Multispektral optoakustisk tomografi för funktionell avbildning i vaskulär forskning

Summary

Detta protokoll beskriver förvärvet av multispektrala optoakustiska bilder av in vivo human hudvaskulatur. Dessa inkluderar kvantifiering av hemoglobin och melanin, betraktad som kromoforer av intresse för funktionell analys.

Abstract

Mikrocirkulationsnedsättning har erkänts i olika sjukdomsprocesser, vilket ligger till grund för detta växande tema inom vaskulär forskning. Under de senaste åren har utvecklingen av levande avbildningssystem satt den (analytiska) takten i både grundläggande och klinisk forskning, med målet att skapa nya instrument som kan tillhandahålla kvantifierbara slutpunkter i realtid med kliniskt intresse och tillämpning. Nära-infraröd spektroskopi (NIRS), positronemissionstomografi (PET), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRI) finns bland andra tekniker, men kostnad, bildupplösning och minskad kontrast erkänns som vanliga utmaningar. Optoakustisk tomografi (OT) erbjuder ett nytt perspektiv på vaskulär funktionell avbildning, som kombinerar toppmodern optisk absorption och rumslig upplösningskapacitet (från mikrometer optisk till millimeter akustisk upplösning) med vävnadsdjup. I denna studie testade vi tillämpligheten av multispektral optoakustisk tomografi (MSOT) för funktionell avbildning. Systemet använder en avstämbar optisk parametrisk oscillator (OPO) som pumpas av en Nd: YAG-laser, vilket ger excitationspulser som avkänns av en 3D-sond vid våglängder från 680 nm till 980 nm. Bilder erhållna från den mänskliga underarmen rekonstruerades genom en specifik algoritm (levereras i tillverkarens programvara) baserat på svaret från specifika kromoforer. Maximalt syresatt hemoglobin (Max HbO₂) och deoxygenerat hemoglobin (Max Hb), totalt hemoglobin (HbT) och genomsnittlig syremättnad (mSO2) till vaskulär densitet (μVu), genomsnittliga avstånd mellan enheter (ζAd) och kapillär blodvolym (mm³) kan mätas med hjälp av detta system. Tillämplighetspotentialen som finns med detta OT-system är relevant. Pågående mjukvaruutveckling kommer säkert att förbättra nyttan av detta bildsystem.

Introduction

Hjärt- och kärlsjukdomar är återkommande främsta dödsorsaker i världen och utgör en enorm börda för alla hälso- och sjukvårdssystem ^1,2. Tekniken har varit en viktig bidragande orsak till utvidgningen av vår förståelse av grundläggande hjärt- och vaskulär patofysiologi, vilket ger mer exakta diagnostiska verktyg och möjlighet till tidig sjukdomsupptäckt och effektivare hantering. Bildtekniker erbjuder möjligheten att mäta inte bara hjärt- och större kärlprestanda utan också, i mycket mindre skala, för att beräkna kapillärdensiteten, lokal perfusion och volym och endoteldysfunktion, bland andra egenskaper. Dessa tekniker har erbjudit de första kvantitativa insikterna i vaskulär biologi med direkt klinisk tillämpning. Förändringar i kapillärtäthet, lokal perfusionsreduktion eller ocklusion motsvarar sannolikt ett ischemiskt tillstånd, vilket hjälper till att förklara bildbehandlingens växande roll och blir ett oumbärligt verktyg i kardiovaskulär forskning och övning ^3,4,5.

Under de senaste åren har funktionell avbildning konsekvent satt takten i teknisk innovation, med ultraljud (USA) nära infraröd spektroskopi (NIRS), positronemissionstomografi (PET), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRI) som några välkända exempel. Flera problem begränsar dock deras tillämpning, från kostnad och patientsäkerhet (samt komfort) till bildkontrast och upplösning ^6,7. Optoakustisk tomografi (OT) har nyligen vuxit fram som en ny riktning inom optiskbaserad vaskulär forskning. Denna teknik, centrerad på detektering av ultraljudsvågor som genereras av termoelastisk expansion av vävnaden som påverkas med ultrakorta laserpulser, har varit känd under en tid ^6,8. Denna fysiska reaktion av värmeutveckling och vävnadsutvidgning framkallar en akustisk signal som detekteras av en ultraljudsgivare. Användningen av ljuspulser från synlig till nära infraröd och frånvaron av en akustisk bakgrundssignal gynnar upplösningsdjupet. Den upptäckta kontrasten är resultatet av de viktigaste kromoforerna som finns (hemoglobin eller melanin). Jämfört med andra tekniker har OT fördelarna med (1) behöver ingen kontrast (etikettfri avbildning), (2) bättre kontrast och upplösning med färre artefakter än ultraljud, och (3) lägre pris och snabbare förvärv och användarvänlighet 6,9,10,11.

Multispektral optoakustisk tomografi (MSOT) är bland den senaste generationen OT-instrument. Byggd med en avstämbar optisk parametrisk oscillator (OPO) pumpad av en Nd: YAG-laser som ger excitationspulser, förvärvas en 3D-bild av tidsupplösta signaler som detekteras från högfrekventa ultraljudsexcitationspulser vid våglängder från 680 nm till 980 nm med en repetitionshastighet på upp till 50 Hz¹². Den optoakustiska bildplattformen ger kvantifiering av olika kromoforer på djupet (så lågt som 15 mm). Variabler som HbO₂, Hb och melanin är lättillgängliga. Andra variabler av intresse, såsom maximalt syresatt hemoglobin (Max HbO₂) och deoxygenerat hemoglobin (Max Hb), finns också tillgängliga. Rekonstruktionsalgoritmer från tillverkarens programvara möjliggör beräkning av andra variabler såsom vaskulär densitet (μVu), medelavstånd mellan enheter (ζAd) och kapillärvolym (mm³).

Den aktuella studien utforskar de väsentliga operativa aspekterna av detta nya system för att bättre förstå dess praktiska egenskaper och potentiella tillämpningar inom kardiovaskulär preklinisk forskning.

Protocol

Det experimentella protokollet godkändes tidigare av etikkommittén vid universitetets hälsovetenskapliga skola (EC. ECTS/P10.21). Förfarandena respekterade fullt ut de principer för god klinisk sed som fastställts för forskning på människa¹³. Ett lämpligt urval av sex friska deltagare av båda könen (n = 3 per kön) med en medelålder på 32,8 ± 11,9 år valdes från universitetsgemenskapen. Utvalda deltagare var skyldiga att vara normotensiva, icke-rökare och fria från medicinering eller kosttillskott. Blodtryck, hjärtfrekvens och Body Mass Index registrerades också. Alla deltagare informerades tidigare om studiens mål och varaktighet och gav informerat skriftligt samtycke.

OBS: Denna studie utfördes med hjälp av MSOTAcuity (se materialförteckning), hädanefter refererad som den optoakustiska bildplattformen.

1. Förberedelse för förvärv

I den experimentella beskrivningen som följer är skärmkommandon i fetstil.

1. Läsa in ämnesinformation: Slå på den optoakustiska bildåtergivningsutrustningen. Medan utrustningen värms upp, presentera deltagarinformationen. Programvarans huvudsakliga välkomstfönster öppnas i skanningsöversikten. Introducera data (inklusive namn, studiebeteckning, personuppgifter och eventuella relevanta observationer) efter att ha klickat på Patient-ID och avsluta ansökan genom att trycka på Välj.
2. Förinställt val: Se till att meddelandet Laser är klar visas på utrustningsskärmen. Efter uppvärmningstiden måste laserstatusfältet på utrustningsskärmen ändras från Laser Standby till Laser is Ready. För detta protokoll är förinställningen utformad för kromoforer Hb, HbO₂ och melanin. Efter att ha valt rätt förinställning testas lasereffekten.
3. Se nu till att det finns ett meddelande på skärmen som påminner varje deltagare i rummet om att tillämpa lasersäkerhetsgoogle. Tryck på laser (power) switch fotpedal och vänta på laser power självkontroll. Efter några sekunder visas ett fönster med aktuell laserstatus med en kontrollrapport. Släpp det här fönstret genom att trycka på den tillgängliga OK-knappen .
   OBS: Den optoakustiska bildplattformen använder en Nd: YAG-laser, som anses vara en klass 4-laser som är särskilt farlig för det mänskliga ögat. Således måste denna laser hanteras med tillräcklig försiktighet.
   VARNING: Inget förvärv bör ske utan att säkerställa att alla säkerhetsprocedurer, inklusive lämpligt ögonskydd, finns på plats.

2. Positionering och bildförvärv

1. Acklimatisera deltagaren till laboratoriemiljön (21 °C ± 1 °C; 40%-60% relativ luftfuktighet) och välj en bekväm position för att minimera onödig rörelse. Se till att området som ska skannas tidigare har rengjorts.
   OBS: Tillverkarens rekommendation att rengöra området som ska avbildas med en 70% etanol / vattenlösning rekommenderas. För bästa bildförvärv föreslås dessutom borttagning av hår (i förekommande fall).
2. Sondhållare och bildstabilisering
   1. Applicera ett tunt lager ultraljudsgel på 3D-koppen. Bildstabilisering kräver att 3D-koppen hålls i önskad bildposition. Placera och stabilisera en låsbar arm för intresseområdet. Armen som användes i denna studie designades internt och byggdes med aluminiumprofilkomponenter (figur 1).
   2. Efter att ha placerat 3D-koppen på intresseområdet, lås delvis det stabiliserande armlåset för bildförvärv.
      OBS: Kvaliteten och till och med appliceringen av ultraljudsgelén är kritisk; Närvaron av luftbubblor kan äventyra bilddefinitionen.
3. Bildförvärv för dynamiska förhållanden, med hjälp av manövern Post-Occlusive Reactive Hyperemia (PORH), på menyfliken Undersökning .
   1. Hämta baslinjekontrollsökningen. Efter att ha hittat ett synfält för avbildning, med den tömda blodtrycksmanschetten på plats, lås 3D-koppens positioneringsarm ordentligt.
   2. Applicera minimalt tryck på bildplatsen, eftersom högre tryck kan äventyra avläsningarna. Tryck på tillverkarens standardförinställda Hb, HbO 2 och Melanin som samtidigt mäter kromoforer för Hb, HbO₂ och melanin.
      VARNING: Det är obligatoriskt att skydda ögonen med rätt skyddsglasögon under drift.
      OBS: Hudfototyperna IV till VI (mörk hud) är benägna att felläsas, vilket kräver en baslinjekontrollbild för vidare bearbetning. Användningen av skyddsglasögon under bildförvärv (när lasern är aktiv) tillåter bara det mänskliga ögat att känna igen gula och blå färger. Färger kan redigeras under bildbehandling.
   3. Välj det anatomiska området för bildförvärv vid baslinjen. För undersökande ändamål rekommenderas den ventrala underarmen. Fortsätt genom att trycka på laserfotbrytarpedalen.
      OBS: Pekskärmsknappen märkt Visa (färgad gul), som visar livebilden på skärmen när du trycker på den. Bildstabilitetsstatusen visas som en grå stapel i mitten av pekskärmen, vilket indikerar stabiliteten hos 3D-sonden.
      1. När bildstabiliteten är maximerad tar du (eller tar en ögonblicksbild) av området genom att trycka på knappen Ögonblicksbild på pekskärmen. Varje skanning kommer att förvärva 10-12 bilder på ett akustiskt djup på 150 mm för varje våglängd som definieras inom förinställningen under en förvärvstid på 2 s. Den här baslinjeförvärvsskanningen kommer att omfatta totalt 30–36 ramar.
         OBS: 10 ramar för varje kromofor detekterad (Hb, HbO₂ och melanin) samlas in med ett maximalt djup på 15 mm.
      2. Fortsätt att trycka på laserfotbrytarpedalen för kontinuerlig videoförvärv och var uppmärksam på Visa-knappen (färgad gul) på pekskärmen. Den stabiliserade bilden visas. Tryck på Spela in (färgad blå) för att starta live-bildinspelning.
      3. Stoppa inspelningen genom att trycka på Stopp-knappen (färgad svart). Den optoakustiska bildplattformen stoppar inspelningen och återger automatiskt videon till förhandsgranskningsläge.
   4. Dynamiska mätningar (PORH-illustration): Justera tryckmanschetten till patientens arm ovanför armbågen för att illustrera denna manöver. Blås upp manschetten med supra systoliskt tryck (~ 200 mmHg) och fortsätt enligt steg 2.3.1 till 2.3.3.1 för att förvärva den avbildade vaskulaturen under tryck.
   5. För att få en video för att bedöma effekten av tryckfrigöringen på den avbildade kärlen, öppna tryckventilen medan du förvärvar videon som i 2.3.3.2. Som tidigare följer du livebilden på skärmen.
      OBS: För att utföra denna manöver bör supra systoliskt tryck bibehållas i 1-5 min; Det är viktigt att vara medveten om att detta tryck kan inducera olika grader av tolerans och obehag hos patienten. Denna aspekt bör hanteras noggrant under experimenten.

3. Protokoll för bildanalys

1. Kopiera de inspelade skanningarna till en vald/dedikerad mapp för säkerhetskopiering och vidare analys på en separat datorarbetsstation med tillverkarens dedikerade analysprogramvara. Varje skanning lagras efter förvärvstid och beställs av programmet i en studiemapp med en löpande kod.
   En säkerhetskopia rekommenderas starkt. Att arbeta direkt med inspelade rådata är möjligt men starkt avskräckt, eftersom alla potentiella hårddiskkrascher kan skada rådata.
2. Öppna analysprogrammet på arbetsstationsdatorn. Välj programmeny > Öppna studie för att importera filer och komma åt säkerhetskopieringsskanningar. Öppna studien och bläddra till botten av mappen (med inspelade skanningar) för att hitta filer med en . NOD-förlängning. Detta är den enda filtypen som känns igen av programvaran för att öppna en studie.
   NOT:. NOD-filer namnges automatiskt med ett löpande nummer som ges till varje studie och har ingen patientinformation i filnamnet.
3. För bildrekonstruktion öppnar du bildanalysmodulen genom att öppna programvarumenyn > avancerad bearbetning.
   1. Se till att programarbetsflödesflikarna är synliga (färgade svarta) i den övre menyraden (kompletterande bild 1): Meny; Skanna översikt; Återuppbyggnad; Fluence korrigering; Spektral blandning; Visualisering & Analys. Under analysen färgas alla aktiverade arbetsflödesflikar blå.
      OBS: Om Advance Processing inte öppnas visar programvaran endast Skanna översikt och visualisering och analys.
4. Rekonstruera bilden via fliken Rekonstruktion i programvaran. Välj skanningarna som ska rekonstrueras från vänster sida av huvudprogrammenyn. Laddade skanningar visas till höger på skärmen. Lämna standardvärdet sex optoakustiska emissionsvåglängder (700, 730, 760, 800, 850 och 900 nm), eftersom de inkluderar den maximala optoakustiska signalen för HbO₂ vid 900 nm, för Hb vid 760 nm och melanin vid 700 nm.
   1. Utför skanningsrekonstruktionen med ikonen på höger sida. Följ programmets arbetsflöde genom att välja förinställningen Skanna och Synfält (upplösning). Information presenteras längst upp till vänster på huvudskärmen. Justera ljudets hastighet för att justera skanningsfokus (kompletterande bild 2). Rekonstruktionspanelen visar också antalet ramar för varje förvärvad skanning och gör det möjligt att analysera valet av repetitioner (om det behövs).
      OBS: Varje skanning laddas med en standardhastighet på ljudet på -90, som bör justeras av användaren. Ljudets hastighet kan också justeras automatiskt med en autofokusfunktion (AF).
5. Tryck på knappen Rekonstruera skanningar högst upp på skärmen för att gå vidare till skanningsrekonstruktion. En tillfällig instrumentpanel visas med meddelandet Jobbbearbetning. Den här panelen kan också nås från menyn > bearbetningsstatus. Efter avslutad rekonstruktion måste bildefterbehandlingsanalysen gå vidare till Fluence Correction.
6. Aktivera Fluence Correction av rekonstruerade bilder i instrumentpanelens meny. Rekonstruerade bilder måste laddas för fluenskorrigering. Dessa visas med en flagga bredvid varje skanningsnummer. Laddade filer visas omedelbart på höger sida av skärmen som valda rekonstruktioner. Aktivera fluenskorrigering genom att interagera med ikonen till höger på skärmen (kompletterande bild 3). Tryck på Save Fluence Correction(s) för att gå vidare.
7. När du har sparat fluenskorrigeringen, utför spektral blandning av den förvärvade förinställningen (Hb, HbO₂ och melanin). Välj fliken Spektral blandning för att öppna listan över valda rekonstruktioner för spektral blandning. En lista med varje skanning av den valda studien visas med historiken för de tidigare bildbehandlingsstegen.
8. Ladda de tidigare sparade fluencekorrigeringsfilerna. Laddade skanningar visas omedelbart på höger sida av skärmen som valda rekonstruktioner (kompletterande figur 4). Aktivera spektral blandning genom att trycka på ikonen till höger på skärmen.
   1. Observera våglängderna som ska vara oblandade. Alla sex optoakustiska emissionsvåglängder (700, 730, 760, 800, 850 och 900 nm) som tas in i rekonstruktionssteget (steg 3.4) väljs automatiskt för spektral blandning. Redigera önskade spektra som ska bearbetas (t.ex. Spectra: Hb, HbO₂ och melanin) med XYZ-ikonen , om det behövs.
   2. Efter att ha bekräftat de justerade parametrarna, klicka på Start Spectral Unmixing för att spektralblandningen ska gå vidare. En bearbetningsmenyrad visas som visar operationsförloppet.
      OBS: Olika parameterjusteringar är möjliga under spektral blandning, och flera blandningsmetoder finns tillgängliga. I detta protokoll används linjär regressionsmetod som standard för att blanda Hb, HbO₂ och melanin.
9. Öppna fliken Visualisering och analys . Klicka på en aktiverad skanning för att visa all ämnesinformation och kommentarer som introducerades i steg 1.1 (kompletterande figur 5).
   Flera skanningar kan visualiseras parallellt.
   1. Tryck på knappen + för att skapa en analys med flera genomsökningar. I det här fönstret introducerar du en flerskanningsvy och trycker på Spara-knappen . När du har sparat vynamnet visas en ny instrumentpanel, inklusive alla skanningar av studien som analyseras.
   2. Välj varje önskad genomsökning för att lägga till (var och en) i den sparade analysvyn. Lägg till ytterligare skanningar längst upp till vänster på ikonen så visas de automatiskt i analysvyn.
10. I analysvyn anger du rätt färguppslagstabeller för att förbereda bilden för analys. Klicka på Fler bildkontrollalternativ i den övre menyraden och aktivera ikonen Max intensitetsprojektion . Tilldela färger till lager genom att trycka på ikonen som är tillgänglig i det nedre högra hörnet av bildvisningen, intill 2D + bildvisning.
11. Välj Mer om du vill redigera färgerna på alla kanaler samtidigt. Den här menyn visar alla kromoforer oblandade och gör det möjligt att välja flera lager för visning.
    OBS: Om du flyttar musen över programvaruikonerna visas deras namn i grått som visas i protokollet.
12. Justera varje lagers färgintensitet med de verktyg som finns längst ned till vänster på skärmen.
    OBS: Justering med min/max interpolation för varje kanal ger generellt bra resultat.

4. Analys av intresseområden (ROI)

OBS: Valet av en region av intresse (ROI) är obligatoriskt för dataanalys.

1. Identifiera avkastningen som ska analyseras. Omge roi med de tillgängliga formerna (i menyraden) i XY-bilden samtidigt som du spårar samma avkastning inom de ortogonala vyerna som finns tillgängliga på XZ- och YZ-axeln (kompletterande figur 6).
   OBS: En polygonform användes för den aktuella ROI-analysen.
   1. Följ roi-formen på den återstående XZ- och YAZ-axeln (exempel i bild 2) medan du placerar flera polygonlager med funktionen Lägg till interpolera och ta bort underregioner . Data kan plottas efter att ha definierat / valt önskad ROI.
   2. Tryck på ikonen Importera region av intresse för kvantifiering och observera multispektrakomponenten som visas till höger på skärmen som en grafisk detalj av den valda avkastningen.
   3. Exportera ROI-data genom att trycka på Excel-ikonen längst ned i den grafiska vyn av ROI-data. Hela datapaketet från alla regioner exporteras som ett paket till ett kalkylblad för efterföljande analys. Figur 3 visar data från en deltagare som underkastade sig en tryckmanschett uppblåst till 200 mmHg och vaskulatur analyserades i jämförelse med vaskulatur vilotillstånd vid 0 mmHg.
2. Kvantifiera flera ROI-objekt samtidigt genom att följa steg 4.1-4.1.3.
3. Exportera bilder från samma meny som TIFF-filer med alla inbäddade data och inbyggd ROI-kontur (bild 2).

Representative Results

Data från optoakustisk avbildning kan analyseras i efterbehandlade exportbilder (figur 2) och plottade data (figur 3). Syftet här var att introducera driften av optoakustisk funktionell avbildning och att utforska dess tillämpning i mer allmänt känd vaskulär forskning. För det jämförde vi bilder som förvärvats under vila och efter en 200 mmHg ocklusion av en större tillförselartär (figur 2). Dessa observationer kan kvantifieras efter ROI-analys och export. I XY-planet kan den högre signalen av melanin jämfört med plan YZ och XZ observeras, vilket indikerar epidermisgränsen. Ocklusionen av brachialartären (armen) provocerar en del stasis i kärlen före OT-sondplaceringen (ventral underarm). Följaktligen upptäckte vi en ökning av de totala signalerna som visas som en ökning av blått (Hb) och rött (HbO₂) vid axlarna XY, YZ och XZ. Stasis kan följas i XY-planet medan du håller 200 mmHg-trycket i manschetten. YZ- och XZ-axlar visar ökad blodvolym på grund av ocklusionen ovan jämfört med de normala perfusionsförhållandena (ingen ocklusion), markerad av de magentamaskerade områdena.

Exporterad ROI-analys av samma mikrovaskulaturområde kvantifierar kromoforerna HbO₂ (röd), Hb (blå) och HbT (rosa), mSO2 (djupröd) och melanin (gul) från stabiliserade bilder som samlats in över 8,6 s. Tryckfrisättningen detekteras omedelbart; Figur 3 visar utvecklingen efter ocklusion av Hb-,_HbO2- och HbT-återhämtning, medan den optoakustiska datautgången följer observationerna i figur 1. Programvaran beräknar syremättnad i blodet (mSO2) och HbT-värden från tillsatsen av godtyckliga signaler från Hb och HbO₂. Melaninkoncentrationen förblir konstant inom 200 mmHg ocklusion och vid vilotillståndet inom tidsintervallet för bildförvärv.

Figur 1: Schematiskt diagram som representerar den flexibla armen som är utformad för att hålla mätsonden i stabiliserad kontakt med deltagarens hud. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Representativa optoakustiska bilder som markerar förändringar i kärlen i vila eller under tryck på 200 mmHg. Bilden som visas innehåller tre färger, som representerar Hb (blå), HbO₂ (röd) och melanin (gul), enligt beskrivningen i bildanalysen i avsnitt 4. Varje optoakustisk bild representerar en projektion med maximal intensitet av alla plan som är associerade med varje skannad kromofor. (A) XY-planet för det optoakustiska förvärvet. (B) YZ ortogonala vy av samma optoakustiska avbildade plats. (C) XZ-vyn av det skannade området. Magentapilarna pekar på områdena med ökad stasis; Det magentamaskerade området markerar den ökade volymen blod som fångas inuti kärl på grund av ocklusion av brachialartären jämfört med de normala perfusionsförhållandena (ingen ocklusion). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 3: Representativ dataexport av en kvantifierad avkastning. Naturliga kromoforer av HbO 2 (röd), Hb (blå) och HbT (rosa), mSO₂ (djupröd) och melanin (gul) avbildas från data extraherade från de stabiliserade bilderna som samlats in över 8,6 s. Graferna från Hb, HbO₂ och HbT visar en återhämtningslutning från ocklusion mot det icke-ockluderade vilotillståndet. Den beräknade blodsyresättningen_mSO2 och melaninkoncentrationen förblir konstanta inom 200 mmHg-ocklusionen och vid vilotillståndet inom tidsintervallet för bildförvärv. Bilder som extraheras är datapunkter som avbildas som medelvärde ± sd av n = 10 bilder per bildruta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Skanna översiktspanelen och huvudmenyn för analysprogramvaran. Genom att trycka på menyknappen (i svart) kommer huvudmenyn att släppa ner alternativ för att välja den valda studien. Den här åtgärden väljer och laddar filen ".nod" som känns igen av programvaran. Skanningsöversikten (i blått) visar alla studiens skanningar. Detaljer (svart) visas till höger. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Arbetsflöde för rekonstruktionsanalys. Panel 1 - Välj den skanning som ska rekonstrueras och tryck på högerpilen på höger sida av skärmen (lila pil) för att gå vidare. Panel 2 - Observera ljudets hastighet och justera skjutreglaget till bästa fokus (blå pil); a) justerat fokus som visas i fönstrets högra sida; b) välja repetitioner som ska analyseras (gul pil); c) tryck på knappen Rekonstruera skanningar för att fortsätta (grön pil). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande bild 3: Arbetsflöde för fluenskorrigeringspanelen. Panel 1 - Välj skanningar som ska korrigeras och tryck på högerpilen till höger på skärmen. Panel 2 - tryck på Spara fluenskorrigering (er) för att fortsätta (grön pil). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Arbetsflöde för uppblandningspanel för spektra. Panel 1 - Välj skanningar för att blanda upp och tryck på högerpilen (lila pil). Panel 2 a) välj skanningen för att blanda upp (blå pil) och en förhandsgranskning av den justerade bilden visas på höger sida; b) Välj de repetitioner som ska blandas (gul pil); c) tryck på Starta spektral blandning för att fortsätta (grön pil). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Visualiseringspanel och val av kromoforfärger. Panel 1) Välj skanningar som ska visas med ett dubbelklick (lila pil); Panel 2) Förvärvad bild i axel XY (blå fyrkant), XZ (gul fyrkant) och YZ (grön fyrkant); 2a) Bildanalysknapp som visar förvärvade våglängder; 2b) välj Fler bildkontrollalternativ i den övre menyraden och aktivera ikonen Max intensitetsprojektion ; välj Mer för att redigera kanalernas färger. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: Val av intresseregion (ROI). Välj lassoverktyget (gul pil) och definiera gränserna för avkastningen på investeringen inom XY-axeln (magentapilen). Det är möjligt att definiera olika formområden (polygon, rektangel, kvadrat, cirkel eller elips). Följ ROI i XZ- och YZ-axeln och lägg till underregioner (grön pil) till det första valet. Flera underregioner visas (cyanpil). För att extrahera data från den valda avkastningen, tryck på ikonen Importera region av intresse för att kvantifiera och fortsätt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta protokoll betonar de arbetssteg som betraktas som praktiska krav för att använda detta nya optoakustiska bildinstrument, från adekvat positionering (deltagare, sond) som behövs för 3D-koppsondstabilisering till bildförvärv, ROI-val och bildrekonstruktion och analys.

Det föreslagna experimentella tillvägagångssättet, med hjälp av "momentana" förvärv tillsammans med bilder som erhållits under dynamiska förhållanden, illustrerar intresset och nyttan av detta instrument för att få tillgång till in vivo mänsklig vaskulär fysiologi. Som visat är den akustiska bildupplösningen på 150 μm som samlats in i en volym på upp till 15 mm³ oöverträffad av andra tomografitekniker.

Särskild uppmärksamhet är nödvändig när det gäller (i) betydelsen av sondstabilisering för bildförvärv; Användningen av en flexibel, säker sondhållare förbättrar tydligt bildförvärvet. ii) korrekt identifiering av kärlstrukturerna, Sonografiska referenser såsom melanin i epidermal-dermal övergång kan användas som en markör för att identifiera de övre plexuskärlen i huden; och (iii) den funktionella bildanalysen som utförs via tillverkarens rekonstruktionsprogramvara.

Avancerad analys av ROI-data och bildexport kräver en djupare förståelse av den dedikerade programvaran och de utvecklade algoritmerna. Det nuvarande optoakustiska bildinstrumentet kan rekonstruera en 3D-volym på 15 mm³ vävnad med en upplösning på 150 μm. Denna kapacitet bör förstärkas för att bättre kvantifiera mikrovaskulär funktion (er) på djupet. Ändå möjliggör den grundläggande operationen direkt observation av referenskromoforer och förvärv av flera förinställningar från samma område, vilket ger snabb skanning och livevideoinspelningar.

Den tillämpbarhetspotential som finns med det optoakustiska bildsystemet är relevant. Pågående mjukvaruutveckling kommer säkert att förbättra nyttan av detta bildsystem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cuff	PIC	107001
Drapes	Pajunk	021151-1501
Ethanol 70%	Sigma Aldrich	EX0281
Gogless	Univet	559G.00.00.201
Kimwipes	Amoos	5601856202331.00
MSOT	iThera	MSOTAcuity
Stabilizing arm	ITEM		Self designed and assemble
Ultrasound gel	Parker Laboratories	308
Waxing cream	Veet	kkdg08hagd