Glykosyleringsmønsteret for et antistof bestemmer dets kliniske ydeevne, således at industrielle og akademiske bestræbelser på at kontrollere glykosylering vedvarer. Da typiske glykoengineeringskampagner er tids- og arbejdskrævende, ville genereringen af en hurtig protokol til at karakterisere virkningen af glykosyleringsgener ved hjælp af forbigående hæmning vise sig nyttig.
Rekombinante monoklonale antistoffer binder specifikke molekylære mål og inducerer efterfølgende et immunrespons eller hæmmer bindingen af andre ligander. Monoklonal antistoffunktionalitet og halveringstid kan dog reduceres ved typen og fordelingen af værtsspecifik glykosylering. Forsøg på at producere overlegne antistoffer har inspireret udviklingen af genetisk modificerede producentceller, der syntetiserer glycooptimerede antistoffer. Glycoengineering kræver typisk generering af en stabil knockout- eller knockincellelinje ved hjælp af metoder såsom clustered regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) -associeret protein 9. Monoklonale antistoffer produceret af konstruerede celler karakteriseres derefter ved anvendelse af massespektrometriske metoder til bestemmelse af, om den ønskede glycoprofil er opnået. Denne strategi er tidskrævende, teknisk udfordrende og kræver specialister. Derfor kan en alternativ strategi, der anvender strømlinede protokoller til genetisk glycoengineering og glycandetektion, hjælpe bestræbelserne mod optimale antistoffer. I denne proof-of-concept-undersøgelse fungerede en IgG-producerende ovariecelle fra kinesisk hamster som en ideel vært for at optimere glycoengineering. Kort interfererende RNA rettet mod Fut8-genet blev leveret til ovarieceller fra kinesiske hamstere, og de resulterende ændringer i FUT8-proteinekspression blev kvantificeret. Resultaterne indikerer, at knockdown ved denne metode var effektiv, hvilket førte til en reduktion på ~ 60% i FUT8. Supplerende analyse af antistofglykoprofilen blev udført ved anvendelse af en hurtig, men meget følsom teknik: kapillærgelelektroforese og laserinduceret fluorescensdetektion. Alle knockdown-eksperimenter viste en stigning i afucosylerede glycaner; det største skift opnået i denne undersøgelse var imidlertid ~ 20%. Denne protokol forenkler glykoengineeringsindsatsen ved at udnytte silico-designværktøjer , kommercielt syntetiserede genmålretningsreagenser og hurtige kvantificeringsassays, der ikke kræver omfattende forudgående erfaring. Som sådan kan de tidseffektiviteter, der tilbydes af denne protokol, hjælpe undersøgelser af nye genmål.
N-bundet glycosylering er en enzymatisk proces, hvorved oligosacchariddele er kovalent forbundet med Asn-rester. I modsætning til de novo proteinsyntese er glycansyntese en ikke-skabelonreaktion, der resulterer i heterogen glykosylering af proteiner. Strukturen, sammensætningen og fordelingen af glycaner kan påvirke proteinkonformation og funktion. Faktisk regulerer N-glycosylering i det krystalliserbare fragment (Fc) -region af immunoglobulin G (IgG) den terapeutiske virkning, immunogenicitet og halveringstid af antistoffet1. Som sådan identificerer kvalitetsparadigmet (QbD) for udvikling af rekombinante bioterapeutiske proteinprodukter naturligt glykosylering som en kritisk kvalitetsattribut (CQA)2,3. Pattedyrceller er ofte de foretrukne ekspressionssystemer, da de i sagens natur producerer menneskelignende glykosyleringsmønstre tættere end bakterier, gær, insekt eller planteceller. Desuden vælges ovarieceller (CHO) fra kinesiske hamstere frem for andre pattedyrcellelinjer, fordi de er resistente over for human virusinfektion, udskiller produkter ved høje titere og kan dyrkes i suspensionskultur til høje levedygtige celletætheder4. Med hensyn til glycandannelse genererer ikke-CHO-murinproduktionsceller immunogene glycaner (α (1-3) -bundet galactose [α (1-3) -Gal] og N-glycolylneuraminsyre [NeuGc]), der påvirker sikker anvendelse af monoklonale antistoffer (mAbs)5. Disse fordele gør CHO-celler til det førende ekspressionssystem, der er ansvarlig for produktionen af over 80% af ny bioterapi mellem 2014 og 20186. Imidlertid er skabelonuafhængig glykosylering en konserveret mekanisme, der fører til CHO-afledt bioterapi med en række glycoformer.
Bioterapeutiske udviklingsstrategier sigter mod at kontrollere heterogenitet i CHO-celler ved genteknologi. Nogle litteratureksempler inkluderer knockdown af sialidaser (Neu1, Neu3)7, GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout8 og overekspression af glycosyltransferaser (GnTIII)9. Fremskridt inden for glycoengineering er mulige på grund af en kombination af offentligt tilgængelige ressourcer, som CHO-genomet10, og den igangværende udvikling af genteknologiske værktøjer, såsom transkriptionsaktivatorlignende effektornukleaser (TALEN’er), zinkfingernukleaser (ZFN’er) og grupperede regelmæssigt interspacede korte palindromiske gentagelser (CRISPR)-associeret protein 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Disse værktøjer leveres typisk til CHO-celler som plasmid-DNA eller som rensede ribonukleoproteinkomplekser (RNP). Omvendt er RNA-interferens (RNAi) en genteknologi, der i sin enkleste form kun kræver levering af oprensede kort interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider. Endogene proteiner behandler dobbeltstrenget siRNA i enkeltstrenge, og nukleasen, RNA-induceret hæmningskompleks (RISC), danner et kompleks med siRNA til spaltning af mål-mRNA-sekvenser 15,16,17. Genhæmning via denne metode er forbigående på grund af RNA-ustabilitet, men undersøgelsen heri udnytter denne funktion til at hjælpe hurtig screening.
Det modelenzym, der er udvalgt til den aktuelle undersøgelse, α1,6-fucosyltransferase (FUT8), producerer N-glycaner med α-1,6 kernebundet L-fucose (Fuc). Denne modifikation er en primær determinant for antistofafhængig cellecytotoksicitet (ADCC) aktivitet, som det fremgår af undersøgelser af kommercielle antistoffer. I mangel af kernefukosylering øger Rituximab (anti-CD20 IgG1) ADCC 50 gange og øger ADCC i Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) ved at forbedre FcgRIIIa-bindingen18,19. Kernefucosylering betragtes således som et uønsket træk ved mAbs, der berettiger bestræbelser på at vende denne fænotype. Der er eksempler på vellykket Fut8-genmålretning ved hjælp af siRNA med samtidige stigninger i ADCC 20,21,22, omend disse eksempler leverer Fut8 siRNA kodet på plasmid-DNA. Sådanne eksperimenter genererer stabil genhæmning, da plasmid-DNA tjener som en skabelon til siRNA-syntese. Dette gør det muligt for celler at genopbygge siRNA-molekyler, der nedbrydes af intracellulære RNaser og fosfataser. Omvendt tillader levering af eksogent syntetisk siRNA kun forbigående genhæmning, da siRNA ikke kan genopfyldes på grund af manglen på en intracellulær skabelon. Således bør brugerne overveje, om eksperimentelle designs er kompatible med plasmidafledt eller syntetisk siRNA. For eksempel kan undersøgelser med fokus på peak mAb-produktion, typisk dag seks i kulturen23,24, vælge syntetisk siRNA, der kan leveres til celler et par dage før peak-ekspression. Fordelene ved en forbigående tilgang ved hjælp af syntetisk siRNA inkluderer evnen til at outsource produktionen og det faktum, at flere siRNA-konstruktioner kan genereres på en brøkdel af den tid, det tager at generere konstruktioner i plasmider. Desuden er syntetisk siRNA effektivt, som det fremgår af litteratureksempler på Fut8-genhæmning, der er tilstrækkelige til at reducere FUT8-proteinekspression25 og give afucosylerede IgG’er med øget FCgRIIIa-binding og ADCC26.
Succesen med denne glycoengineeringsprotokol blev bestemt af graden af Fc-glycosylering. Massespektrometri er normalt den valgte metode til glykæmiske analyser; kapillærgelelektroforese og laserinduceret fluorescensdetektion (CGE-LIF) er imidlertid perfekt egnet til at løse glykoprofilen af rensede IgG’er og har fordelen ved større hurtighed og enkelhed. Massespektrometriprotokoller skal kombinere de relevante kromatografiske og derivatiseringsmetoder, ioniseringskilder og masseanalysatorer 27,28,29. Ud over at kræve en uddannet specialist er massespektrometriprotokoller lange, og mangfoldigheden af metoder gør data vanskelige at sammenligne mellem laboratorier med forskellige opsætninger. I forbindelse med biofarmaceutiske produkter er CGE-LIF en følsom metode, der kan give tilstrækkelige detaljer om en antistofglykoprofil og er let skalerbar til metoder med høj kapacitet. For lav overflod, meget komplekse blandinger med dårligt karakteriserede glycoproteiner, kan fordelene ved massespektrometri forblive. Imidlertid tjener den højopløselige og højfølsomme mAb-analyse, der leveres af CGE-LIF-baseret N-glycananalyse, som en begrundelse for at afprøve denne metode. Desuden er prøveforberedelse og analyse afsluttet på få timer30. Nylige undersøgelser har vist, at CGE-LIF kan bruges til at overvåge glycaner afledt af human plasma31, mus32 og CHO IgGs33. Disse undersøgelser fremhæver brugen af CGE-LIF til analyse af prøver med høj kapacitet og små prøvemængder.
CGE-LIF-metoden har begrænsninger, der bør tages i betragtning. Omkostninger er en betydelig barriere for brugen af dette og andre enheder til glycananalyse. Disse omkostninger er imidlertid typiske inden for området, og CGE-LIF anses for at være en omkostningseffektiv løsning34. Laboratorier med mindre budgetter kan finde det mere praktisk at lease maskiner eller outsource prøveanalyse. En anden overvejelse af enhver analytisk metode er repeterbarhed. Evaluering af CGE-LIF blev udført ved hjælp af 48 replikater af den samme prøve, der blev analyseret på forskellige dage. Den relative standardafvigelse pr. kapillær blev bestemt for intrabatch og interbatch repeterbarhed. Intrabatch-sammenligningen af replikater viste sig at have en relativ standardafvigelse på 6,2%, hvilket indikerer, at kapillærydelsen ikke er ensartet. Endvidere viste en sammenligning af interbatch-data en relativ standardafvigelse på 15,8%31, hvilket indikerer, at kapillærydelsen ændrer sig over tid. De konstaterede operationelle mangler gælder muligvis ikke i den aktuelle undersøgelse, som anvender forskellige maskiner og proprietære reagenser. Hvis brugerne har til hensigt at udvikle en intern protokol, ville det være værd at overveje undersøgelsen af Ruhaak et al. 31, som omhyggeligt evaluerede reagenserne til CGE-LIF. Som sådan er reagenserne til prøveinjektion (Hi-Di Formamid og DMSO), glycanmærkning (NaBH3CN eller 2-picolin boran)31 og andre blevet optimeret.
Denne undersøgelse præsenterer en tidseffektiv glycoengineeringsprotokol, der kombinerer hurtigheden af direkte RNAi med downstream glykæmisk analyse. Metoden er illustreret ved hjælp af Fut8-genet som et mål af de grunde, der er skitseret ovenfor.
Glykosyleringsveje involverer et komplekst metabolisk netværk af enzymer og tilbehørsproteiner. Dissekering af funktionen af vejbestanddele er skræmmende, hvis den er afhængig af konventionelle knockout- eller knockin-genteknologiske strategier alene. En alternativ tilgang er foreløbigt at screene medlemmer af en vej ved hjælp af et forbigående funktionstabsassay. Til dette formål blev to hurtige protokoller kombineret, RNAi og CGE-LIF detektion, for at skabe en mere effektiv måde at karakterisere glycosyleringsgener på. Den beskrevne metode kræver 5-7 dage til færdiggørelse sammenlignet med konventionelle metoder, der potentielt tager flere uger at afslutte. Desuden kan forskningsmiljøer med automatiseringsfunktioner udnytte denne metode til at screene flere genkandidater end muligt med manuel håndtering.
Succesen med en forbigående glycoengineering-kampagne afhænger i høj grad af siRNA-designet. Brugerdefinerede DsiRNA-designs skal følge de tidligere skitserede regler, eller for nemheds skyld kan brugerne vælge kommercielt tilgængelige foruddesignede sekvenser. Ligesom andre genmodifikationsstrategier har RNAi potentialet for off-target effekter. Derfor opfordres brugerne til at vurdere utilsigtet genmålretning ved hjælp af beregningsmetoder41. Eksperimentelle designvalg kan også hjælpe med at begrænse off-target effekter. Kittler et al. viste, at den multipleksede levering af siRNA førte til en reduktion i off-target effekter42. Selvom dette virker kontraintuitivt, foreslås det, at en masterblanding reducerer koncentrationen af hver siRNA-konstruktion og dermed begrænser muligheden for off-target genhæmning. En yderligere fordel er, at den samtidige transfektion af siRNA-strukturer, der er målrettet mod det samme gen, øger sandsynligheden for vellykket RNAi. Brugen af en masterblanding sikrer også konsistens mellem prøver og replikater og fremskynder transfektionsprocessen. Efter en indledende screening af blandede siRNA-konstruktioner kan et andet eksperiment udføres ved hjælp af individuelle konstruktioner for at fastslå RNAi-effektiviteten af hver sekvens. I denne og andre knockdown-undersøgelser er op til tre siRNA blevet samlet og leveret til celler 43,44,45. Det kan dog være ønskeligt at screene mere end tre siRNA samtidigt for effektivt at målrette mod et enkelt gen eller for at målrette mod flere gener. Faktisk viste en undersøgelse multiplekset siRNA-medieret hæmning af op til seks gener på niveauer, der kan sammenlignes med hæmning af individuelle gener46. Imidlertid er der behov for yderligere undersøgelser for at bestemme det maksimale antal siRNA-konstruktioner, der kan bruges i en pool uden at gå på kompromis med lyddæmpningseffektiviteten. Multiplexstrategien blev foreslået af Martin et al. for at forbedre tempoet i RNAi-biblioteksscreeningseksperimenter46, og et lignende koncept kan vise sig nyttigt til at screene glykosyleringsgener.
Protokollen beskrevet heri fungerer som et proof-of-concept med forventning om, at efterfølgende eksperimenter vil blive udført for at validere andre glykosyleringsgener. Nye gener af interesse kan være ukarakteriserede eller mindre populære end Fut8, og primære antistoffer til påvisning af genhæmning kan være dårlige eller utilgængelige. I dette scenario kan alternative metoder såsom RT-PCR anvendes til at kvantificere genhæmning47, men det skal bemærkes, at RT-PCR detekterer mRNA snarere end protein. Når antistoffer til western blotting er tilgængelige, er et almindeligt problem dårlig påvisning eller tilstedeværelsen af ikke-specifikke bånd. Fejlfindingsvejledninger til at hjælpe brugerne med at løse almindelige problemer er tilgængelige, og disse har tendens til at omfatte en række løsninger såsom primær antistoftitrering, alternativ blokering og detektionsbetingelser48,49. I denne undersøgelse optrådte FUT8 uventet som et dobbeltbånd ved ~65 og ~70 kDa. Det er muligt, at ~70 kDa-båndet repræsenterer glykosyleret FUT8. Litteraturbeviser fra humane cellelinjer beskriver O-bundet glykosylering ved Thr 56450,51, et sted, der er bevaret i kinesisk hamster, og CHO K1 FUT8-sekvenser.
Som tidligere nævnt involverer glycosyleringsveje ofte et komplekst udvalg af enzymer. Den nuværende protokol er udviklet, optimeret og demonstreret ved hjælp af en monogen glykosyleringsreaktion kontrolleret af Fut8. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte robustheden af denne metode, når målgenet koder for et enzym med alternative kinetik- og ekspressionsniveauer eller en vej reguleret af isoenzymer med overflødige funktioner.
Samlet set er evnen til hurtigt at tavse gener og detektere modificerede IgG-glycoprofiler et nyttigt værktøj i bestræbelserne på at tilpasse glycoengineered antistoffer. Indsigt fra lignende kortsigtede undersøgelser kan anvendes til at generere stabile glycoengineered celler til brug i langsigtede assays som fed-batch kultur. Uden for den farmaceutiske kontekst bidrager denne metode til studiet af glycanbiologi og fremhæver glycans vigtige funktion i udvikling, sundhed og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
PK takker Institut for Kemiteknik, Imperial College London, for hans stipendium. RD takker det britiske bioteknologiske og biologiske videnskabsforskningsråd for hans studietid. MM er finansieret af U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Tilskudsreference: BB/S006206/1). IAG takker det irske forskningsråd (stipendie nr. GOIPG/2017/1049) og CONACyT (stipendie nr. 438330).
32 Karat software | SCIEX | contact manufacturer | Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method. |
Acetonitrile, HPLC grade | Sigma Aldrich | 34851 | Solvent. |
Anti-FUT8 antibody | AbCam | ab198741 | Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene. |
Anti-GAPDH antibody | AbCam | ab181602 | Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user. |
BioDrop Spectrophotometer | Biochrom | 80 3006 55 | Instrument used to quantify protein concentration. |
BLItz | ForteBio | 45 5000 | Instrument. Label-Free Protein Analysis System. |
BRAND Haemocytometer | Sigma Alrich | BR717810 | Counting chamber device |
Capillary cartridge | SCIEX | A55625 | Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d). |
C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis | SCIEX | contact manufacturer | Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used. |
CD CHO Medium | Thermo Fisher Scientific | 10743029 | Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice. |
Centrifuge tubes, 15 mL | Greiner Bio | 188261 | Sterile polypropylene tube. |
Centrifuge tubes, 50 mL | Greiner Bio | 227270 | Sterile polypropylene tube. |
CHO IgG | MedImmune | Gift | Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x PBS, without calcium or magnesium. |
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL | Corning | 431143 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL | Corning | 431144 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
Fast Glycan Labelling and Analysis kit | SCIEX | B94499PTO | Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS. |
Fut8 DsiRNA | IDT | Custom | Custom designed DsiRNA targetting Fut8. |
Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm | Bio-Rad | 1652088 | Electroporation cuvette. |
Gene Pulser Xcell Eukaryotic System | Bio-Rad | 165 2661 | Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod. |
Immobilon-FL PVDF membrane | Merck-Millipore | IPFL00010 | Immunoblot transfer membrane, low background. |
L-Methionine sulfoximine (MSX) | Sigma Aldrich | M5379 | Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system. |
Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 10623111 | Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes. |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 78505 | Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate. |
Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | 10365710 | Solvent. |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 616201 | Autoclavable tubes. |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system | Bio-Rad | 1658035FC | Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply. |
NC-Slide A8 | ChemoMetec | 942 0003 | 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250. |
Negative Control DsiRNA, 5 nmol | IDT | 51 01 14 04 | Non-targeting DsiRNA. |
Nuclease-free duplex buffer | IDT | 11-01-03-01 | Reconstitution buffer for DsiRNA. |
NucleoCounter NC-250 | Chemometec | contact manufacturer | Instrument. Automated Cell Analyzer |
Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting. |
PCR tubes | Greiner Bio | 608281 | Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation. |
Pipette filter tips sterilised (10, 200, 1000 µL) | Gibson | F171203, F171503, F171703 | Sterile filter tips to avoid RNA contamination. |
PNGase F enzyme | New England Biolabs | P0704S | Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins. |
Polypropylene columns, 1 mL | Qiagen | 34924 | Columns for gravity-flow chromatography. |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases |
Protein-A Agarose Beads | Merck-Millipore | 16 125 | For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins. |
Protein-A biosensor | ForteBio | 18 5010 | Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification. |
RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Removes RNAse contamination. |
Sample dilutent | ForteBio | 18 1104 | Activate Protein A tips. |
Serological pipets (5, 10, 25 mL) | Corning | 4487, 4488, 4489 | Used for sterile cell culture tecniques. |
Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF | Sigma Aldrich | 296813 | Reducing agent. |
Solution 18 | ChemoMetec | 910-3018 | Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) |
Spin-X Centrifuge Tube Filters | Corning | 8161 | 0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane. |
Suspension plate with lid, 6-well | Greiner Bio | 657 185 | Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures. |
Syringe filters, 0.22 μm | Sartorius | 514 7011 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) |
Syringes with Luer lock tip, 20 mL | Fisher Scientific | 10569215 | For secure connection with syringe filter. |
Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | Stains dead and dying cells. |
Vivaspin 500, 3,000 MWCO | Sartorius | VS0191 | Polyethersulfone |
WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | WB7105 | Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online. |