एंटीबॉडी का ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न इसके नैदानिक प्रदर्शन को निर्धारित करता है, इस प्रकार ग्लाइकोसिलेशन को नियंत्रित करने के लिए औद्योगिक और अकादमिक प्रयास जारी रहते हैं। चूंकि विशिष्ट ग्लाइकोइंजीनियरिंग अभियान समय और श्रम-गहन होते हैं, इसलिए क्षणिक साइलेंसिंग का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेशन जीन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल की पीढ़ी उपयोगी साबित होगी।
पुनः संयोजक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट आणविक लक्ष्यों को बांधते हैं और बाद में, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करते हैं या अन्य लिगेंड के बंधन को रोकते हैं। हालांकि, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कार्यक्षमता और आधा जीवन मेजबान-विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन के प्रकार और वितरण से कम हो सकता है। बेहतर एंटीबॉडी का उत्पादन करने के प्रयासों ने आनुवंशिक रूप से संशोधित निर्माता कोशिकाओं के विकास को प्रेरित किया है जो ग्लाइको-अनुकूलित एंटीबॉडी को संश्लेषित करते हैं। ग्लाइकोइंजीनियरिंग को आमतौर पर क्लस्टर किए गए नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) से जुड़े प्रोटीन 9 जैसे तरीकों का उपयोग करके एक स्थिर नॉकआउट या नॉकिन सेल लाइन की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इंजीनियर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को तब बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियों का उपयोग करके यह निर्धारित करने की विशेषता है कि वांछित ग्लाइकोप्रोफाइल प्राप्त किया गया है या नहीं। यह रणनीति समय लेने वाली, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और विशेषज्ञों की आवश्यकता है। इसलिए, एक वैकल्पिक रणनीति जो आनुवंशिक ग्लाइकोइंजीनियरिंग और ग्लाइकन का पता लगाने के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का उपयोग करती है, इष्टतम एंटीबॉडी की दिशा में प्रयासों में सहायता कर सकती है। इस प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन में, एक आईजीजी-उत्पादक चीनी हैम्स्टर अंडाशय सेल ने ग्लाइकोइंजीनियरिंग को अनुकूलित करने के लिए एक आदर्श मेजबान के रूप में कार्य किया। Fut8 जीन को लक्षित करने वाले लघु हस्तक्षेप आरएनए को चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं को वितरित किया गया था, और एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिणामी परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणाम बताते हैं कि इस विधि द्वारा नॉकडाउन कुशल था, जिससे एफयूटी 8 में ~ 60% की कमी आई। एंटीबॉडी ग्लाइकोप्रोफाइल का पूरक विश्लेषण एक तेजी से अभी तक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक का उपयोग करके किया गया था: केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन और लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाना। सभी नॉकडाउन प्रयोगों ने एफुकोसिलेटेड ग्लाइकन में वृद्धि देखी; हालाँकि, इस अध्ययन में हासिल की गई सबसे बड़ी पारी ~ 20% थी। यह प्रोटोकॉल सिलिको डिजाइन टूल, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित जीन लक्ष्यीकरण अभिकर्मकों, और तेजी से मात्रा का ठहराव परख में दोहन करके ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रयासों को सरल बनाता है जिन्हें व्यापक पूर्व अनुभव की आवश्यकता नहीं होती है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा दी गई समय क्षमता नए जीन लक्ष्यों में जांच में सहायता कर सकती है।
एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन एक एंजाइमेटिक प्रक्रिया है जिसके द्वारा ओलिगोसेकेराइड मोइटीज़ एएसएन अवशेषों से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। डे नोवो प्रोटीन संश्लेषण के विपरीत, ग्लाइकन संश्लेषण एक गैर-टेम्पलेटेड प्रतिक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन का विषम ग्लाइकोसिलेशन होता है। ग्लाइकन की संरचना, संरचना और वितरण प्रोटीन विरूपण और कार्य को प्रभावित कर सकता है। दरअसल, इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के क्रिस्टलीय टुकड़े (एफसी) क्षेत्र में एन-ग्लाइकोसिलेशन एंटीबॉडी1 की चिकित्सीय प्रभावकारिता, इम्युनोजेनेसिटी और आधे जीवन को नियंत्रित करता है। इस प्रकार, पुनः संयोजक बायोथेरेप्यूटिक प्रोटीन उत्पादों के विकास के लिए डिजाइन (क्यूबीडी) प्रतिमान द्वारा गुणवत्ता स्वाभाविक रूप से ग्लाइकोसिलेशन को एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता (सीक्यूए) 2,3 के रूप में पहचानती है। स्तनधारी कोशिकाएं अक्सर पसंदीदा अभिव्यक्ति प्रणाली होती हैं क्योंकि वे स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया, खमीर, कीट या पौधों की कोशिकाओं की तुलना में मानव जैसे ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न का अधिक बारीकी से उत्पादन करती हैं। इसके अलावा, चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) कोशिकाओं को अन्य स्तनधारी सेल लाइनों पर चुना जाता है क्योंकि वे मानव वायरस संक्रमण के लिए प्रतिरोधी होते हैं, उच्च टाइटर्स पर उत्पादों का स्राव करते हैं, और निलंबन संस्कृति में उच्च व्यवहार्य सेल घनत्व4. ग्लाइकन गठन के संबंध में, गैर-सीएचओ म्यूरिन उत्पादन कोशिकाएं इम्यूनोजेनिक ग्लाइकन (α (1-3) -लिंक्ड गैलेक्टोज [α (1-3)-गैल] और एन-ग्लाइकोलिलन्यूरामिनिक एसिड [न्यूजीसी]) उत्पन्न करती हैं जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) 5 के सुरक्षित उपयोग पर प्रभाव डालती हैं। ये लाभ सीएचओ कोशिकाओं को सबसे महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति प्रणाली बनाते हैं, जो 2014 और 2018 के बीच 80% से अधिक नए बायोथेरेप्यूटिक्सके उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं। हालांकि, टेम्पलेट-स्वतंत्र ग्लाइकोसिलेशन एक संरक्षित तंत्र है जो ग्लाइकोफॉर्म की एक सरणी के साथ सीएचओ-व्युत्पन्न बायोथेरेप्यूटिक्स की ओर जाता है।
बायोथेरेप्यूटिक विकास रणनीतियों का उद्देश्य आनुवंशिक इंजीनियरिंग द्वारा सीएचओ कोशिकाओं में विषमता को नियंत्रित करना है। कुछ साहित्य उदाहरणों में सियालिडेस (एनईयू 1, एनईयू 3)7, जीडीपी-मैनोज़ 4,6-डिहाइड्रेटेज (जीएमडी) नॉकआउट8, और ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ (जीएनटीआईआईआईआई) 9 का ओवरएक्सप्रेशन शामिल है। ग्लाइकोइंजीनियरिंग में प्रगति सार्वजनिक रूप से उपलब्ध संसाधनों के संयोजन के कारण संभव है, जैसे कि सीएचओ जीनोम10, और आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरणों के चल रहे विकास, जैसे प्रतिलेखन एक्टिवेटर जैसे प्रभावक न्यूक्लियस (टीएएलईएन), जस्ता उंगली न्यूक्लियस (जेडएफएन), और क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) से जुड़े प्रोटीन 9 (सीआरआईएसपीआर-कैस 9) 11,12,13,13,14 . इन उपकरणों को आमतौर पर सीएचओ कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए के रूप में या शुद्ध राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसरों के रूप में वितरित किया जाता है। इसके विपरीत, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक है, जो अपने सबसे सरल रूप में, केवल शुद्ध लघु हस्तक्षेप आरएनए (एसआईआरएनए) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के वितरण की आवश्यकता होती है। अंतर्जात प्रोटीन डबल-फंसे हुए सीआरएनए को एकल किस्में में संसाधित करते हैं, और न्यूक्लियस, आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (आरआईएससी), लक्ष्य एमआरएनएअनुक्रम15,16,17 को क्लीव करने के लिए एसआईआरएनए के साथ एक जटिल बनाता है। आरएनए अस्थिरता के कारण इस पद्धति के माध्यम से जीन साइलेंसिंग क्षणिक है, लेकिन यहां की जांच तेजी से स्क्रीनिंग की सहायता के लिए इस सुविधा का लाभ उठाती है।
वर्तमान अध्ययन के लिए चयनित मॉडल एंजाइम, α1,6-फ्यूकोसिलट्रांसफेरेज़ (एफयूटी 8), α-1,6 कोर-लिंक्ड एल-फ्यूकोस (एफयूसी) के साथ एन-ग्लाइकन का उत्पादन करता है। यह संशोधन एंटीबॉडी-निर्भर सेल साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) गतिविधि का एक प्राथमिक निर्धारक है, जैसा कि वाणिज्यिक एंटीबॉडी के अध्ययन से स्पष्ट है। कोर फ्यूकोसिलेशन की अनुपस्थिति में, रितुक्सिमैब (एंटी-सीडी 20 आईजीजी 1) एडीसीसी 50 गुना बढ़ाता है और एफसीजीआरआईआईआईए बाइंडिंग 18,19 में सुधार करके ट्रास्टुज़ुमाब (एंटी-हर 2 आईजीजी1) में एडीसीसी बढ़ाता है। इस प्रकार, कोर फ्यूकोसिलेशन को एमएबीएस की एक अवांछनीय विशेषता माना जाता है जो इस फेनोटाइप को उलटने के प्रयासों को वारंट करता है। एडीसीसी20,21,22 में सहवर्ती वृद्धि के साथ एसआईआरएनए का उपयोग करके सफल फट 8 जीन लक्ष्यीकरण के उदाहरण हैं, हालांकि ये उदाहरण प्लास्मिड डीएनए पर एन्कोडेड फट 8 एसआईआरएनए प्रदान करते हैं। इस तरह के प्रयोग स्थिर जीन साइलेंसिंग उत्पन्न करते हैं क्योंकि प्लास्मिड डीएनए एसआईआरएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। यह कोशिकाओं को सिआरएनए अणुओं को फिर से भरने की अनुमति देता है जो इंट्रासेल्युलर आरएनए और फॉस्फेटेस द्वारा अपमानित होते हैं। इसके विपरीत, बहिर्जात सिंथेटिक सीआरएनए की डिलीवरी केवल क्षणिक जीन साइलेंसिंग की अनुमति देती है क्योंकि इंट्रासेल्युलर टेम्पलेट की कमी के कारण एसआईआरएनए को फिर से नहीं भरा जा सकता है। इस प्रकार, उपयोगकर्ताओं को विचार करना चाहिए कि क्या प्रयोगात्मक डिजाइन प्लास्मिड-व्युत्पन्न या सिंथेटिक सिआरएनए के साथ संगत हैं। उदाहरण के लिए, पीक एमएबी उत्पादन पर केंद्रित अध्ययन, आमतौर पर संस्कृति23,24 के छठे दिन, सिंथेटिक सिरना का विकल्प चुन सकते हैं जिसे चोटी की अभिव्यक्ति से कुछ दिन पहले कोशिकाओं को दिया जा सकता है। सिंथेटिक सिआरएनए का उपयोग करके एक क्षणिक दृष्टिकोण के लाभों में उत्पादन को आउटसोर्स करने की क्षमता और तथ्य यह है कि प्लास्मिड में निर्माण उत्पन्न करने में लगने वाले समय के एक अंश में कई एसआईआरएनए निर्माण उत्पन्न किए जा सकते हैं। इसके अलावा, सिंथेटिक सिरना प्रभावशाली है, जैसा कि एफयूटी 8 जीन साइलेंसिंग के साहित्य उदाहरणों से स्पष्ट है जो एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति25 को कम करने के लिए पर्याप्त हैं और बढ़े हुए एफसीजीआरआईआईआईए बाध्यकारी और एडीसीसी26 के साथ एफ्यूकोसिलेटेड आईजीजी उत्पन्न करते हैं।
इस ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रोटोकॉल की सफलता एफसी ग्लाइकोसिलेशन की डिग्री से निर्धारित की गई थी। मास स्पेक्ट्रोमेट्री आमतौर पर ग्लाइकोमिक विश्लेषण के लिए पसंद की विधि है; हालांकि, केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन और लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाने (सीजीई-एलआईएफ) शुद्ध आईजीजी के ग्लाइकोप्रोफाइल को हल करने के लिए पूरी तरह से उत्तरदायी है और इसमें अधिक तीव्रता और सादगी का लाभ है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटोकॉल उपयुक्त क्रोमैटोग्राफिक और व्युत्पन्न विधियों, आयनीकरण स्रोतों, और बड़े पैमाने परविश्लेषकों 27,28,29 गठबंधन करना चाहिए। एक प्रशिक्षित विशेषज्ञ की आवश्यकता के अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटोकॉल लंबे होते हैं, और विधियों की विविधता विभिन्न सेटअपों के साथ प्रयोगशालाओं के बीच तुलना करना मुश्किल बनाती है। बायोफार्मास्यूटिकल्स के संदर्भ में, सीजीई-एलआईएफ एक संवेदनशील विधि है जो एंटीबॉडी ग्लाइकोप्रोफाइल का पर्याप्त विवरण प्रदान कर सकती है और उच्च-थ्रूपुट विधियों के लिए आसानी से स्केलेबल है। कम बहुतायत के लिए, खराब विशेषता वाले ग्लाइकोप्रोटीन के साथ अत्यधिक जटिल मिश्रण, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के फायदे रह सकते हैं। हालांकि, सीजीई-एलआईएफ-आधारित एन-ग्लाइकन विश्लेषण द्वारा प्रदान किए गए उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च संवेदनशीलता एमएबी एनालिटिक्स इस पद्धति का परीक्षण करने के लिए एक तर्क के रूप में काम करते हैं। इसके अलावा, नमूना तैयारी और विश्लेषण केवल कुछ घंटों मेंपूरा हो जाता है 30. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सीजीई-एलआईएफ का उपयोग मानव प्लाज्मा 31, माउस32 और सीएचओ आईजीजी33 से प्राप्त ग्लाइकन की निगरानी के लिए किया जा सकताहै। ये अध्ययन उच्च-थ्रूपुट नमूना विश्लेषण और छोटे नमूना संस्करणों के लिए सीजीई-एलआईएफ के उपयोग को उजागर करते हैं।
सीजीई-एलआईएफ विधि की सीमाएं हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। ग्लाइकन विश्लेषण के लिए इस और अन्य उपकरणों के उपयोग के लिए लागत एक महत्वपूर्ण बाधा है। हालांकि, ये लागत क्षेत्र के भीतर विशिष्ट हैं, और सीजीई-एलआईएफ को एक लागत प्रभावी विकल्प माना जाता है34. छोटे बजट वाली प्रयोगशालाओं को मशीनरी को पट्टे पर देना या नमूनों के विश्लेषण को आउटसोर्स करना अधिक व्यावहारिक लग सकता है। किसी भी विश्लेषणात्मक विधि का एक और विचार पुनरावृत्ति है। सीजीई-एलआईएफ का मूल्यांकन एक ही नमूने के 48 प्रतिकृतियों का उपयोग करके आयोजित किया गया था जो अलग-अलग दिनों में परख किए गए थे। इंट्राबैच और इंटरबैच पुनरावृत्ति के लिए प्रति केशिका सापेक्ष मानक विचलन निर्धारित किया गया था। प्रतिकृतियों की इंट्राबैच तुलना में 6.2% का सापेक्ष मानक विचलन पाया गया, यह दर्शाता है कि केशिका प्रदर्शन समान नहीं है। इसके अलावा, इंटरबैच डेटा की तुलना में 15.8% 31 का सापेक्ष मानक विचलन दिखाया गया, यह दर्शाता है कि केशिका प्रदर्शन समय के साथ बदलता है। पहचानकी गई परिचालन कमियां वर्तमान अध्ययन में लागू नहीं हो सकती हैं, जो विभिन्न मशीनरी और मालिकाना अभिकर्मकों का उपयोग करती हैं। यदि उपयोगकर्ता इन-हाउस प्रोटोकॉल विकसित करने का इरादा रखते हैं, तो यह रुहाक एट अल द्वारा अध्ययन पर विचार करने लायक होगा। 31, जिसने सीजीई-एलआईएफ के लिए अभिकर्मकों का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया। इस प्रकार, नमूना इंजेक्शन (हाय-डि फॉर्मामाइड और डीएमएसओ), ग्लाइकन लेबलिंग (एनएबीएच3सीएन या 2-पिकोलिन बोरेन) 31 के लिए अभिकर्मकों, और अन्य को अनुकूलित किया गया है।
यह अध्ययन एक समय-कुशल ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो डाउनस्ट्रीम ग्लाइकोमिक विश्लेषण के साथ प्रत्यक्ष आरएनएआई की तीव्रता को जोड़ती है। पद्धति को ऊपर उल्लिखित कारणों के लिए एक लक्ष्य के रूप में Fut8 जीन का उपयोग करके सचित्र किया गया है।
ग्लाइकोसिलेशन मार्गों में एंजाइमों और सहायक प्रोटीन का एक जटिल चयापचय नेटवर्क शामिल है। मार्ग घटकों के कार्य को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण है यदि पारंपरिक नॉकआउट या अकेले आनुवंशिक इंजीनियरिंग रणनीतियों पर निर्भर है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रारंभिक रूप से एक क्षणिक हानि-ऑफ-फ़ंक्शन परख का उपयोग करके एक मार्ग के सदस्यों को स्क्रीन करना है। इस अंत में, ग्लाइकोसिलेशन जीन को चिह्नित करने के लिए एक अधिक कुशल तरीका बनाने के लिए दो रैपिड प्रोटोकॉल, आरएनएआई और सीजीई-एलआईएफ डिटेक्शन को जोड़ा गया था। वर्णित विधि को पारंपरिक तरीकों की तुलना में पूरा होने के लिए 5-7 दिनों की आवश्यकता होती है जो संभावित रूप से पूरा होने में कई सप्ताह लगते हैं। इसके अलावा, स्वचालन क्षमताओं के साथ अनुसंधान वातावरण मैनुअल हैंडलिंग के साथ संभव से अधिक जीन उम्मीदवारों को स्क्रीन करने के लिए इस पद्धति का फायदा उठा सकता है।
एक क्षणिक ग्लाइकोइंजीनियरिंग अभियान की सफलता काफी हद तक सीआरएनए डिजाइन पर निर्भर है। कस्टम DsiRNA डिज़ाइन को पहले उल्लिखित नियमों का पालन करना चाहिए, या आसानी के लिए, उपयोगकर्ता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व डिज़ाइन किए गए अनुक्रमों का विकल्प चुन सकते हैं। अन्य जीन संशोधन रणनीतियों की तरह, आरएनएआई में ऑफ-टारगेट प्रभावों की क्षमता है। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को कम्प्यूटेशनल विधियों द्वारा अनजाने जीन लक्ष्यीकरण का आकलन करने के लिए प्रोत्साहितकिया जाता है 41. प्रायोगिक डिजाइन विकल्प ऑफ-टारगेट प्रभावों को सीमित करने में भी मदद कर सकते हैं। किटलर एट अल से पता चला है कि एसआईआरएनए की मल्टीप्लेक्स डिलीवरी ने ऑफ-टारगेट प्रभाव42 में कमी का नेतृत्व किया। यद्यपि यह प्रतिकूल लगता है, यह सुझाव दिया जाता है कि एक मास्टर मिश्रण प्रत्येक सिरना निर्माण की एकाग्रता को कम करता है, इस प्रकार ऑफ-टारगेट जीन साइलेंसिंग के अवसर को सीमित करता है। एक और लाभ यह है कि एक ही जीन को लक्षित करने वाली एसआईआरएनए संरचनाओं का एक साथ अभिकर्मक सफल आरएनएआई की संभावना को बढ़ाता है। एक मास्टर मिश्रण का उपयोग नमूनों और प्रतिकृतियों के बीच स्थिरता भी सुनिश्चित करता है और अभिकर्मक प्रक्रिया को गति देता है। मिश्रित एसआईआरएनए निर्माणों की प्रारंभिक स्क्रीन के बाद, प्रत्येक अनुक्रम की आरएनएआई दक्षता का पता लगाने के लिए व्यक्तिगत निर्माणों का उपयोग करके एक और प्रयोग किया जा सकता है। इस और अन्य नॉकडाउन अध्ययनों में, तीन एसआईआरएनए को पूल किया गया है औरकोशिकाओं 43,44,45 तक पहुंचाया गया है। हालांकि, एक जीन को कुशलतापूर्वक लक्षित करने या कई जीनों को लक्षित करने के लिए एक साथ तीन से अधिक एसआईआरएनए को स्क्रीन करना वांछनीय हो सकता है। दरअसल, एक अध्ययन ने व्यक्तिगत जीन46 के चुप्पी के बराबर स्तर पर छह जीनों तक के मल्टीप्लेक्स सिआरएनए-मध्यस्थता चुप्पी का प्रदर्शन किया। हालांकि, सिआरएनए निर्माणों की अधिकतम संख्या निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जिनका उपयोग साइलेंसिंग दक्षता से समझौता किए बिना पूल में किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स रणनीति मार्टिन एट अल द्वारा प्रस्तावित की गई थी आरएनएआई लाइब्रेरी स्क्रीनिंग प्रयोगों46 की गति को बढ़ाने के लिए, और इसी तरह की अवधारणा ग्लाइकोसिलेशन जीन को स्क्रीन करने के लिए उपयोगी साबित हो सकती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल इस उम्मीद के साथ एक सबूत-अवधारणा के रूप में कार्य करता है कि बाद के प्रयोगों को अन्य ग्लाइकोसिलेशन जीन को मान्य करने के लिए किया जाएगा। ब्याज के नए जीन Fut8 की तुलना में अनिर्दिष्ट या कम लोकप्रिय हो सकते हैं, और जीन साइलेंसिंग का पता लगाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी खराब या अनुपलब्ध हो सकते हैं। इस परिदृश्य में, आरटी-पीसीआर जैसे वैकल्पिक तरीकों का उपयोग जीन साइलेंसिंग47 को मापने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरटी-पीसीआर प्रोटीन के बजाय एमआरएनए का पता लगाता है। जब पश्चिमी सोख्ता के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध होते हैं, तो एक सामान्य मुद्दा खराब पहचान या गैर-विशिष्ट बैंड की उपस्थिति है। उपयोगकर्ताओं को सामान्य समस्याओं को हल करने में मदद करने के लिए समस्या निवारण मार्गदर्शिकाएँ उपलब्ध हैं, और इनमें प्राथमिक एंटीबॉडी अनुमापन, वैकल्पिक अवरुद्ध और पता लगाने की स्थिति48,49 जैसे समाधानों की एक श्रृंखला शामिल है। इस अध्ययन में, एफयूटी 8 अप्रत्याशित रूप से ~ 65 और ~ 70 केडीए पर डबल बैंड के रूप में दिखाई दिया। यह संभव है कि ~ 70 केडीए बैंड ग्लाइकोसिलेटेड एफयूटी 8 का प्रतिनिधित्व करता है। मानव कोशिका रेखाओं से साहित्य साक्ष्य थ्र 56450,51 पर ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन का वर्णन करता है, एक साइट जो चीनी हैम्स्टर में संरक्षित है, और सीएचओ के 1 एफयूटी 8 अनुक्रम।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ग्लाइकोसिलेशन मार्गों में अक्सर एंजाइमों की एक जटिल सरणी शामिल होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल को Fut8 द्वारा नियंत्रित मोनोजेनिक ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके विकसित, अनुकूलित और प्रदर्शित किया गया है। इसलिए, इस पद्धति की मजबूती की पुष्टि करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है जब लक्ष्य जीन वैकल्पिक कैनेटीक्स और अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक एंजाइम को एन्कोड करता है या अनावश्यक कार्यों के साथ आइसोएंजाइम द्वारा विनियमित मार्ग होता है।
एक साथ लिया गया, जीन को तेजी से चुप कराने और संशोधित आईजीजी ग्लाइकोप्रोफाइल्स का पता लगाने की क्षमता कस्टम ग्लाइकोइंजिनियर एंटीबॉडी के प्रयास में एक उपयोगी उपकरण है। इसी तरह के अल्पकालिक अध्ययनों से अंतर्दृष्टि को फेड-बैच संस्कृति जैसे दीर्घकालिक परखों में उपयोग के लिए स्थिर ग्लाइकोइंजिनियर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है। दवा संदर्भ के बाहर, यह विधि ग्लाइकन जीव विज्ञान के अध्ययन में योगदान देती है और विकास, स्वास्थ्य और बीमारी में ग्लाइकन के महत्वपूर्ण कार्य पर प्रकाश डालती है।
The authors have nothing to disclose.
पीके ने अपनी छात्रवृत्ति के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन के केमिकल इंजीनियरिंग विभाग को धन्यवाद दिया। आरएंडडी ने अपनी छात्रवृत्ति के लिए यूके बायोटेक्नोलॉजी एंड बायोलॉजिकल साइंसेज रिसर्च काउंसिल को धन्यवाद दिया। एमएम यूके जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान संदर्भ: बीबी / आईएजी आयरिश अनुसंधान परिषद (छात्रवृत्ति सं। जीओआईपीजी/2017/1049) और कोनासाइट (छात्रवृत्ति संख्या 438330)।
32 Karat software | SCIEX | contact manufacturer | Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method. |
Acetonitrile, HPLC grade | Sigma Aldrich | 34851 | Solvent. |
Anti-FUT8 antibody | AbCam | ab198741 | Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene. |
Anti-GAPDH antibody | AbCam | ab181602 | Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user. |
BioDrop Spectrophotometer | Biochrom | 80 3006 55 | Instrument used to quantify protein concentration. |
BLItz | ForteBio | 45 5000 | Instrument. Label-Free Protein Analysis System. |
BRAND Haemocytometer | Sigma Alrich | BR717810 | Counting chamber device |
Capillary cartridge | SCIEX | A55625 | Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d). |
C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis | SCIEX | contact manufacturer | Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used. |
CD CHO Medium | Thermo Fisher Scientific | 10743029 | Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice. |
Centrifuge tubes, 15 mL | Greiner Bio | 188261 | Sterile polypropylene tube. |
Centrifuge tubes, 50 mL | Greiner Bio | 227270 | Sterile polypropylene tube. |
CHO IgG | MedImmune | Gift | Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x PBS, without calcium or magnesium. |
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL | Corning | 431143 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL | Corning | 431144 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
Fast Glycan Labelling and Analysis kit | SCIEX | B94499PTO | Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS. |
Fut8 DsiRNA | IDT | Custom | Custom designed DsiRNA targetting Fut8. |
Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm | Bio-Rad | 1652088 | Electroporation cuvette. |
Gene Pulser Xcell Eukaryotic System | Bio-Rad | 165 2661 | Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod. |
Immobilon-FL PVDF membrane | Merck-Millipore | IPFL00010 | Immunoblot transfer membrane, low background. |
L-Methionine sulfoximine (MSX) | Sigma Aldrich | M5379 | Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system. |
Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 10623111 | Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes. |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 78505 | Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate. |
Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | 10365710 | Solvent. |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 616201 | Autoclavable tubes. |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system | Bio-Rad | 1658035FC | Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply. |
NC-Slide A8 | ChemoMetec | 942 0003 | 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250. |
Negative Control DsiRNA, 5 nmol | IDT | 51 01 14 04 | Non-targeting DsiRNA. |
Nuclease-free duplex buffer | IDT | 11-01-03-01 | Reconstitution buffer for DsiRNA. |
NucleoCounter NC-250 | Chemometec | contact manufacturer | Instrument. Automated Cell Analyzer |
Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting. |
PCR tubes | Greiner Bio | 608281 | Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation. |
Pipette filter tips sterilised (10, 200, 1000 µL) | Gibson | F171203, F171503, F171703 | Sterile filter tips to avoid RNA contamination. |
PNGase F enzyme | New England Biolabs | P0704S | Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins. |
Polypropylene columns, 1 mL | Qiagen | 34924 | Columns for gravity-flow chromatography. |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases |
Protein-A Agarose Beads | Merck-Millipore | 16 125 | For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins. |
Protein-A biosensor | ForteBio | 18 5010 | Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification. |
RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Removes RNAse contamination. |
Sample dilutent | ForteBio | 18 1104 | Activate Protein A tips. |
Serological pipets (5, 10, 25 mL) | Corning | 4487, 4488, 4489 | Used for sterile cell culture tecniques. |
Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF | Sigma Aldrich | 296813 | Reducing agent. |
Solution 18 | ChemoMetec | 910-3018 | Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) |
Spin-X Centrifuge Tube Filters | Corning | 8161 | 0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane. |
Suspension plate with lid, 6-well | Greiner Bio | 657 185 | Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures. |
Syringe filters, 0.22 μm | Sartorius | 514 7011 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) |
Syringes with Luer lock tip, 20 mL | Fisher Scientific | 10569215 | For secure connection with syringe filter. |
Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | Stains dead and dying cells. |
Vivaspin 500, 3,000 MWCO | Sartorius | VS0191 | Polyethersulfone |
WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | WB7105 | Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online. |