Summary
In vitro reconstitutie van cytoskeletale eiwitten is een essentieel hulpmiddel om de fundamentele functionele eigenschappen van deze eiwitten te begrijpen. Het huidige artikel beschrijft een protocol om de kwaliteit van recombinante septinecomplexen, die een centrale rol spelen bij celdeling en migratie, te zuiveren en te beoordelen.
Abstract
Septines zijn een familie van geconserveerde eukaryote GTP-bindende eiwitten die cytoskeletale filamenten en hogere orde structuren kunnen vormen uit hetero-oligomere complexen. Ze interageren met andere cytoskeletale componenten en het celmembraan om deel te nemen aan belangrijke cellulaire functies zoals migratie en celdeling. Vanwege de complexiteit van de vele interacties van septines, het grote aantal septinegenen (13 bij mensen) en het vermogen van septines om hetero-oligomere complexen te vormen met verschillende subeenheidsamenstellingen, is celvrije reconstitutie een vitale strategie om de basisprincipes van septinebiologie te begrijpen. Het huidige artikel beschrijft eerst een methode om recombinante septines in hun hetero-oligomere vorm te zuiveren met behulp van een tweestaps affiniteitschromatografiebenadering. Vervolgens wordt het proces van kwaliteitscontrole dat wordt gebruikt om te controleren op de zuiverheid en integriteit van de septinecomplexen gedetailleerd beschreven. Dit proces combineert inheemse en denaturerende gel-elektroforese, negatieve kleuringselektronenmicroscopie en interferometrische verstrooiingsmicroscopie. Ten slotte wordt een beschrijving gegeven van het proces om te controleren op het polymerisatievermogen van septinecomplexen met behulp van negatieve vlekelektronenmicroscopie en fluorescerende microscopie. Dit toont aan dat het mogelijk is om hoogwaardige menselijke septinehexameren en octameren te produceren die verschillende isovormen van septin_9 bevatten, evenals Drosophila septine hexameren.
Introduction
Het cytoskelet is klassiek beschreven als een driecomponentensysteem bestaande uit actinefilamenten, microtubuli en intermediaire filamenten1, maar onlangs zijn septines erkend als een vierde component van het cytoskelet1. Septines zijn een familie van GTP-bindende eiwitten die worden bewaard in eukaryoten2. Septines zijn betrokken bij vele cellulaire functies zoals celdeling3, cel-cel adhesie4, celmotiliteit5, morfogenese6, cellulaire infectie7 en de vaststelling en instandhouding van celpolariteit8. Ondanks hun belangrijke functies, is hoe septines betrokken zijn bij dergelijke processen slecht begrepen.
De septinefamilie van eiwitten is onderverdeeld in verschillende subgroepen (vier of zeven, afhankelijk van de classificatie) op basis van eiwitsequentieovereenkomst2. Leden van verschillende subfamilies kunnen palindromische hetero-oligomere complexen vormen, die de bouwstenen van filamenten zijn en die op hun beurt samenkomen in structuren van hogere orde, zoals bundels, ringen en meshworks 1,9,10,11,12. Verdere moleculaire complexiteit komt voort uit de aanwezigheid van verschillende splicevarianten, een voorbeeld is menselijk SEPT9, waar er bewijs is voor specifieke functies van verschillende splicevarianten 13,14,15. Bovendien is de lengte van de hetero-oligomeren afhankelijk van soort en celtype. Caenorhabditis elegans septines vormen bijvoorbeeld tetrameren16, Drosophila melanogaster septines vormen hexameren17 (figuur 1A), Saccharomyces cerevisiae septines vormen octameren18 en menselijke septines vormen zowel hexameren als octameren19 (figuur 1A). Het vermogen van septine-isovormen, splicevarianten en posttranslationeel gemodificeerde septines uit dezelfde subfamilie om elkaar te vervangen in het complex en het (co-)bestaan van hetero-oligomeren van verschillende grootte hebben het moeilijk gemaakt om de cellulaire functies van verschillende hetero-oligomere complexen af te bakenen12.
Een ander interessant vermogen van septines is hun vermogen om te interageren met veel bindende partners in de cel. Septines binden het plasmamembraan en vliezige organellen tijdens interfase en celdeling 20,21,22. In delende cellen werken septines samen met anilline 23,24,25 en actine en myosine tijdens cytokinese 26,27. In de late stadia van cytokinese lijken septines de endosomale sorteercomplexen te reguleren die nodig zijn voor het transportsysteem (ESCRT) voor midbody abscissie28. Daarnaast is er ook bewijs van septine op de actine cortex en actine stressvezels van cellen in interfase cellen 29,30,31. In specifieke celtypen binden en reguleren septines ook het microtubulecytoskelet32,33.
Al deze kenmerken maken septines een zeer interessant eiwitsysteem om te bestuderen, maar ook een uitdagend systeem. De combinatie van het grote aantal septine-subeenheden (13 genen bij mensen zonder splicevariantente tellen 2) met het potentieel van septine-subeenheden uit dezelfde onderfamilie om elkaar te vervangen en hetero-oligomeren van verschillende grootte te vormen, maakt het moeilijk om een conclusie te trekken over de cellulaire functie van een specifiek septine door genetische manipulatie. Bovendien maken de meervoudige interacties van septines het interpreteren van de effecten van veelgebruikte onderzoeksinstrumenten zoals geneesmiddelen34 gericht op cytoskeletale of membraancomponenten een moeilijke taak.
Een manier om deze situatie te overwinnen is om onderzoek in cellen aan te vullen met in vitro (celvrije) reconstitutie van septines. In vitro reconstitutie maakt de isolatie mogelijk van een enkel type septine hetero-oligomeren met een specifieke subeenheidssamenstelling en lengte 18,35,36,37. Dit complex kan vervolgens worden bestudeerd in een gecontroleerde omgeving, hetzij alleen om de fundamentele structurele en fysisch-chemische eigenschappen van septines 38,39,40 te ontdekken, hetzij in combinatie met gewenste partners zoals modelbiomembranen 11,41,42, actinefilamenten 10,27 of microtubuli32,36 om de aard van hun Interacties.
Daarom is een betrouwbare methode om verschillende septinecomplexen efficiënt te zuiveren van vitaal belang voor septineonderzoek. Maar zelfs met hetzelfde protocol kunnen verschillende zuiveringen eiwitten geven met verschillende activiteit / functionaliteit of zelfs integriteit. Voor in de handel verkrijgbare eiwitten zoals enzymen worden de functionaliteit en enzymatische activiteit zorgvuldig gevalideerd43. Het implementeren van zorgvuldige kwaliteitscontrole voor cytoskeletale of structurele eiwitten zoals septines kan een uitdaging zijn, maar het is essentieel om experimenten in laboratoria vergelijkbaar te maken.
Dit artikel beschrijft een robuuste methode om hoogwaardige recombinante septines in hun hetero-oligomere vorm te zuiveren op basis van de gelijktijdige expressie van twee vectoren die mono- of bi-cistronische constructen bevatten (tabel 1) in Escherichia coli-cellen. De methode bestaat uit een tweestaps affiniteitschromatografiebenadering om septine hetero-oligomeren te vangen die zowel een 6-getagd septine als een Strep-II-gelabeld septine bevatten (figuur 1B,C). Dit protocol, voor het eerst beschreven in Iv et al.10, is gebruikt om Drosophila septine hexameren 11,27,35, humane septine hexameren10 en verschillende menselijke septine octameren met verschillende inheemse (isoform 1, 3 en 5)10,32 of gemuteerde SEPT9 isovormen32 . Verder wordt een beschrijving gegeven van een reeks technieken om de kwaliteit van de gezuiverde septines te beoordelen. Eerst wordt de integriteit en correcte stoichiometrie van de septinesubeenheden gecontroleerd met behulp van denaturerende elektroforese en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Vervolgens worden de aanwezigheid van hetero-oligomeren van de juiste moleculaire massa en de aanwezigheid van monomeren of kleinere oligomeren die wijzen op complexe instabiliteit onderzocht door native elektroforese en massafotometrie via interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT). Ten slotte bestaat de laatste stap uit de beoordeling van de polymeriserende activiteit van de septines met behulp van fluorescentiemicroscopie en TEM.
Figuur 1: Zuiveringsstrategie. (A) Schema's van de septine hetero-oligomeren die voorkomen in menselijke (links) en Drosophila (rechts) cellen. Getallen duiden septinesubeenheden aan uit de aangegeven groepen en P duidt op Peanut. Menselijke SEPT9 kan elk van zijn isovormen zijn. De septine-subeenheden hebben een asymmetrische vorm en zijn longitudinaal geassocieerd met twee verschillende interfaces, de NC: NC en de G: G-interface, zoals aangeduid door respectievelijk NC en G, bovenop het menselijke hexameer. (B,C) Schematische illustratie van de tweestapschromatografiestrategie, getoond voor (B) menselijke septinehexameren en (C) octameren. H geeft de his-tags aan, terwijl S de Strep-II-tags aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
1. Zuivering van septine hetero-oligomeren
- Cotransformatie van bacteriële cellen met de expressievectoren
- Selecteer een combinatie van één pnEA en één pnCSplasmide 44 die voor expressie zal worden gebruikt. Kies de combinatie afhankelijk van de gewenste subeenheidsamenstelling van het septine hetero-oligomeer10,35 en afhankelijk van het al dan niet nodig zijn van fluorescerende tagging.
OPMERKING: C-terminally tagged monomere superfolder GFP (msfGFP)-tagged SEPT2 (voor menselijke septines) of msfGFP- of monomeric enhanced GFP (mEGFP)-DSep2 (voor Drosophila septines) wordt hier gebruikt (tabel 1). - Pipetteer 1 μL van elk plasmide (~1 ng/μL) in 100 μL competente BL21 Escherichia coli-cellen en incubeer gedurende 20 minuten op ijs.
- Plaats de cellen gedurende 40 s in een waterbad bij 42 °C en incubeer ze vervolgens onmiddellijk gedurende 3 minuten op ijs.
- Voeg 0,9 ml lysogeniebouillon (LB) medium toe aan de celsuspensie en laat de cellen 1 uur groeien bij 37 °C. Plaat 100 μL cellen op warme LB-agar platen met 100 μg/ml ampicilline en 100 μg/ml spectinomycine en incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Selecteer een combinatie van één pnEA en één pnCSplasmide 44 die voor expressie zal worden gebruikt. Kies de combinatie afhankelijk van de gewenste subeenheidsamenstelling van het septine hetero-oligomeer10,35 en afhankelijk van het al dan niet nodig zijn van fluorescerende tagging.
- Kweek bacteriële voorkweek
- Vul een Erlenmeyer van 250 ml met 100 ml Terrific bouillon (TB) of LB medium met 100 μg/ml ampicilline en 100 μg/ml spectinomycine.
- Kies een enkele kolonie uit de LB-agarplaat met een steriele inentingslus en breng deze over naar verse media vanaf stap 1.2.1.
- Incubeer bij 37 °C in een roterende schudmachine, hetzij 's nachts, hetzij gedurende ten minste 6 uur.
OPMERKING: Uit deze cultuur kan een glycerolvoorraad worden bereid door de bacteriële suspensie 1:1 te mengen met glycerol en opgeslagen bij −80 °C. Deze voorraad kan worden gebruikt in stap 1.2.2. in plaats van een vers getransformeerde kolonie.
- Bacteriële cultuur en eiwitexpressie inductie
- Breng 100 ml gekweekte bacteriën over in 5 L TB of LB met 50 μg/ml ampicilline en 50 μg/ml spectinomycine.
- Kweek deze cultuur bij 37 °C in een shaker incubator totdat deze een optische dichtheid (OD) bereikt, gemeten op een golflengte van 600 nm in het bereik van 2-3 voor ongelabelde septines of 0,6-0,8 voor msfGFP/mEGFP-gelabelde septines en induceer eiwitexpressie door toevoeging van een eindconcentratie van 0,5 mM IPTG. De lagere OD voor de gelabelde septines is om te voorkomen dat ze de doodsfase bereiken in hun langere expressietijd, zoals beschreven in de volgende stap.
- Incubeer de cellen die ongelabelde septine hetero-oligomeren tot expressie brengen gedurende 3 uur bij 37 °C of de cellen die msfGFP-gelabelde hetero-oligomeren tot expressie brengen gedurende een nacht bij 17 °C.
OPMERKING: De korte eiwitexpressietijd voor ongelabelde complexen, vergemakkelijkt door het gebruik van het rijkere TB-medium, wordt gekozen om eiwitafbraak te voorkomen. De langere expressietijd in combinatie met een lagere temperatuur voor gelabelde complexen wordt gekozen om het correct vouwen van de msfGFP-tag mogelijk te maken.
- Bacteriële lyse- en lysaatklaring
OPMERKING: Houd vanaf dit punt in de zuiveringsprocedure de eiwithoudende oplossing te allen tijde op ijs of bij 4 °C om proteolytische eiwitafbraak of verlies van activiteit te voorkomen.- Verzamel de gekweekte cellen door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Optioneel, snap-vries de pellet in deze stap en bewaar bij −80 °C gedurende maximaal 6 maanden. Als deze optie wordt gekozen, zorg er dan voor dat u de pellet op ijs ontdooit voordat u doorgaat.
- Los de pellet op in 100 ml lysisbuffer (tabel 2) en laat de cellen lyseren. Kies een van de twee onderstaande opties
- Soniceer in 7 cycli van 30 s AAN en 59 s UIT met een tip sonicator met 30% amplitude (merk op dat de instellingen afhankelijk zijn van sonicator).
- Breek de cellen in de Franse pers af door ze minstens 3x door te geven.
- Verduidelijk het cellysaat door gedurende 30 minuten bij 4 °C te centrifugeren op 20.000 x g en bewaar het supernatant. Het wordt aanbevolen om te beginnen met stap 1.5.1. tijdens deze centrifugale stap.
- Neem eventueel een monster voor denaturering van elektroforese, zoals beschreven in rubriek 2.
- Verzamel de gekweekte cellen door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Affiniteitschromatografie voor His-tagged eiwitten
OPMERKING: Deze stap levert complexen op die menselijke SEPT2 of Drosophila Sep1 bevatten met behulp van een nikkelkolom (figuur 1B).- Balanceer een voorverpakte nikkel sepharose high-performance chromatografie kolom met septine buffer (tabel 2).
- Laad het geklaarde supernatant op de kolom met 1 ml/min en was het gebonden eiwit met ten minste drie kolomvolumes septinebuffer.
- Eluteer de septinecomplexen met 50% HisTrap-elutiebuffer (tabel 2) bij 1 ml/min terwijl u 0,5 ml fracties verzamelt om een imidazoolconcentratie van 250 mM te verkrijgen.
- Kies de fracties die septinecomplexen bevatten, zoals aangegeven door de optische absorptie van het eluaat bij 280 nm online gecontroleerd met een snel eiwitvloeistofchromatografie (FPLC) -systeem of na de zuivering met een microvolumespectrofotometer.
OPMERKING: Imidazol absorbeert licht bij 280 nm. Dit verklaart waarschijnlijk waarom de eiwitpiek na de septine-elutie niet teruggaat naar nul absorptie (figuur 2A).
- Affiniteitschromatografie voor Strep-II-gelabelde eiwitten
OPMERKING: Deze stap levert complexen op die menselijke SEPT7 (hexameren), menselijke SEPT9 (octameren) of Drosophila-pinda bevatten met behulp van een Strep-Tactin-kolom (figuur 1B). De chromatografiekolom is gebaseerd op een gemodificeerd biotine-streptavidinsysteem. Het eiwit is gelabeld met gemodificeerd biotine (Strep-II-tag) en de kolom bevat een gemanipuleerde streptavidin (Strep-Tactin). Ondanks dat het is gemodificeerd van het biotine-streptavidin-systeem, is er geen interferentie tussen het Strep-Tactin-Strep-II-tag-systeem en het biotine-streptavidin-systeem. Het beschreven systeem wordt gebruikt om interferentie met reconstitutietests met behulp van biotine en streptavidin te voorkomen.- Equilibrate een voorverpakte StrepTactin sepharose high-performance chromatografie kolom met septine buffer (tabel 2). Laad de septinehoudende fracties die uit de nikkelkolom zijn teruggewonnen op 1 ml/min en was het gebonden eiwit met ten minste drie kolomvolumes septinebuffer.
- Eluteer de septinecomplexen met 100% StrepTrap-elutiebuffer (tabel 2) bij 1 ml/min terwijl u 0,5 ml fracties verzamelt om een concentratie van 2,5 mM desthiobiotine te verkrijgen.
OPMERKING: De desthiobiotine in de StrepTrap-elutiebuffer moet vers worden opgelost. - Kies de fracties die septinecomplexen bevatten, zoals aangegeven door de optische absorptie van het eluaat bij 280 nm online bewaakt met een FPLC-systeem of na de zuivering met een microvolumespectrofotometer.
OPMERKING: De denaturering elektroforese wordt meestal op dit punt gedaan met monsters van de kolomwassingen en septinefracties. De volgorde van kolommen kan worden omgekeerd met niet te onderscheiden resultaten, d.w.z. het verduidelijkte lysaat na stap 1.4. kan worden onderworpen aan Strep-Tactin affiniteitschromatografie gevolgd door nikkelaffiniteitschromatografie.
- Dialyse en opslag
- Om de desthiobiotine uit de uiteindelijke opslagoplossing te verwijderen, dialyseert u de septinecomplexen in een monster-buffervolumeverhouding van ~1:300 tegen septinebuffer (tabel 2) aangevuld met 1 mM DTT 's nachts, of gedurende ten minste 4 uur, bij 4 °C met behulp van een 30 kDa MWCO-dialysemembraan.
- Optioneel, concentreer de septines met behulp van een 30 kDa MWCO centrifugale concentratiekolom tot de gewenste concentratie. Streef naar een concentratie van 5-7 μM, zoals gemeten via de optische absorptie van de oplossing bij 280 nm en met behulp van een theoretische extinctiecoëfficiënt berekend via ProtParam (tabel 3).
- Aliquot de eiwitcomplexen in de gewenste aliquotgrootte, vries de aliquot in en bewaar het bij −80 °C.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het eiwit niet langer dan 6 maanden op te slaan. Bovendien wordt aanbevolen om regelmatig kwaliteitscontrole-experimenten uit te voeren, vooral als het eiwit langer dan de aanbevolen tijd wordt bewaard.
2. Kwaliteitscontrole van zuiverheid en integriteit van het septine hetero-oligomeer
OPMERKING: De kwaliteitscontrole van hetero-oligomeren bestaat uit een reeks biochemische en beeldvormingstechnieken die de detectie van de massa en integriteit van de septinecomplexen in de oplossing mogelijk maken.
- Denaturering elektroforese om te controleren op de vorming van het septine hetero-oligomeer met de juiste componenten
- Meng 10 μL van de geselecteerde fracties met 10 μL 2x SDS-monsterbuffer, laad ze op een prefab 4% -15% TGX-gel en vul het systeem met Tris / glycine / SDS-loopbuffer.
- Voer de elektroforese gedurende 35 minuten uit op 200 V en kleur de gel (Tabel met Materialen) om de resultaten te visualiseren. De molecuulgewichten van de individuele septine-eiwitten en septine hetero-oligomere complexen zijn te vinden in tabel 3.
- Meet de relatieve intensiteit van elke band binnen elke baan die gezuiverde septines bevat in een contrast-omgekeerd beeld. Doe dit door de gemiddelde intensiteit te berekenen van even grote rechthoeken rond elke band en van een rechthoek van gelijke grootte op een gebied zonder band in dezelfde baan. Normaliseer vervolgens de waarden door de intensiteit van elke band te delen door de intensiteit van het gebied zonder banden.
OPMERKING: Als de intensiteit verzadigd is (bijvoorbeeld waarden van 255 voor een 8-bits afbeelding op een contrast-omgekeerde afbeelding), slaat u de rijstrook over.
- Ensemblegemiddelde native grootteverdeling via native elektroforese
- Bereid de dag ervoor 800 ml anodebuffer en 200 ml lichtblauwe kathodebuffer en bewaar ze in de koelkast. Om de anodebuffer voor te bereiden, verdunt u 40 ml 20x lopende buffer met 760 ml type-I gedeïoniseerd water (I-water). Om de lichtblauwe kathodebuffer te bereiden, verdunt u 10 ml 20x lopende buffer en 1 ml 20x kathodeadditief met 189 ml I-water. De loopbuffer en kathodeadditief worden geleverd met een kit (Tabel van Materialen).
- Bereid 10 μL van het monster door ~500 ng septine te mengen met de benodigde hoeveelheid monsterbuffer (2,5 μL in dit geval, vanwege het gebruik van een 4x monsterbuffer; zie Tabel van materialen) en voldoende I-water om een volume van 10 μL te bereiken.
- Laad de monsters op de gel en vul het systeem met de ijskoude anode- en kathodebuffers.
- Voer de elektroforese ongeveer 115 minuten uit bij 150 V met een voeding die niet stopt bij lage stromen en de gel (Materiaaltabel) kleurt om de resultaten te visualiseren. De molecuulgewichten van de afzonderlijke eiwitten en complexen berekend op basis van de sequentie zijn te vinden in tabel 3.
- Massaverdeling met één molecuul met behulp van massafotometrie via interferometrische verstrooiingsmicroscopie
- Was # 1,5 glazen dia's door ze te soniceren in een ultrasone reiniger gedurende 5 minuten in I-water, 5 minuten in isopropanol en ten slotte 5 minuten in I-water.
- Droog twee glazen glaasjes met een zachte stroom stikstofgas en plaats een druppel van 7 μL van 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) oplossing op het midden van een van de dia's. Plaats vervolgens het midden van de andere dia bovenop de PLL-druppel en oriënteer de twee dia's orthogonaal voor eenvoudige scheiding. Incubeer gedurende 30 s.
- Wassen door onder te dompelen in een bekerglas met I-water 1x en door direct een stroom I-water 2x aan te brengen. Droog vervolgens de twee dia's met een stroom stikstofgas. Deze dia's kunnen daarna ongeveer 6 weken bij kamertemperatuur in droge omstandigheden worden bewaard.
OPMERKING: Label de zijkant van de dia die wordt behandeld met de PLL om het experiment correct uit te voeren.
- Wassen door onder te dompelen in een bekerglas met I-water 1x en door direct een stroom I-water 2x aan te brengen. Droog vervolgens de twee dia's met een stroom stikstofgas. Deze dia's kunnen daarna ongeveer 6 weken bij kamertemperatuur in droge omstandigheden worden bewaard.
- Snijd vlak voor het experiment een stuk van 2 x 2, 3 x 2 of 3 x 3 pakkingen (die respectievelijk 4, 6 of 9 beeldkamers / dia opleveren) en plak het op het met PLL behandelde deel van een glasplaat terwijl u vermijdt dat de glasschuif en de pakkingen contact maken met vuil oppervlak. Plaats de glijbaan op een licht ruitenwisserdoekje en druk met een pipetpunt op de pakkingen om ze met het beschermende plastic nog op de pakkingen te plakken.
- Warm septinebuffer (tabel 2) op kamertemperatuur en ontdooi de eiwitten in de hand (bewaar ze daarna op ijs).
OPMERKING: iSCAT toont het signaal van sommige detergentia en kleine moleculen die lijken op eiwitsignalen45. DTT is een van die kleine moleculen en daarom wordt het niet gebruikt voor dit experiment. Er is alleen een spoor van DTT afkomstig van het opgeslagen septine. - Plaats de dia met pakkingen op het commerciële massafotometriesysteem met 19 μL septinebuffer en stel de microscoop scherp met behulp van de autofocusoptie. Volg de instructies van de fabrikant om te controleren of de gevonden focus correct is. De standaard 100x doelstelling die deel uitmaakt van de setup wordt hier gebruikt.
- Maak of laad een projectmap om de gegevens op te slaan met Bestand > Nieuw project of Bestand > Project laden.
- Pipetteer 1 μL monster op de 19 μL septinebufferval (stap 2.3.5) die wordt gebruikt om te focussen en te mengen, terwijl de beweging van de dia wordt geminimaliseerd door niets aan te raken terwijl u dit doet. Neem vervolgens een video van 6.000 frames op door op Opnemen te klikken.
- Noteer voor een correcte analyse de volgende monsters: septinebuffer, eiwitmassastandaard voor de kalibratie van de signaal-massaverhouding (als een recente kalibratie beschikbaar is en de omgevingsomstandigheden niet zijn veranderd, kan dit monster worden overgeslagen) en 250 nM septinecomplexen verdund in septinebuffer zonder DTT (dit geeft een eindconcentratie van ~ 12,5 nM).
- Analyseer de video's met behulp van de software van de fabrikant om de eiwitmassaverdeling te verkrijgen. Controleer als volgt op gegevens van goede kwaliteit.
- Als de pieken van verschillende septine hetero-oligomerengroottes te veel overlappen of te veel gebeurtenissen worden gedetecteerd (>3.500 gebeurtenissen voor een video van 6.000 frames met het normale gezichtsveld van 128 pixels x 34 pixels verspreid over 10,8 μm x 2,9 μm), verlaag dan de uiteindelijke septineconcentratie en meet opnieuw.
- Als er niet genoeg tellingen van afzonderlijke moleculen worden gemeten (ten minste 2.500-3.500 voor een video van 6.000 frames met het normale gezichtsveld), verhoogt u de septineconcentratie en meet u opnieuw.
- Directe beeldvorming van septinecomplexen via negatieve vlektransmissie-elektronenmicroscopie
- Verdun monsters tot een concentratie van ongeveer 50 nM in septinebuffer en bereid de kleuringsoplossing (2% uranylformiaat of uranylacetaat in I-water).
OPMERKING: Uranylformiaat moet vers worden bereid. - Pipetteer 4 μL verdunde septines op een gloeiend elektronenmicroscopieraster en incubeer gedurende 30 s.
- Verwijder het grootste deel van de eiwitoplossing met een filterpapier en was het rooster 2x met septinebuffer en 1x met I-water om los geadsorbeerde septines te verwijderen.
- Beits met 2% uranylacetaat of uranylformiatuuroplossing in I-water gedurende 1 minuut, absorbeer de kleuringsoplossing met een filterpapier en droog het rooster een paar minuten aan de lucht.
- Scherm het raster met behulp van een goed uitgelijnde transmissie-elektronenmicroscoop om te zoeken naar gebieden met verbeterde vlekken en verzamel ongeveer 100 afbeeldingen binnen deze geselecteerde gebieden.
- Verzamel afbeeldingen bij een vergroting van ten minste 50.000x om een pixelgrootte van ongeveer 2 Å/pixel te verkrijgen en met een onscherpte variërend van −1 μm tot −2 μm. Gebruik een acceleratiespanning van 200 kV. Gebruik bij voorkeur een geautomatiseerde procedure om de gegevens te verzamelen, die afhankelijk zijn van de beschikbare acquisitiesoftware.
- Voer 2D-beeldverwerking uit met behulp van speciale software
- Pak minstens 2.000 deeltjes uit met behulp van een speciale software46.
- Voer tweedimensionale uitlijning en classificatie iteratief uit totdat klassen zijn verkregen zonder verdere verbetering. De eerste uitlijnings- en classificatiestap moet referentievrij zijn om vertekening in de classificatie te voorkomen.
- Gebruik de gemiddelden verkregen uit de eerste referentievrije classificatie als nieuwe referenties om een extra classificatieronde uit te voeren. Herhaal dit proces iteratief totdat er geen verdere verbetering is bereikt. Zorg ervoor dat elke klasse is gebaseerd op 50 tot 100 geplukte deeltjes en dat individuele subeenheden duidelijk zichtbaar zijn. Verschillende softwaretools kunnen worden gebruikt (Spider, Eman of Relion)46,47,48.
- Verdun monsters tot een concentratie van ongeveer 50 nM in septinebuffer en bereid de kleuringsoplossing (2% uranylformiaat of uranylacetaat in I-water).
3. Septine functionele kwaliteitscontrole via polymerisatie analyse
OPMERKING: De kwaliteitscontrole van de functionaliteit bestaat uit een reeks beeldvormingstechnieken die de detectie van gepolymeriseerde septinecomplexen mogelijk maken. Hieronder worden ongelabelde septines "donkere" septines genoemd en de buffer die wordt gebruikt voor het polymeriseren van ongelabelde septines wordt "donkere" septinepolymerisatiebuffer (SPB) genoemd.
- Septinebundel beeldvorming via fluorescentiemicroscopie
- Bereid de 5x fluoSPB (tabel 2) en een septinemix bestaande uit 90% donker septine en 10% msfGFP-septine op zes keer hogere concentratie dan de gewenste eindconcentratie in septinebuffer + 1 mM DTT. Een typische concentratie voor deze test is 300 nM en daarom is de concentratie 1.800 nM voor deze mix.
- Polymeriseer het septine door, in deze specifieke volgorde, I-water te mengen (voldoende om bij te vullen tot het uiteindelijke gewenste volume), 20% 5xfluoSPB (een uiteindelijke verdunning van 1:5), 0,05 μM PCD en 16,67% septinemengsel (een uiteindelijke verdunning van 1:6). Meng voor 10 μL 6,23 μL I-water, 2 μL 5xfluoSPB, 0,1 μL PCD (met een bouillon van 5 μM) en 1,67 μL septinemengsel. Incubeer deze mix gedurende minstens 30 min bij kamertemperatuur.
- Voeg de monsters toe aan een beeldkamer gewassen met fluoSPB (tabel 2) en breng de septinebundels in beeld. PLL-PEG-gepassiveerde stroomkanalen, zoals beschreven in eerder onderzoek10,32, werken goed voor dit experiment.
- Septinebundel imagining via negatieve kleuringstransmissie elektronenmicroscopie
- Bereid de 5x darkSPB (tabel 2) en een septinemix bestaande uit 100% donker septine in zes keer hogere concentratie dan de gewenste eindconcentratie in septinebuffer + 1 mM DTT. Een typische concentratie voor deze test is 300 nM en daarom is de concentratie 1.800 nM voor deze mix.
- Polymeriseer de septinecomplexen door in deze specifieke volgorde I-water te mengen (genoeg om bij te vullen tot het uiteindelijke gewenste volume), 20% 5xdarkSPB en 16,67% septinemix. Meng voor 5 μL 3,16 μL I-water, 1 μL 5x darkSPB en 0,83 μL septinemengsel. Incubeer deze mix gedurende minstens 30 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 3-5 μL monster toe aan een gloeiend elektronenmicroscopieraster en incubeer gedurende 1 min. Was vervolgens het rooster 2x met darkSPB (tabel 2) door de vloeistof te absorberen met een filterpapier en een druppel darkSPB-buffer toe te voegen, was 1x met I-water, incubeer gedurende ~ 30 s met 2% uranylacetaat, dep de vlek en droog het monster een paar minuten aan de lucht.
- Beeld de septinebundels bij 120 kV en vergrotingen tussen 5.000x en 60.000x met een onscherpte tussen 1-2 μm.
Representative Results
Zoals vermeld in het protocol, werden 5 L E. coli-cellen die samen met de twee septine-expresserende plasmiden werden getransformeerd, gekweekt en de expressie van septines werd geïnduceerd door IPTG toe te voegen. Na 3 uur werden de cellen verzameld door centrifugatie, geresuspendeerd in lysisbuffer en gelyseerd door ultrasoonapparaat. Het lysaat werd vervolgens geklaard door centrifugatie en de geklaarde oplossing werd toegepast op een HisTrap-kolom (figuur 2A). Na de eerste zuivering werden de septinehoudende fracties samengevoegd en aangebracht op een StrepTrap-kolom (figuur 2B). Dit levert meestal ongeveer 3-5 ml ~1 μM septinecomplex op. Alvorens de septine-bevattende fracties te poolen, kan denaturerende gel-elektroforese worden gebruikt om te controleren op de integriteit van de septinesubeenheden en de equimolaire stoichiometrische verhouding tussen de verschillende septinesubeenheden die het complex vormen. (Figuur 3A). Als de gel vergelijkbare intense banden vertoont die overeenkomen met de molecuulgewichten (tabel 3) van de septinesubeenheden, kan het protocol worden voortgezet. Zo niet, dan is het aan te raden om het protocol opnieuw te starten. In het voorbeeld voor menselijk septine octameer met SEPT9_i1 toont figuur 3A duidelijk banden die overeenkomen met SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 en SEPT2 (in de volgorde van boven naar beneden) met vergelijkbare intensiteiten; het 99% betrouwbaarheidsinterval van de genormaliseerde intensiteit was 1,128 ± 0,048 voor SEPT2, 1,092 ± 0,034 voor SEPT6, 1,108 ± 0,040 voor SEPT7 en 1,067 ± 0,029 voor SEPT9. Als SEPT2 is getagd met msfGFP, zal het heel dicht onder SEPT9_i1 verschuiven. Afhankelijk van het gebruikte elektroforesesysteem en de aanwezigheid van de C-terminalE TEV-Strep-tag voor SEPT7 (waardoor deze langzamer migreert dan ongelabelde SEPT7), smelten de SEPT7- en SEPT6-banden soms samen vanwege hun vergelijkbare molecuulgewichten. De volgende stap is om de fracties te poolen en dialyseren tegen septinebuffer met DTT. Als na de dialyse de concentratie te laag is (<2 μM) of een hogere concentratie nodig is voor de experimenten, kan een concentratiestap worden opgenomen, zoals beschreven in het protocol. Concentraties onder de 1 μM duiden meestal op een slechte functionele kwaliteit van de septines. Een uiteindelijke septinecomplexconcentratie tussen 3,5 μM en 7 μM werkt goed voor de meeste in vitro assays. Deze concentraties worden meestal verkregen wanneer het volume na concentratie 0,5-1 ml bereikt.
Figuur 2: Voorbeeldchromatogrammen die overeenkomen met de zuivering van donker menselijk septine octamers_9i1. (A) HisTrap kolomchromatogram. Na de septine-elutiepiek gaat de absorptie niet terug naar nul, waarschijnlijk als gevolg van de aanwezigheid van imidazool in de buffer. De gepoolde fractie ging vanaf het begin van de elutiepiek totdat de absorptie stabiliseerde op ongeveer 250 ml. (B) StrepTrap kolomchromatogram. De gepoolde fractie ging vanaf het begin van de elutiepiek totdat de absorptie terugging naar ongeveer 0 bij 50 ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om door te gaan met de kwaliteitscontrole werd native elektroforese, zoals beschreven in het protocol, uitgevoerd (figuur 3B). In de gels kan een grote band worden waargenomen die overeenkomt met de intacte hetero-oligomeren en, meestal, een kleine band die overeenkomt met dimeren. Menselijke hexameren worden iets boven de 242 kDa-markerband gevonden, terwijl octameren boven de 480 kDa-band worden gevonden, boven hun berekende moleculaire massa. De locatie van deze banden werd gecontroleerd door western blot analyse van eukaryote celextracten32. Tagging met msfGFP koppelt elke SEPT2 met een msfGFP-eiwit. Dit veroorzaakt een toename van het molecuulgewicht van septinecomplexen van 53,4 kDa (26,7 kDa/msGFP-molecuul). Niettemin is op de inheemse elektroforesegel het schijnbare molecuulgewicht van de msfGFP-gelabelde complexen niet te onderscheiden van dat van de niet-gecodeerde complexen.
Een aanvullende techniek om te testen of de septinecomplexen intact zijn, is massafotometrie door iSCAT-microscopie. iSCAT bewaakt de lichtverstrooiing van moleculen die landen op een glazen glijbaan die wordt versterkt door interferentie met referentielicht, meestal de reflectie van de laser op de onderkant van de glasplaat. Vervolgens wordt een achtergrondaftrekbenadering gebruikt om contrast aan de deeltjes te geven. Door deze correctie vertoont het signaal positieve en negatieve waarden, afhankelijk van of de deeltjes op het glas terechtkomen of ervan weggaan49. Het gedetecteerde signaal is recht evenredig met het molecuulgewicht van eiwitten50. Daarom kan een signaal-massakalibratie met een massastandaard de massa van de monstereiwitten bepalen. Figuur 3C toont een voorbeeld van menselijke septine octameren die SEPT9_i1 bevatten. De meeste gedetecteerde afzonderlijke deeltjes (~50%) hebben een molecuulgewicht dat wordt verwacht voor complete octameren die SEPT9_i1 bevatten (423 kDa) (figuur 3C). Er zijn ook deeltjes met massa's tussen 150-300 kDa, maar er wordt geen duidelijke piek waargenomen, wat wijst op de mogelijke aanwezigheid van andere septinesoorten in lage abundantie. Evenzo hebben de meeste gedetecteerde afzonderlijke deeltjes voor mEGFP-gelabelde Drosophila-hexameren een molecuulgewicht dat wordt verwacht voor intacte hexameren (361 kDa) (figuur 3D). Een extra duidelijke piek bij 241 kDa duidt op de aanwezigheid van stabiele tetrameren die twee pinda-eiwitten bevatten, een DSep1 en een mEGFP-DSep2. Ten slotte vertonen zowel de menselijke als de vliegenseptinecomplexen een piek rond 80 kDa die een mix van monomeren en dimeren zou kunnen zijn, mogelijk versterkt door een spoor van DTT of een ander klein molecuul dat aggregeert, wat een piek in de positieve kant van de plot45 laat zien.
Figuur 3: Voorbeelden van resultaten van de oligomeerkwaliteitscontrole. (A) Voorbeeld van denatureringsgel met verschillende fracties van de elutiepiek van de zuivering van donkere menselijke septine octamers_9i1. (B) Voorbeeld van inheemse elektroforese van verschillende septinecomplexen. (C,D) Verschillende voorbeelden van histogramresultaten van massafotometrie bij 12,5 nM septinecomplexen: (C) donker menselijk septine octamers_9i1 en (D) DSep1-msfGFP Drosophila septine hexameren. Lijnen zijn Gaussiaanse pasvormen. (E) TEM-opname van 25 nM donker menselijk septine octamers_9i1 in septinebuffer. Schaalbalk = 200 nm. (F) Klassegemiddelde afbeelding van SEPT2-msfGFP humane septine octamers_9i1. De msfGFP-tags zijn zichtbaar als vage dichtheden aan de twee uiteinden. Schaalbalk = 10 nm. Panelen (E) en (F) vallen onder het auteursrecht van The Company of Biologists en zijn met toestemming overgenomen van Iv et al.10 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aangezien zowel native gels als iSCAT alleen ensemblegemiddelde informatie bieden, werd klassegemiddelde van transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van enkelvoudige septine-oligomeren gebruikt om de integriteit en zuiverheid van de complexen door directe visualisatie te controleren. In TEM-beelden van septinecomplexen in septinebuffer kunnen staafjes van 24 nm (hexameren) of 32 nm (octameren) lang worden waargenomen. Een voorbeeld van een menselijk septine octameer met SEPT9_i1 is te zien in figuur 3E. Wanneer ze worden gemiddeld, kan elk van de subeenheden worden waargenomen en geteld, zoals te zien is voor het msfGFP-gelabelde menselijke octameer met SEPT9_i1 in figuur 3F. In het geval dat het oligomeer fluorescerend wordt gelabeld, kunnen extra dichtheden worden waargenomen die overeenkomen met de SEPT2-msfGFP aan het einde van de staafjes (figuur 3F).
De combinatie van bovenstaande technieken bewijst dat octameren (of hexameren) met de juiste stoichiometrische verhouding en hoge zuiverheid gezuiverd kunnen worden met behulp van het beschreven protocol. Ten slotte is de laatste kwaliteitscontrole voor de functionaliteit van de septinecomplexen in termen van hun polymerisatievermogen. In aanwezigheid van een lage zoutconcentratie (<150 mM KCl met de beschreven buffer9), als septines niet in de aanwezigheid van andere eiwitten of negatief geladen lipidemembranen zijn, assembleren ze zichzelf in bundels9. Septines worden voorkomen van polymerisatie door ze in de opslagbuffer te houden, die een hoge (300 mM) KCl-concentratie heeft. De septine hetero-oligomeren worden vervolgens verdund met een volumeverhouding van 1:6 in een buffer van dezelfde samenstelling maar zonder KCl om een uiteindelijke KCl-concentratie van 50 mM te bereiken. Om fluorescentiebeeldvorming uit te voeren, wordt deze buffer aangevuld met een zuurstofopruimingssysteem om te beschermen tegen fotobleaching en met een knipperende onderdrukker. In TIRF-microscopie kunnen kleine clusters van eiwitten worden waargenomen binnen het ondiepe TIRF-veld (~ 100 nm; Figuur 4A,B). Op een confocale microscoop zijn grote clusters van filamenteuze structuren te zien die hoger in oplossing zweven (figuur 4C). Ten slotte kunnen met TEM kleine bundels septine (figuur 4D), overeenkomend met de clusters waargenomen door TIRF, en grote bundels (figuur 4E), overeenkomend met de structuren waargenomen door confocale microscopie, worden waargenomen. De inzetstukken van figuur 4D,E laten zien dat beide soorten structuren bestaan uit lange, dunne filamenten die parallel lopen en bundels vormen met taps toelopende uiteinden. Samen bewijzen de fluorescentie- en TEM-beelden dat de gezuiverde septinecomplexen kunnen polymeriseren tot filamenten, die zichzelf op hun beurt assembleren tot bundels.
Figuur 4: Voorbeelden van resultaten van de polymerisatiecapaciteit kwaliteitscontrole. (A) TIRF-beeld van 300 nM humane septinehexameren (10% msfGFP-gelabelde hexameren) in fluoSPB. (B) TIRF-opname van 300 nM humane septine octameren die SEPT9_i1 (10% msfGFP-gelabeld octamers9_i1) in fluoSPB bevatten. (C) Confocale maximale intensiteitsprojecties van Z-stacks over ~30 μm met 0,5 μm afstand van 300 nM humaan septine octamers_9i3 in fluoSPB. (A-C) Schaalbalk = 10 μm en omgekeerde grijswaarden. (D,E) Voorbeeld TEM-afbeeldingen van (D) kleine en (E) grote bundels menselijk septine octamers_9i1 in darkSPB. Inzetstukken tonen gebieden waar duidelijke filamenten die parallel lopen in de bundel kunnen worden waargenomen. Schaalstaven = 500 nm. Panelen (C-E) zijn copyright van The Company of Biologists en zijn met toestemming overgenomen van Iv et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van plasmiden. Plasmiden om septine-oligomeren te zuiveren volgens dit protocol. Alle plasmiden zijn gedeponeerd in Addgene (eerste kolom). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Lijst van buffers. Buffersamenstellingen die worden gebruikt voor de zuivering en kwaliteitscontrole van septine-oligomeren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Molecuulgewichten en extinctiecoëfficiënten. Lijst van molecuulgewichten (MW) en optische extinctiecoëfficiënten (ε) bij een golflengte van 280 nm berekend met ProtParam op basis van de sequenties van het complex, uitgaande van lineaire fusie van de septinesubeenheden, de verschillende septinecomplexen en de unieke septinesubeenheden (alleen MW) die kunnen worden gezuiverd met de plasmiden vermeld in tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
De hier beschreven methode maakt de robuuste zuivering en kwaliteitscontrole van voorgevormde septine hetero-oligomeren mogelijk. Enkele van de belangrijkste kwesties om te overwegen voor de juiste toepassing van de methode zijn als volgt. Tijdens de elutiestappen in de chromatografische scheidingen is het belangrijk om het aanbevolen (of lagere) debiet te gebruiken om de verdunning van de septinecomplexen te minimaliseren. Bovendien, om het herstel van eiwitten tijdens de laatste concentratiestap te maximaliseren, is de concentratorkolom zo gericht dat de oplossing niet tegen het filter wordt geduwd (wanneer er slechts aan één kant een filter is). Als de oplossing rechtstreeks naar het filter gaat, kleeft het eiwit er veel meer aan, waardoor de uiteindelijke opbrengst aanzienlijk afneemt. Het is ook belangrijk om te bedenken dat de concentratiestap niet altijd nodig is. Het plukken van fracties alleen uit een smal bereik rond de piek in het chromatogram geeft meestal een voldoende hoge voorraadconcentratie (> 3.000 nM) voor veel reconstitutietoepassingen (die meestal tussen 10-300 nM werken). Ten slotte is het voor de kwaliteitscontrole van de functionaliteit van de septinecomplexen door fluorescentiemicroscopie belangrijk om het oppervlak van de microscopiedia's correct te passiveren, omdat septinecomplexen gretig aan glas kleven. Passivering van de glasglaasjes kan worden uitgevoerd via PLL-PEG-functionalisatie of door de vorming van neutrale (100% DOPC) ondersteunde lipide bilayers11,32.
Ten opzichte van het oorspronkelijke zuiveringsprotocol dat voor het eerst werd beschreven in Iv et al.10, is er een verandering in de buffersamenstellingen (tabel 2). De concentratie van MgCl2 is verlaagd van 5 mM naar 2 mM en de concentratie en pH van Tris-HCl zijn verlaagd van respectievelijk 50 mM naar 20 mM en van 8,0 naar 7,4. Deze veranderingen werden aangebracht om de buffercondities compatibel te maken met studies van de interacties van menselijke septines met lipide bilayers, actinefilamenten en microtubuli 10,11,32. Dit komt omdat de auteurs ondersteunde lipide bilayers en gepolymeriseerd actine in de F-buffer vormden, waarvan de samenstelling identiek is aan die van darkSPB, afgezien van de aanwezigheid van ATP in de F-buffer. De bufferverandering bracht geen veranderingen teweeg in de kwaliteit of levensduur van de gezuiverde septines in vergelijking met de oorspronkelijke buffers.
Deze methode van zuivering heeft nog steeds verschillende beperkingen. Ten eerste kunnen verschillende zuiveringspogingen variëren in opbrengst (0,5-1 ml van 2-5 μM septinecomplexen) en functionele kwaliteit, zoals gecontroleerd door het bundelvormingsvermogen van de gezuiverde septinecomplexen. Daarom is het erg belangrijk om de kwaliteitscontroles die in dit artikel worden beschreven consequent uit te voeren. Het zeer goed regelen van de expressietijden en de optische dichtheid van de bacteriecultuur kan helpen het verschil in opbrengst te verminderen. Ten tweede kan deze zuiveringspijplijn geen onderscheid maken tussen trimers en hexameren of tussen tetrameren en octameren (figuur 1B). De kwaliteitscontrole-experimenten kunnen echter worden gebruikt om te bewijzen dat de meerderheid van septinecomplexen zich in hun lange oligomeervorm bevinden. Indien een nog smallere oligomeergrootteverdeling vereist is, kan tussen stap 1.6 grootte-uitsluitingschromatografie worden ingevoegd. en stap 1.7. van het zuiveringsprotocol. Deze optionele stap vermindert echter drastisch de opbrengst en wordt niet aanbevolen, tenzij het strikt noodzakelijk is. Een laatste, meer fundamentele, beperking komt van het gebruik van E. coli als een expressiesysteem voor recombinante septinecomplexen. Uiteraard laat dit systeem geen posttranslationele modificaties (PTM's) toe, die zijn gemeld in dierlijke cellen, zoals fosforylering, acetylering en sumoylation 6,51,52,53. Deze posttranslationele modificaties kunnen worden toegevoegd door een vergelijkbare zuiveringsstrategie in insecten of menselijke cellen te implementeren. Bovendien heeft dit artikel alleen de reconstitutie van septines op zichzelf besproken, maar studies in cellen geven aan dat regulerende eiwitten zoals eiwitten uit de Borg-familie54,55 en anilline 24,25,56 substantiële maar slecht begrepen effecten kunnen hebben op de assemblage en functies van septines en daarom belangrijk zijn om uiteindelijk in in vitro op te nemen Studies. Protocollen voor de zuivering van Borg-eiwitten en anilline zijn gemeld54,57.
Het septinezuiveringsprotocol dat hier wordt gerapporteerd, biedt een gestandaardiseerde manier om septines in hun oligomeervorm te zuiveren met de juiste subunit-stoichiometrie, wat een belangrijke vooruitgang biedt ten opzichte van veel eerdere in vitro studies die afhankelijk zijn van enkelvoudige septinesubeenheden. Hoewel sommige septines in specifieke contexten kunnen fungeren als een enkele subeenheid2, suggereert de huidige literatuur sterk dat septines in dierlijke cellen meestal functioneren in complexen 9,58. Daarom is het gebruik van voorgevormde hetero-oligomeren, zoals beschreven in dit artikel en andere 10,11,18,32,35,36,37, van groot belang om de structurele en biofysische eigenschappen van septines via in vitro te bestuderen. reconstitutie om hun functies in de cel te ontleden. Bovendien zijn septines zelfassemblerende eiwitten met veel interactiepartners, waaronder het membraan en het cytoskelet, waardoor ze van groot belang zijn voor bottom-up synthetische biologie 59,60,61 en studies van eiwit-geïnduceerde veranderingen in membraanbiofysische eigenschappen zoals kromming 42,62,63.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
We danken Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay en Katharina Häußermann voor hun hulp bij massafotometrie (iSCAT) experimenten; Arjen Jakobi en Wiel Evers voor hun hulp bij TEM; Lucia Baldauf voor haar hulp bij TIRF; Pascal Verdier-Pinard voor zijn advies met betrekking tot inheemse elektroforese; Agata Szuba en Marjolein Vinkenoog voor hun hulp bij het opzetten van de Drosophila septine zuiveringsinspanningen, en de Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, lid van de Franse Nationale Onderzoeksinfrastructuur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). Dit onderzoek ontving financiering van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) via de zwaartekrachtsubsidie 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' (024.003.019) en van het Agence Nationale pour la Recherche (ANR-subsidies ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME"; en ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488nm laser combiner iLAS2 | Gataca | TIRF microscope | |
| 488nm Sapphire laser lines | Coherent | Confocal microscope | |
| 4k X 4k F416 CMOS camera | TVIPS | For JEM-1400plus | |
| 4x sample buffer nativePAGE | Thermo Fisher scientific | BN2003 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX) | Sigma-Aldrich | 238813 | To prevent blinking |
| AKTA pure 25 M1 | GE healthcare | 1680311 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Carbon Type-B, 300 mesh EM grid | Ted pella | 01813-F | |
| Carbon Type-B, 300 mesh EM grid | Electron micoscopy sciences | CF300-Cu | |
| Cover glass #1.5H | Thorslabs | CG15KH | |
| CSU-X1-M1 confocal unit | Yokogawa | Confocal microscope | |
| Desthiobiotin | Sigma-Aldrich | D1411-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon instruments | Confocal microscope | |
| EDTA-free protease inhibtor cocktail | Roche | 481761 | |
| HisTrap HP, 5 mL | GE healthcare | 29-0588-3 | |
| iLAS2 azimuthal TIRF illumination system | Gataca | TIRF microscope | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 1202-1KG | |
| InstantBlue Protein Gel Stain | Westburg Life Sciences | EP ab119211 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher scientific | 10849040 | |
| iXon Ultra 888 EMCCD camera | Andor | Confocal microscope | |
| iXon Ultra 897 EM-CCD | Andor | TIRF microscope | |
| JEM-1400plus | JOEL | TEM microscope TUDelft | |
| kappa-cassein | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich | L3022-6X1KG | |
| Lyzozyme | Sigma-Aldrich | 62971-10G-F | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 746452-1KG | |
| Methylecllulose | Sigma-Aldrich | 8074844 | |
| MilliQ system (Integral 10) | Merck-Millipore | I-water dispenser | |
| Mini protean TGX gels | BIORAD | 4561086 | |
| NativeMark unstained protein standard | Invitrogen | LC0725 | For iSCAT and Native gels |
| NativePAGE 4-16% GELS | Thermo Fisher scientific | BN1002BOX | |
| NativePAGE Running Buffer kit | Thermo Fisher scientific | BN2007 | |
| Nikon Ti2-E | Nikon instruments | TIRF microscope | |
| Nr. 1 Menzel coverslips | Thermo Fisher scientific | 11961988 | |
| parafilm | Sigma-Aldrich | P7668 | |
| Plan Apo ×100/1.45 NA oil immersion objective | Nikon instruments | Confocal microscope | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG) | SuSoS | CHF560.00 | |
| Poly-L-lysine solution 0.01% | Sigma-Aldrich | P4832 | For iSCAT glass slides |
| Pottassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| Power supply for native gels | CONSORT | S/N 71638 | |
| POWERPAC UNIVERSAL | BIORAD | 042BR31206 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenger - enzyme |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 03930590-50MG | oxygen scavenger - reagent |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | |
| Quemesa camera | Olympus | For Tecnai Spirit | |
| Refeyn OneMP | Refeyn | ||
| Sample buffer, laemmli 2x concentrate | Sigma-Aldrich | S3401-10vl | |
| Silicon gaskets | Sigma-Aldrich | GBL103250-10EA | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL | Thermo Fisher scientific | 66381 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | PHR1441-1G | |
| StrepTrap HP, 1 mL | GE healthcare | 28-9075-46 | |
| Tecnai Spirit microscope | Thermo Scientific, FEI | TEM microscope Institute Curie | |
| Terrific broth | Sigma-Aldrich | T0918-1KG | |
| Tris/Glyine/SDS buffer | BIORAD | 1610772 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941-1KG | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | CPX2800H-E | |
| Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES | Sartorius | VS0622 |
References
- Mostowy, S., Cossart, P. Septins: The fourth component of the cytoskeleton. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 183-194 (2012).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3802 (2022).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. Septin form and function at the cell cortex. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17173-17180 (2015).
- Smith, C., et al. Septin 9 exhibits polymorphic binding to F-actin and inhibits myosin and cofilin activity. Journal of Molecular Biology. 427 (20), 3273-3284 (2015).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Marquardt, J., Chen, X., Bi, E. Architecture, remodeling, and functions of the septin cytoskeleton. Cytoskeleton. 76 (1), 7-14 (2018).
- Van Ngo, H., Mostowy, S.
- Fung, K. Y. Y., Dai, L., Trimble, W. S. Cell and molecular biology of septins. International Review of Cell and Molecular Biology. 310, 289-339 (2014).
- Kinoshita, M., Field, C. M., Coughlin, M. L., Straight, A. F., Mitchison, T. J. Self- and actin-templated assembly of mammalian septins. Developmental Cell. 3 (6), 791-802 (2002).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers 2 with distinct SEPT9 isoforms. Journal of Cell Science. 134 (15), (2021).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Kinoshita, M.
- Connolly, D., et al. Septin 9 isoform expression, localization and epigenetic changes during human and mouse breast cancer progression. Breast Cancer Research. 13 (4), 76 (2011).
- Connolly, D., et al. Septin 9 amplification and isoform-specific expression in peritumoral and tumor breast tissue. Biological Chemistry. 395 (2), 157-167 (2014).
- Estey, M. P., Di Ciano-Oliveira, C., Froese, C. D., Bejide, M. T., Trimble, W. S. Distinct roles of septins in cytokinesis: SEPT9 mediates midbody abscission. Journal of Cell Biology. 191 (4), 741-749 (2010).
- John, C. M., et al. The Caenorhabditis elegans septin complex is nonpolar. EMBO Journal. 26 (14), 3296-3307 (2007).
- Field, C. M., et al. A purified Drosophila septin complex forms filaments and exhibits GTPase activity. Journal of Cell Biology. 133 (3), 605-616 (1996).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: Supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Sellin, M. E., Sandblad, L., Stenmark, S., Gullberg, M. Deciphering the rules governing assembly order of mammalian septin complexes. Molecular Biology of the Cell. 22 (17), 3152-3164 (2011).
- Akil, A., et al. Septin 9 induces lipid droplets growth by a phosphatidylinositol-5-phosphate and microtubule-dependent mechanism hijacked by HCV. Nature Communications. 7, 12203 (2016).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology. 19 (2), 140-145 (2009).
- Omrane, M., et al. Septin 9 has two polybasic domains critical to septin filament assembly and Golgi integrity. iScience. 13, 138-153 (2019).
- Carim, S. C., Kechad, A., Hickson, G. R. X. Animal cell cytokinesis: The rho-dependent actomyosin-anilloseptin contractile ring as a membrane microdomain gathering, compressing, and sorting machine. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575226 (2020).
- El Amine, N., Kechad, A., Jananji, S., Hickson, G. R. X. Opposing actions of septins and Sticky on Anillin promote the transition from contractile to midbody ring. Journal of Cell Biology. 203 (3), 487-504 (2013).
- Renshaw, M. J., Liu, J., Lavoie, B. D., Wilde, A. Anillin-dependent organization of septin filaments promotes intercellular bridge elongation and Chmp4B targeting to the abscission site. Open Biology. 4 (1), 130190 (2014).
- Vogt, E. T., et al. The ultrastructural organization of actin and myosin II filaments in the contractile ring: new support for an old model of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 28 (5), 613-623 (2017).
- Mavrakis, M., et al. Septins promote F-actin ring formation by crosslinking actin filaments into curved bundles. Nature Cell Biology. 16 (4), 322-334 (2014).
- Karasmanis, E. P., et al. A septin double ring controls the spatiotemporal organization of the ESCRT machinery in cytokinetic abscission. Current Biology. 29 (13), 2174-2182 (2019).
- Hagiwara, A., et al. Submembranous septins as relatively stable components of actin-based membrane skeleton. Cytoskeleton. 68 (9), 512-525 (2011).
- Calvo, F., et al. Cdc42EP3/BORG2 and septin network enables mechano-transduction and the emergence of cancer-associated fibroblasts. Cell Reports. 13 (12), 2699-2714 (2015).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Kuzmić, M., et al. Septin-microtubule association via a motif unique to isoform 1 of septin 9 tunes stress fibers. Journal of Cell Science. 135 (1), (2022).
- Shindo, A., et al. Septin-dependent remodeling of cortical microtubule drives cell reshaping during epithelial wound healing. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Hu, Q., Nelson, W. J., Spiliotis, E. T. Forchlorfenuron alters mammalian septin assembly, organization, and dynamics. Journal of Biological Chemistry. 283 (43), 29563-29571 (2008).
- Mavrakis, M., Tsai, F. C., Koenderink, G. H. Purification of recombinant human and Drosophila septin hexamers for TIRF assays of actin-septin filament assembly. Methods in Cell Biology. 136, 199-220 (2016).
- Nakos, K., Radler, M. R., Spiliotis, E. T. Septin 2/6/7 complexes tune microtubule plus-end growth and EB1 binding in a concentration- and filament-dependent manner. Molecular Biology of the Cell. 30 (23), 2913-2928 (2019).
- Kaplan, C., et al. Absolute arrangement of subunits in cytoskeletal septin filaments in cells measured by fluorescence microscopy. Nano Letters. 15 (6), 3859-3864 (2015).
- Castro, D. K. S. V., et al. A complete compendium of crystal structures for the human SEPT3 subgroup reveals functional plasticity at a specific septin interface. IUCrJ. 7, Pt 3 462-479 (2020).
- Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 1-13 (2020).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10, 420 (2019).
- Zhou, R., Shi, Y., Yang, G. Expression, purification, and enzymatic characterization of intramembrane proteases. Methods in Enzymology. 584, 127-155 (2017).
- Diebold, M. L., Fribourg, S., Koch, M., Metzger, T., Romier, C. Deciphering correct strategies for multiprotein complex assembly by co-expression: Application to complexes as large as the histone octamer. Journal of Structural Biology. 175 (2), 178-188 (2011).
- Lebedeva, M. A., Palmieri, E., Kukura, P., Fletcher, S. P. Emergence and rearrangement of dynamic supramolecular aggregates visualized by interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 14 (9), 11160-11168 (2020).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. Journal of Structural Biology. 128 (1), 82-97 (1999).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. Journal of Structural Biology. 116 (1), 190-199 (1996).
- Young, G., Kukura, P.
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Hernández-Rodríguez, Y., Momany, M. Posttranslational modifications and assembly of septin heteropolymers and higher-order structures. Current Opinion in Microbiology. 15 (6), 660-668 (2012).
- Ribet, D., et al. SUMOylation of human septins is critical for septin filament bundling and cytokinesis. Journal of Cell Biology. 216 (12), 4041-4052 (2017).
- Sinha, I., et al. Cyclin-dependent kinases control septin phosphorylation in Candida albicans hyphal development. Developmental Cell. 13 (3), 421-432 (2007).
- Sheffield, P. J., et al. Borg/Septin interactions and the assembly of mammalian septin heterodimers, trimers, and filaments. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3483-3488 (2003).
- Joberty, G., et al. Borg proteins control septin organization and are negatively regulated by Cdc42. Nature Cell Biology. 3 (10), 861-866 (2001).
- Chen, X., Wang, K., Svitkina, T., Bi, E. Critical roles of a RhoGEF-anillin module in septin architectural remodeling during cytokinesis. Current Biology. 30 (8), 1477-1490 (2020).
- Kučera, O., et al.
- Hsu, S. C., et al. Subunit composition, protein interactions, and structures of the mammalian brain sec6/8 complex and septin filaments. Neuron. 20 (6), 1111-1122 (1998).
- Olivi, L., et al. Towards a synthetic cell cycle. Nature Communications. 12 (1), 1-11 (2021).
- Hürtgen, D., Härtel, T., Murray, S. M., Sourjik, V., Schwille, P. Functional modules of minimal cell division for synthetic biology. Advanced Biosystems. 3 (6), 1800315 (2019).
- Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: Reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. The Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Lobato-Márquez, D., Mostowy, S. Septins recognize micron-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
