人类诱导多能干细胞分化方案的最新进展允许逐步衍生器官特异性细胞类型。在这里,我们提供了在气液界面培养物中维持和扩增iPSC衍生的气道基底细胞及其分化为粘纤毛上皮的详细步骤。
传导气道疾病,如哮喘、囊性纤维化 (CF)、原发性纤毛运动障碍 (PCD) 和病毒性呼吸道感染,是全世界发病和死亡的主要原因。使用人支气管上皮细胞(HBECs)的 体外 平台有助于我们了解健康和疾病中的气道上皮。从患有罕见遗传疾病或罕见突变的个体中获取HBECs是肺部研究的瓶颈。
诱导多能干细胞(iPSCs)很容易通过“重编程”体细胞产生,并保留个体供体的独特遗传背景。最近的进展允许iPSCs定向分化为肺上皮祖细胞,肺泡2型细胞,以及 通过 基底细胞(主要气道干细胞)传导气道上皮的细胞。
在这里,我们概述了iPSC衍生的气道基底细胞(以下简称iBC)的维持和扩增方案,以及它们在气液界面(ALI)培养物中的三系分化。iBC作为上皮球体维持和扩增,悬浮在细胞外基质液滴中,在补充TGF-ß和BMP信号通路抑制剂的初级基底细胞培养基中培养。这些上皮球内的iBC表达关键的基础标志物TP63和NGFR,可以通过荧光活化细胞分选(FACS)纯化,并且在标准ALI培养条件下接种在多孔膜上时,分化成功能性气道上皮。来自健康供体的ALI培养物由基底细胞、分泌细胞和多纤毛细胞组成,并显示出上皮屏障完整性、运动纤毛和粘液分泌。源自CF或PCD个体的培养物概括了功能失调的CFTR介导的氯化物转运或纤毛不力,以及相应的致病上皮缺陷。
在这里,我们提出了一种用于生成人体细胞的方案,可用于建模和理解气道疾病。
慢性肺病在全世界的发病率和死亡率方面负担很大1.影响传导气道的疾病,如哮喘、囊性纤维化 (CF)、原发性纤毛运动障碍 (PCD) 和病毒感染,都是常见和罕见的获得性疾病和遗传性疾病,这些疾病导致了这一全球负担。传导气道的主要功能是:1)作为层流空气的导管,以及2)提供病原体和碎片的粘膜纤毛清除。分泌性、多纤毛细胞和基底细胞代表了传导气道的主要上皮细胞类型。较罕见的上皮细胞类型包括离子细胞、簇状细胞和神经内分泌细胞,并已在其他地方进行了回顾2.
从广义上讲,理解疾病机制和推进治疗方法的一个主要障碍是始终缺乏用于临床前模型的人类原代组织。HBECs通常被认为是人类气道上皮生物学的金标准 体外 模型,并在CF研究中发挥了关键作用,特别是3。然而,它们通常从支气管镜活检中分离出来,从手术后的肺组织中分离出来,或者从移植目的而被排斥的肺部中分离出来。从遗传病患者那里获得HBECs,包括CF和PCD的研究重点,是罕见且不可预测的。需要克服患者来源的气道上皮细胞的这一瓶颈。iPSCs很容易从任何个体产生,它们保留了供体的独特遗传背景,并且在细胞培养条件下具有显着的增殖和长期存活能力4,5,6。通过概括关键的胚胎学步骤,iPSCs经历“定向分化”成器官特异性细胞类型。我们和其他人已经开发了方案来产生iPSC衍生的肺祖细胞,肺泡2型细胞7,8 和传导气道的细胞,包括气道基底细胞9,10,11,12。
气道基底细胞是传导气道13的干细胞。在先前发表的工作中,我们的团队已经产生了iPSC衍生的气道上皮细胞,包括表达典型基底细胞标志物(包括TP63,KRT5和NGFR)的亚群(iBC)。根据成人基底细胞生物学的线索,抑制双SMAD途径(TGF-β和BMP)导致NGFR + iBC11,14的上调。NGFR + iBC作为单细胞重悬于细胞外基质液滴中,并在基底细胞培养基中培养。它们自我更新以维持ibc种群并形成上皮球体;然而,一定比例也以这种格式分化成分泌细胞(称为3-D培养物)。在以下实验方案中,我们详细介绍了在3-D培养物中维持和扩展这些iBC的步骤,以及生成功能性2-D粘膜纤毛ALI培养物所需的步骤。
该分化方案的初始步骤先前已经发布,在此不再回顾11,12。本手稿将围绕iBC的扩增和纯化以及它们随后在ALI培养物中分化为功能性分泌细胞和多纤毛细胞。
HBECs是研究气道上皮疾病的金标准细胞类型。由于它们的局限性(包括可及性和遗传操作的难度),我们产生了iBC和ALI培养物的衍生方案。这些细胞可以来自任何供体并保留其独特的遗传背景,从而允许进行基本的发育研究,疾病建模和新的治疗发展。
虽然所描述的协议的每个单独步骤都是必要的,但有几个步骤值得额外提及。首先,在需要将球体解离成单个细胞的每个步骤中,避免过度移液至关重要;酶消化(使用脱饷酶或胰蛋白酶)可促进更好的细胞存活,而过度移液会导致严重的细胞死亡。其次,在纯化NGFR + iBC时,同种型对照的利用至关重要,我们建议选择具有FACS表达最高的NGFR +细胞(图3)。这种方法可获得最佳的 ALI 培养效果,并进行适当的粘膜纤毛分化。最后,按照方案中的记录精确制备和接种多孔膜是ALI培养物生存的基础。虽然我们通常每个插入片段接种30,000-60,000个细胞,但我们的成功细胞只有20,000个。虽然可以使用人胚胎干细胞合格的基质包衣产生成功的培养物,但我们最近使用了人重组层粘连蛋白-521,其ALI培养物的耐久性显着更高。
极少数情况下,iPSC分化可能无法上调足够百分比的NGFR + iBC。在这种情况下,iBC的串行传代(在3D培养中)可能导致NGFR频率随着时间的推移而增加。该协议的局限性包括生成这些单元所需的时间,成本和专业知识。此外,我们认识到许多研究人员对气道上皮的不太常见的细胞类型(例如,离子细胞,神经内分泌细胞)感兴趣。虽然我们已经检测到一些这些更稀有的细胞类型,如在原代HBEC培养物中,但它们没有被可重复地识别,可能是由于对产生这些细胞所需的发育线索的不完全了解。
正如所写的,上述协议从已经冷冻保存的iBC的解冻开始。这种冷冻保存之前的细节先前已经描述过,并且超出了本手稿11,12的范围。
我们的气道上皮ALI培养方法允许从几乎任何供体中产生功能性气道上皮细胞。这大大增加了珍贵的遗传控制气道上皮细胞的可及性,这些细胞可用于疾病建模,药物筛选,未来的基于细胞的疗法,以及提高对气道上皮内发育模式的理解。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢霍金斯,科顿和戴维斯实验室的成员多年来对这个项目和其他项目的有益投入。我们还感谢Brian Tilton(BU细胞分选总监)的奉献精神和技术专长,我们感谢波士顿大学再生医学中心(CReM)的Greg Miller和Marianne James在患者特定iPSC的维护和表征方面的支持和技术专长,并得到NIH拨款NO1 75N92020C00005和U01TR001810的支持。这项工作得到了NIH拨款U01HL148692,U01HL134745,U01HL134766和R01HL095993到D.N.K,R01HL139876到B.R.D,R01 HL139799到F.H.,囊性纤维化基金会(CFF)资助CFF 00987G220和CFF WANG20GO到D.N.K,CFF DAVIS15XX1,DAVIS17XX0,DAVIS19XX0到B.R.D,CFF SUZUKI19XX0到S.S,CFF BERICA2010到A.B., 和CFF HAWKIN20XX2到F.H.
12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 |