Summary
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het isoleren van preadipocyten uit vetweefsel in vleeskuikenembryo's. Deze methode maakt isolatie mogelijk met een hoge opbrengst, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten. Olie Rode O-kleuring en lipide/ DNA-kleuring maten het adipogene vermogen van geïsoleerde cellen geïnduceerd met differentiatiemedia.
Abstract
Primaire preadipocyten zijn een waardevol experimenteel systeem voor het begrijpen van de moleculaire routes die de differentiatie en het metabolisme van adipocyten regelen. Kippenembryo's bieden de mogelijkheid om preadipocyten te isoleren vanaf het vroegste stadium van de ontwikkeling van vetstoffen. Deze primaire cel kan worden gebruikt om factoren te identificeren die de proliferatie van preadipocyten en adipogene differentiatie beïnvloeden, waardoor ze een waardevol model zijn voor studies met betrekking tot obesitas bij kinderen en de controle van overtollige vetafzetting bij pluimvee. De snelle groei van postnatale vetweefsel verspilt effectief voer door het weg te trekken van spiergroei bij vleeskuikens. Daarom kunnen methoden om de vroegste stadia van de ontwikkeling van vetweefsel te begrijpen aanwijzingen geven om deze neiging te reguleren en manieren te identificeren om vetexpansie vroeg in het leven te beperken. De huidige studie was ontworpen om een efficiënte methode te ontwikkelen voor isolatie, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten geïsoleerd uit het ontwikkelen van vetweefsel van commerciële vleeskuiken (vleestype) kuikenembryo's. De procedure is geoptimaliseerd om cellen op te leveren met een hoge levensvatbaarheid (~ 98%) en een verhoogd vermogen om te differentiëren tot volwassen adipocyten. Deze eenvoudige methode van embryonale preadipocytenisolatie, -cultuur en -differentiatie ondersteunt functionele analyses van vetgroei en -ontwikkeling in het vroege leven.
Introduction
Obesitas is een wereldwijde bedreiging voor de gezondheid van zowel volwassenen als kinderen. Kinderen met overgewicht of obesitas hebben ongeveer vijf keer meer kans om zwaarlijvig te zijn als volwassenen, waardoor ze een aanzienlijk verhoogd risico lopen op hart- en vaatziekten, diabetes en vele andere comorbiditeiten. Ongeveer 13,4% van de Amerikaanse kinderen van 2-5 jaar heeft obesitas1, wat illustreert dat de neiging om overtollig lichaamsvet te accumuleren al heel vroeg in het leven in gang kan worden gezet. Om heel verschillende redenen is de ophoping van overtollig vetweefsel een zorg voor vleeskuikens (vleesachtige) kippen. Moderne slachtkuikens zijn ongelooflijk efficiënt, maar accumuleren nog steeds meer lipiden dan fysiologisch noodzakelijk is 2,3. Deze neiging begint kort na het uitkomen en verspilt effectief voer, de duurste productiecomponent, door het weg te trekken van spiergroei. Daarom is het voor zowel kinderen als vleeskuikens, zij het om heel verschillende redenen, nodig om factoren te begrijpen die de ontwikkeling van vetweefsel beïnvloeden en manieren te vinden om vetexpansie vroeg in het leven te beperken.
Adipocyten vormen zich uit preadipocyten, van vetweefsel afgeleide stamcellen die differentiatie ondergaan om volwassen, lipide-opslaande vetcellen te ontwikkelen. Dienovereenkomstig zijn preadipocyten in vitro een waardevol experimenteel model voor obesitasstudies. Deze cellen, geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van vetdepots, kunnen een fundamenteel begrip bieden van moleculaire routes die de differentiatie van adipocyten en het metabolisme regelen 4,5. Kuikenembryo's zijn een gunstig experimenteel model in ontwikkelingsstudies omdat het kweken van eieren volgens het gewenste schema experimentele manipulatie gemakkelijker maakt, omdat het het verkrijgen van embryo's mogelijk maakt zonder het offer van de moeder om een reeks ontwikkelingsstadia van embryo's te observeren. Bovendien zijn gecompliceerde chirurgische procedures en lange perioden niet nodig om embryo's te verkrijgen ten opzichte van grotere diermodellen. Daarom biedt het kuikenembryo een kans om preadipocyten te verkrijgen uit de vroegste stadia van de ontwikkeling van vetweefsel. Onderhuids vetweefsel wordt zichtbaar in het kuiken rond embryonale dag 12 (E12) als een duidelijk gedefinieerd depot rond de dij. Dit depot is verrijkt met zeer proliferatieve preadipocyten die actief differentiatie ondergaan onder ontwikkelingssignalen om volwassen adipocyten te vormen 6,7. Het proces van adipogene differentiatie is vergelijkbaar tussen kippen en mensen. Daarom kunnen preadipocyten geïsoleerd uit kuikenembryo's worden gebruikt als een model met twee doelen voor studies die relevant zijn voor mens en pluimvee. De opbrengst van preadipocyten neemt echter af met veroudering naarmate cellen uitgroeien tot volwassen adipocyten5.
Het huidige protocol optimaliseert de isolatie van preadipocyten uit vetweefsel tijdens het stadium (E16-E18) waarin adipogene differentiatie en adipocytenhypertrofie op hun hoogtepunt zijn in vleeskuikenembryo's8. Deze procedure kan de effecten beoordelen van factoren waaraan het zich ontwikkelende embryo in ovo wordt blootgesteld, zoals het kippendieet, op de ontwikkeling van adipocyten en adipogene potentie ex vivo. Het kan ook de impact testen van verschillende manipulaties (bijv. Hypoxie, toevoegingen van voedingsstoffen, farmacologische agonisten en antagonisten) op adipogenese of de verschillende 'omes(bijv. Transcriptoom, metaboloom, methyloom) van adipocytenvoorlopers. Als een weergave van het vroegste stadium van vetvorming, zijn cellen verkregen met behulp van dit protocol waardevolle modellen voor studies die relevant zijn voor pluimvee en mensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee. Vers bevruchte commerciële vleeskuikeneieren (Cobb 500) werden verkregen van een lokale broederij. Eieren werden bebroed bij 38 °C met 60% relatieve vochtigheid tot dissecties op embryonale dagen 16-18 (E16-E18). Vetweefsel werd verzameld uit het onderhuidse (femorale) depot.
1. Voorbereiding op isolatie en cultuur
- Bereid de kweekkap en de instrumenten voor.
- Voordat u begint met dissecties, stelt u een werkgebied in de laminaire stromingskap in. Desinfecteer het werkgebied en alle instrumenten door te vegen met 70% ethanol. Voer alle procedures uit met steriele materialen.
OPMERKING: Veeg de containers en instrumenten altijd uit met 70% ethanol voordat u ze terug in de celkweekkap plaatst. Het wordt aanbevolen om een benchtop instrument sterilisator in de kap te plaatsen, zodat instrumenten gemakkelijk tussen embryo's kunnen worden gesteriliseerd.
LET OP: Wanneer u een instrumentsterilisator gebruikt, koelt u het hete instrument goed af om brandwonden en weefselschade te voorkomen. Een minimale koeltijd van 3 minuten wordt aanbevolen. Wattenstaafje met 70% ethanol voor gebruik. - Monteer de volgende instrumenten en vaten in de kap: rechte tang (120 mm), pincet (110 mm), twee paar gebogen tangen (100 mm), twee paar rechte scharen (140 mm), gebogen chirurgische scharen (115 mm), weefselzeef (250 μm nylon gaas), celzeef (40 μm nylon gaas), conische centrifugebuizen (15 ml en 50 ml), petrischalen (60 mm en 100 mm), klein bekerglas (100 ml), 70% ethanolspray en steriel gaas, papieren handdoek en tafelwisser (zie materiaaltabel).
- Voordat u begint met dissecties, stelt u een werkgebied in de laminaire stromingskap in. Desinfecteer het werkgebied en alle instrumenten door te vegen met 70% ethanol. Voer alle procedures uit met steriele materialen.
- Bereid enzymatische oplossingen, verzamelmedia en cultuurmedia voor volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Bereid oplossingen van tevoren voor en bewaar bij 4 °C tot gebruik. Media moeten op ijs worden geplaatst voordat weefsel wordt verzameld. Alle reagentia die in deze stap worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen.- Bereid media die worden gebruikt voor zowel het verzamelen van vetweefsel als de bereiding van enzymatische oplossing door DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium met 2,50 mM L-glutamine en 15 mM HEPES-buffer) aan te vullen met 2,5 μg/ml amfotericine B en 1x penicilline/streptomycine (P/S), 100 U/ml. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
OPMERKING: Dit medium blijft 1 jaar stabiel bij opslag bij 4 °C. - Bereid sterilisatieoplossing door Betadine te verdunnen tot 20% (v/v) in 1x PBS (Phosphate Buffered Saline met pH 7,4, zonder calcium, magnesium of fenolrood) met 2,5 μg/ml amfotericine B. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
OPMERKING: De oplossing is 2 jaar stabiel bij opslag bij 4 °C. - Bereid enzymatische oplossing door type 1 collagenase (1 mg/ml) op te lossen in DMEM/F12 met 2,5 μg/ml amfotericine B en 1x P/S (stap 1.2.1). Maak verse collagenase-oplossing en onderhoud deze op ijs tijdens dissecties. Ongeveer 10 minuten voor gebruik, voorverwarmen door deze oplossing bij 37 °C in een waterbad te incuberen om de enzymatische activiteit te starten.
OPMERKING: Ongeveer 1 ml collagenase-oplossing (1 mg / ml) is nodig per 100 mg vetweefsel. - Bereid groeimedia voor die worden gebruikt voor plating en vermeerdering door DMEM/F12-media aan te vullen met 1x P/S en 10% FBS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
OPMERKING: De oplossing is 1 jaar stabiel bij bewaring bij 4 °C. - Bereid de wasoplossing door 1x PBS aan te vullen met 2,5 μg/ml amfotericine B. Pas de oplossing aan op de gewenste pH 7,4. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
OPMERKING: De oplossing is 2 jaar stabiel bij opslag bij 4 °C.
- Bereid media die worden gebruikt voor zowel het verzamelen van vetweefsel als de bereiding van enzymatische oplossing door DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium met 2,50 mM L-glutamine en 15 mM HEPES-buffer) aan te vullen met 2,5 μg/ml amfotericine B en 1x penicilline/streptomycine (P/S), 100 U/ml. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
2. Vetweefselverzameling en spijsvertering
- Euthanaseer het embryo.
- Verwijder op embryonale dag 16 de eieren uit de couveuse. De primaire potentiële bron van microbiële besmetting is het oppervlak van het ei; veeg daarom de eieren uit met een steriel gaasje gedrenkt in 70% ethanol voordat je ze kraakt. Na het afvegen, plaats het ei verticaal met het puntige uiteinde naar beneden op een klein bekerglas (100 ml) bekleed met papieren handdoeken om het ei uit het glas te dempen.
- Gebruik het handvat van de tang om een ei te breken door op het stompe uiteinde van het ei te tikken. Verwijder voorzichtig de eierschaal om een opening te creëren die groot genoeg is om het embryo te verwijderen (stap 2.1.3). Scheur voorzichtig het witte schilmembraan om het embryo bloot te stellen (figuur 1A). Prik het amnion voorzichtig door met een steriel pincet (figuur 1B).
OPMERKING: De vruchtzak is een transparant membraan gevuld met vruchtwater dat het embryo omsluit. - Verwijder het embryo uit het ei door de nek van het embryo lichtjes vast te pakken met een rechte tang. Breek de dooierzak af om deze los te koppelen van het embryo en breng het embryo over naar een petrischaaltje van 100 mm.
- Onthoofd onmiddellijk met een chirurgische schaar en tang.
- Voer de verzameling vetweefsel uit.
- Wattenstaaf het embryolichaam met 70% ethanol en scrub het huidoppervlak voorzichtig met een steriel gaasje om veren te verwijderen, omdat ze de filtratie in latere stappen na de spijsvertering kunnen verstoren. Gebruik bankwissers om te voorkomen dat de huid en veren verzameld weefsel raken.
- Snijd de huid tussen de benen en het abdominale gebied af om het paar femorale vetdepots te onthullen.
- Houd de huid rond het been met een gebogen tang met één hand. Verwijder voorzichtig het femorale onderhuidse vet met de andere hand, gebruik een gebogen tang om het depot voorzichtig weg te trekken van het been.
OPMERKING: Er is relatief weinig bindweefsel dat zich hecht aan het vetkussen aan het been en het hele vetkussen moet uit één stuk worden verwijderd met alleen een tang. Dit kan worden vergemakkelijkt door de tang naar achteren te houden, zodat de gebogen delen (in plaats van de uiteinden) het vetkussen klemmen voor verwijdering.- Knip desnoods het vetkussen weg met een gebogen schaar. Herhaal dit met het andere vetkussen en extra embryo's indien nodig.
OPMERKING: Uit de meeste embryo's kan in totaal 80 mg onderhuids vet worden verkregen bij E16 (figuur 1C). Dit levert meestal ~ 1 x 106 cellen op, voldoende om één T-25 kolf te plaatsen. Het kan bij deze stap nuttig zijn om vetkussens van een paar embryo's te wegen om de hoeveelheid uitgangsmateriaal te beoordelen, omdat vetkussengewichten kunnen variëren tussen specifieke vleeskuikenlijnen en vanwege oncontroleerbare factoren, zoals de leeftijd van de fokker en het dieet. Onderhuids vet werd routinematig verzameld uit vijf eieren om een adequate opbrengst van cellen te garanderen voor plating in meerdere kolven.
- Knip desnoods het vetkussen weg met een gebogen schaar. Herhaal dit met het andere vetkussen en extra embryo's indien nodig.
- Breng de weefsels over in ~ 5 ml verzamelmedia in een buis van 15 ml en herhaal de dissectie voor de resterende eieren.
- Spoel de verzamelde vetkussens kort af door ze over te brengen naar een petrischaaltje van 60 mm met sterilisatieoplossing en de schaal een paar keer te draaien.
- Spoel de sterilisatieoplossing af door vetkussens over te brengen naar een petrischaaltje van 60 mm met 1x PBS. Draai zachtjes. Herhaal deze stap door over te zetten naar een tweede petrischaaltje van 60 mm met 1x PBS.
- Voer enzymatische spijsvertering en preadipocytenisolatie uit volgens de onderstaande stappen.
- Breng de vetweefsels over in een buis van 15 ml met ~ 1 ml voorverwarmde enzymatische oplossing per 100 mg weefsel. Dompel een lange, rechte schaar onder in de buis en hak de vetweefsels fijn in de oplossing in zo klein mogelijke stukjes (~1 mm3) (figuur 2A).
OPMERKING: De celopbrengst zal worden verminderd als de weefsels niet grondig worden gehakt. - Breng het gehakte weefsel en de enzymatische oplossing over in een kolf van 25 ml met autoclaaf. Wikkel de kolf in met paraffinefolie. Plaats op een orbitale shaker in een couveuse en schud op 37 °C tijdens de verteringsstap.
OPMERKING: U kunt ook een schuddend waterbad gebruiken. Bij beide benaderingen moet de snelheid voldoende zijn om te voorkomen dat stukjes weefsel zich op de bodem van de kolf nestelen, maar mag niet zo snel zijn dat stukken naar de bovenkant van de kolf worden voortgestuwd en aan het glas blijven kleven, of dat vloeistof zich ophoopt op het paraffinefilmdeksel. - Snijd na ~ 30 minuten het uiteinde van een pipetpunt van 1 ml tot een diameter van ongeveer 3 mm. Pipetteer het weefselmengsel een paar keer op en neer om de cellen uit het vetweefsel vrij te maken. Breng de kolf terug naar de couveuse/het waterbad en hervat het schudden.
- Controleer na nog eens 15 minuten de kolf op volledigheid van de spijsvertering. Na het verwijderen van de kolf uit de shaker, zal zich een laag witachtige cellen vormen aan de bovenkant van de vloeistoflaag. Als er nog steeds weefselfragmenten overblijven, snijdt u het uiteinde van een andere pipetpunt en pipet u het mengsel voorzichtig op en neer en blijft u nog eens 15 minuten schudden.
OPMERKING: Volledig verteerd weefsel / collagenasemengsel ziet eruit als melkachtige chyme. Meestal is weefsel voldoende verteerd na 1 uur zacht schudden. Als er op dit punt veel fragmenten achterblijven, kan dit wijzen op een probleem met het gebruikte collagenase-enzym. Constant schudden kan de opbrengst verhogen; langdurige blootstelling aan het enzym en de fysieke stress kan echter ook de cellen beschadigen. - Pipet na de spijsvertering voorzichtig op en neer om goed te mengen. Filter door een weefselzeef van 250 μm in een buis van 15 ml door te pipetteren om stukjes onverteerd weefsel en puin te verwijderen.
- Spoel de kolf af met 4 ml groeimedia door te pipetteren om cellen te verwijderen die aan het glas kunnen worden gehecht en filter in dezelfde buis van 15 ml. Spoel de zeef af met extra groeimedia door te pipetteren om eventuele gevangen cellen los te maken, tot een totaal volume van 14 ml.
- Pellet de celfractie door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij RT (7 min voor 50 ml buis).
OPMERKING: Veeg de buizen altijd uit met 70% ethanol voordat u terugkeert naar de celkweekkap. - Aspirateer het supernatant. Pas op dat u de celpellet niet losmaakt. Resuspenseer de pellet voorzichtig in 1 ml rode bloedcellysisbuffer (zie Materiaaltabel) door op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. De oplossing wordt roodachtig als rode bloedcellen worden gelyseerd (figuur 2B).
OPMERKING: Plaats de RBC-lysisbuffer voor gebruik op RT. Kippen hebben nucleated rode bloedcellen9, en ze hechten zich aan weefselkweek gerechten samen met preadipocyten. RBC-lysisbuffer wordt gebruikt om deze cellen te lyseren om hun interferentie met nauwkeurige celtellingen te voorkomen. - Voeg 5 ml groeimedia toe aan de buis met de cellen om de lysisbuffer te verdunnen en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Filtreer met behulp van een pipet door een celzeef van 40 μm in een nieuwe buis van 50 ml en spoel de zeef af met nog eens 5 ml groeimedia.
- Pelletcellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 7 minuten bij RT. Adem het supernatant voorzichtig op en resuspendeer de resterende celkorrel in 1 ml groeimedia door op en neer te pipetteren.
- Gebruik een hemocytometer, celteller en Trypan Blue-kleuring om cellen te tellen en de levensvatbaarheid van cellen te bepalen. Neem 10 μL monster en meng met 10 μL Trypan Blue door pipetteer. Laad 10 μL van het mengsel op de hematocytometer en meet10.
OPMERKING: Centrifugatiesnelheden kunnen worden verhoogd tot 600 x g als voldoende celpellets niet direct zichtbaar zijn na de eerste spin.
- Gebruik een hemocytometer, celteller en Trypan Blue-kleuring om cellen te tellen en de levensvatbaarheid van cellen te bepalen. Neem 10 μL monster en meng met 10 μL Trypan Blue door pipetteer. Laad 10 μL van het mengsel op de hematocytometer en meet10.
- Breng de vetweefsels over in een buis van 15 ml met ~ 1 ml voorverwarmde enzymatische oplossing per 100 mg weefsel. Dompel een lange, rechte schaar onder in de buis en hak de vetweefsels fijn in de oplossing in zo klein mogelijke stukjes (~1 mm3) (figuur 2A).
3. Zaaien en kweken van preadipocyten
- Zaad ~ 1 x 106 cellen in 4 ml voorverwarmde groeimedia in een T-25 kolf. Volg dezelfde beplatingsdichtheid als u andere soorten kweekvaten gebruikt. Plaats in de incubator voor weefselkweek en laat een nacht hechten.
OPMERKING: Cellen worden gekweekt in een incubator van 38 °C met een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. De optimale temperatuur voor de groei van vogelcellen11 is 38 °C en ze groeien langzaam bij 37 °C. - De volgende dag aspirateer media en was de cellen voorzichtig met 1x PBS door te pipetteren om niet-gehechte of dode cellen te verwijderen. Vervang door 4 ml verse groeimedia. Controleer de cellen onder een microscoop. Cellen moeten spichtig gevormd zijn, zoals fibroblasten (figuur 2A).
OPMERKING: Meestal hechten preadipocyten vrij snel (binnen een paar uur). Het succes of falen van celisolatie kan op dit moment (na 24 uur) worden bevestigd. - Vervang elke 2 dagen door 4 ml verse groeimedia en subcultuur- of cryopreservecellen wanneer ze 70% -80% samenvloeiing bereiken (figuur 3C).
4. Subculturatie en cryopreservatie
- Aspirateer oude media en was cellen voorzichtig met 4 ml 1x PBS door pipetteren. Aspirateer PBS, voeg 2 ml 0,1% trypsine toe om het celoppervlak te bedekken in een T-25 kolf (pas het volume dienovereenkomstig aan voor andere kweekvaten) en incubeer vervolgens gedurende 3-4 minuten bij 38 °C.
OPMERKING: Observeer of de cellen los zijn van de kweekplaat. Tik zachtjes op de kweekplaat om de cel los te maken. Het te lang incuberen van cellen met trypsine zal cellen beschadigen. - Voeg een equivalent volume voorverwarmde groeimedia toe om de trypsinereactie te remmen. Pipetteer meerdere keren over het celoppervlak en kantel de plaat om de resterende cellen los te maken.
- Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT (7 minuten voor een buis van 50 ml). Aspirateer het supernatant.
- Indien subculturerend, resuspend pellet in 1 ml groeimedia door op en neer te pipetteren. Tel cellen zoals beschreven in stap 2.3.9.1 en herplateer vervolgens met dezelfde platingdichtheid die aanvankelijk in stap 3.1 werd gebruikt.
- Bereid bij cryopreservatie 4 ml vriesmedia voor een T-25 kolf met 90% samenvloeiing.
OPMERKING: Het bevriezen van media bestaat uit 10% DMSO, 30% FBS en 60% DMEM/F12. - Resuspendeer celpellet in vriesmedia en breng 1 ml vriesmedia over in een cryoviaal. Vries de cryovialen langzaam in tot -1 °C/min met behulp van een vriescontainer. Plaats de container een nacht in een vriezer van -80 °C en breng deze vervolgens over op vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
OPMERKING: Goed gecryopreserveerde preadipocyten behouden hun levensvatbaarheid gedurende ten minste 3 jaar en presteren meestal als vers geïsoleerde cellen wanneer ze worden ontdooid en verguld.
5. Adipogene differentiatie
OPMERKING: 2% gelatine-gecoate platen kunnen worden gebruikt om de celhechting te verbeteren.
- Bereid een gelatineoplossing van 2% (g/v) (zie materiaaltabel) in gedestilleerd water. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psi gedurende 30 minuten om te steriliseren. Laagkweekoppervlak met 5-10 μL gelatineoplossing/cm2 (d.w.z. 100-200 μg/cm2). Draai voorzichtig om het oppervlak gelijkmatig te bedekken.
- Controleer de platen op gelijkmatige verspreiding van de gelatine-oplossing, omdat sommige regio's in eerste instantie ongecoat kunnen blijven. Laat de met gelatine beklede plaat minstens 1 uur op RT blijven staan. Verwijder het volledige volume gelatine-oplossing uit de putjes.
OPMERKING: Dit laat een dunne gelatinelaag achter op de bodem van de putten / schalen. Gelatine-oplossing kan meerdere keren (minstens 10 keer) worden hergebruikt zonder de celhechting en -groei te veranderen. Laat de met gelatine beklede schalen minstens 30 minuten in de weefselkweekkap blijven voordat de cellen worden platgelegd. - Induceer de preadipocyten van de kip om adipogene differentiatie te ondergaan door groeimedia aan te vullen met vetzuren. Om adipogene differentiatiemedia (ADM) te bereiden, vult u DMEM/F12 aan met 10% kippenserum, 1x linolzuur-oliezuur-albumine (9,4 μg/ml) en 1x P/S (zie Materiaaltabel). Maak ADM vers en warm voor gebruik.
OPMERKING: Kippreadipocyten worden vaak geïnduceerd om adipogene differentiatie te ondergaan door media aan te vullen met vetzuren in plaats van hormonale cocktails die meestal worden gebruikt voor adipocyten van andere soorten12. - Induceer differentiatie door groeimedia te vervangen door adipogene differentiatiemedia wanneer cellen ~ 90% samenvloeiing bereiken. Onderhoud cellen in dit medium en vervang ze om de 2 dagen. Beoordeel de differentiatie visueel onder een microscoop (20x) op basis van de vorming van lipidedruppels, die gemakkelijk zichtbaar worden binnen 48 uur na het induceren van differentiatie.
6. Beoordeling van adipogenesis
- Voer Oil Red O-kleuring uit volgens de onderstaande stappen.
- Plaats de cellen in een plaat met zes putten en induceer adipogene differentiatie bij ~ 90% confluency.
- Bereid een werkoplossing van Oil Red O door zes delen van de Oil Red O-stamoplossing te combineren met vier delen gedestilleerd water in een buis van 50 ml. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en laat 10 minuten op RT staan en filtreer vervolgens door een grade 1-filterpapier (zie materiaaltabel) in de trechter door de oplossing langzaam in een buis van 50 ml te gieten.
OPMERKING: Oil Red O stockoplossing wordt gemaakt door 0,7 g Oil Red O (zie materiaaltabel) op te lossen in 200 ml 100% isopropanol in een fles met autoclaaf. Meng goed en laat het 20 min staan. Bewaren bij 4 °C en uit de buurt van licht houden tot gebruik. Dit is 1 jaar stabiel. De werkoplossing kan gedurende 3 uur worden gebruikt; het wordt echter aanbevolen om het binnen 2 uur te gebruiken. - Verwijder de media en was de putjes twee keer voorzichtig met 2 ml voorverwarmd 1x PBS met behulp van een pipet. Verwijder PBS volledig door af te pipetteren. Fix cellen met 2 ml 10% gebufferde formaline en wikkel de plaat met paraffinefilm. Laat minstens 1 uur en tot 2 dagen voor de kleuring bij RT staan.
OPMERKING: Om 1 l 10% gebufferde formalineoplossing te maken, mengt u 100 ml 37% formaldehyde, 4,09 g NaH2PO4, 6,5 g Na2HPO4 (zie materiaaltabel) en 900 ml gedestilleerd water. Pipetteer formaline niet rechtstreeks op de cellen. Doseer voorzichtig op de zijwand bij de bodem van de put. - Verwijder formaline en was de putjes voorzichtig met 2 ml gedestilleerd water. Vervang door 2 ml 60% isopropanol. Verwijder na 5 min isopropanol en laat de putjes ongeveer 10 min volledig drogen. Voer alle kleuringsstappen uit bij RT.
- Voeg 1 ml Olie Rode O-werkoplossing toe aan cellen en incubeer gedurende 10-20 minuten bij RT. Verwijder vlekken door te pipetteren en was vijf keer door in leidingwater te dopen totdat er geen overtollige vlek wordt gezien. Voeg na de laatste spoeling 1 ml water toe aan cellen voordat u de kleuring visualiseert en afbeeldingen onder een microscoop verzamelt.
- Om lipide accumulatie per gerecht te kwantificeren, verwijdert u water en extraheer u olierode O-kleurstof uit cellen door 1-2 ml 100% isopropanol toe te voegen dat voldoende is om cellen in een put van zes putten volledig te bedekken. Incubeer met zacht schudden op een platenschudder gedurende 10 minuten bij RT.
- Breng 200 μL van de extractie over in een putje van de 96-well testplaat. Kwantificeer de relatieve hoeveelheid vlek met behulp van een spectrofotometerplaatlezer om de absorptie bij 495 nm te meten.
- Voer de kleuringstest uit van de intracellulaire lipidedruppels en de kern.
- Plaatcellen in zwarte onderste 96-well platen en induceren adipogene differentiatie zoals beschreven in stap 5.3.
- Om de cellen te kleuren, voegt u 200 μL van de kleuringsoplossing toe die een fluorescerende lipidekleuring en een fluorescerende DNA-kleuring bevat (zie Materiaaltabel) in 1x PBS per put. Voeg na het berekenen van het totale volume van de vereiste vlek twee druppels dna-vlek en 25 μl lipidevlek per ml voorverwarmde 1x PBS toe met behulp van een met folie omwikkelde buis om de oplossing tegen licht te beschermen. Incubeer op RT gedurende 20 minuten en bescherm tegen licht.
- Lees de fluorescentie af met behulp van een fluorescerende plaatlezer (zie Materiaaltabel). Detecteer de lipidekleuring (Excitatie: 485 nm/Emissie: 572 nm) met behulp van een rood filter en de DNA-vlek (Excitatie: 359 nm/Emissie: 450 nm) door een blauw/cyaanfilter.
OPMERKING: Kleuring kan ook worden gevisualiseerd en beelden worden vastgelegd onder een fluorescerende microscoop. - Normaliseer de lipidekleuringsintensiteiten naar de DNA-kleuringsintensiteiten om lipideaccumulatie ten opzichte van celnummer13 te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire preadipocyten zijn morfologisch vergelijkbaar met fibroblasten, met onregelmatige, sterachtige vormen en een centrale kern (figuur 2A-C). De cellen hechten zich gemakkelijk aan weefselkweekplastic en beginnen zich snel na aanhechting te vermenigvuldigen. Ze differentiëren en accumuleren snel lipidedruppels (figuur 3D) wanneer ze worden voorzien van vetzuren in de media. De levensvatbaarheid (98%, gebaseerd op kleurstofuitsluiting) gerapporteerd in de isolaties die hier worden weergegeven, is typerend. Hoewel de cellen redelijk robuust zijn, leidt agressieve behandeling tijdens isolatie tot celbeschadiging (figuur 3E), waardoor cellen ontstaan die zich slecht hechten en zich niet vermenigvuldigen. Ondanks de procedures die zijn ingebouwd om microbiële besmetting te voorkomen, kan overdracht van niet-steriel materiaal plaatsvinden (figuur 3F). Vanwege hun snelle groeisnelheid consumeren kuikenembryopreadiptocyten glucose in de media met hoge snelheden. Media moeten elke 48 uur worden vervangen om hun energietoevoer te behouden.
De hier gepresenteerde representatieve resultaten illustreren het adipogene potentieel van kuikenembryopreadiptocyten. Deze cellen hopen zich snel op om lipidedruppels te ontwikkelen onder adipogene omstandigheden en de accumulatie vordert in de loop van de tijd (figuur 4 en figuur 5). Er zijn twee methoden gepresenteerd die kunnen worden gebruikt om de mate van lipideaccumulatie in deze cellen beter te visualiseren en te kwantificeren, wat een directe weerspiegeling is van adipogenese. Het kleuren van lipiden met Oil Red O is een goedkope methode om de accumulatie van lipidedruppels te visualiseren en te kwantificeren (figuur 4). Een lichtmicroscoop wordt gebruikt om beelden te verzamelen en gekleurde cellen kunnen op de bank worden gehouden totdat beelden zijn verzameld. Lipide accumulatie in elk schotel van cellen kan worden gekwantificeerd zoals beschreven door de vlek te extraheren en de absorptie bij 495 nm te lezen met behulp van een spectrofotometer. Met behulp van de combinatie van de geselecteerde lipide- en DNA-vlekken was het mogelijk om de lipideaccumulatie ten opzichte van het celnummer te kwantificeren, wat compenseert voor niet-adipogene cellen die in cultuur kunnen blijven bestaan (figuur 5). Als er maatregelen worden genomen over meerdere tijdstippen (figuur 5B-C), maakt deze combinatie het mogelijk om zowel adipogenese als proliferatie te beoordelen, bijvoorbeeld als reactie op toegevoegde hormonen of peptiden.
Figuur 1: Vetweefselverzameling. (A) Bij het breken van de eierschaal werd het witte schaalmembraan onthuld. (B) Het amnion doorboren met een steriel pincet. (C) Een totaal van ~ 80 mg femoraal onderhuids vet kan worden verkregen uit E16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weefselfragmenten voor enzymatische vertering en celpellet na vertering. (A) Gehakt vetweefsel in enzymatische oplossing (~1 mm3). (B) Pijlen geven celpellets aan na RBC-lysis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Celmorfologische vergelijkingen van geïsoleerde primaire preadipocyten. (A) Preadipocyten na 24 uur na isolatie. (B) Preadipocyten na 48 uur na isolatie. (C) Preadipocyten met 80% confluentie na 72 uur na isolatie. (D) Preadipocyten na 48 h adipogene inductie bij passage 4, lipidedruppels zijn zichtbaar. Inzet geeft het vergrote beeld van lipidedruppels aan. (E) Representatief beeld van beschadigde cellen. (F) Pijl geeft zwarte zwempunten aan in besmette cultuur. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Evaluatie van lipideaccumulatie door olierode O-kleuring. (A) Representatieve beelden van olierode O-kleuring van E16-preadipocyten na 24 uur, 48 uur en 72 h adipogene differentiatie ex vivo. Schaalstaven = 100 μm. (B) Kwantificering van lipidedruppels gemeten door elutie van olierode O-kleuring. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. a,b,c P < 0,05 door eenrichtings-ANOVA met posthoc Tukey's HSD-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beoordeling van adipocytendifferentiatie door lipidekleuring/DNA-kleuring. (A) Representatieve beelden van de lipidekleuring (rood) en de DNA(blauwe) kleuring van E16-preadipocyten na 24 uur, 48 uur en 72 h adipogene differentiatie ex vivo. Schaalstaven = 150 μm. (B) Lipidekleuring (Excitatie: 485 nm/Emissie: 572 nm) werd uitgevoerd om lipideaccumulatie in gedifferentieerde preadipocyten te beoordelen. (C) DNA-kleuring (Excitatie: 359 nm/Emissie: 450 nm) werd uitgevoerd om variaties in het aantal cellen te beoordelen. (D) De verhouding tussen lipide en DNA-kleuring. Lipide accumulatie wordt genormaliseerd naar het DNA-gehalte. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. a,b,c P < 0,05 door eenrichtings-ANOVA met posthoc Tukey's HSD-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Leeftijd (n=) | x106 cellen/100 mg weefsel | Levensvatbaarheid (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1,22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1,717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabel 1: Gemiddeld celaantal en levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen van embryo- en post-hatchkuikens.
Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. a,b P < 0,05 door eenrichtings-ANOVA met posthoc Tukey's HSD-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel verschillende goed beschreven protocollen de isolatie van preadipocyten 14,15,16,17 hebben gemeld, is isolatie voor embryonale preadipocyten geoptimaliseerd, wat kan worden gebruikt voor functionele analyses van de vroege groei en ontwikkeling van vetgroei en ontwikkeling bij vleeskuikens. Dit protocol levert embryonale adipocytenvoorlopers met een hoge levensvatbaarheid op met een hoog differentiatiepotentieel. Bovendien is de gepresenteerde procedure voor het isoleren van preadipocyten niet beperkt tot embryo's, maar kan deze worden gebruikt in kuikens na het uitkomen. Het is echter geoptimaliseerd voor gebruik met E16-embryo's en de opbrengsten van kuikens na het uitkomen zijn aanzienlijk lager (tabel 1), waarschijnlijk als gevolg van een toename van de relatieve hoeveelheid bindweefsel naarmate kuikens snel groeien.
Het succes van celisolatie wordt uiteindelijk geëvalueerd door de vorm en het aantal aangesloten cellen te observeren (figuur 3A). Een laag celaantal of beschadigde cellen kan worden waargenomen wanneer de weefselfracties te lang worden verteerd, vooral wanneer de weefseldissociatie langer dan 1,5 uur vordert (figuur 3E). Daarom wordt aanbevolen dat 1,5 uur spijsvertering niet wordt overschreden. Aan de andere kant, als het weefselfragment duidelijk blijft na een uur spijsvertering, moet de spijsverteringstijd of de hoeveelheid worden verhoogd. De verkregen hoeveelheid vetweefsel kan ook worden gevarieerd, afhankelijk van de genetische stam van de kip. Als dit protocol wordt gebruikt om cellen van andere leeftijden of soorten te isoleren, zullen zowel de hoeveelheid collagenase als de verteringstijd waarschijnlijk moeten worden gewijzigd.
Een veel voorkomende beperking van primaire celkweek is dat geïsoleerde cellen adipogene potentie beginnen te verliezen na verschillende passages in cultuur; het is dus belangrijk om binnen enkele dagen na isolatie differentiatie te induceren om ervoor te zorgen dat de embryonale preadipocyten hun adipogene vermogen niet verliezen. Adipogene voorlopers van embryo's differentiëren gemakkelijk in volwassen adipocyten in de hierboven beschreven mediaformulering, zonder de noodzaak van confluentie of hormonale inductie. De cellen tot passage 4 (10-14 dagen) kunnen gemakkelijk worden gedifferentieerd binnen 48 uur na inducering (figuur 3D).
Het beheersen van celbesmetting in primaire celkweek is een andere uitdaging, waarbij schimmelbesmetting het meest voorkomt. Het gebruik van Amfotericine B, zoals beschreven, is over het algemeen effectief in het voorkomen van schimmelgroei18,19. Het kan in lage concentraties in de kweekmedia worden opgenomen zonder merkbare effecten op de levensvatbaarheid of het adipogene potentieel. Niet-identificeerbare microbiële verontreinigingen zijn waargenomen in de vorm van zwarte zwempunten die een paar dagen na celisolatie verschijnen (figuur 3F). Deze hadden een negatieve invloed op de celgroei en waren onmogelijk te verwijderen zodra deze infectie optrad20. Of deze verontreinigingen een onbekende microbiële soort waren die in of op eieren werd aangetroffen of uit een andere bron kwam, is onbekend. Dit protocol probeert het risico op besmetting te minimaliseren door embryo's aseptisch uit het ei te halen21. Het gebruik van een op warmte gebaseerde instrumentsterilisator in de kap tijdens dissectie helpt ook om het potentieel voor besmetting te minimaliseren, vooral wanneer meerdere embryo's worden ontleed.
Een overweging in het proces is verminderde celhechting aan weefselkweekplaat tijdens differentiatie, als gevolg van fysieke veranderingen als cellen lipidedruppels vormen en uitbreiden. Hoewel ze zich in de cellen bevinden, zijn lipidedruppels drijvend en lijken ze, wanneer ze groot zijn, te fungeren als ballonnen die de neiging hebben om cellen te bevorderen die van het oppervlak opstijgen. Daarom moet voorzichtig worden omgegaan met preadipocyten bij het induceren van differentiatie, en met name wanneer adipogenese wordt beoordeeld. Hoewel het hier gepresenteerde protocol het kweekoppervlak niet wijzigt, kan de celhechting worden verbeterd bij het plateren van cellen op gerechten bedekt met 2% gelatine. Het is ook belangrijk om te bevestigen dat de pH van wasoplossingen 7,4 is en om voorverwarmde PBS-oplossing te gebruiken bij het wassen van cellen en het mengen met de DNA-vlek om koude stress te verminderen.
Met behulp van meerdere embryo's kunnen voldoende aantallen cellen worden geïsoleerd om experimentele replicaties te produceren zonder de noodzaak van meerdere passages, uitbreiding en het risico dat cellen hun adipogene potentieel verliezen. RNA kan gemakkelijk worden geïsoleerd uit zowel pre- als gedifferentieerde kuikenembryo-adipocyten die worden geïsoleerd met behulp van fenol- of membraangebaseerde commerciële methoden voor genexpressiestudies. Voldoende RNA kan worden verkregen uit een enkele put van een zesputtenplaat voor gebruik in cDNA-synthese en follow-on qPCR of RNAseq.
Kortom, de toegankelijkheid van vetdepots in het kuikenembryo om een celmodel te isoleren is zeer relevant voor zowel pluimvee als mensen. Dit protocol is relatief eenvoudig uit te voeren en het levert een hoog percentage levensvatbare cellen op die gemakkelijk kunnen worden geïnduceerd om adipogene differentiatie in vitro te ondergaan. Bevruchte kippeneieren kunnen worden verkregen uit verschillende commerciële bronnen voor minimale kosten, waardoor deze cellen een direct beschikbaar model zijn voor praktisch gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken UT AgResearch en de afdeling Dierwetenschappen voor het ondersteunen en optimaliseren van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door USDA-subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022).
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Adipose Tissue Protocols. , Springer. 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).
