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Developmental Biology

ब्रॉयलर चिक भ्रूण से प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/63861
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Animal Science, University of Tennessee

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल ब्रॉयलर भ्रूण में वसा ऊतक से प्रीडिपोसाइट्स को अलग करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है। यह विधि उच्च उपज, प्राथमिक संस्कृति और प्रीडिपोसाइट्स के एडिपोजेनिक भेदभाव के साथ अलगाव को सक्षम बनाती है। तेल लाल ओ धुंधला और लिपिड / डीएनए दाग ने भेदभाव मीडिया के साथ प्रेरित पृथक कोशिकाओं की एडिपोजेनिक क्षमता को मापा।

Abstract

प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स आणविक मार्गों को समझने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक प्रणाली है जो एडिपोसाइट भेदभाव और चयापचय को नियंत्रित करती है। चिकन भ्रूण वसा विकास के शुरुआती चरण से प्रीडिपोसाइट्स को अलग करने का अवसर प्रदान करते हैं। इस प्राथमिक कोशिका का उपयोग प्रीडिपोसाइट प्रसार और एडिपोजेनिक भेदभाव को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिससे उन्हें बचपन के मोटापे और पोल्ट्री में अतिरिक्त वसा जमाव के नियंत्रण से संबंधित अध्ययनों के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाया जा सकता है। प्रसवोत्तर वसा ऊतक की तेजी से वृद्धि प्रभावी रूप से ब्रॉयलर मुर्गियों में मांसपेशियों की वृद्धि से दूर आवंटित करके फ़ीड को बर्बाद कर देती है। इसलिए, वसा ऊतक विकास के शुरुआती चरणों को समझने के तरीके इस प्रवृत्ति को विनियमित करने और जीवन की शुरुआत में वसा विस्तार को सीमित करने के तरीकों की पहचान करने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं। वर्तमान अध्ययन को वाणिज्यिक ब्रॉयलर (मांस-प्रकार) चूजे भ्रूण के वसा ऊतक के विकास से अलग प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव, प्राथमिक संस्कृति और एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए एक कुशल विधि विकसित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। प्रक्रिया को उच्च व्यवहार्यता (~ 98%) के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया गया है और परिपक्व एडिपोसाइट्स में अंतर करने की क्षमता में वृद्धि हुई है। भ्रूण प्रीडिपोसाइट अलगाव, संस्कृति और भेदभाव की यह सरल विधि प्रारंभिक जीवन में वसा वृद्धि और विकास के कार्यात्मक विश्लेषण का समर्थन करती है।

Introduction

मोटापा वयस्कों और बच्चों दोनों के लिए एक वैश्विक स्वास्थ्य खतरा है। जो बच्चे अधिक वजन या मोटापे से ग्रस्त हैं, वे वयस्कों के रूप में मोटापे से ग्रस्त होने की संभावना लगभग पांच गुना अधिक हैं, जिससे उन्हें हृदय रोग, मधुमेह और कई अन्य कोमोर्बिडिटी के लिए काफी जोखिम में डाल दिया जाता है। 2-5 वर्ष की आयु के लगभग 13.4% अमेरिकी बच्चों में मोटापा1 है, यह दर्शाता है कि शरीर में अतिरिक्त वसा जमा करने की प्रवृत्ति को जीवन में बहुत जल्दी गति में सेट किया जा सकता है। बहुत अलग कारणों से, अतिरिक्त वसा ऊतक का संचय ब्रॉयलर (मांस-प्रकार) मुर्गियों के लिए एक चिंता का विषय है। आधुनिक ब्रॉयलर अविश्वसनीय रूप से कुशल हैं लेकिन फिर भी शारीरिक रूप से आवश्यक 2,3 की तुलना में अधिक लिपिड जमा करते हैं। यह प्रवृत्ति हैच के तुरंत बाद शुरू होती है और मांसपेशियों की वृद्धि से दूर आवंटित करके सबसे महंगे उत्पादन घटक फ़ीड को प्रभावी ढंग से बर्बाद कर देती है। इसलिए, बच्चों और ब्रॉयलर मुर्गियों दोनों के लिए, यद्यपि बहुत अलग कारणों से, वसा ऊतक विकास को प्रभावित करने वाले कारकों को समझने और जीवन की शुरुआत में वसा विस्तार को सीमित करने के तरीकों की पहचान करने की आवश्यकता है।

एडिपोसाइट्स प्रीडिपोसाइट्स, वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं से बनते हैं जो परिपक्व, लिपिड-भंडारण वसा कोशिकाओं को विकसित करने के लिए भेदभाव से गुजरते हैं। तदनुसार, इन विट्रो में प्रीडिपोसाइट्स मोटापे के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल हैं। वसा डिपो के स्ट्रोमल संवहनी अंश से पृथक ये कोशिकाएं, एडिपोसाइट भेदभाव और चयापचय 4,5 को नियंत्रित करने वाले आणविक मार्गों की मौलिक समझ प्रदान कर सकती हैं। चूजा भ्रूण विकासात्मक अध्ययनों में एक अनुकूल प्रयोगात्मक मॉडल हैं क्योंकि वांछित अनुसूची पर अंडे की खेती प्रयोगात्मक हेरफेर को आसान बनाती है, क्योंकि यह भ्रूण के विकास चरणों की एक श्रृंखला का निरीक्षण करने के लिए मां के बलिदान के बिना भ्रूण प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, बड़े पशु मॉडल के सापेक्ष भ्रूण प्राप्त करने के लिए जटिल सर्जिकल प्रक्रियाओं और लंबी अवधि की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, चूजा भ्रूण वसा ऊतक विकास के शुरुआती चरणों से प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने का अवसर प्रस्तुत करता है। चमड़े के नीचे वसा ऊतक जांघ के चारों ओर स्थित एक स्पष्ट रूप से परिभाषित डिपो के रूप में भ्रूण दिवस 12 (ई 12) के आसपास चूजे में दिखाई देता है। यह डिपो अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव प्रीडिपोसाइट्स में समृद्ध है जो परिपक्व एडिपोसाइट्स 6,7 बनाने के लिए विकासात्मक संकेतों के तहत सक्रिय रूप से भेदभाव से गुजरता है। एडिपोजेनिक भेदभाव की प्रक्रिया मुर्गियों और मनुष्यों के बीच तुलनीय है। इसलिए, चूजे के भ्रूण से पृथक प्रीडिपोसाइट्स का उपयोग मनुष्यों और पोल्ट्री के लिए प्रासंगिक अध्ययनों के लिए दोहरे उद्देश्य मॉडल के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, उम्र बढ़ने के साथ प्रीडिपोसाइट्स की उपज कम हो जाती है क्योंकि कोशिकाएं परिपक्व एडिपोसाइट्स में बढ़ती हैं5.

वर्तमान प्रोटोकॉल चरण (ई 16-ई 18) के दौरान वसा ऊतक से प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव का अनुकूलन करता है जिस पर एडिपोजेनिक भेदभाव और एडिपोसाइट अतिवृद्धि ब्रॉयलर चिक भ्रूण8 में अपने चरम पर होती है। यह प्रक्रिया उन कारकों के प्रभावों का आकलन कर सकती है जिनके लिए विकासशील भ्रूण ओवो में उजागर होता है, जैसे मुर्गी आहार, एडिपोसाइट विकास और एडिपोजेनिक संभावित पूर्व विवो पर। यह एडिपोजेनेसिस या एडिपोसाइट पूर्वजों के विभिन्न 'ओम (जैसे, ट्रांसक्रिप्टोम, मेटाबोलोम, मिथाइलोम) पर विभिन्न जोड़तोड़ (जैसे, हाइपोक्सिया, पोषक तत्व परिवर्धन, औषधीय एगोनिस्ट और विरोधी) के प्रभाव का भी परीक्षण कर सकता है। वसा गठन के शुरुआती चरण के प्रतिनिधित्व के रूप में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त कोशिकाएं पोल्ट्री और मनुष्यों के लिए प्रासंगिक अध्ययन के लिए मूल्यवान मॉडल हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को टेनेसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। ताजा निषेचित वाणिज्यिक ब्रॉयलर अंडे (कोब 500) एक स्थानीय हैचरी से प्राप्त किए गए थे। अंडे भ्रूण के दिनों 16-18 (ई 16-ई 18) में विच्छेदन तक 60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 38 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। वसा ऊतक चमड़े के नीचे (ऊरु) डिपो से एकत्र किया गया था।

1. अलगाव और संस्कृति के लिए तैयारी

  1. संस्कृति हुड और उपकरणों को तैयार करें।
    1. विच्छेदन शुरू करने से पहले, लामिना-प्रवाह हुड में एक कार्य क्षेत्र स्थापित करें। 70% इथेनॉल के साथ स्वैबिंग करके कार्य क्षेत्र और सभी उपकरणों को कीटाणुरहित करें। बाँझ सामग्री का उपयोग करके सभी प्रक्रियाओं को निष्पादित करें।
      नोट: सेल संस्कृति हुड में वापस रखने से पहले हमेशा कंटेनरों और उपकरणों को 70% इथेनॉल के साथ झाड़ू लगाएं। हुड में एक बेंचटॉप इंस्ट्रूमेंट स्टेरिलाइज़र रखने की सिफारिश की जाती है ताकि उपकरणों को भ्रूण के बीच आसानी से निष्फल किया जा सके।
      सावधानी: एक उपकरण स्टरलाइज़र का उपयोग करते समय, जला चोट और ऊतक क्षति को रोकने के लिए गर्म उपकरण को ठीक से ठंडा करें। 3 मिनट का न्यूनतम शीतलन समय अनुशंसित है। उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ स्वैब।
    2. हुड में निम्नलिखित उपकरणों और जहाजों को इकट्ठा करें: सीधे संदंश (120 मिमी), चिमटी (110 मिमी), घुमावदार संदंश के दो जोड़े (100 मिमी), सीधे कैंची के दो जोड़े (140 मिमी), घुमावदार सर्जिकल कैंची (115 मिमी), ऊतक छलनी (250 μm नायलॉन जाल), सेल छलनी (40 μm नायलॉन जाल), शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (15 m)। छोटे बीकर (100 एमएल), 70% इथेनॉल स्प्रे और बाँझ धुंध, पेपर तौलिया और बेंचटॉप वाइपर ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एंजाइमेटिक समाधान, संग्रह मीडिया और संस्कृति मीडिया तैयार करें।
    नोट: अग्रिम में समाधान तैयार करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऊतक संग्रह से पहले मीडिया को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। इस चरण में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।
    1. एफ 12 (एल-ग्लूटामाइन के 2.50 एमएम और एचईपीईएस बफर के 15 एमएम के साथ डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम) को एम्फोटेरिसिन बी और 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), 100 यू / एमएल के 2.5 μg / एमएल के पूरक द्वारा एंजाइमेटिक समाधान की तैयारी दोनों के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया को तैयार करें। उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 1 वर्ष के लिए स्थिर रहता है।
    2. 1 एक्स पीबीएस (फॉस्फेट बफर किए गए खारा पीएच 7.4, कैल्शियम, मैग्नीशियम, या फिनोल लाल के बिना) में 20% (वी / वी) तक बीटाडीन को पतला करके नसबंदी समाधान तैयार करें।
      नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 2 साल के लिए स्थिर है।
    3. एम्फोटेरिसिन बी और 1 एक्स पी / एस (चरण 1.2.1) के 2.5 μg / एमएल के साथ डीएमईएम / एफ 12 में टाइप 1 कोलेजनेज (1 मिलीग्राम / एमएल) को भंग करके एंजाइमेटिक समाधान तैयार करें। ताजा कोलेजनेज समाधान बनाएं और विच्छेदन के दौरान बर्फ पर इसे बनाए रखें। उपयोग से पहले लगभग 10 मिनट, इसकी एंजाइमी गतिविधि शुरू करने के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान को इनक्यूबेट करके पूर्व-गर्म करें।
      नोट: लगभग 1 मिलीलीटर कोलेजनेज समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) प्रति 100 मिलीग्राम वसा ऊतक की आवश्यकता होती है।
    4. एस और 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम / एफ 12 मीडिया को पूरक करके चढ़ाना और प्रसार के लिए उपयोग किए जाने वाले विकास मीडिया तैयार करें। उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 1 वर्ष के लिए स्थिर है।
    5. एम्फोटेरिसिन बी के 2.5 μg / एमएल के साथ 1x पीबीएस को पूरक करके धोने का समाधान तैयार करें वांछित पीएच 7.4 के लिए समाधान समायोजित करें। उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 2 साल के लिए स्थिर है।

2. वसा ऊतक संग्रह और पाचन

  1. भ्रूण को इच्छामृत्यु दें।
    1. भ्रूण के दिन 16 पर, इनक्यूबेटर से अंडे निकालें। माइक्रोबियल संदूषण का प्राथमिक संभावित स्रोत अंडे की सतह है; इसलिए, उन्हें क्रैक करने से पहले 70% इथेनॉल में भिगोए गए बाँझ धुंध के साथ अंडे को झाड़ू दें। स्वैबिंग के बाद, अंडे को कांच से अंडे को कुशन करने के लिए पेपर तौलिए के साथ पंक्तिबद्ध एक छोटे बीकर (100 एमएल) पर नुकीले छोर के साथ लंबवत रखें।
    2. संदंश हैंडल का उपयोग करके, अंडे के कुंद अंत दोहन करके एक अंडे को तोड़ें। ध्यान से भ्रूण (चरण 2.1.3) को हटाने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ा एक उद्घाटन बनाने के लिए अंडे के छिलके को हटा दें। धीरे भ्रूण (चित्रा 1 ए) बेनकाब करने के लिए सफेद खोल झिल्ली फाड़। बाँझ चिमटी (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके ध्यान से एमनियन पियर्स करें।
      नोट: एमनियोटिक थैली एमनियोटिक द्रव से भरा एक पारदर्शी झिल्ली है जो भ्रूण को घेरता है।
    3. सीधे संदंश का उपयोग कर भ्रूण की गर्दन को हल्के ढंग से पकड़कर अंडे से भ्रूण निकालें। भ्रूण से डिस्कनेक्ट करने के लिए जर्दी की थैली को अलग करें, और भ्रूण को 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    4. सर्जिकल कैंची और संदंश का उपयोग कर तुरंत विघटित करें।
  2. वसा ऊतक संग्रह करें।
    1. 70% इथेनॉल के साथ भ्रूण शरीर को झाड़ू और पंखों को हटाने के लिए बाँझ धुंध के साथ त्वचा की सतह को धीरे से साफ़ करें, क्योंकि वे पाचन के बाद बाद के चरणों में निस्पंदन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। एकत्रित ऊतक को छूने से त्वचा और पंखों को रखने के लिए बेंचटॉप वाइपर का उपयोग करें।
    2. ऊरु वसा डिपो की जोड़ी को प्रकट करने के लिए पैरों और पेट के क्षेत्र के बीच की त्वचा को काट दें।
    3. एक हाथ से घुमावदार संदंश का उपयोग कर पैर के चारों ओर त्वचा पकड़ो। धीरे-धीरे दूसरे हाथ से ऊरु चमड़े के नीचे वसा को हटा दें, घुमावदार संदंश का उपयोग करके धीरे-धीरे डिपो को पैर से दूर खींचें।
      नोट: अपेक्षाकृत कम संयोजी ऊतक है जो पैर के लिए वसा पैड का पालन करता है, और पूरे वसा पैड को केवल संदंश का उपयोग करके एक टुकड़े में हटाने योग्य होना चाहिए। यह संदंश को पीछे की ओर पकड़कर सुविधाजनक बनाया जा सकता है ताकि घुमावदार भाग (सिरों के बजाय) हटाने के लिए वसा पैड को क्लैंप करें।
      1. यदि आवश्यक हो, तो घुमावदार कैंची के साथ वसा पैड को काट लें। आवश्यकतानुसार अन्य वसा पैड और अतिरिक्त भ्रूण के साथ दोहराएं।
        नोट: चमड़े के नीचे वसा के कुल 80 मिलीग्राम E16 (चित्रा 1सी) में अधिकांश भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है। यह आमतौर पर ~ 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं की पैदावार करताहै , जो एक टी -25 फ्लास्क को प्लेट करने के लिए पर्याप्त है। प्रारंभिक सामग्री की मात्रा का आकलन करने के लिए कुछ भ्रूणों से वसा पैड का वजन करना इस चरण में उपयोगी हो सकता है, क्योंकि वसा पैड वजन विशिष्ट ब्रॉयलर लाइनों में भिन्न हो सकता है, और बेकाबू कारकों के कारण, जैसे कि ब्रीडर मुर्गी की उम्र और आहार। चमड़े के नीचे वसा नियमित रूप से पांच अंडे से एकत्र किया गया था ताकि कई फ्लास्क में चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त उपज सुनिश्चित की जा सके।
    4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में संग्रह मीडिया के ~ 5 मिलीलीटर में ऊतकों स्थानांतरण और शेष अंडे के लिए विच्छेदन दोहराने।
    5. संक्षेप में नसबंदी समाधान युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करके और पकवान को कुछ बार घुमाकर एकत्र वसा पैड कुल्ला।
    6. 1x पीबीएस युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश के लिए वसा पैड स्थानांतरित करके नसबंदी समाधान बंद कुल्ला। धीरे-धीरे घुमाएं। 1x पीबीएस युक्त एक दूसरे 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करके इस चरण को दोहराएं।
  3. नीचे दिए गए चरणों के बाद एंजाइमेटिक पाचन और प्रीडिपोसाइट अलगाव करें।
    1. वसा ऊतकों को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 100 मिलीग्राम ऊतक प्रति पूर्व-गर्म एंजाइमी समाधान के ~ 1 एमएल होते हैं। ट्यूब में लंबी, सीधी कैंची की एक जोड़ी विसर्जित करें और समाधान में वसा ऊतकों को यथासंभव छोटे टुकड़ों में बारीक कीमा बनाएं (~ 1 मिमी3) (चित्रा 2 ए)।
      नोट: सेल उपज कम हो जाएगा अगर ऊतकों को अच्छी तरह से कीमा बनाया नहीं जाता है।
    2. कीमा बनाया हुआ ऊतक और एंजाइमी समाधान को 25 एमएल आटोक्लेव फ्लास्क में स्थानांतरित करें। पैराफिन फिल्म के साथ फ्लास्क लपेटें। एक इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय शेकर पर रखें और पाचन चरण के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक मिलाते हुए पानी के स्नान का उपयोग करें। या तो दृष्टिकोण के साथ, गति ऊतक के टुकड़ों को फ्लास्क के नीचे बसने से रोकने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए, लेकिन इतनी तेज नहीं होनी चाहिए कि टुकड़े फ्लास्क के शीर्ष पर चले जाएं और कांच से चिपके रहें, या वह तरल पदार्थ पैराफिन फिल्म कवर पर जमा हो जाए।
    3. ~ 30 मिनट के बाद, लगभग 3 मिमी के व्यास के लिए एक 1 एमएल विंदुक टिप के अंत में कटौती। विंदुक ऊपर और नीचे कुछ बार वसा ऊतक से कोशिकाओं को छोड़ने में मदद करने के लिए। फ्लास्क को इनक्यूबेटर/पानी के स्नान में लौटाएं और मिलाते हुए फिर से शुरू करें।
    4. एक अतिरिक्त 15 मिनट के बाद, पाचन की पूर्णता के लिए फ्लास्क की जांच करें। शेकर से फ्लास्क को हटाने के बाद, द्रव परत के शीर्ष पर सफेद कोशिकाओं की एक परत बन जाएगी। यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी बने हुए हैं, तो एक और पिपेट टिप से अंत में कटौती करें और धीरे-धीरे मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें, फिर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए हिलना जारी रखें।
      नोट: पूरी तरह से पचा ऊतक/कोलेजनेज मिश्रण दूधिया चाइम की तरह दिखता है। आमतौर पर, कोमल झटकों के 1 घंटे के बाद ऊतक पर्याप्त रूप से पच जाता है। यदि इस बिंदु पर कई टुकड़े बने रहते हैं, तो यह उपयोग किए जाने वाले कोलेजनेज एंजाइम के साथ एक समस्या का संकेत दे सकता है। लगातार झटकों से उपज बढ़ सकती है; हालांकि, एंजाइम और शारीरिक तनाव के लंबे समय तक संपर्क में रहने से कोशिकाओं को भी नुकसान हो सकता है।
    5. पाचन के बाद, पिपेट धीरे-धीरे ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। बिना पचे ऊतक और मलबे के किसी भी बिट्स को हटाने के लिए पाइपिंग द्वारा 15 एमएल ट्यूब में 250 μm ऊतक छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      1. कांच का पालन करने वाली कोशिकाओं को हटाने के लिए पाइपिंग द्वारा 4 मिलीलीटर विकास मीडिया के साथ फ्लास्क को कुल्ला, और उसी 15 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें। 14 एमएल की कुल मात्रा तक, किसी भी फंसे हुए कोशिकाओं को ढीला करने के लिए पाइपिंग द्वारा अतिरिक्त विकास मीडिया के साथ छलनी कुल्ला।
    6. आरटी (50 एमएल ट्यूब के लिए 7 मिनट) पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा सेल अंश गोली।
      नोट: सेल संस्कृति हुड पर लौटने से पहले हमेशा 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबों को झाड़ू दें।
    7. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें। सेल गोली को हटाने के लिए नहीं सावधान रहें। धीरे-धीरे लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) ऊपर और नीचे पाइपिंग करके, और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। समाधान लाल रंग की हो जाएगी क्योंकि लाल रक्त कोशिकाओं को लाइज़ किया जाता है (चित्रा 2 बी)।
      नोट: उपयोग करने से पहले आरटी पर आरबीसी लाइसिस बफर रखें। मुर्गियों में न्यूक्लिएटेड लाल रक्त कोशिकाएं9 होती हैं, और वे प्रीडिपोसाइट्स के साथ टिशू कल्चर व्यंजनों से जुड़ती हैं। आरबीसी लाइसिस बफर का उपयोग सटीक सेल गिनती के साथ उनके हस्तक्षेप को रोकने के लिए इन कोशिकाओं को लाइज करने के लिए किया जाता है।
    8. लाइसिस बफर को पतला करने के लिए कोशिकाओं वाले ट्यूब में 5 एमएल विकास मीडिया जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। एक पिपेट का उपयोग करके, एक नए 50 एमएल ट्यूब में 40 μm सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें और विकास मीडिया के अतिरिक्त 5 मिलीलीटर के साथ छलनी कुल्ला।
    9. आरटी पर 7 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा गोली कोशिकाओं सावधानीपूर्वक सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर में शेष सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
      1. कोशिकाओं की गिनती और सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर, सेल काउंटर और ट्रिपैन ब्लू दाग का उपयोग करें। नमूना के 10 μL ले लो और पाइपिंग द्वारा ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के साथ मिश्रण। हेमटोसाइटोमीटर पर मिश्रण के 10 μL लोड करें और10 मापें।
        नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन गति को 600 एक्स जी तक बढ़ाया जा सकता है यदि प्रारंभिक स्पिन के बाद पर्याप्त सेल छर्रों आसानी से दिखाई नहीं देते हैं।

3. प्रीडिपोसाइट्स की बीजारोपण और संस्कृति

  1. बीज ~ 1 एक्स 10 एक टी -25 फ्लास्क में पूर्व-गर्म विकास मीडिया के 4 एमएल में6 कोशिकाएं। अन्य प्रकार के संस्कृति जहाजों का उपयोग करते समय एक ही चढ़ाना घनत्व का पालन करें। टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखें और रात भर संलग्न करने की अनुमति दें।
    नोट: कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के आर्द्र वातावरण के साथ 38 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया जाताहै। एवियन कोशिकाओं11 के विकास के लिए इष्टतम तापमान 38 डिग्री सेल्सियस है, और वे धीरे-धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं।
  2. अगले दिन, एस्पिरेट मीडिया और धीरे-धीरे असंबद्ध या मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पाइपिंग द्वारा 1 एक्स पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। ताजा विकास मीडिया के 4 एमएल के साथ बदलें। एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जाँच करें। कोशिकाओं को फाइब्रोब्लास्ट्स (चित्रा 2 ए) की तरह स्पिंडली आकार का होना चाहिए।
    नोट: आमतौर पर, प्रीडिपोसाइट्स काफी तेज़ी से संलग्न होते हैं (कुछ घंटों के भीतर)। सेल अलगाव की सफलता या विफलता की पुष्टि इस समय (24 घंटे के बाद) की जा सकती है।
  3. हर 2 दिनों में ताजा विकास मीडिया के 4 मिलीलीटर और उपसंस्कृति या क्रायोप्रिजर्व कोशिकाओं के साथ बदलें जब वे 70% -80% संगम (चित्रा 3 सी) तक पहुंचते हैं।

4. उप-संवर्धन और क्रायोप्रेज़र्वेशन

  1. पुराने मीडिया की आकांक्षा करें और पाइपिंग द्वारा 1 एक्स पीबीएस के 4 एमएल के साथ धीरे-धीरे कोशिकाओं को धो लें। एस्पिरेट पीबीएस, टी -25 फ्लास्क में सेल की सतह को कवर करने के लिए 0.1% ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें (अन्य संस्कृति जहाजों के लिए तदनुसार मात्रा समायोजित करें), और फिर 38 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: निरीक्षण करें कि क्या कोशिकाओं को संस्कृति प्लेट से अलग किया जाता है। सेल टुकड़ी में मदद करने के लिए संस्कृति प्लेट को धीरे से टैप करें। बहुत लंबे समय तक ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाएगा।
  2. ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को बाधित करने के लिए पूर्व-गर्म विकास मीडिया की एक समान मात्रा जोड़ें। सेल की सतह पर पिपेट कई बार, शेष कोशिकाओं को ढीला करने के लिए प्लेट झुकाव।
  3. आरटी (50 एमएल ट्यूब के लिए 7 मिनट) पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर एक 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  4. यदि उपसंस्लन, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। चरण 2.3.9.1 में वर्णित कोशिकाओं की गणना करें और फिर चरण 3.1 में शुरू में उपयोग किए जाने वाले समान चढ़ाना घनत्व का उपयोग करके पुन: प्लेट करें।
  5. यदि क्रायोप्रिजर्विंग है, तो 90% संगम के साथ टी -25 फ्लास्क के लिए 4 एमएल फ्रीजिंग मीडिया तैयार करें।
    नोट: फ्रीजिंग मीडिया में 10% डीएमएसओ, 30% एफबीएस और 60% डीएमईएम /
  6. ठंड मीडिया में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और एक क्रायोवियल में ठंड मीडिया के 1 मिलीलीटर स्थानांतरित करें। एक ठंड कंटेनर का उपयोग करके क्रायोवियल्स को धीरे-धीरे -1 डिग्री सेल्सियस / कंटेनर को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें और फिर इसे दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    नोट: ठीक से क्रायोप्रिजर्व्ड प्रीडिपोसाइट्स कम से कम 3 साल तक अपनी व्यवहार्यता बनाए रखते हैं और आमतौर पर पिघला हुआ और मढ़वाया जाने पर ताजा पृथक कोशिकाओं की तरह प्रदर्शन करते हैं।

5. एडिपोजेनिक भेदभाव

नोट: सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए 2% जिलेटिन-लेपित प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. आसुत जल में 2% (डब्ल्यू / वी) जिलेटिन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव, निष्फल करने के लिए 30 मिनट के लिए 15 साई। सेमी 2 (यानी, 100-200 μg / सेमी2 ) के 5-10 μL के साथ कोट संस्कृतिसतह। सतह को समान रूप से कोट करने के लिए धीरे-धीरे घुमाएं।
  2. जिलेटिन समाधान के प्रसार के लिए प्लेटों की जांच करें क्योंकि कुछ क्षेत्र शुरू में अनकोटेड रह सकते हैं। जिलेटिन लेपित प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर रहने दें। कुओं से जिलेटिन समाधान की पूरी मात्रा निकालें।
    नोट: यह कुओं / व्यंजनों के तल पर एक पतली जिलेटिन कोट छोड़ देगा। जिलेटिन समाधान को सेल आसंजन और विकास को बदले बिना कई बार (कम से कम 10 बार) पुन: उपयोग किया जा सकता है। जिलेटिन लेपित व्यंजन कोशिकाओं चढ़ाना से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति हुड में रहने के लिए अनुमति दें।
  3. फैटी एसिड के साथ विकास मीडिया को पूरक करके एडिपोजेनिक भेदभाव से गुजरने के लिए चिकन प्रीडिपोसाइट्स को प्रेरित करें। एडिपोजेनिक भेदभाव मीडिया (एडीएम) तैयार करने के लिए, 10% चिकन सीरम, 1 एक्स लिनोलिक एसिड-ओलिक एसिड-एल्बुमिन (9.4 μg / एमएल), और 1x P / S ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ डीएमईएम / उपयोग करने से पहले एडीएम को ताजा और गर्म करें।
    नोट: चिकन प्रीडिपोसाइट्स आमतौर पर अन्य प्रजातियों से एडिपोसाइट्स के लिए उपयोग किए जाने वाले हार्मोनल कॉकटेल के बजाय फैटी एसिड के साथ मीडिया को पूरक करके एडिपोजेनिक भेदभाव से गुजरने के लिए प्रेरित होते हैं12.
  4. कोशिकाओं ~ 90% संगम तक पहुँचने पर एडिपोजेनिक भेदभाव मीडिया के साथ विकास मीडिया की जगह भेदभाव प्रेरित। इस मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखें, उन्हें हर 2 दिनों में बदल दें। लिपिड बूंदों के गठन के आधार पर माइक्रोस्कोप (20x) के तहत नेत्रहीन भेदभाव का आकलन करें, जो भेदभाव को प्रेरित करने के 48 घंटे के भीतर आसानी से दिखाई देते हैं।

6. एडिपोजेनेसिस का आकलन करना

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए तेल लाल ओ धुंधला करें।
    1. छह अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को प्लेट करें और ~ 90% संगम पर एडिपोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करें।
    2. 50 मिलीलीटर ट्यूब में आसुत जल के चार भागों के साथ तेल लाल ओ स्टॉक समाधान के छह भागों के संयोजन से तेल लाल ओ का एक कामकाजी समाधान तैयार करें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिश्रण करें और आरटी पर 10 मिनट के लिए खड़े होने दें, और फिर धीरे-धीरे 50 एमएल ट्यूब में समाधान डालकर फ़नल के अंदर ग्रेड 1 फ़िल्टर पेपर ( सामग्री की तालिका देखें) के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      नोट: ऑयल रेड ओ स्टॉक समाधान एक ऑटोक्लेव बोतल में 100% आइसोप्रोपेनोल के 200 मिलीलीटर में 0.7 ग्राम ऑयल रेड ओ ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करके बनाया जाता है। अच्छी तरह मिलाएं और इसे 20 मिनट के लिए छोड़ दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग होने तक प्रकाश से दूर रहें। यह 1 साल के लिए स्थिर है। काम करने वाले समाधान का उपयोग 3 घंटे के लिए किया जा सकता है; हालाँकि, इसे 2 घंटे के भीतर उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    3. मीडिया निकालें और धीरे एक विंदुक का उपयोग कर पूर्व गर्म 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार कुओं को धो लें। पीबीएस को पूरी तरह से पाइपिंग करके निकालें। 10% बफर फॉर्मलिन के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और पैराफिन फिल्म के साथ प्लेट लपेटें। धुंधला होने से पहले कम से कम 1 घंटे और 2 दिनों तक आरटी पर छोड़ दें।
      नोट: 10% बफर किए गए फॉर्मलिन समाधान का 1 एल बनाने के लिए, 37% फॉर्मलाडेहाइड के 100 एमएल, एनएएच2पीओ 4 के4.09 ग्राम, ना2एचपीओ4 के 6.5 ग्राम ( सामग्री की तालिका देखें), और आसुत जल के 900 एमएल मिलाएं। कोशिकाओं पर सीधे फॉर्मलिन पिपेट न करें। कुएं के तल के पास साइडवॉल पर धीरे-धीरे वितरित करें।
    4. फॉर्मलिन निकालें और धीरे-धीरे 2 मिलीलीटर आसुत जल के साथ कुओं को धो लें। 60% आइसोप्रोपेनॉल के 2 एमएल के साथ बदलें। 5 मिनट के बाद, आइसोप्रोपेनॉल को हटा दें और कुओं को लगभग 10 मिनट तक पूरी तरह से सूखने दें। आरटी पर सभी धुंधला चरणों का प्रदर्शन करें।
    5. कोशिकाओं के लिए तेल लाल ओ काम समाधान के 1 एमएल जोड़ें और आरटी पर 10-20 मिनट के लिए सेते हैं पाइपिंग द्वारा दाग निकालें और नल के पानी में डुबकी लगाकर पांच बार धो लें जब तक कि कोई अतिरिक्त दाग न देखा जाए। अंतिम कुल्ला के बाद, धुंधला कल्पना और एक माइक्रोस्कोप के तहत छवियों को इकट्ठा करने से पहले कोशिकाओं के लिए पानी के 1 एमएल जोड़ें।
    6. प्रति डिश लिपिड संचय को मापने के लिए, पानी निकालें और 100% आइसोप्रोपेनॉल के 1-2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं से तेल लाल ओ डाई निकालें जो छह-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में कोशिकाओं को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त है। आरटी पर 10 मिनट के लिए एक प्लेट शेकर पर कोमल मिलाते हुए के साथ सेते हैं।
    7. स्थानांतरण 96 अच्छी तरह से परख प्लेट के एक कुएं में निष्कर्षण के 200 μL. 495 एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्लेट रीडर का उपयोग करके दाग की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करें।
  2. इंट्रासेल्युलर लिपिड बूंदों और नाभिक के धुंधला परख प्रदर्शन.
    1. काले तल 96-अच्छी तरह से प्लेटों में प्लेट कोशिकाएं और चरण 5.3 में वर्णित एडिपोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करती हैं।
    2. कोशिकाओं को दागने के लिए, फ्लोरोसेंट लिपिड दाग और फ्लोरोसेंट डीएनए दाग युक्त धुंधला समाधान के 200 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति 1x पीबीएस में अच्छी तरह से। आवश्यक दाग की कुल मात्रा की गणना करने के बाद, समाधान को प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी-लिपटे ट्यूब का उपयोग करके पूर्व-गर्म 1 एक्स पीबीएस के एमएल प्रति एमएल डीएनए दाग की दो बूंदें और लिपिड दाग के 25 μL जोड़ें। 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं और प्रकाश से रक्षा करते हैं।
    3. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति पढ़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। सियान फिल्टर के माध्यम से लाल फिल्टर और डीएनए दाग (उत्तेजना: 359 एनएम / उत्सर्जन: 450 एनएम) का उपयोग करके लिपिड दाग (उत्तेजना: 485 एनएम / उत्सर्जन: 572 एनएम) का पता लगाएं।
      नोट: धुंधला भी कल्पना की जा सकती है और छवियों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया जा सकता है।
    4. सेल नंबर13 के सापेक्ष लिपिड संचय को मापने के लिए डीएनए दाग तीव्रता के लिए लिपिड दाग तीव्रता को सामान्य करें।

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Representative Results

प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स रूपात्मक रूप से फाइब्रोब्लास्ट के समान होते हैं, अनियमित, स्टार जैसी आकृतियों और एक केंद्रीय नाभिक (चित्रा 2 ए-सी) के साथ। कोशिकाएं आसानी से टिशू कल्चर प्लास्टिक का पालन करती हैं और लगाव के तुरंत बाद फैलना शुरू कर देती हैं। वे तेजी से अंतर और मीडिया में फैटी एसिड के साथ प्रदान की जब लिपिड बूंदों (चित्रा 3 डी) जमा करते हैं। यहां प्रतिनिधित्व किए गए अलगावों में रिपोर्ट की गई व्यवहार्यता (डाई बहिष्करण के आधार पर 98%)विशिष्ट है। जबकि कोशिकाएं काफी मजबूत होती हैं, अलगाव के दौरान आक्रामक हैंडलिंग सेल क्षति (चित्रा 3 ई) की ओर जाता है, जो कोशिकाओं को खराब रूप से संलग्न करता है और प्रसार करने में विफल रहता है। माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए शामिल प्रक्रियाओं के बावजूद, गैर-बाँझ सामग्री का हस्तांतरण हो सकता है (चित्रा 3 एफ)। उनकी तेजी से वृद्धि दर के कारण, चिक भ्रूण प्रीडिपोसाइट्स उच्च दर पर मीडिया में ग्लूकोज का उपभोग करते हैं। ऊर्जा की आपूर्ति को बनाए रखने के लिए मीडिया को हर 48 घंटे में बदलना चाहिए।

यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम चिक भ्रूण प्रीडिपोसाइट्स की एडिपोजेनिक क्षमता को दर्शाते हैं। ये कोशिकाएं जल्दी से एडिपोजेनिक स्थितियों के तहत लिपिड बूंदों को विकसित करने के लिए जमा होती हैं, और समय के साथ संचय आगे बढ़ता है (चित्रा 4 और चित्रा 5)। दो विधियों को प्रस्तुत किया गया है जिनका उपयोग इन कोशिकाओं में लिपिड संचय की डिग्री को बेहतर ढंग से कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जो एडिपोजेनेसिस का प्रत्यक्ष प्रतिबिंब है। तेल लाल ओ के साथ धुंधला लिपिड लिपिड बूंदों (चित्रा 4) के संचय की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कम लागत वाली विधि है। छवियों को इकट्ठा करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, और छवियों को एकत्र किए जाने तक बेंचटॉप पर दाग वाली कोशिकाओं को रखा जा सकता है। कोशिकाओं के प्रत्येक पकवान में लिपिड संचय को दाग निकालने और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 495 एनएम पर अवशोषण को पढ़कर वर्णित किया जा सकता है। चयनित लिपिड और डीएनए दाग के संयोजन का उपयोग करते हुए, सेल नंबर के सापेक्ष लिपिड संचय को निर्धारित करना संभव था, जो गैर-एडिपोजेनिक कोशिकाओं के लिए क्षतिपूर्ति करता है जो संस्कृति (चित्रा 5) में बने रह सकते हैं। यदि उपाय कई समय बिंदुओं (चित्रा 5 बी-सी) पर किए जाते हैं, तो यह संयोजन एडिपोजेनेसिस और प्रसार दोनों का आकलन करना संभव बनाता है, उदाहरण के लिए अतिरिक्त हार्मोन या पेप्टाइड्स के जवाब में।

Figure 1
चित्रा 1: वसा ऊतक संग्रह( ए) अंडे के छिलके को तोड़ने पर, सफेद खोल झिल्ली का पता चला था। (बी) बाँझ चिमटी का उपयोग करके एमनियन को भेदी करना। (सी) ई 16 से कुल ~ 80 मिलीग्राम ऊरु चमड़े के नीचे वसा प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एंजाइमी पाचन के लिए ऊतक के टुकड़े और पाचन के बाद सेल गोली( ए) एंजाइमी समाधान में कीमा बनाया हुआ वसा ऊतक (~ 1 मिमी3)। (बी) तीर आरबीसी लिसिस के बाद सेल छर्रों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पृथक प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स की सेल आकृति विज्ञान तुलना( ए) अलगाव के बाद 24 घंटे में प्रीडिपोसाइट्स। (बी) अलगाव के बाद 48 घंटे में प्रीडिपोसाइट्स। (सी) अलगाव के बाद 72 घंटे में 80% संगम के साथ प्रीडिपोसाइट्स। (डी) मार्ग 4 पर 48 घंटे एडिपोजेनिक प्रेरण के बाद प्रीडिपोसाइट्स, लिपिड बूंदें दिखाई देती हैं। इनसेट लिपिड बूंदों की आवर्धित छवि को इंगित करता है। (ई) क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवि। (एफ) तीर दूषित संस्कृति में काले तैराकी डॉट्स को इंगित करता है। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: तेल लाल ओ धुंधला द्वारा लिपिड संचय का मूल्यांकन (ए) 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे एडिपोजेनिक भेदभाव पूर्व विवो के बाद ई 16 प्रीडिपोसाइट्स के तेल लाल ओ धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। स्केल सलाखों = 100 μm. (ख) तेल लाल हे धुंधला के क्षालन द्वारा मापा लिपिड बूंदों का ठहराव। ए , बी, सी पी < 0.05 को पोस्टहॉक टुकी के एचएसडी परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा द्वारा माध्य ± रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
डीएनए दाग द्वारा एडिपोसाइट भेदभाव का आकलन (ए) लिपिड दाग (लाल) की प्रतिनिधि छवियां और 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे एडिपोजेनिक भेदभाव पूर्व विवो के बाद ई 16 प्रीडिपोसाइट्स का डीएनए (नीला) धुंधला हो जाना। स्केल बार = 150 μm. (बी) लिपिड धुंधला (उत्तेजना: 485 एनएम / उत्सर्जन: 572 एनएम) विभेदित प्रीडिपोसाइट्स में लिपिड संचय का आकलन करने के लिए किया गया था। (सी) डीएनए धुंधला (उत्तेजना: 359 एनएम / उत्सर्जन: 450 एनएम) कोशिकाओं की संख्या में भिन्नता का आकलन करने के लिए किया गया था। (डी) लिपिड और डीएनए दाग का अनुपात। लिपिड संचय डीएनए सामग्री के लिए सामान्यीकृत है। ए, बी, सी पी ± < 0.05 को पोस्टहॉक टुकी के एचएसडी परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा द्वारा माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आयु (एन =) x106 कोशिकाओं/100 मिलीग्राम ऊतक व्यवहार्यता (%)
ई 12 (4) 0.97 ± 0.115 ए, बी 98.5 ± 0.58 ए
ई 14 (4) 1.22 ± 0.232 ए, बी 98.3 ± 0.96 ए, बी
ई 16 (21) 1.61 ± 1.717 एक 97.6 ± 1.58 ए
ई 17 (4) 0.81 ± 0.282 ए, बी 96.8 ± 2.63 ए, बी
ई 18 (7) 0.72 ± 0.611 ए, बी 95.9 ± 1.81 ए, बी
ई 20 (4) 0.94 ± 0.171 ए, बी 97.8 ± 0.8 ए, बी
डी 4 (9) 0.24 ± 0.164 ए, बी 93.6 ± 4.28 बी
डी 5 (4) 0.25 ± 0.073 ए, बी 98.5 ± 0.71 ए, बी
डी 7 (10) 0.17 ± 0.162 बी 96.8 ± 3.49 ए, बी
D14 (4) 0.25 ± 0.051 ए, बी 99.0 ± 0.00 ए, बी

तालिका 1: भ्रूण और पोस्ट-हैच चूजों से पृथक कोशिकाओं की औसत सेल संख्या और व्यवहार्यता।
ए , बी पी ± < 0.05 को पोस्टहॉक टुकी के एचएसडी परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा द्वारा व्यक्त किया जाता है।

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Discussion

यद्यपि कई अच्छी तरह से वर्णित प्रोटोकॉल ने प्रीडिपोसाइट्स 14,15,16,17 के अलगाव की सूचना दी है, भ्रूण प्रीडिपोसाइट्स के लिए अलगाव को अनुकूलित किया गया है, जिसका उपयोग ब्रॉयलर चूजों में प्रारंभिक जीवन वसा वृद्धि और विकास के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल उच्च भेदभाव क्षमता के साथ उच्च व्यवहार्यता भ्रूण आदिपोसाइट पूर्वजों पैदावार। इसके अलावा, प्रीडिपोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रस्तुत प्रक्रिया भ्रूण तक सीमित नहीं है, बल्कि पोस्ट-हैच चूजों में इस्तेमाल की जा सकती है। हालांकि, इसे ई 16 भ्रूण के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, और हैच के बाद चूजों से पैदावार काफी कम है (तालिका 1), संभवतः संयोजी ऊतक की सापेक्ष मात्रा में वृद्धि के कारण चूजे तेजी से बढ़ते हैं।

सेल अलगाव की सफलता अंततः संलग्न कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) के आकार और संख्या का अवलोकन करके मूल्यांकन किया जाता है। कम सेल संख्या या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को देखा जा सकता है जब ऊतक अंश बहुत लंबे समय तक पच जाते हैं, खासकर जब ऊतक पृथक्करण 1.5 घंटे (चित्रा 3 ई) से अधिक के लिए प्रगति करता है। इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि पाचन का 1.5 घंटे पार नहीं किया जाता है। दूसरी ओर, यदि पाचन के एक घंटे के बाद ऊतक का टुकड़ा स्पष्ट रूप से रहता है, तो पाचन समय या मात्रा में वृद्धि की जानी चाहिए। प्राप्त वसा ऊतक राशि भी चिकन के आनुवंशिक तनाव के आधार पर भिन्न हो सकती है। यदि इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य उम्र या प्रजातियों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है, तो कोलेजनेज और पाचन समय दोनों की मात्रा को संशोधित करने की आवश्यकता होगी।

प्राथमिक सेल संस्कृति की एक सामान्य सीमा यह है कि संस्कृति में कई मार्गों के बाद पृथक कोशिकाएं एडिपोजेनिक क्षमता खोना शुरू कर देती हैं; इस प्रकार, यह सुनिश्चित करने के लिए अलगाव के कुछ दिनों के भीतर भेदभाव को प्रेरित करना महत्वपूर्ण है कि भ्रूण प्रीडिपोसाइट्स अपनी एडिपोजेनिक क्षमता को न खोएं। भ्रूण के एडिपोजेनिक अग्रदूत संगम या हार्मोनल प्रेरण की आवश्यकता के बिना, ऊपर वर्णित मीडिया फॉर्मूलेशन में परिपक्व एडिपोसाइट्स में आसानी से अंतर करते हैं। पारित करने के लिए कोशिकाओं 4 (10-14 दिनों) आसानी से प्रलोभन (चित्रा 3 डी) के 48 घंटे के भीतर विभेदित कर रहे हैं।

प्राथमिक सेल संस्कृति में सेल संदूषण को नियंत्रित करना एक और चुनौती है, जहां फंगल संदूषण सबसे आम है। एम्फोटेरिसिन बी का उपयोग, जैसा कि वर्णित है, आमतौर पर कवक विकास18,19 को रोकने में प्रभावी है। इसे व्यवहार्यता या एडिपोजेनिक क्षमता पर कोई ध्यान देने योग्य प्रभाव के साथ संस्कृति मीडिया में कम सांद्रता पर शामिल किया जा सकता है। सेल अलगाव (चित्रा 3 एफ) के कुछ दिनों बाद दिखाई देने वाले काले तैराकी डॉट्स के रूप में अज्ञात माइक्रोबियल दूषित पदार्थों को देखा गया है। ये कोशिका वृद्धि पर प्रतिकूल प्रभाव डालते थे और इस संक्रमण के20 होने के बाद इसे हटाना असंभव था। क्या ये दूषित पदार्थ एक अज्ञात माइक्रोबियल प्रजाति थे जो अंडे में या उस पर पाए जाते थे या किसी अन्य स्रोत से उत्पन्न होते थे, अज्ञात है। यह प्रोटोकॉल अंडे21 से भ्रूण निकालकर संदूषण के जोखिम को कम करने का प्रयास करता है। विच्छेदन के दौरान हुड में एक गर्मी आधारित उपकरण अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ का उपयोग भी संदूषण की क्षमता को कम करने में मदद करता है, खासकर जब कई भ्रूण विच्छेदित होते हैं।

प्रक्रिया में एक विचार भेदभाव के दौरान टिशू कल्चर प्लेट के लिए सेल आसंजन कम हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं बनती हैं और लिपिड बूंदों का विस्तार करती हैं। यद्यपि कोशिकाओं के भीतर निहित, लिपिड बूंदें उत्साही होती हैं और, जब बड़ी होती हैं, तो गुब्बारे के रूप में कार्य करती हैं जो सतह से उठाने वाली कोशिकाओं को बढ़ावा देती हैं। इस प्रकार, भेदभाव को प्रेरित करते समय प्रीडिपोसाइट्स को संभालने में देखभाल की जानी चाहिए, और विशेष रूप से जब एडिपोजेनेसिस का मूल्यांकन किया जाता है। जबकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल संस्कृति की सतह को संशोधित नहीं करता है, सेल आसंजन को बढ़ाया जा सकता है जब 2% जिलेटिन के साथ लेपित व्यंजनों पर कोशिकाओं को चढ़ाना। 7.4 होने के लिए धोने के समाधान के पीएच की पुष्टि करना और ठंडे तनाव को कम करने के लिए कोशिकाओं को धोते समय और डीएनए दाग के साथ मिश्रण करते समय पूर्व-गर्म पीबीएस समाधान का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है।

कई भ्रूणों का उपयोग करके, कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या को कई मार्गों, विस्तार और कोशिकाओं की अपनी एडिपोजेनिक क्षमता खोने के जोखिम के बिना प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां उत्पन्न करने के लिए अलग किया जा सकता है। आरएनए को जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए फिनोल- या झिल्ली-आधारित वाणिज्यिक तरीकों का उपयोग करके पूर्व और विभेदित चिक भ्रूण एडिपोसाइट्स दोनों से आसानी से अलग किया जा सकता है। सीडीएनए संश्लेषण और अनुवर्ती क्यूपीसीआर या आरएनएसेक में उपयोग के लिए छह-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं से पर्याप्त आरएनए प्राप्त किया जा सकता है।

संक्षेप में, सेल मॉडल को अलग करने के लिए चूजे के भ्रूण में वसा डिपो की पहुंच पोल्ट्री और मनुष्यों दोनों के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। यह प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, और यह व्यवहार्य कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत पैदा करता है जिसे आसानी से इन विट्रो में एडिपोजेनिक भेदभाव से गुजरने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। निषेचित चिकन अंडे न्यूनतम लागत के लिए विभिन्न वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए जा सकते हैं, जिससे ये कोशिकाएं व्यावहारिक उपयोग के लिए आसानी से उपलब्ध मॉडल बन जाती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल का समर्थन और अनुकूलन करने के लिए यूटी एग्रीसर्च और पशु विज्ञान विभाग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूएसडीए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Pipette Eppendorf Z683825 Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip Fisher Scientific 02-707-402
100% Isopropanol Fisher Scientific A426P4
1x PBS Gibco 10010023
25 mL Flask Pyrex 4980-25
37% Formaldehyde Fisher Scientific F75P-1GAL
6-Well Plate Falcon 353046 Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate Costar 3632
96-Well Plate, Black Bottom Costar 3603 Tissue Culture-treated
AdipoRed Lonza PT-7009
Amphotericin B Gibco 15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper) Kimberly-Clark 34155
Betadine Up & Up NDC 1167300334 20% Working Solution
Cell Counter Corning 6749
Cell Strainer, 40 µm SPL 93040
Centrifugaton Eppendorf 5702
Chicken Serum Gibco 16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL VWR 10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL Falcon 352098
Cryovial Nunc 343958
Curved Forceps, 100 mm Roboz Surgical RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm Roboz Surgical RS-6839
Distilled Water Millipore SYNSV0000 Despensed as needed
DMEM/F12 HyClone SH30023.01
DMSO Sigma D2650
Ethanol Decon Labs 2701 70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
Fluorescent Microscope EVOS M7000
Fluorescent Plate Reader Biotek Synergy H1
Foil Reynolds Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
Gelatin Millipore 4055 2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber) Corning 480200 0.1 mm deep
Incubator Fisher Scientific 6845
Instrument Sterilizer VWR B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin Sigma L9655 1x Working Solution
Microscope Evos AMEX1000
Multi-Channel Pipette Thermo Scientific 4661070 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4 Sigma S-7907
NaH2PO4 Sigma S-3139
NucBlue Invitrogen R37605
Oil Red O Sigma O-0625
Orbital Shaker IKA KS130BS1
Paper Towel Tork RK8002
Parafilm Parafilm M PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S) Gibco 15140122 1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm Falcon 351029
Petri dishes, 60 mm Falcon 351007
Plate Shaker VWR 200
RBC Lysis Buffer Roche 11814389001
Reagent Reservior VWR 89094-680
Small Beaker, 100 mL Pyrex 1000-100
Spectrophotometer Plate Reader Biotek Synergy H1
Sterile Gauze McKesson 762703
Straight Forceps, 120 mm Roboz Surgical RS-4960
Straight Scissors, 140 mm Roboz Surgical RS-6762
T-25 Flask Corning 430639 Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific 50144906
Tissue Strainer, 250 µm Pierce 87791
Trypan Blue Stain Gibco 15250061
Trypsin Gibco 15400054 0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm Roboz Surgical RS-5035
Type 1 Collagenase Gibco 17100017
Water Bath Fisher Scientific 15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-110

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 186
ब्रॉयलर चिक भ्रूण से प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव
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Kim, M., Jung, U., Shepherd, E.,… More

Kim, M., Jung, U., Shepherd, E., Mihelic, R., Voy, B. H. Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos. J. Vis. Exp. (186), e63861, doi:10.3791/63861 (2022).

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