मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल भेदभाव प्रोटोकॉल में हालिया प्रगति अंग-विशिष्ट सेल प्रकारों के चरणबद्ध व्युत्पत्ति की अनुमति देती है। यहां, हम आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार और वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों में एक श्लेष्म उपकला में उनके भेदभाव के लिए विस्तृत कदम प्रदान करते हैं।
अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया (पीसीडी), और वायरल श्वसन संक्रमण जैसे वायुमार्ग के रोग दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारण हैं। मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (एचबीईसी) का उपयोग करने वाले इन विट्रो प्लेटफार्मों ने स्वास्थ्य और बीमारी में वायुमार्ग उपकला की हमारी समझ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। दुर्लभ आनुवंशिक बीमारियों या दुर्लभ उत्परिवर्तन वाले व्यक्तियों से एचबीईसी तक पहुंच फेफड़ों के अनुसंधान में एक बाधा है।
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) आसानी से “रीप्रोग्रामिंग” दैहिक कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न होते हैं और व्यक्तिगत दाता की अद्वितीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखते हैं। हाल की प्रगति फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं, वायुकोशीय प्रकार 2 कोशिकाओं के साथ-साथ बेसल कोशिकाओं, प्रमुख वायुमार्ग स्टेम कोशिकाओं के माध्यम से संचालन वायुमार्ग उपकला की कोशिकाओं के लिए आईपीएससी के निर्देशित भेदभाव की अनुमति देती है।
यहां हम आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं (इसके बाद आईबीसी) के रखरखाव और विस्तार के साथ-साथ वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृतियों में उनके त्रिवंश भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। आईबीसी को टीजीएफ-ए और बीएमपी सिग्नलिंग मार्गों के अवरोधकों के साथ पूरक प्राथमिक बेसल सेल माध्यम में सुसंस्कृत बाह्य मैट्रिक्स की बूंदों में निलंबित उपकला क्षेत्रों के रूप में बनाए रखा और विस्तारित किया जाता है। इन उपकला क्षेत्रों के भीतर आईबीसी प्रमुख बेसल मार्करों टीपी 63 और एनजीएफआर को व्यक्त करते हैं, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा शुद्ध किया जा सकता है, और जब मानक एएलआई संस्कृति स्थितियों में झरझरा झिल्ली पर चढ़ाया जाता है, तो एक कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला में अंतर होता है। स्वस्थ दाताओं से प्राप्त एएलआई संस्कृतियां बेसल, स्रावी और बहुकोशिकीय कोशिकाओं से बनी होती हैं और उपकला बाधा अखंडता, गतिशील सिलिया और बलगम स्राव का प्रदर्शन करती हैं। सीएफ या पीसीडी वाले व्यक्तियों से प्राप्त संस्कृतियां बेकार सीएफटीआर-मध्यस्थता क्लोराइड परिवहन या इमोटाइल सिलिया, संबंधित रोग पैदा करने वाले उपकला दोषों को दोहराती हैं।
यहां, हम मानव कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे वायुमार्ग रोगों के मॉडलिंग और समझने के लिए लागू किया जा सकता है।
क्रोनिक फुफ्फुसीय रोगदुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर का एक बड़ा बोझ है1. अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया (पीसीडी), और वायरल संक्रमण जैसे संचालन वायुमार्ग को प्रभावित करने वाली स्थितियां सामान्य और दुर्लभ दोनों बीमारियों, अधिग्रहित और आनुवंशिक दोनों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो दुनिया भर में इस बोझ में योगदान करती हैं। संचालन वायुमार्ग के प्रमुख कार्य हैं: 1) हवा के लामिना के प्रवाह के लिए एक नाली के रूप में कार्य करें, और 2) रोगजनकों और मलबे की श्लेष्म निकासी प्रदान करें। स्रावी, बहुआयामी और बेसल कोशिकाएं संचालन वायुमार्ग के प्रमुख उपकला कोशिका प्रकारों का प्रतिनिधित्व करती हैं। दुर्लभ उपकला कोशिका प्रकारों में आयनोसाइट्स, टफ्ट कोशिकाएं और न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाएं शामिल हैं, और कहीं और समीक्षा की गई है2.
मोटे तौर पर, रोग के तंत्र को समझने और चिकित्सीय दृष्टिकोण को आगे बढ़ाने के लिए एक प्रमुख बाधा प्रीक्लिनिकल मॉडल में उपयोग के लिए मानव प्राथमिक ऊतक की लगातार कमी रही है। एचबीईसी को आम तौर पर मानव वायुमार्ग उपकला जीव विज्ञान के इन विट्रो मॉडल में स्वर्ण-मानक माना जाता है और विशेष रूप से सीएफ अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाईहै 3. हालांकि, वे आमतौर पर या तो ब्रोंकोस्कोपिक बायोप्सी से, सर्जरी के बाद फेफड़ों के ऊतकों से, या प्रत्यारोपण उद्देश्यों के लिए अस्वीकार किए गए फेफड़ों से अलग होते हैं। सीएफ और पीसीडी की अनुसंधान प्राथमिकताओं सहित आनुवंशिक बीमारियों वाले व्यक्तियों से एचबीईसी तक पहुंच, दुर्लभ और अप्रत्याशित है। रोगी-व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के लिए इस अड़चन पर काबू पाने की आवश्यकता है। आईपीएससी आसानी से किसी भी व्यक्ति से उत्पन्न होते हैं, वे दाता की अद्वितीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखते हैं, और सेल संस्कृति की स्थिति 4,5,6 में दीर्घकालिक प्रसार और जीवित रहने की उल्लेखनीय क्षमता रखते हैं। प्रमुख भ्रूणविज्ञान चरणों को दोहराते हुए, आईपीएससी अंग-विशिष्ट सेल प्रकारों में “निर्देशित-भेदभाव” से गुजरते हैं। हमने और अन्य लोगों ने आईपीएससी-व्युत्पन्न फेफड़ों के पूर्वजों, वायुकोशीय प्रकार 2 कोशिकाओं 7,8 और वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं 9,10,11,12 सहित संचालन वायुमार्ग की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं।
वायुमार्ग बेसल सेल संचालन वायुमार्ग13 का स्टेम सेल है। पहले प्रकाशित काम में, हमारे समूह ने आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न किया है, जिसमें एक सबसेट (आईबीसी) शामिल है जो टीपी 63, केआरटी 5 और एनजीएफआर सहित विहित बेसल सेल मार्करों को व्यक्त करता है। वयस्क बेसल सेल जीव विज्ञान से संकेतों के बाद, दोहरी एसएमएडी मार्गों (टीजीएफ-β और बीएमपी) के निषेध से एनजीएफआर + आईबीसी11,14 का उन्नयन होता है। एनजीएफआर + आईबीसी को बाह्य मैट्रिक्स की बूंदों में एकल कोशिकाओं के रूप में फिर से निलंबित कर दिया जाता है और बेसल सेल माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है। वे आईबीसी आबादी को बनाए रखने और उपकला स्फेरॉइड बनाने के लिए आत्म-नवीनीकरण करते हैं; हालाँकि, एक अनुपात इस प्रारूप में स्रावी कोशिकाओं में भी अंतर करता है (जिसे 3-डी संस्कृति के रूप में संदर्भित किया जाता है)। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम 3-डी संस्कृति में इन आईबीसी को बनाए रखने और विस्तारित करने के चरणों का विस्तार करते हैं, साथ ही साथ एक कार्यात्मक 2-डी म्यूकोसिलरी एएलआई संस्कृति उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम भी उठाते हैं।
इस भेदभाव प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों को पहले प्रकाशित किया गया है और यहां11,12 की समीक्षा नहीं की जाएगी। यह पांडुलिपि आईबीसी के विस्तार और शुद्धिकरण और एएलआई संस्कृति में कार्यात्मक स्रावी और मल्टीसिलिएटेड कोशिकाओं में उनके बाद के भेदभाव पर केंद्रित होगी।
एचबीईसी वायुमार्ग उपकला के रोगों का अध्ययन करने के लिए स्वर्ण-मानक सेल-प्रकार हैं। उनकी सीमाओं (आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए पहुंच और कठिनाई सहित) के कारण, हमने आईबीसी और एएलआई संस्कृतियों की व्युत्पत्ति के लिए एक प्रोटोकॉल उत्पन्न किया है। इन कोशिकाओं को किसी भी दाता से प्राप्त किया जा सकता है और उनकी अनूठी आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखा जा सकता है, इस प्रकार बुनियादी विकास अध्ययन, रोग मॉडलिंग और उपन्यास चिकित्सीय विकास की अनुमति मिलती है।
जबकि वर्णित प्रोटोकॉल का प्रत्येक व्यक्तिगत चरण आवश्यक है, ऐसे कई हैं जो अतिरिक्त उल्लेख के लायक हैं। सबसे पहले, प्रत्येक चरण में जिसमें एकल कोशिकाओं में स्फेरॉइड के पृथक्करण की आवश्यकता होती है, अत्यधिक पाइपिंग से बचना महत्वपूर्ण है; एंजाइमेटिक पाचन (विघटन या ट्रिप्सिन के साथ) बेहतर कोशिका अस्तित्व को बढ़ावा देता है, जबकि अत्यधिक पाइपिंग महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु की ओर जाता है। दूसरे, एनजीएफआर + आईबीसी को शुद्ध करते समय, आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग महत्वपूर्ण है और हम एफएसीएस (चित्रा 3) के साथ उच्चतम व्यक्त एनजीएफआर + कोशिकाओं के लिए चयन करने की सलाह देते हैं। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप उपयुक्त श्लेष्म भेदभाव के साथ इष्टतम एएलआई संस्कृतियां होती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल में प्रलेखित छिद्रपूर्ण झिल्ली की तैयारी और बोना एएलआई संस्कृति अस्तित्व के लिए मौलिक है। जबकि हम आम तौर पर प्रति सम्मिलित 30,000-60,000 कोशिकाओं को बीज देते हैं, हमें 20,000 कोशिकाओं के साथ सफलता मिली है। जबकि सफल संस्कृतियों को मानव भ्रूण स्टेम सेल-योग्य मैट्रिक्स कोटिंग का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है, हमने हाल ही में एएलआई संस्कृतियों के काफी अधिक स्थायित्व के साथ मानव पुनः संयोजक लैमिनिन -521 का उपयोग किया है।
बहुत कम ही, आईपीएससी भेदभाव एनजीएफआर + आईबीसी के पर्याप्त प्रतिशत को अपग्रेड करने में विफल हो सकता है। इस उदाहरण में, आईबीसी (3-डी संस्कृति में) के सीरियल पासिंग के परिणामस्वरूप समय के साथ एनजीएफआर आवृत्ति में वृद्धि हो सकती है। इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में इन कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय, लागत और विशेषज्ञता शामिल है। इसके अतिरिक्त, हम मानते हैं कि कई शोधकर्ता वायुमार्ग उपकला (जैसे, आयनोसाइट्स, न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाओं) के कम सामान्य सेल प्रकारों में रुचि रखते हैं। जबकि हमने इनमें से कुछ दुर्लभ सेल प्रकारों का पता लगाया है, जैसा कि प्राथमिक एचबीईसी संस्कृतियों में है, वे पुनरुत्पादनशील रूप से पहचाने नहीं जाते हैं, संभवतः इन कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक विकासात्मक संकेतों के बारे में अधूरे ज्ञान के कारण।
जैसा कि लिखा गया है, उपरोक्त प्रोटोकॉल पहले से ही क्रायोप्रिजर्व्ड आईबीसी के पिघलने के साथ शुरू होता है। इस क्रायोप्रेज़र्वेशन से पहले के विवरण पहले वर्णित हैं और इस पांडुलिपि11,12 के दायरे से परे हैं।
हमारे वायुमार्ग उपकला एएलआई संस्कृति विधि लगभग किसी भी दाता से कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह बहुमूल्य आनुवंशिक रूप से नियंत्रित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं तक पहुंच को बहुत बढ़ाता है जिसका उपयोग रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, भविष्य के सेल-आधारित उपचारों के साथ-साथ वायुमार्ग उपकला के भीतर विकासात्मक पैटर्निंग की समझ में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम हॉकिन्स, कोटन और डेविस प्रयोगशालाओं के सदस्यों को इस और अन्य परियोजनाओं के बारे में वर्षों से उनके सहायक इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं। हम अपने समर्पण और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए ब्रायन टिल्टन (बीयू सेल सॉर्टिंग डायरेक्टर) के भी ऋणी हैं, और हम बोस्टन यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर रीजनरेटिव मेडिसिन (सीआरईएम) के ग्रेग मिलर और मैरिएन जेम्स के आभारी हैं, जो रोगी-विशिष्ट आईपीएससी के रखरखाव और लक्षण वर्णन में उनके समर्थन और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए हैं, एनआईएच अनुदान एनओ 1 75 एन 9 2020 सी00005 और यू01टीआर0001810 द्वारा समर्थित है। यह काम एनआईएच अनुदान यू01एचएल148692, यू01एचएल134745, यू01एचएल134766 और आर01एचएल095993 से डीएनके, आर01एचएल139876 से बीआरडी, आर01 एचएल139799 से एफएच और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (सीएफएफ) अनुदान सीएफएफ 0098 जी 220 और सीएफएफ वांग द्वारा समर्थित था और सीएफएफ हॉकिन 20 एक्सएक्स 2 से एफ.एच.
12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 |