인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.
천식, 낭포성 섬유증 (CF), 원발성 섬모 운동 장애 (PCD) 및 바이러스 성 호흡기 감염과 같은 실시기도의 질병은 전 세계적으로 이환률 및 사망률의 주요 원인입니다. 인간 기관지 상피 세포 (HBECs)를 사용하는 시험관 내 플랫폼은 건강과 질병에서기도 상피에 대한 우리의 이해에 도움이되었습니다. 희귀 한 유전 질환 또는 희귀 한 돌연변이를 가진 개인의 HBEC에 대한 접근은 폐 연구의 병목 현상입니다.
유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 체세포를 “재 프로그래밍”함으로써 쉽게 생성되며 개별 기증자의 독특한 유전 적 배경을 유지합니다. 최근의 발전은 iPSCs를 폐 상피 전구 세포, 폐포 유형 2 세포뿐만 아니라 주요 기도 줄기 세포인 기저 세포를 통해 전도하는 기도 상피의 세포로의 지향적 분화를 허용한다.
여기서 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포 (이하 iBCs)의 유지 및 확장뿐만 아니라 공기 액체 계면 (ALI) 배양물에서의 삼선 분화를위한 프로토콜을 개략적으로 설명합니다. iBCs는 TGF-ß 및 BMP 신호전달 경로의 억제제로 보충된 일차 기저 세포 배지에서 배양된 세포외 매트릭스의 액적에 현탁된 상피 구체로서 유지되고 확장된다. 이들 상피 구체 내의 iBCs는 주요 기저 마커 TP63 및 NGFR을 발현하고, 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 정제될 수 있고, 표준 ALI 배양 조건에서 다공성 멤브레인 상에 플레이팅될 때, 기능성 기도 상피로 분화된다. 건강한 기증자로부터 유래된 ALI 배양물은 기저, 분비 및 다균 세포로 구성되며 상피 장벽 완전성, 운동성 섬모 및 점액 분비를 입증합니다. CF 또는 PCD를 갖는 개체로부터 유래된 배양물은 각각의 질환-유발 상피 결함인 기능장애성 CFTR-매개된 클로라이드 수송 또는 이모성 섬모를 재검토한다.
여기에서, 우리는 기도 질환을 모델링하고 이해하는데 적용될 수 있는 인간 세포의 생성을 위한 프로토콜을 제시한다.
만성 폐 질환은 전 세계적으로 이환률과 사망률의 큰 부담을 차지합니다1. 천식, 낭포성 섬유증 (CF), 원발성 섬모 운동 장애 (PCD) 및 바이러스 감염과 같은 실시기도에 영향을 미치는 상태는 후천성 및 유전 적 흔하고 희귀 한 질병을 나타내며, 이는 전 세계적인 부담에 기여합니다. 전도 기도의 주요 기능은 1) 공기의 층류를위한 도관 역할을하고, 2) 병원균과 파편의 점액 제거를 제공하는 것입니다. 분비, 다섬모, 및 기저 세포는 전도 기도의 주요 상피 세포 유형을 나타낸다. 희귀한 상피 세포 유형은 이온세포, 터프트 세포, 및 신경내분비 세포를 포함하며, 다른 곳에서 검토되었다2.
광범위하게, 질병의 메카니즘을 이해하고 치료 접근법을 발전시키는 데 대한 주요 장벽은 전임상 모델에서 사용하기 위한 인간 일차 조직의 일관된 부족이었다. HBECs는 일반적으로 인간 기도 상피 생물학의 금 표준 시험관 내 모델로 간주되며 특히 CF 연구에서 중요한 역할을수행했습니다 3. 그러나 이들은 일반적으로 기관지 경 생검, 수술 후 폐 조직 또는 이식 목적으로 거부 된 폐에서 분리됩니다. CF 및 PCD의 연구 우선 순위를 포함하여 유전 질환을 앓고있는 개인의 HBEC에 대한 접근은 드물고 예측할 수 없습니다. 환자 유래 기도 상피 세포에 대한 이러한 병목 현상을 극복하는 것이 필요하다. iPSCs는 임의의 개체로부터 쉽게 생성되고, 공여자의 독특한 유전적 배경을 보유하며, 세포 배양 조건4,5,6에서 장기간 증식하고 생존할 수 있는 현저한 능력을 갖는다. 주요 배아 학적 단계를 되풀이함으로써 iPSC는 장기 특이적 세포 유형으로 “직접 분화”를 겪습니다. 우리와 다른 사람들은 iPSC 유래 폐 전구 인자, 폐포 유형 2 세포 7,8 및 기도 기저 세포9,10,11,12를 포함하는 전도 기도의 세포를 생성하기위한 프로토콜을 개발했습니다.
기도 기저 세포는 전도 기도(13)의 줄기 세포이다. 이전에 발표 된 연구에서 우리 그룹은 TP63, KRT5 및 NGFR을 포함한 표준 기저 세포 마커를 발현하는 하위 집합 (iBCs)을 포함하여 iPSC 유래 기도 상피 세포를 생성했습니다. 성인 기저 세포 생물학의 단서에 따라, 이중 SMAD 경로 (TGF-β 및 BMP)의 억제는 NGFR + iBC11,14의 상향 조절을 유도합니다. NGFR+ iBCs는 세포외 매트릭스의 액적에 단일 세포로서 재현탁되고 기저 세포 배지에서 배양된다. 그들은 iBC 인구를 유지하고 상피 구상체를 형성하기 위해 스스로 갱신합니다. 그러나, 비율은 또한 이 포맷(3-D 배양물이라고 함)에서 분비 세포로 분화된다. 다음 프로토콜에서는 3-D 배양물에서 이러한 iBC를 유지 및 확장하는 단계와 기능적 2-D 점막질 ALI 배양물을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.
이 분화 프로토콜의 초기 단계는 이전에 발표되었으며 여기에서 검토되지 않을 것입니다11,12. 이 원고는 iBCs의 확장 및 정제와 ALI 배양물에서 기능적 분비 및 다균 세포로의 후속 분화에 중점을 둘 것입니다.
HBECs는 기도 상피의 질병을 연구하는 금 표준 세포 유형입니다. 그들의 한계 (접근성 및 유전자 조작의 어려움 포함)로 인해 우리는 iBC 및 ALI 배양의 유도를위한 프로토콜을 생성했습니다. 이 세포는 모든 기증자로부터 유래 될 수 있으며 고유 한 유전 적 배경을 유지하므로 기본 발달 연구, 질병 모델링 및 새로운 치료 개발을 허용합니다.
설명 된 프로토콜의 각 개별 단계가 필요하지만 추가 언급이 필요한 몇 가지가 있습니다. 첫째, 구상체를 단일 세포로 해리해야하는 각 단계에서 과도한 피펫팅을 피하는 것이 중요합니다. 효소 소화 (디스파제 또는 트립신 사용)는 더 나은 세포 생존을 촉진하는 반면, 과도한 피펫팅은 상당한 세포 사멸을 초래합니다. 둘째, NGFR+ iBC를 정제할 때 이소타입 조절의 활용이 매우 중요하며, FACS를 사용하여 가장 많이 발현하는 NGFR+ 세포를 선택하는 것이 좋습니다(그림 3). 이 접근법은 적절한 점막질 분화를 갖는 최적의 ALI 배양을 초래한다. 마지막으로, 프로토콜에 문서화 된 바와 같이 정확하게 다공성 멤브레인의 준비 및 시딩은 ALI 문화 생존을위한 기본입니다. 우리는 일반적으로 삽입 당 30,000-60,000 개의 세포를 시드하지만 20,000 개의 세포로 성공을 거두었습니다. 성공적인 배양은 인간 배아 줄기 세포 자격을 갖춘 매트릭스 코팅을 사용하여 생성 될 수 있지만, 우리는 ALI 배양물의 상당히 높은 내구성을 가진 인간 재조합 라미닌 -521을 최근에 사용했습니다.
매우 드물게, iPSC 분화는 NGFR+ iBC의 적절한 비율을 상향조절하지 못할 수 있다. 이 경우, iBC의 직렬 패시징(3D 문화권에서)은 시간이 지남에 따라 NGFR 주파수가 증가할 수 있습니다. 이 프로토콜의 한계에는 이러한 셀을 생성하는 데 필요한 시간, 비용 및 전문 지식이 포함됩니다. 또한, 우리는 많은 연구자들이 기도 상피의 덜 일반적인 세포 유형 (예 : 이온세포, 신경 내분비 세포)에 관심이 있음을 알고 있습니다. 우리는 일차 HBEC 배양에서와 같이 이러한 희귀 한 세포 유형 중 일부를 발견했지만, 재현 가능하게 확인되지 않았으며, 이는 이러한 세포를 생성하는 데 필요한 발달 단서에 관한 불완전한 지식 때문일 수 있습니다.
쓰여진 바와 같이, 위의 프로토콜은 이미 냉동 보존 된 iBC의 해동으로 시작됩니다. 이 냉동 보존 이전의 세부 사항은 이전에 설명되었으며이 원고11,12의 범위를 벗어납니다.
우리의 기도 상피 ALI 배양 방법은 거의 모든 기증자로부터 기능적 기도 상피 세포의 생성을 허용합니다. 이것은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 미래의 세포 기반 요법에 사용될 수있는 귀중한 유전자 조절기도 상피 세포에 대한 접근성을 크게 증가시킬뿐만 아니라기도 상피 내의 발달 패터닝에 대한 이해를 향상시킵니다.
The authors have nothing to disclose.
Hawkins, Kotton 및 Davis 연구소의 회원들이이 프로젝트와 다른 프로젝트와 관련하여 수년 동안 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 또한 브라이언 틸튼 (BU Cell Sorting Director)의 헌신과 기술 전문 지식에 대한 빚을지고 있으며, NIH 보조금 NO1 75N92020C00005 및 U01TR001810의 지원을 받아 환자 별 iPSC의 유지 보수 및 특성화에 대한 지원 및 기술 전문 지식에 대해 보스턴 대학 재생 의학 센터 (CReM)의 Greg Miller와 Marianne James에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 및 R01HL095993을 D.N.K, R01HL139876을 B.R.D, R01 HL139799를 F.H.에 부여하고, 낭포성 섬유증 재단 (CFF)은 CFF 00987G220 및 CFF WANG20GO를 D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0에서 B.R.D, CFF SUZUKI19XX0에서 S.S, CFF BERICA2010을 A.B.에 부여합니다. CFF HAWKIN20XX2에서 F.H.로
12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 |