De senaste framstegen inom humaninducerade pluripotenta stamcellsdifferentieringsprotokoll möjliggör stegvis härledning av organspecifika celltyper. Här ger vi detaljerade steg för underhåll och expansion av iPSC-härledda luftvägsbasalceller och deras differentiering till ett mucociliärt epitel i luft-flytande gränssnittskulturer.
Sjukdomar i den ledande luftvägarna som astma, cystisk fibros (CF), primär ciliär dyskinesi (PCD) och virala luftvägsinfektioner är viktiga orsaker till sjuklighet och dödlighet över hela världen. In vitro-plattformar som använder humana bronkialepitelceller (HBECs) har varit avgörande för vår förståelse av luftvägsepitelet vid hälsa och sjukdom. Tillgång till HBECs från individer med sällsynta genetiska sjukdomar eller sällsynta mutationer är en flaskhals inom lungforskningen.
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genereras lätt genom “omprogrammering” av somatiska celler och behåller den unika genetiska bakgrunden hos den enskilda givaren. De senaste framstegen möjliggör riktad differentiering av iPSC till lungepitelceller, alveolära typ 2-celler, liksom cellerna i det ledande luftvägsepitelet via basalceller, de viktigaste luftvägsstamcellerna.
Här beskriver vi ett protokoll för underhåll och expansion av iPSC-härledda luftvägsbasalceller (nedan kallade iBC) samt deras trilineagedifferentiering i luft-vätskegränssnitt (ALI) -kulturer. iBC bibehålls och expanderas som epitelsfärer suspenderade i droppar av extracellulär matris odlad i ett primärt basalcellsmedium kompletterat med hämmare av TGF-ß- och BMP-signalvägar. iBC inom dessa epitelsfärer uttrycker viktiga basalmarkörer TP63 och NGFR, kan renas genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), och när de pläteras på porösa membran under standard ALI-odlingsförhållanden, differentieras till ett funktionellt luftvägsepitel. ALI-kulturer som härrör från friska givare består av basala, sekretoriska och multicilierade celler och visar epitelbarriärintegritet, rörliga flimmerhår och slemsekretion. Kulturer som härrör från individer med CF eller PCD rekapitulerar den dysfunktionella CFTR-medierade kloridtransporten eller immotile cilia, respektive sjukdomsframkallande epitelfel.
Här presenterar vi ett protokoll för generering av mänskliga celler som kan tillämpas för modellering och förståelse av luftvägssjukdomar.
Kroniska lungsjukdomar står för en stor börda av sjuklighet och dödlighet över hela världen1. Tillstånd som påverkar de ledande luftvägarna, såsom astma, cystisk fibros (CF), primär ciliär dyskinesi (PCD) och virusinfektioner representerar både vanliga och sällsynta sjukdomar, förvärvade och genetiska, som bidrar till denna världsomspännande börda. De viktigaste funktionerna i de ledande luftvägarna är att: 1) fungera som en ledning för det laminära luftflödet och 2) tillhandahålla mucociliary clearance av patogener och skräp. Sekretoriska, multicilierade och basala celler representerar de viktigaste epitelcellstyperna i den ledande luftvägarna. Sällsynta epitelcelltyper inkluderar jonocyter, tuftceller och neuroendokrina celler och har granskats någon annanstans2.
I stort sett har ett stort hinder för att förstå sjukdomsmekanismer och utveckla terapeutiska metoder varit en konsekvent brist på mänsklig primär vävnad för användning i prekliniska modeller. HBECs anses allmänt vara den guldstandard in vitro-modellen för human luftvägsepitelbiologi och har spelat nyckelroller i CF-forskning i synnerhet3. De isoleras emellertid vanligtvis antingen från bronkoskopiska biopsier, från lungvävnad efter operation eller från lungor som avvisas för transplantationsändamål. Tillgång till HBECs från individer med genetiska sjukdomar, inklusive forskningsprioriteringar för CF och PCD, är sällsynt och oförutsägbar. Att övervinna denna flaskhals till patient-härledda luftvägsepitelceller behövs. iPSCs genereras lätt från vilken individ som helst, de behåller donatorns unika genetiska bakgrund och har en anmärkningsvärd förmåga att sprida sig och överleva på lång sikt under cellodlingsförhållanden 4,5,6. Genom att rekapitulera viktiga embryologiska steg genomgår iPSCs “riktad differentiering” till organspecifika celltyper. Vi och andra har utvecklat protokoll för att generera iPSC-härledda lungprogenitorer, alveolära typ 2-celler 7,8 och cellerna i den ledande luftvägen inklusive luftvägsbasceller 9,10,11,12.
Luftvägsbasalcellen är stamcellen i den ledande luftvägen13. I tidigare publicerat arbete har vår grupp genererat iPSC-härledda luftvägsepitelceller, inklusive en delmängd (iBC) som uttrycker kanoniska basalcellsmarkörer inklusive TP63, KRT5 och NGFR. Efter ledtrådar från vuxen basalcellsbiologi leder hämning av dubbla SMAD-vägar (TGF-β och BMP) till uppreglering av NGFR + iBC11,14. NGFR+ iBC:er återsuspenderas som enstaka celler i droppar av extracellulär matris och odlas i ett basalcellsmedium. De förnyar sig själv för att upprätthålla en iBC-population och bilda epitelsfäroider; emellertid differentieras en andel också till sekretoriska celler i detta format (kallad 3D-kultur). I följande protokoll beskriver vi stegen för att underhålla och utöka dessa iBC i 3D-kulturen, liksom de steg som krävs för att generera en funktionell 2-D mucociliary ALI-kultur.
De första stegen i detta differentieringsprotokoll har publicerats tidigare och kommer inte att granskas här 11,12. Detta manuskript kommer att fokusera på expansion och rening av iBC och deras efterföljande differentiering till funktionella sekretoriska och multicilierade celler i ALI-odling.
HBECs är guldstandardcelltypen för att studera sjukdomar i luftvägsepitelet. På grund av deras begränsningar (inklusive tillgänglighet och svårigheter att genetiskt manipulera) har vi genererat ett protokoll för härledning av iBC och ALI-kulturer. Dessa celler kan härledas från vilken givare som helst och behålla sin unika genetiska bakgrund, vilket möjliggör grundläggande utvecklingsstudier, sjukdomsmodellering och ny terapeutisk utveckling.
Medan varje enskilt steg i det beskrivna protokollet är nödvändigt, finns det flera som förtjänar extra omnämnande. För det första, vid varje steg som kräver dissociation av sfäroider i enskilda celler, är det viktigt att undvika överdriven pipettering; enzymatisk matsmältning (med dispas eller trypsin) främjar bättre cellöverlevnad, medan överdriven pipettering leder till signifikant celldöd. För det andra, vid rening av NGFR + iBC: er är användningen av isotypkontrollen avgörande och vi rekommenderar att du väljer för de högst uttryckande NGFR + -cellerna med FACS (figur 3). Detta tillvägagångssätt resulterar i optimala ALI-kulturer med lämplig mucociliär differentiering. Slutligen är beredning och sådd av porösa membran exakt som dokumenterat i protokollet grundläggande för ALI-kulturens överlevnad. Medan vi vanligtvis sår 30 000-60 000 celler per insats, har vi haft framgång med så få som 20 000 celler. Medan framgångsrika kulturer kan genereras med hjälp av den humana embryonala stamcellskvalificerade matrisbeläggningen, har vi nyligen använt humant rekombinant laminin-521 med en signifikant högre hållbarhet hos ALI-kulturerna.
Mycket sällan kan iPSC-differentieringar misslyckas med att uppreglera en tillräcklig procentandel ngfr+ iBC. I detta fall kan seriell passaging av iBC (i 3D-kultur) resultera i en ökad NGFR-frekvens över tid. Begränsningar i detta protokoll inkluderar tid, kostnad och expertis som behövs för att generera dessa celler. Dessutom inser vi att många forskare är intresserade av de mindre vanliga celltyperna i luftvägsepitelet (t.ex. jonocyter, neuroendokrina celler). Medan vi har upptäckt några av dessa sällsynta celltyper, som i primära HBEC-kulturer, identifieras de inte reproducerbart, troligen på grund av ofullständig kunskap om de utvecklingssignaler som krävs för att generera dessa celler.
Som det är skrivet börjar ovanstående protokoll med upptining av redan kryokonserverade iBC. Detaljerna före denna kryokonservering är tidigare beskrivna och utanför ramen för detta manuskript 11,12.
Vår luftvägsepitel ALI-odlingsmetod möjliggör generering av funktionella luftvägsepitelceller från nästan vilken givare som helst. Detta ökar kraftigt tillgängligheten till värdefulla genetiskt kontrollerade luftvägsepitelceller som kan användas för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening, framtida cellbaserade terapier, samt för att förbättra förståelsen för utvecklingsmönstret i luftvägsepitelet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmarna i laboratorierna Hawkins, Kotton och Davis för deras hjälpsamma bidrag genom åren angående detta och andra projekt. Vi står också i tacksamhetsskuld till Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) för hans engagemang och tekniska expertis, och vi är tacksamma mot Greg Miller och Marianne James från Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) för deras support och tekniska expertis inom underhåll och karakterisering av patientspecifika iPSCs, med stöd av NIH-bidrag NO1 75N92020C00005 och U01TR001810. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 och R01HL095993 till D.N.K, R01HL139876 till B.R.D, R01 HL139799 till F.H. och Cystic Fibrosis Foundation (CFF) beviljar CFF 00987G220 och CFF WANG20GO till D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 till B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 till S.S, CFF BERICA2010 till AB, och CFF HAWKIN20XX2 till F.H.
12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 |