuk (10 μm x 10 μm) içerir. Sağ panel, hem sıvı-EM hem de kriyo-EM araştırması için kullanılabilecek mikroçipli sandviç tekniğinin bir şemasını sunar. Sandviç montajları, karbon kaplı altın TEM ızgarası ile eşleştirilmiş bir SiN mikroçipi kullanır. Montajın enine kesiti, sırasıyla 10 nm veya 5 nm membran kalınlıklarına sahip 250 μm x 250 μm ila 50 μm x 50 μm arasında değişen çoklu görüntüleme pencerelerini gösterir. Karbon destek filmi ~ 5 nm kalınlığındadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıvı-EM ve kriyo-EM için mikroçipli sandviç tekniği . (A) Mikroçipli sandviç tertibatı, karbon kaplı altın TEM ızgarası ile eşleştirilmiş bir SiN mikroçipi kullanır. Bir jel paketine parıltılı boşaltılmış bir mikroçip yerleştirilir ve mikroçipe virüs örnekleri eklenir. Kısa bir inkübasyon süresinden sonra, fazla çözelti çıkarılır ve sandviç TEM ızgarası ile kapatılır. (B) Mikroçipli sandviç, oda sıcaklığında bir kırpma cihazında kapatılır ve doğrudan tek eğimli bir TEM tutucuya veya bir TEM otomatik yükleyici sistemine yüklenebilir. (C) Mikroçipli sandviç tertibatının kesit çizimleri, mikroçiplerin ve karbon tabakasının boyutlarını vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: AAV'nin sıvı-EM ve kriyo-EM yapılarının karşılaştırılması. (A) AAV'nin çözeltideki yapısı (3.22 şçözünürlük), harita boyunca 5 nm dilimleri gösteren renkli radyal yoğunluklarla. Ölçek çubuğu 5 nm'dir. Görüntüleme metrikleri, doğrudan elektron dedektörü kullanılarak veri toplama içindir. (B) Renkli radyal yoğunluklara sahip buzda görüntülenen AAV'nin yapısı (3.37 şçözünürlük), yapı boyunca 5 nm dilimleri temsil eder. Ölçek çubuğu 5 nm'dir. Görüntüleme metrikleri, doğrudan elektron dedektörü kullanılarak veri toplama içindir. (C) İlgi çekici bir bölge, farklı zaman noktalarında hesaplanan Fourier dönüşümleri ile birlikte 5 s ve 20 s zaman noktalarını gösterir. Sol taraf CTF tahminlerini, sağ taraf deneysel verileri gösterir. (D) Sıvı ve buz yapılarından ekstrakte edilen AAV VP1 alt ünitesinin rotasyonel görünümleri. Segmentler kristal yapı kullanılarak yorumlandı (PDB kodu 3KIC, A zinciri25). Ölçek çubuğu 10 Å. (E) Moleküler yapı analiz yazılımındaki morf haritası fonksiyonu kullanılarak oluşturulan sıvı yapılardaki dinamik değerler ve adım 4.1.6-4.2.3'te açıklanmıştır. Soldan sağa, çoklu virüs gruplarından ortalama yapılar, EM verileri kullanılarak ölçülen karşılık gelen ~% 5'lik bir çap değişikliği ile konformasyonel değişiklikler gösterir. Voksellerdeki RMSD değerleri, renk skalasına göre değişiklikleri gösterir. Şekil12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroçipli sandviç tekniği kullanılarak sıvı olarak hazırlanan SARS-CoV-2 alt viral grupları. (A) COVID-19 hastalarından serum fraksiyonlarından izole edilen SARS-CoV-2 alt viral gruplarının görüntüsü. Görüntüleme metrikleri, doğrudan elektron dedektörü kullanılarak veri toplama içindir. Görüntünün sağ üst köşesindeki beyaz kabarcıklar, numunede sıvı bulunduğunun görsel bir göstergesidir. Ölçek çubuğu 100 nm'dir. (B) Görüntünün hesaplanan Fourier dönüşümü, karşılık gelen görüntüde çok az veya hiç sapma olmadan karşılıklı alanda yüksek çözünürlüklü bilgileri gösterir. Sınıf ortalamaları, çözümde bulunan viral derlemelerdeki benzersiz özellikleri gösterir. (C) Alt viral montajların EM rekonstrüksiyonu, harita boyunca 5 nm dilimlerde renkli radyal yoğunluklarla gösterilir. Ölçek çubuğu 25 nm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mikroçipli sandviç tekniği kullanılarak sıvı halde hazırlanan rotavirüs DLP'leri. (A,B) Analiz yazılımı kullanılarak düşük büyütmeli tarama adımları. Sınırlı buz kristalleri gözlendi ve pencere zarları ince ve berraktı, bu da veri toplama için alan seçimini basitleştirdi. (A) cinsinden ölçek çubuğu 5 μm ve (B) cinsinden 500 nm'dir. (C) Filmler, belirtilen görüntüleme metriklerine göre sayma modunda doğrudan elektron dedektörü kullanılarak elde edilmiştir. Ölçek çubuğu 50 nm'dir. (D) Fourier dönüşüm bilgisi, verilerde bulunan yüksek çözünürlüklü bilgileri gösterir ve sınıf ortalamaları ikosahedral kafeste güçlü özellikler gösterir. Sınıf ortalamaları, virüs derlemelerindeki özellikleri eserlerden arındırılmış ve diğer yapısal gözlemlerle tutarlı olarak gösterir 6,15,17. (E) DLP'lerin EM rekonstrüksiyonu (10.15 şçözünürlük), harita boyunca 10 nm dilimlerde renkli radyal yoğunluklarla gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 15 nm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: EM numunelerinde sıvı varlığının doğrulanması. Düşük doz koşullarında (<10 e- Å-2 s-1) elde edilen çözeltideki AAV parçacıklarının düşük büyütme görüntüleri kabarcıklardan yoksundur. >100 e- Å-2 s-1'lik odaklanmış bir ışın kullanarak, sıvı numuneler kabarcık oluşumu (siyah oklar) gösterdi. Ölçek çubuğu 500 nm'dir. Şekil12'den değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Sıvıda AAV boyutlarındaki değişikliklerin ölçülmesi. (A) Virüs parçacıklarının kontur izleri 20 saniyelik bir zaman diliminde elde edilmiştir. Ölçek çubuğu 25 nm'dir. (B,C) 1, 5, 10 ve 20 saniyelik partikül çapı ölçümlerinin tablo ve grafik gösterimleri. 20 s kaydı sırasında parçacık çaplarındaki genel değişim, ~ 1e-Å-2 s-1 dozunda% 0.28 idi. (D,E) Film çekimi sırasında değişen zaman noktasında belirlenen sinyal-gürültü değerleri. Şekil12'den değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Hasta kaynaklı SARS-CoV-2 alt komplekslerinin yüksek büyütmeli görüntüsü. Heterojen viral gruplar, bazı parçacıkların yüzeyinde başak proteinlerinin (kırmızı oklar) varlığını gösterdi. Diğer parçacıklar etiketlendiği gibi yüzey sivri uçlarında eksikti. Ölçek çubuğu 100 nm'dir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 1: AAV'nin sıvı içinde gerçek zamanlı görüntülenmesi. AAV'nin sıvı içinde gerçek zamanlı kaydının (solda) ve çözelti içinde yayılan parçacıkların renkli kontur izlerinin (sağda) yan yana karşılaştırılması. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: Görüntü izlemenin sıvı içinde görselleştirilmesi. Çözelti içinde (solda) yayılan parçacıkların (sağda) çözelti içinde difüzyon yapan AAV'nin renkli ve düşük geçişli filtrelenmiş bir filminin yan yana karşılaştırılması (sağda). Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kriyo-EM alanından uyarlanmış yeni otomatik araçlar ve teknolojiler kullanarak mevcut sıvı-EM iş akışlarını kolaylaştırmak için yeni fırsatlar sunulmaktadır. Yeni mikroçipli sandviç tekniğini içeren uygulamalar, sıvı veya vitreus buzunda yüksek çözünürlüklü görüntüleme analizine olanak sağladıkları için diğer yöntemlere göre önemlidir. Protokoldeki en kritik adımlardan biri, nano ölçekte zarif ayrıntıları görselleştirmek için ideal sıvı kalınlığına sahip örnekler üretmektir. İlgilenilen ideal bölgeler, otomatik veri toplama için yüksek verimli rutinler uygulamadan önce tüm numune taranarak daha düşük büyütmelerde belirlenir. Sıvı veya buz örneklerinde tanımlanan bölgeler ışın hasarlı eserler içeriyorsa veya görsel olarak net olan tek tek parçacıkları tanımlamak için çok kalın görünüyorsa, veri toplama dışında tutulmalıdır. Yüksek çözünürlüklü veri toplamadaki sınırlamalar, sıvı numunelerde ışın kaynaklı hareketi ve Brownian hareketini içerir. Cryo-EM yöntemleri biyolojik örneklerde hareketi en aza indirmeyi amaçlar; Bununla birlikte, hareket düzeltme yöntemleri, bu çözünürlük sınırlayıcı faktörleri azaltmada hesaplama açısından sağlamdır. Sıvı numunelerde uzun süreli sapma ve termal dengesizlik varsa, sıvı tabakaların kalınlığını azaltmak için numune hazırlama adımları sırasında fazla çözelti çıkarılarak daha ince numuneler hazırlanabilir.
Virüs parçacıkları arasındaki moleküler kalabalık, numuneler yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında ortaya çıkabilir. Sağlam veri toplamayı sınırlayacak şekilde örtüşen parçacıklara sahip birden fazla bölge varsa, numune hazırlamadan önce giriş numunesinin konsantrasyonu azaltılmalıdır. Uygun bir numune konsantrasyonuna sahip olmak, protokolde çok önemli bir adımdır. Çok fazla parçacık içeren görüntüler, aşağı akış görüntü işleme prosedürlerini karmaşıklaştırır. Saflaştırılmış virüs parçacıkları için, numunenin boyutlarına ve moleküler ağırlığına bağlı olarak yeterli bir konsantrasyon aralığı 0.3-3 mg / mL arasındadır. Daha büyük virüsler (~ 100 nm çap veya daha büyük), tekniğin başarısı için tipik olarak daha küçük virüslerden (~ 25 nm çapı veya daha az) daha yüksek konsantrasyonlar gerektirir. Dikkate alınması gereken bir diğer faktör, ilgilenilen parçacıkların parıltılı boşaltılmış mikroçiplere yapışma seviyesidir. Virüs numunesi yüzeye iyi yapışmazsa, sıvı-EM veya kriyo-EM için numuneleri yeterince hazırlamak için daha büyük bir konsantrasyona ihtiyaç duyulabilir. Alternatif olarak, numune bunun yerine, muhafazanın kapağı olarak işlev gören mikroçip ile karbon kaplı altın ızgaraya uygulanabilir. Bu prosedürler veri toplama prosedürleri için yeterli parçacık toplayamazsa, afinite yakalama yöntemleri uygulanabilir bir seçenek sunabilir26,27,28.
Deterjanlar, gliserol, polietilen glikoller ve yüksek düzeyde sakkaroz veya glikoz gibi bazı katkı maddelerinin kullanımı sıvı-EM görüntüleme için en aza indirilmeli veya kaçınılmalıdır. Bu reaktifler görüntülerde artefaktlar ortaya çıkarabileceği gibi, ışın hasarı nedeniyle aşırı kabarcıklanma, hidroliz ürünleri ve serbest radikal oluşumuna yol açabilir. Bu tür etkiler, görüntülenen parçacıklarda sessiz özelliklere yol açar ve sonuçta yapısal çözünürlüğü sınırlar. Biyokimyasal preparatlarda kullanılıyorlarsa, bu reaktifleri uzaklaştırmanın bir yolu, katkı maddelerinden yoksun bir tampon çözeltisine kapsamlı diyaliz yapmaktır. Bu reaktiflerin duruma göre test edilmesi ve kullanılması gerekecektir. Ayrıca, mikroçipli sandviç tekniği kullanılarak yeterli numune üretildikten sonra, hemen görüntülenebilir veya incelemeye hazır olana kadar 4 ° C'de saklanabilir. Depolama süreleri numune kararlılığına bağlıdır.
Genel olarak, sıvı-EM'nin kriyo-EM ile birlikte kullanılması, araştırmacıların biyolojik sistemleri tamamlayıcı görüntüleme araçlarıyla incelemelerine izin verir. Yeni geliştirilen mikroçipli sandviç tekniği, sıvı veya buzda TEM görüntüleme için tutarlı örnekler verir. Bu teknik ayrıca, araştırmacıların ticari bir numune tutucuya veya vitrifikasyon sistemine ihtiyaç duymadan numuneleri hazırlamaları ve görüntülemeleri için basit bir araç sağlar. Otomatik görüntüleme protokolleri ile birlikte, numune başına oturum başına binlerce görüntü sırasına göre büyük miktarda veri elde edilebilir. Parsons ve meslektaşlarının öncü çalışmaları 29,30,31,32,33, sıvı muhafazalarda biyolojik örnekler üretmek için temel zemini attı. Burada sunulan protokoller, son teknoloji ürünü araçların biyolojik makromolekülleri yeni gözlerle görselleştirmek için nasıl heyecan verici bir araç sağlayabileceğini açıklamaktadır. Bu tekniklerde uzmanlaşmaktan kaynaklanması beklenen gelecekteki uygulamalar, yüksek performanslı bilgi işlemle eşleştirildiğinde, yapı-işlev ilişkilerini 3B'de anlamak için gerçek zamanlı mekanik içgörülerdir. Sıvı-EM alanı, insan sağlığına tehdit oluşturan yeni virüsler hakkındaki araştırmaları artırmaya hizmet edebilir, hatta belki de pandemik hazırlık önlemlerine katkıda bulunabilir. Özetle, bu protokollerin kullanımı, bilim adamlarının ve mühendislerin, yaşam bilimleri, tıp ve malzeme araştırmalarını kapsayan çok çeşitli örneklerde atomik detaylarda dinamik süreçleri daha iyi incelemelerine izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Yazar Madeline J. Dressel-Dukes, Protochips, Inc.'in bir çalışanıdır ve Michael Spilman, DirectElectron'un bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Yazarlar, saflaştırılmış AAV-3 sağladığı için Dr. Luk H. Vandenberghe'ye (Harvard Tıp Fakültesi, Oftalmoloji Bölümü) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 - D.F.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
