Nylige fremskritt i menneskeskapte pluripotente stamcelledifferensieringsprotokoller tillater trinnvis avledning av organspesifikke celletyper. Her gir vi detaljerte trinn for vedlikehold og utvidelse av iPSC-avledede luftveisbasalceller og deres differensiering i et mucociliary epitel i luft-væske grensesnittkulturer.
Sykdommer i den ledende luftveiene som astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliary dyskinesi (PCD) og virale luftveisinfeksjoner er viktige årsaker til sykelighet og dødelighet over hele verden. In vitro-plattformer som bruker humane bronkiale epitelceller (HBECs) har vært medvirkende til vår forståelse av luftveisepitelet i helse og sykdom. Tilgang til HBECer fra personer med sjeldne genetiske sykdommer eller sjeldne mutasjoner er en flaskehals i lungeforskning.
Induserte pluripotente stamceller (iPSCer) genereres lett av “omprogrammering” somatiske celler og beholder den unike genetiske bakgrunnen til den enkelte donor. Nylige fremskritt tillater rettet differensiering av iPSC til lunge epiteliale stamceller, alveolar type 2 celler, samt cellene i ledende luftveis epitel via basale celler, de store luftveis stamcellene.
Her skisserer vi en protokoll for vedlikehold og utvidelse av iPSC-avledede luftveisbasalceller (heretter iBO-er) samt deres trilineage differensiering i luft-væske grensesnitt (ALI) kulturer. iBO-er vedlikeholdes og utvides etter hvert som epitelsfærer suspenderes i dråper med ekstracellulær matrise dyrket i et primært basalcellemedium supplert med hemmere av TGF-ß- og BMP-signalveier. iBO-er innenfor disse epiteliale sfærene uttrykker viktige basale markører TP63 og NGFR, kan renses ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS), og når de er belagt på porøse membraner under standard ALI-kulturforhold, skille seg ut i et funksjonelt luftveisepitel. ALI-kulturer avledet fra friske givere består av basale, sekretoriske og multicilierte celler og demonstrerer epitelial barriereintegritet, motil cilia og slimsekresjon. Kulturer avledet fra personer med CF eller PCD rekapitulerer den dysfunksjonelle CFTR-medierte kloridtransporten eller immotile cilia, de respektive sykdomsfremkallende epitelfeilene.
Her presenterer vi en protokoll for generering av menneskelige celler som kan brukes til modellering og forståelse av luftveissykdommer.
Kroniske lungesykdommer står for en stor byrde av sykelighet og dødelighet over hele verden1. Forhold som påvirker de ledende luftveiene, som astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliary dyskinesi (PCD) og virusinfeksjoner representerer både vanlige og sjeldnere sykdommer, ervervet og genetisk, som bidrar til denne verdensomspennende byrden. De viktigste funksjonene i de ledende luftveiene er å: 1) fungere som en kanal for laminær luftstrøm, og 2) gi mucociliary clearance av patogener og rusk. Sekretoriske, multicilierte og basale celler representerer de viktigste epitelcelletypene i den ledende luftveien. Sjeldnere epitelceller inkluderer ionocytter, tuftceller og nevroendokrine celler, og har blitt gjennomgått andre steder2.
Generelt har en stor barriere for å forstå sykdomsmekanismer og fremme terapeutiske tilnærminger vært en konsekvent mangel på humant primærvev for bruk i prekliniske modeller. HBECer regnes generelt som den gullstandardiserte in vitro-modellen for human luftveis epitelbiologi og har spilt nøkkelroller i CF-forskning spesielt3. Imidlertid er de vanligvis isolert enten fra bronkoskopiske biopsier, fra lungevev etter operasjonen, eller fra lunger avvist for transplantasjonsformål. Tilgang til HBECer fra personer med genetiske sykdommer, inkludert forskningsprioritetene til CF og PCD, er sjeldne og uforutsigbare. Det er nødvendig å overvinne denne flaskehalsen til pasientavledede epitelceller i luftveiene. iPSCer genereres lett fra ethvert individ, de beholder donorens unike genetiske bakgrunn, og har en bemerkelsesverdig evne til å spre seg og overleve langsiktig i cellekulturforhold 4,5,6. Ved å rekapitulere viktige embryologiske trinn gjennomgår iPSCer “rettet differensiering” i organspesifikke celletyper. Vi og andre har utviklet protokoller for å generere iPSC-avledede lungeforfedre, alveolar type 2 celler 7,8 og cellene i den ledende luftveien, inkludert luftveisbasalceller 9,10,11,12.
Luftveisbasalcellen er stamcellen til den ledende luftveien13. I tidligere publisert arbeid har gruppen vår generert iPSC-avledede epitelceller i luftveier, inkludert et delsett (iBCer) som uttrykker kanoniske basale cellemarkører, inkludert TP63, KRT5 og NGFR. Etter signaler fra voksen basal cellebiologi fører hemming av doble SMAD-veier (TGF-β og BMP) til oppregulering av NGFR + iBCer11,14. NGFR+ iBO-er resuspenderes som enkeltceller i dråper med ekstracellulær matrise og dyrkes i et basalcellemedium. De fornyer seg selv for å opprettholde en iBC-befolkning og danne epitelske sfæroider; En andel skiller seg imidlertid også ut i sekretoriske celler i dette formatet (referert til som 3D-kultur). I følgende protokoll beskriver vi trinnene for å vedlikeholde og utvide disse iBO-ene i 3D-kultur, samt trinnene som kreves for å generere en funksjonell 2D-mucociliary ALI-kultur.
De første trinnene i denne differensieringsprotokollen er publisert tidligere og vil ikke bli gjennomgått her11,12. Dette manuskriptet vil dreie seg om utvidelse og rensing av iBO-er og deres påfølgende differensiering i funksjonelle sekretoriske og multicilierte celler i ALI-kulturen.
HBECer er gullstandard celletypen for å studere sykdommer i luftveisepitelet. På grunn av deres begrensninger (inkludert tilgjengelighet og vanskeligheter med å genetisk manipulere), har vi generert en protokoll for avledning av iBO-er og ALI-kulturer. Disse cellene kan avledes fra enhver donor og beholde sin unike genetiske bakgrunn, og dermed tillate grunnleggende utviklingsstudier, sykdomsmodellering og ny terapeutisk utvikling.
Mens hvert enkelt trinn i den beskrevne protokollen er nødvendig, er det flere som fortjener ekstra omtale. For det første, på hvert trinn som krever dissosiasjon av sfæroider i enkeltceller, er det viktig å unngå overdreven pipettering; enzymatisk fordøyelse (med dispase eller trypsin) fremmer bedre celleoverlevelse, mens overdreven pipettering fører til betydelig celledød. For det andre, når du renser NGFR + iBCer, er utnyttelse av isotypekontrollen avgjørende, og vi anbefaler å velge for de høyeste uttrykkende NGFR + -cellene med FACS (figur 3). Denne tilnærmingen resulterer i optimale ALI-kulturer med passende mucociliary differensiering. Til slutt er tilberedning og såing av porøse membraner nøyaktig som dokumentert i protokollen grunnleggende for ALI-kulturoverlevelse. Mens vi vanligvis frø 30,000-60,000 celler per innsats, har vi hatt suksess med så få som 20,000 celler. Mens vellykkede kulturer kan genereres ved hjelp av det humane embryonale stamcellekvalifiserte matrisebelegget, har vi nylig brukt human rekombinant laminin-521 med en betydelig høyere holdbarhet av ALI-kulturene.
Svært sjelden kan iPSC-differensieringer mislykkes i å oppregulere en tilstrekkelig prosentandel av NGFR + iBCer. I dette tilfellet kan seriell passaging av iBO-er (i 3D-kultur) føre til økt NGFR-frekvens over tid. Begrensninger i denne protokollen inkluderer tiden, kostnadene og ekspertisen som trengs for å generere disse cellene. I tillegg erkjenner vi at mange forskere er interessert i de mindre vanlige celletypene av luftveisepitelet (f.eks. ionocytter, nevroendokrine celler). Selv om vi har oppdaget noen av disse sjeldnere celletypene, som i primære HBEC-kulturer, blir de ikke reprodusert identifisert, sannsynligvis på grunn av ufullstendig kunnskap om utviklingssignalene som kreves for å generere disse cellene.
Som det er skrevet, begynner ovennevnte protokoll med opptining av allerede kryopreserverte iBO-er. Detaljene før denne kryopreserveringen er tidligere beskrevet og utenfor omfanget av dette manuskriptet11,12.
Vår epitelkulturmetode for luftveier muliggjør generering av funksjonelle luftveisepitelceller fra nesten alle donorer. Dette øker i stor grad tilgjengeligheten til dyrebare genetisk kontrollerte luftveis epitelceller som kan brukes til sykdomsmodellering, legemiddelscreening, fremtidige cellebaserte terapier, samt for å forbedre forståelsen av utviklingsmønsteret i luftveisepitelet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmene av Laboratoriene Hawkins, Kotton og Davis for deres nyttige innspill gjennom årene angående dette og andre prosjekter. Vi står også i gjeld til Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) for hans engasjement og tekniske ekspertise, og vi er takknemlige til Greg Miller og Marianne James fra Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) for deres støtte og tekniske ekspertise innen vedlikehold og karakterisering av pasientspesifikke iPSCer, støttet av NIH gir NO1 75N92020C00005 og U01TR005 og U01TR0018. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til D.N.K, R01HL139876 til B.R.D, R01 HL139799 til F.H., og Cystic Fibrosis Foundation (CFF) gir CFF 00987G220 og CFF WANG20GO til D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 til B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 til S.S, CFF BERICA2010 til A.B., og CFF HAWKIN20XX2 til F.H.
12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 |