Summary
이 프로토콜에서는 심폐 우회술 없이 왼쪽 흉벽의 작은 절개를 통해 새로운 돼지 정맥 우회술을 시행했습니다. 수술 후 병리학 연구가 수행되어 내막이 두꺼워지는 것으로 나타났습니다.
Abstract
정맥 이식 질환(VGD)은 관상동맥우회술(CABG) 실패의 주요 원인입니다. CABG-VGD의 대형 동물 모델은 질병 메커니즘의 조사 및 치료 전략의 개발에 필요합니다.
수술을 수행하기 위해 세 번째 늑간 공간을 통해 심실로 들어가 내부 유방 정맥을 조심스럽게 해부하고 생리 식염수에 담그십시오. 그런 다음 오른쪽 주요 관상 동맥을 허혈로 치료합니다. 표적 혈관을 절개하고, 션트 플러그를 배치하고, 이식 정맥의 말단부를 문합합니다. 상행 대동맥이 부분적으로 막히고 이식 정맥의 근위 끝이 천공 후 문합됩니다. 이식편 정맥의 개통을 확인하고 근위 우측 관상동맥을 결찰합니다.
CABG 수술은 혈관 이식편으로 사용하기 위해 왼쪽 내부 유방 정맥을 적출하기 위해 미니피그에서 수행됩니다. 혈청 생화학 검사는 수술 후 동물의 생리적 상태를 평가하는 데 사용됩니다. 초음파 검사는 이식 혈관의 근위부, 중간 및 말단부가 막히지 않았음을 보여줍니다. 수술 모델에서, CABG 수술 후 조직학적 검사에서 이식편 내의 난류 혈류가 관찰되고, 내막 증식과 관련된 정맥 이식편 협착증이 이식편에서 관찰된다. 여기에서 연구는 반복 가능한 CABG 유도 VGD 모델을 구축하기 위한 자세한 수술 절차를 제공합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안 관상 동맥 심장 질환 사망률이 크게 감소했지만, 미국 중년 성인의 절반이 매년 허혈성 심장 관련 증상을 나타내며 노인의 1/3이 관상 동맥 심장 질환으로 사망합니다1. 관상동맥우회술(CABG)은 심근 허혈을 개선하는 효과적인 수술 방식이며, 더 중요한 것은 다혈관 관상동맥 질환 치료를 위한 대체할 수 없는 수술 방식입니다2. 그러나 시간이 지남에 따라 혈관 이식편은 염증, 내막 증식 및 진행성 죽상동맥경화증을 일으켜 정맥 이식 실패 또는 정맥 이식 질환(VGD)을 유발하는 것으로 알려져 있습니다3. CABG 후 환자에서 재협착이 발생하면 경우에 따라 병든 혈관만 교체할 수 있다2. 고령 환자와 추가된 동반 질환으로 인해 관상동맥 우회술을 다시 하는 것이 상당히 어렵습니다. 이식된 혈관과 관련된 병리학적 문제를 지연시키거나 조절하는 것은 해결해야 할 시급한 문제이다. CABG-VGD의 대형 동물 모델은 질병 메커니즘의 조사 및 치료 전략의 개발에 필요합니다. 연구자들은 생쥐4, 쥐5, 토끼6, 돼지7과 같은 크고 작은 동물에서 동물 VGD 모델을 성공적으로 확립했다. 작은 동물에 비해 돼지와 같은 큰 동물은 인간과 유사한 해부학적 구조와 생리학적 특성을 가지고 있으며 수명이 더 깁니다 8,9. 따라서 대형 동물은 정맥 이식편 질환의 장기적인 병리학 적 변화를 탐구하고 약물 또는 장치의 전임상 시험에 더 적합합니다. 우리와 우리의 협력 팀은 돼지 심부전 모델을 확립하기 위해 수술 기법을 성공적으로 적용했으며 이 모델의 심장 병리학적 변화를 설명했습니다10.
CABG 수술은 임상에서 표준화되어 있지만, VGD 동물 모델 구축에 적용하면 종 간의 차이, 동물 장비 및 시설 확보, 동물 외과 수술, 동물 급여 및 간호 등이 연구자에게 큰 과제입니다. 임상 실습에서와 같이, VGD 동물 모델을 확립하기 위해 사용되는 CABG 수술에 대한 접근법은 정중선 흉골 절개술11 및 좌측 측면 개흉술12을 포함한다. 정중선 흉골 절개술이 더 일반적으로 사용됩니다13,14. 그러나 이 접근 방식은 인간과 동물 모두에게 높은 위험을 초래합니다. Thankam et al.이 보고한 연구에서 모델링에 사용된 돼지 6마리 중 2마리가 수술 중 사망했습니다15. 모델 사망률이 높으면 연구 비용이 증가하고 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. 한 연구에 따르면 돼지11에서 CABG 유발 VGD를 확립하기 위해 왼쪽 흉벽 절개가 가능하다는 것이 밝혀졌습니다. 여기에서 본 연구는 미니피그에서 CABG 유도 VGD 모델에 대한 재현 가능한 수술을 확립하고 이 모델의 표현형을 평가하기 위한 단계별 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 합니다. 실험 프로토콜은 심장 수술 및 마취 팀이 공동으로 설계했습니다. 왼쪽 제3늑간공간에 대한 수술적 접근은 수술 전 실험실에 있는 다른 미니피그의 사체에 따라 결정하였으며, 마취법은 중앙에서 사용한 방법에 따라 수행하였다(16). 동물모델을 평가하기 위해 혈액생화학적 검사, 초음파 검사, 조직검사 등을 실시하였다.
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Protocol
실험실 동물의 관리 및 사용 절차는 광동 실험실 동물 모니터링 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, USA)에 따라 수행하였다. 수술 절차는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 동물의 수술 전 준비
- 체중이 30-35kg인 3개월 된 수컷 미니돼지 10마리를 가짜 그룹(n = 5)과 VGD 그룹(n = 5)으로 무작위로 나눕니다.
- 체질량 지수(BMI)를 사용하여 돼지의 수술 전후 건강 상태를 평가합니다. 다음과 같이 BMI를 계산합니다.
BMI = 체중(kg)/(몸길이[cm] ×몸길이[cm])
참고: 몸 길이는 돼지의 코에서 꼬리 기저부까지 측정됩니다. - 마취 후 흡인을 피하기 위해 수술 전 12시간 동안 동물을 금식시킵니다. 마취기, 가스, 마취제, 마취관, 특수 후두경, 수술 도구, 갈비뼈 리테이너, 봉합사, 갑상선 견인기, 수술용 겸자 등을 포함한 마취기구 및 수술 기구를 준비합니다. 수술에 사용할 모든 기구를 소독하십시오.
2. 수술을 위한 동물 준비
- 동물의 무게를 측정하고 마취 용량을 계산하십시오. 2mg/kg의 1:1 틸레타민 및 졸라제팜, 0.2mg/kg 디아제팜 및 0.02mg/kg의 아트로핀으로 구성된 마취 혼합물을 근육내 투여합니다17. 수술 중 통증 완화를 위해 펜타닐(50mg/kg)을 사용하십시오30.
- 적절한 마취면이 이루어졌는지 확인하고 유치 정맥 카테터(20G)를 가장자리 귀 정맥에 삽입하여 귀에 접근합니다. 돼지를 수술대 위로 옮기고 앙와위 자세로 놓습니다. 붕대로 팔다리를 고정시키고 멸균 드레이프로 머리를 들어 올리십시오.
참고: 마취 상태는 안구의 중앙 고정, 동공 축소, 동공 반사 상실 및 통증 반사 상실로 모니터링되었습니다. 심박수 및 혈압은 기준선보다 낮은 수준으로 유지되었다. 외과의는 마비 상태에서 HR, BP 및 기타 매개변수를 모니터링하고 HR이 기준선보다 20% > 증가하면 마취 용량을 늘려야 합니다. - 수의학 후두경을 사용하여 후두개와 성문을 노출시킵니다. 7.0-7.5Fr 튜브로 기관 삽관을 수행하고 마취 호흡 회로에 연결하십시오.
참고: 인공호흡기는 일회 호흡량 280mL, 흡기/호기 비율 1:2, 호흡수 20회/분, 호기말 양압(5cm H2O)의 연속 양압 환기에 사용됩니다. - 브롬화 베쿠로늄(0.1mg/kg)을 정맥 주사하여 수술 중 근육을 이완시키고 2% 이소플루란을 사용하여 호흡수 16-20bpm, 일회 호흡량 10mL/kg으로 마취를 유지합니다.
참고: Vecuronium은 마비된 동물에서 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 제공되며, 특히 유도 약물과 이소플루란의 용량이 권장량의 하단에 있기 때문에 더욱 그렇습니다. - 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 돼지의 눈에 수의사 연고를 사용하십시오. 전기 담요를 사용하여 돼지의 체온을 38 °C ± 5 °C로 유지하십시오.
- 심전도를 사용하여 심박수, 혈중 산소 수치 및 체온을 모니터링합니다.
3. 수술 절차
- 왼쪽 흉벽을 면도하고 0.7% 요오드와 75% 알코올을 번갈아 가며 3회 도포하여 수술 부위를 왼쪽 하악 각도까지, 탯줄까지, 왼쪽에서 후방 겨드랑이 라인까지, 오른쪽에서 겨드랑이 앞까지 무균 상태로 준비합니다. 수술 부위 주위에 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다.
- 세 번째 왼쪽 늑간 공간에 전기 칼로 7-10cm 가로 절개를하고 피하 조직을 층별로 분리합니다 (그림 2A). 뼈 가위로 세 번째 갈비뼈의 5-6cm 부분을 제거하고 세 번째 갈비뼈-흉골 관절을 노출시킨 후 견인기로 내부 유방 정맥을 노출시킵니다(그림 2B).
- 흉골 왼쪽의 왼쪽 내유선과 함께 내정맥을 찾습니다. 혈관 겸자로 내부 유방 정맥의 무딘 절제술을 수행하십시오.
- 전기 나이프로 왼쪽 내부 유방 정맥의 가지를 전기 응고시켜 지혈을 수행하십시오. 지혈이 불완전한 경우 지혈을 위해 면사 결찰을 사용하십시오. 채취하는 동안 정맥의 두 끝을 Ligate하고 표시합니다(그림 2C).
- 헤파린 나트륨 용액 2mL와 생리식염수 98mL를 첨가하여 헤파린 생리식염수를 준비합니다. 정맥을 제거한 후 전처리를 위해 헤파린 생리 식염수를 정맥에 주입합니다(그림 2D). 그런 다음 정맥을 생리 식염수에 넣고 백업을 위해 보관하십시오.
- 위에서 설명한 것과 유사한 절개를하고 가짜 그룹의 내부 유방 정맥을 제거하십시오. 심낭을 열고 가짜 그룹의 흉벽을 닫습니다. 관상 동맥 우회술없이 병리학 적 조절을 위해 가짜 그룹의 내부 유방 정맥을 사용하십시오.
- 오른쪽 관상 동맥 줄기를 노출시키기 위해 심낭에 전기 칼로 ~ 7cm 절개를합니다. 심낭을 매달고 1-0 수술 봉합사로 동측 피부에 봉합합니다(그림 2E). 오른쪽 관상 동맥 트렁크를 주변 조직과 분리합니다 (그림 2E).
- 와이어 후크로 대동맥 근처의 고립된 우측 관상동맥의 근위 말단 아래에 있는 차단 밴드를 우회하고 차단 밴드를 조이고 이완하여 2분 허혈 및 5분 재관류의 3주기로 심근을 치료합니다(그림 2F). 허혈/재관류 전처리 동안 심전도 모니터로 심장의 전기적 활동을 모니터링합니다(그림 2G).
참고: 오른쪽 관상동맥이 막히면 심전도에서 심박수와 ST 분절 상승이 증가합니다. - 밴드를 조여 올바른 관상 동맥 혈류를 차단합니다. 혈관을 덮고있는 심 외막을 자릅니다. 관상동맥벽을 노출시키고 수술용 칼날 끝으로 혈관 전벽 중앙을 세로로 자릅니다.
- 내강을 자른 후 가위로 절개 부위를 확대하고 관상 동맥 션트를 놓습니다. 코일이 있는 션트의 한쪽 끝을 파열을 통해 원위 관상동맥에 삽입합니다. 관상동맥의 혈액을 속이 빈 관상동맥 션트로 션트하여 명확한 수술 영역을 확보합니다(그림 2H).
- 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 내부 유방 정맥과 오른쪽 관상 동맥 줄기 사이에 종단 간 연속 봉합을 수행합니다(그림 2I). 상행 대동맥의 중간에서 상행 대동맥의 왼쪽 전외측 벽을 반 폐색 클램프로 폐색합니다.
- 수술용 칼날을 사용하여 외막이 절단된 대동맥 벽에 작은 절개를 하고, 이 절개를 통해 펀치의 헤드 엔드에 있는 슬라이딩 샤프트의 헤드 엔드를 대동맥강에 삽입하고, 슬라이딩 샤프트를 바깥쪽으로 수축시키고, 그 위의 원형 나이프는 동맥 벽의 일부를 잘라냅니다. 펀치에 의해 잘라낸 조직 블록은 직경이 약 3mm입니다(그림 2J).
- 션트를 당겨 빼냅니다. 6-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 내부 유방 정맥과 대동맥 벽 사이에 종단 간 연속 봉합을 수행합니다(그림 2K). 세미 오클루전 클램프를 엽니다.
- 초음파를 사용하여 문합 부위에 근접한 우측 관상 동맥 줄기의 우회 흐름을 기록합니다. 심전도를 사용하여 심장의 전기적 활동을 모니터링합니다(그림 2L).
- 임시 배액관(Fr: 16)을 흉강 내로 들여보내 혈액과 체액이 배출되도록 합니다. 1-0 면사를 사용하여 심낭 절개를 꿰매고 각 층에 페니실린 (약 0.5g) 분말을 넣으면서 가슴을 층별로 (안쪽에서 바깥쪽으로 : 흉막층, 근육층, 피하 조직층, 피부층) 닫습니다. 1-0 면사를 사용하여 피부 절개 부위를 꿰매 후 배액관을 제거합니다.
4. 수술 후 관리
- 동물이 자발 호흡으로 돌아온 후 기관 내 튜브를 제거하십시오. 마취과 의사는 동물의 활력(예: 호흡수, 심박수, 산소 포화도 등)을 평가하고 동물이 깨어나 자발적인 활동으로 돌아온 후 ECG를 제거해야 합니다. 동물들을 먹이실로 돌려보내고 가짜 동물들을 사육실의 다른 우리에 넣습니다. 전기 담요로 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 수술 후 매 시간마다 동물을 관찰하십시오 (적어도 4 회).
- 수술 다음날 동물에게 먹이를주십시오. 아스피린(200mg)을 동물 사료에 7일 동안 매일 2회 첨가하여 수술 후 혈전증을 예방하고 상처 통증을 줄입니다.
알림: 흡인을 방지하기 위해 수술 당일 동물에게 먹이를 주지 마십시오. - 수술 후 감염을 예방하기 위해 연속 7 일 동안 매일 1 회 페니실린을 근육 주사하여 동물에게 투여하십시오 (kg 당 14,000 단위).
5. 초음파 검사
- CABG 수술 후 멸균 초음파 프로브 슬리브를 사용하여 고주파 선형 어레이 프로브를 감쌉니다. 정맥 이식편 표면에 프로브를 놓습니다.
- 2차원 초음파 모드에서 이식편의 윤곽을 표시한 다음 컬러 도플러 모드로 전환하여 이식편의 혈류를 감지합니다.
6. 정맥 이식 조직 수집
- 생화학적 검사를 위해 귀 정맥의 정맥 회로에서 혈액 샘플 10mL를 수집합니다. (표 1). 혈액 샘플을 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 자동 생화학 분석기로 생화학적 테스트를 수행합니다.
- 앞에서 설명한대로 동물을 마취하십시오. 마취 깊이가 확인되면 귀 변연부 정맥 또는 앞다리 정맥에서 10% 염화칼륨 0.5mL/kg 체중을 주입합니다. 그런 다음 수술 30일 후 전기칼로 10cm 중앙값 흉골 절개를 하여 정맥 이식편을 채취합니다. 2.2 단계와 같이 신체 위치를 고정하고 멸균 및 드레이프 배치 후 흉골 중앙 절개를하여 흉골을 분할합니다. 분리하는 동안 주요 혈관과 심장을 피하고 이식 된 혈관을 층별로 분리하십시오.
- 심장에 연결된 큰 혈관을 빠르게 잘라내고 심장과 상행 대동맥을 얼음 조각 위에 놓고 이식편 혈관 다리, 연결된 대동맥 및 오른쪽 관상 동맥을 제거합니다. 모든 샘플을 4°C에서 생리식염수로 헹굽니다.
- 약 3-4cm 크기의 이식편 용기 전체를 취하여 4-5등분으로 나누고 냉동보존관으로 옮깁니다. 튜브를 액체 질소에 빠르게 넣어 급속 동결하고 보관을 위해 -80°C 초저온 냉동고로 이동합니다.
- 분석을 위해 얼음처럼 차가운 0.9 % 식염수로 이식편을 헹구고 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 고정하십시오. 조직 블록 크기 대 고정 용액의 비율을 1:10으로 유지하고 조직을 12시간 이상 고정합니다.
- 헤마톡실린 수용액 50mL에 절편을 3분 동안 염색합니다. 0.5% 염산 에탄올 50mL와 0.2% 암모니아수 50mL로 각각 10초 동안 세척하여 절편을 분리합니다.
- 흐르는 물로 1시간 동안 헹군 다음 증류수에 3분 동안 담가 세척합니다. 70 % 및 90 % 에탄올에서 각각 10 분 동안 탈수합니다. 0.5% 알코올 에오신 염색 용액 50 mL에 넣고 2-3분 동안 담가둡니다.
- 염색된 부분을 순수한 에탄올로 10분 동안 탈수한 다음 순수한 자일렌에 10분 동안 담가 샘플을 투명하게 만듭니다. 투명 부분을 중성 접착제로 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다. 40x 배율의 광학 현미경으로 병리학적 부분을 관찰합니다.
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Representative Results
BMI 및 혈청 생화학 지표
가짜 그룹과 VGD 그룹 간의 BMI는 유의하게 다르지 않았습니다(가짜 대 VGD, 22.05kg/cm2 ± 0.46kg/cm2 대 21.14kg/cm2 ± 0.39kg/cm2, p = 0.46). 혈청 생화학적 결과는 표 1에 열거되어 있다. 그룹 간 통계적으로 유의미한 변화는 아스파르테이트 아미노전이효소(AST, 가짜 대 VGD, 25.25 IU/L ± 1.88 IU/L 대 31.5 IU/L ± 2.58 IU/L), 혈청 빌리루빈(가짜 대 VGD, 2.5μmol/L ± 0.47μmol/L 대 4.5μmol/L ± 0.14μmol/L), 총 빌리루빈(가짜 대 VGD, 0.025μmol/L ± 0.14μmol/L 대 0.92μmol/L ± 0.33μmol/L), 및 크레아티닌(가짜 대 VGD, 92.75μmol/L ± 4.15μmol/L 대 141.75μmol/L ± 12.65μmol/L).
초음파 검사
가짜 (n = 5) 및 VGD 그룹 (n = 5)의 모든 동물은 생존했습니다. CABG의 수술 절차는 그림 1에 나와 있습니다. 평균 수술 시간은 105분 ± 25분(범위: 90-160분)이었고 평균 수술 중 출혈량은 85mL ± 35mL(범위: 50-200mL)였습니다. 작동 시간의 영향은 주로 작업자의 숙련도가 인간에서 돼지로 전환되는 것이며 특별한 의미는 없습니다. 절개 문합 후 기관 발관까지의 평균 기간은 17분 ± 5분(범위: 15-30분)이었습니다. 초음파 검사 결과 이식된 혈관의 혈액 공급은 정상 관상동맥에 비해 부분적인 역류가 있었고 전체 혈류 방향은 일반적으로 정상이었습니다(그림 3). 기흉, 압전, 감염 또는 기타 심각한 합병증은 수술 후 관찰되지 않았습니다. 수술 후 1개월 동안 가짜 그룹과 VGD 그룹 간에 체중이나 BMI에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다.
초음파 검사는 이식 혈관의 근위 끝 (그림 3A, B), 혈관강 (그림 3C, D) 및 말단 끝 (그림 3E, F)에서 수행되었습니다. 역행 흐름은 이식 혈관의 근위 및 말단부에서 관찰되었습니다. 그러나 혈액 유출은 관찰되지 않았습니다.
정맥의 병리학 적 변화
모든 정맥 이식편은 길이에 따라 3개의 세그먼트로 균등하게 나누어졌으며, 평가를 위해 각 세그먼트에서 하나의 섹션이 선택되었고, 관상동맥 협착증에 대한 수정된 프루딜릿 분류에 따라 분류되었다18. 3개 섹션의 평균값을 폐색 정도에 대한 결과로 채택했습니다. 구체적인 분류는 다음과 같다: 등급 I = 0점, 재협착 없이 정상; 등급 II = 1점, 경미한 협착증<30%; 등급 III = 2점, 30%에서 50% 사이의 협착; 등급 IV = 3점, 50%에서 90% 사이의 중증 협착증; 등급 V = 4점, 소계 폐색>90%; 및 등급 VI = 5점, 전체 폐색, 정맥 이식편으로의 혈류 없음. 정량화된 결과를 평가하기 위해 관상동맥 협착증에 대한 수정된 Proudilit 분류를 채택했습니다. 가짜 그룹의 결과는 0.00 ± 0.00으로 혈관 폐색이 없음을 나타내는 반면 CABG 그룹의 결과는 3.12 ± 1.22였습니다. 따라서 두 그룹 간에 차이가 유의하였다(p < 0.05, 표 2).
현미경으로 볼 때, 가짜 그룹에서, tunica intima, tunica media 및 venous graft의 정맥 벽은 정상으로 나타났다. VGD 그룹에서 정맥 이식편의 tunica intima 및 tunica medium은 CABG 수술 후 30일 후에 유의하게 두꺼워졌습니다. 튜니카 친밀감은 튜니카 미디어와 모호하게 구분되었습니다. 튜니카 미디어의 탄성층이 사라졌습니다(그림 4). 정맥 이식편의 내강은 과형성 조직으로 채워졌다(도 4). 용기 직경의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다.
그림 1: 절차 개요. (A-C) 수술 전: 미니피그의 무게를 측정하고, 제세동기와 인공호흡기의 성능을 확인하고, 인공호흡관을 연결한다. (D-F) 마취 : 미니 피그에 근육 내 마취 주사를 투여하고, 미니 피그를 수술대에 고정시키고, 기관 삽관을 위해기도를 완전히 노출시키고, 인공 호흡기를 연결하고, 흡입 마취를 사용하여 마취를 유지합니다. (지-아이) 수술 중: 미니피그의 심장 기능에 대한 수술 전 초음파 평가를 수행하고 왼쪽 흉벽 절개를 통해 관상동맥 우회술을 완료합니다. (J-L) 수술 후 : 상처를 문합하고 수술 후 관리와 미니 피그의 먹이에주의를 기울이십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술 절차. (A) 흉벽을 절단하고, (B) 내부 유방 정맥을 분리하고, (C) 내부 유방 정맥을 제거하고, (D) 헤파린 전처리를 수행하고, (E) 심낭을 현탁시키고, (F) 심근 허혈 재관류를 수행하고, (G) 심전도 변화를 모니터링하고, (H) 관상 동맥 혈류를 차단하고, (I) 이식 혈관의 근위 말단을 문합하고, (J ) 원위 관상동맥 문합 부위, (K) 관상동맥 원위 문합, (L) 완전한 관상동맥 우회술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 초음파 검사. 관상 동맥 우회술이 완료된 후, 이식 된 혈관의 혈류 개통은 초음파로 평가됩니다. (ᄀ,ᄃ,ᄂ) 정상적인 관상 동맥 혈류 영상. 지속적인 혈류 신호는 이식된 혈관의 (B) 근위부, (D) 중간 및 (F) 말단부에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 조직학적 분석 . (A) 정상적인 내부 유방 정맥 병리학적 섹션은 명확한 혈관 계층을 보였고 내강 협착증은 없었습니다. (나,씨) 관상 동맥 이식 30 일 후 내부 유방 정맥의 병리학은 혈관의 내막이 다양한 정도로 두꺼워지고 내강이 분명히 좁아지는 것으로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 지표 | 가짜 그룹(n=5) | 이식 그룹(n=5) |
| 알트(IU/L) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| AST(IU/L) | 25.25 ±1.88 | 31.5±2.58* |
| 총 단백질(IU/L) | 63.12 ±.138 | 60.17±1.91 |
| 알부민 (IU / L) | 32.25 ±0.77 | 23.77±5.61 |
| 글로불린(g/L) | 30.87 ±.136 | 36.4±6.03 |
| 혈청 빌리루빈(μmol/L) | 2.5 ±0.47 | 4.5±0.14* |
| 총 빌리루빈(μmol/L) | 0.025 ±0.14 | 0.92±0.33* |
| 알칼리성 포스파타제(IU/L) | 103 ±19.3 | 104±16.04 |
| 글루코사민 (mmol/L) | 4.44 ±0.36 | 5.96±0.42 |
| 요소 질소 (mmol / L) | 2.46 ±0.17 | 2.89±0.65 |
| 혈청 크레아티닌 μmol/L | 92.75 ±4.15 | 141.75±12.65* |
| 총 콜레스테롤(mmol/L) | 2.37 ±0.12 | 2.16±0.06 |
| 트리글리세리드(mmol/L) | 0.48 ±0.10 | 0.25±0.05 |
| 고밀도 지단백질 mmol/L | 1.05 ±0.07 | 1.03±0.07 |
| 초저밀도 지단백질(mmol/L) | 1.43 ±0.06 | 1.29±0.04 |
| 젖산 탈수소효소(mmol/L) | 384.75 ±26.8 | 478.25±49.58* |
표 1. 혈청 생화학 지표. 분석을 위해 통계 분석 소프트웨어를 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(n=5)로 표시하였다. 측정 데이터의 비교는 스튜던트 t-검정으로 분석하였다. p-값이 0.05보다 작으면 통계적 유의성을 나타냅니다. *p < 0.05, CABG 대 가짜.
| Proudilit 분류 | ||||||
| S. 샘플 번호 | CABG 수술 직후 점수 | CABG 수술 후 30일 점수 | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
표 2. 수술 직후와 수술 후 30일의 이식편 폐색 정도에 대한 통계적 결과. 수정된 Proudilit 분류 척도는 혈관 폐색 정도에 사용되었습니다: 등급 I = 0점, 재협착 없이 정상; 등급 II = 1점, 경미한 협착증<30%; 등급 III = 2점, 30%에서 50% 사이의 협착; 등급 IV = 3점, 50%에서 90% 사이의 중증 협착증; 등급 V = 4점, 소계 폐색>90%; 및 등급 VI = 5점, 전체 폐색, 정맥 이식편으로의 혈류 없음. 데이터에는 길이에 따라 3개의 섹션으로 균등하게 분할된 5개의 정맥 이식 결과가 포함됩니다.
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Discussion
본 연구에서는 CABG 유도 VGD 모델 개발 시 동물 선택, 기구 준비, 수술 절차, 수술 후 평가에 대한 프로토콜을 자세히 설명했습니다. CABG 수술 전후의 정맥 이식편에 대한 초음파 검사와 수술 후 30일 후에 이식편의 조직학적 검사를 시행하였다. 내부 유방 정맥의 혈류는 CABG 수술 전에 정상이었고, 내부 유방 정맥의 이식편에서는 역행 흐름이 관찰되었습니다. 가짜 수술군과 비교했을 때, 수술군 동물의 간과 신장 기능은 어느 정도 손상되었다. 관상동맥 이식편 질환의 발생을 고려할 때, 심근 수축력의 약화는 말초 조직의 불충분한 관류를 초래하였다. 정맥 이식편은 CABG 수술 후 30일 후에 내막 증식과 혈관 리모델링을 보였다(그림 4). 혈관 주위의 섬유성 변화는 상처 치유와 관련이 있고, 섬유아세포 증식은 상처 치유 초기에 1일째 내지 3일째에 일어나며, 활성 I형 콜라겐 및 피브로넥틴의 생성은 4일째 내지 6일째에 발생하고, 세포질 α-SM 액틴 피브릴 응집은 7일째 내지 14일째에 발생한다(19). 응력 섬유는 상처 수축과 일치하는 근섬유아세포의 형성을 의미한다20. 혈관주위 섬유증이 수술 결과에 영향을 미치는지 여부는 불분명합니다.
여기서는 미니피그를 선택하여 정맥이식 질환 모델을 구축하였다. VGD21의 병리학적 기전을 연구하기 위해 쥐와 같은 작은 동물이 사용되어 왔지만, 돼지는 크기, 해부학적 구조 및 생리학적으로 인간과 유사하므로 인간 심장 질환의 발병기전을 연구하거나 장치 개발을 위한 도구로 더 적합하다22. 내부 유방 정맥은 또한 종종 임상적으로 이식편으로 선택됩니다. 두 개의 독립적인 그룹의 임상 연구에서 내부 유방 정맥 이식편이 정맥 이식편 병변의 발생률이 높은 특성을 가지고 있으며 우리 연구에서도 동일한 병리학적 변화가 관찰되었습니다(그림 4)23,24. 임상 실습에서와 마찬가지로 동물 수술에서 적절한 외과적 접근법을 선택하는 것은 수술의 성공에 매우 중요합니다. 여기서 우리는 Hocum의 왼쪽 개흉술11을 언급했습니다. 우리는 왼쪽 개흉술이 수술 부위를 명확하게 노출시킬 수 있고 절개 부위 주변의 해부학적 구조를 식별하기 쉽고 출혈량이 적다는 것을 발견했습니다. 또한 중앙 개흉술에 비해 외측 개흉술은 흉골 절단이 필요하지 않아 수술 스트레스를 줄일 수 있습니다.
마취는 수술 모델의 성공에 매우 중요합니다. 이 연구에서는 Kotani 등에서 프로토콜을 수정하여 마취 유도로 사용되는 케타민과 디아제팜의 조합과 유지 마취로 이소플루란 흡입을 사용했습니다25. 또한, 한 연구 그룹은 정맥 주사 약물이 유지 마취에도 적합하다는 것을 보여주었다26. 돼지의 기관내 삽관은 동물 수술팀에게 어려울 수 있습니다. 인간의 기도와 비교했을 때, 돼지의 기관 해부학적 구조는 성문의 노출을 어렵게 만든다27. 여기에서는 성문을 더 잘 노출시키기 위해 돼지의 위턱을 눌러 돼지의 성문을 노출시켰습니다(그림 1D). 반면에, 직접 후두경 검사 또는 광섬유 기관지경 검사를 사용하면 기관내 삽관에서 성문을 시각화하는 데 도움이 된다28.
정맥 이식 질환의 병리학 적 상태는 주로 3 단계로 나뉩니다 : 1) 급성기 (1 개월 이내) 혈전증; 2) 아 급성기 (1-12 개월) 내막 증식증; 3) 이식편 협착 및 폐색의 원인인 죽상동맥경화증의 말기(12개월 이상) 형성29. VGD의 급성기 변화의 대부분은 수술 요인과 관련이 있으며, 말기에 형성된 죽상 동맥 경화증은 돌이킬 수 없습니다. 아급성 자궁내막 비후의 연구는 VGD의 발병기전, 치료 및 예방에 매우 중요합니다. 선택한 이식편이 대복재정맥의 수직 혈관과 다른 것도 중요합니다. 내부 유방 정맥은 일반적으로 정수압이 적고 이식 후 병리학 적 변화가 대 복재 정맥보다 빠릅니다. 우리 모델에서, 이식된 혈관의 내강을 막는 전형적인 내막 증식이 수술 후 30일째 조직학적 검사에서 나타났고, 다른 임상 연구에서도 동일한 병리학적 변화가 관찰되었다23,24. 미니피그에서 내부 유방 정맥을 선별한 모델링 결과는 표현형이 안정적이고 모델링 시간이 짧으며 VGD의 병리학적 변화 감소 정도가 높아 후속 연구 개발에 도움이 됩니다.
이 모델에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 대형 동물 모델링 과정, 수술 중 동물 활력 징후 모니터링 및 수술 후 소생술의 일부 미세 작업에는 모두 특정 실제 경험이 필요하므로 전문 외과의와 마취과 의사가 훈련을 안내하고 동물의 우발적 사망률을 크게 줄여야 합니다. 대형 동물 수술은 특정 실험 장소, 전문 인력 및 충분한 재정 지원이 필요하며 이는 소규모 연구소에 더 큰 부담이 될 수 있습니다.
결론적으로, 전문가의지도하에 잘 갖추어 진 실험실은 VGD 치료에 매우 중요한이 minipig VGD 모델을 구축함으로써 VGD의 병리학 적 변화를 추가로 연구 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원, 동물 관리 및 샘플 수집에 대해 Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute에 감사드립니다. 그들은 또한 초음파 검사에 대한 기술 지원을 위해 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd에 감사드립니다. 이 작업은 중국 광동 과학 기술 프로그램과 지난 대학 중앙 대학 기초 과학 연구 사업 비용 프로젝트 (2017A020215076, 2008A08003 및 21621409)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
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