허혈 재관류 연구를 위한 좌전하행 관상동맥 결찰술: 기술적 수정 및 품질 관리를 통한 모델 개선

Summary

여기에서 우리는 급성 심근 허혈 재관류 연구를 위해 쥐의 전통적인 절차를 기술적으로 수정하여 좌전하행 관상동맥 결찰술의 품질 관리에 초점을 맞춘 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

관상 동맥 심장 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 관상동맥의 혈류가 완전히 중단되면 ST 분절 상승 심근경색증(STEMI)이 발생하여 높은 사망률과 관련된 심인성 쇼크 및 치명적인 부정맥이 발생합니다. 관상동맥 재개통을 위한 1차 관상동맥 중재술(PCI)은 STEMI의 결과를 크게 개선하지만, Door-to-balloon 시간을 단축하는 발전은 병원 내 사망률을 줄이는 데 실패하여 추가적인 치료 전략이 필요함을 시사합니다. 쥐의 좌전하행 관상동맥(LAD) 결찰은 PCI를 통한 신속한 관상동맥 재개통이 STEMI에 사용되는 임상 시나리오와 유사한 급성 심근 IR 연구를 위한 동물 모델입니다. 그러나 PCI 유발 STEMI는 높은 사망률과 경색 크기의 큰 변화와 관련된 기술적으로 어렵고 복잡한 수술입니다. 우리는 LAD 결찰을 위한 이상적인 위치를 식별하고, 올가미 루프를 제어하는 장치를 만들고, 수정된 수술 조작을 지원하여 조직 손상을 줄여 쥐를 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 급성 심근 허혈 재관류(IR) 연구 프로토콜을 수립했습니다. 이것은 비 생존 수술입니다. 우리는 또한 후속 생화학 분석의 정확성을 결정하기 위한 중요한 단계인 연구 결과의 품질을 검증하는 방법을 제안합니다.

Introduction

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다 ^1,2. 관상 동맥 심장 질환의 발병을 예방하기 위한 수정 가능한 위험 인자의 통제 외에도 급성 관상 동맥 증후군 ^3,4에 대한 치료 전략이 결정적으로 필요합니다. 급성 ST-분절 상승 심근경색증(STEMI)에서 심인성 쇼크 및 치명적인 부정맥은 병원 내 사망률의 가능성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 5,6,7,8. 1차 경피적 관상동맥 중재술(PCI)은 STEMI ^9,10,11에 선호되는 치료법입니다. 그러나, 치료 효과는 door-to-balloon 시간이 <90분일 때 상한선이 있다^12,13. 질환의 임상 결과를 추가로 개선하기 위한 추가적인 전략이 필요하다 14,15,16,17,18,19.

쥐의 좌전하행동맥(LAD) 결찰을 포함하는 급성 심근 허혈-재관류(IR) 실험은 STEMI 환자가 허혈성 손상으로부터 심장을 구출하기 위해 짧은 door-to-balloon 시간이 필요한 임상 시나리오에 필적하는 동물 모델 중 하나입니다. 그러나 작은 동물에서 수술로 인한 STEMI는 높은 사망률과 경색 크기^{20,21,22,23,24}의 높은 변화와 관련된 복잡한 수술이기 때문에 기술적으로 어려운 경우가 많습니다. 기술적 과제를 극복하기 위해 본 연구는 기술적 수정을 통해 신뢰할 수 있고 재현 가능한 급성 심근 IR 연구 프로토콜을 확립하기 위해 쥐(쥐보다 크기 때문에)에서 포괄적이고 효과적인 동물 모델을 개발했습니다. 제안된 프로토콜은 수술 합병증이 적고 조직 손상이 적으며 수술 중 사망 가능성이 적습니다. 또한 경색 크기와 위험 영역(AAR)을 측정하여 연구 결과의 품질을 검증하는 절차가 사용되었습니다. 제안된 프로토콜은 손상에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 급성 심근 IR 스트레스의 병태생리학적 과정을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 실험은 미국 국립 보건원에 의해 발행된 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH 간행물 번호 85-23, 1996년 개정판)에 따라 수행되었다. 연구 프로토콜은 Fu-Jen Catholic University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 승인되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 식염수 습식 면봉의 준비
   1. 수술 용 마스크와 장갑을 착용하십시오.
   2. 멸균 된 면화의 작은 부분을 꼬집고 굴려서 공 모양을 만듭니다. 이 절차를 반복합니다.
   3. 면봉을 멸균 0.9 % 식염수에 담그고 여분의 식염수를 짠다.
   4. 면봉은 75% 에탄올로 멸균된 깨끗한 상자에 보관하십시오.
2. 홀딩 후크 준비.
   1. 수술 용 마스크와 장갑을 착용하십시오.
   2. 클립과 고무 밴드를 75 % 에탄올로 소독하십시오.
   3. 클립을 가슴 벽과 조직의 고리 모양으로 구부립니다.
   4. 구부러진 클립을 1개, 2개 또는 3개의 고무 밴드로 연결하여 수술 창의 상처로 인한 장력이 LAD 결찰에 충분히 넓은지 확인합니다.
   5. 75 % 에탄올로 멸균 된 깨끗한 상자에 최소 5 개의 수제 후크를 준비하고 보관하십시오.
3. 결찰 루프의 준비.
   1. 7-0 실크 스티치의 중간을 테이퍼 형 비 스웨이지 수술 바늘의 1/2 원 크기 3 스프링 눈에 놓습니다.
4. 스네어 루프 제어기 준비
   1. 가위를 사용하여 5mm 폴리에틸렌(PE)-10 튜브를 자릅니다.
   2. 튜브를 화염으로 가열하고 부드럽게 하여 양쪽 가장자리를 매끄럽게 합니다.
5. 쥐 준비
   1. 최소 무게가 250g인 8주 된 Sprague-Dawley 수컷 쥐를 선택하십시오.
   2. 음식, 표준 마우스 알갱이 및 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있는 제어된 온도(21°C ± 2°C)에서 12시간의 명암 주기 하에 쥐를 수용하고 유지합니다.
   3. 쥐를 펜토바르비탈(50mg/kg, 복강내 투여)로 마취합니다.
      참고: 추가 마취제(펜토바르비탈, 30mg/kg)는 매시간 투여해야 합니다.
   4. 꼬리와 뒷발을 꼬집어 쥐의 반사 신경을 확인하여 동물이 충분히 마취되었는지 확인하십시오.
   5. 가위를 사용하여 성문 아래의 두 카트리지 링 사이의 조직을 열고 기관내 튜브²⁵ 역할을 하도록 3cm PE-10 튜브를 삽입합니다.
   6. 기관내관을 인공호흡기에 수동으로 연결합니다.
   7. 폐가 적절하게 환기되는지 확인하기 위해 호흡 주기와 동기화된 동물의 흉부 움직임을 검사합니다.
   8. 목 부위를 열고 경정맥을 캐뉼라⁽²⁶)로 만듭니다.

2. LAD 결찰

1. 수술 용 마스크와 장갑을 착용하십시오.
2. 가슴을 만지고 manubrium과 흉골 각도 (manubrium과 흉골 몸체의 교차점)를 찾으십시오.
3. 흉골 각도(늑골 A)와 연결되는 왼쪽 늑골을 수동으로 터치하여 식별합니다.
4. 갈비뼈 A 바로 아래의 늑간 공간을 확인하십시오. 미세한 집게를 사용하여 늑간 공간 가까이에서 피부를 부드럽게 들어 올린 다음 칼날이 달린 수술용 메스를 사용하여 흉골체의 왼쪽으로 약 5mm 지점에서 피부 장력선을 따라 1cm 비스듬한 절개를 만듭니다.
5. 구부러진 집게를 사용하여 절개 부위에서 피부와 근육층을 부드럽게 분리합니다. 왼쪽 전방 흉벽 바깥쪽의 근육층을 구부러진 클립으로 아래쪽으로 걸어 갈비뼈를 아래에 노출시킵니다.
6. 갈비뼈 A(갈비뼈 B) 아래의 갈비뼈를 식별합니다. 갈비뼈 연골 중앙에서 뭉툭한 가위로 갈비뼈 B를 자릅니다 (흉골 몸체에서 약 2-3mm). 출혈이 발생하면 식염수 젖은 면봉으로 상처를 몇 초 동안 부드럽게 만지고 압축하십시오.
7. 4 개의 구부러진 클립으로 갈비뼈 B의 절단에서 흉부를 조심스럽게 엽니 다. 구부러진 각 클립은 늑간 근육과 갈비뼈를 연결하여 흉벽을 네 방향(즉, 위, 왼쪽, 오른쪽, 왼쪽, 오른쪽)으로 부드럽게 펼치고 직사각형 수술 창을 만들어야 합니다.
8. 시술 중 우발적인 조직 손상을 방지하기 위해 다른 구부러진 클립으로 심낭을 덮고 있는 왼쪽 폐 및 기타 인접 조직에 부드럽게 연결합니다.
9. 집게로 얇은 심낭을 부드럽게 제거하여 심장을 노출시킵니다. 일반적으로 폐동맥과 왼쪽 귓바퀴 사이에 있는 왼쪽 주관동맥(LMCA)의 1번째 가지를 식별합니다. LMCA와 LAD는 왼쪽 귓바퀴의 가장자리에서 정점을 향해 이어지는 표면의 밝은 빨간색 선으로 나타납니다.
10. 준비된 수술 바늘을 사용하여 실수로 왼쪽 귓바퀴에 구멍이 뚫리는 것을 방지하기 위해 LMCA의 1번째 분기 바로 원위 위치에 LAD 아래에 실크 스티치를 삽입하고 LAD의 왼쪽에서 오른쪽 방향으로 통과시켜 열린 결찰 루프를 만듭니다. 단일 봉합사로 개방 루프가 생성됩니다. 심장 표면을 덮고 있는 체액이나 혈액으로 인해 LAD가 보이지 않는 경우 심장 표면을 부드럽게 면봉으로 닦아 관상 동맥을 시각화합니다.
11. 봉합사의 한쪽을 잡고 바늘 홀더를 사용하여 봉합사에서 바늘을 부드럽게 분리합니다.
12. 개방 루프의 한쪽에 있는 실크 봉합사의 두 끝을 다른 쪽의 원에 삽입하여 스네어 루프를 형성합니다.
13. 루프를 닫기 전에 스네어 루프의 실크 봉합사의 두 끝을 준비된 스네어 컨트롤러에 삽입하십시오.
14. 실크 봉합사를 따라 스네어 루프 컨트롤러를 밀면서 실크를 부드럽게 늘려 스네어 루프를 닫습니다. LAD의 관상동맥 흐름을 중단하여 1시간 동안 일시적인 심근 허혈을 유도합니다.
15. 루프가 단단히 묶이면 실크를 잡고 켈리 집게로 스네어 루프 컨트롤러의 위치를 고정합니다. LAD 결찰 중에 켈리 집게의 다른 쪽 끝을 수술대에 놓습니다.
16. LAD 결찰 중 식염수 젖은 면봉으로 수술 창을 덮습니다.
17. 켈리 집게를 엽니다.
18. 2시간 동안 관상동맥 흐름의 재관류를 위해 스네어 루프 컨트롤러를 해제합니다.
19. 기저부와 혈관 경계를 따라 심장을 조심스럽게 절제하고 조직을 잡지 마십시오.
    참고: 40% 케이지 부피/분의 유속으로_CO2로 쥐를 안락사시킵니다.

Representative Results

심근 허혈 및 재관류가 끝나면 추가 생화학적 또는 분자 분석 전에 LAD 결찰의 품질을 평가해야 합니다.

결찰을 통한 LAD 폐색의 충분성은 중심 정맥 카테터를 통해 2% Evan's blue 염료 1mL를 주입하여 측정했습니다. 이어서, 관상동맥 관류가 있는 심근은 적색으로 남아있는 비관류 영역과 비교하여 청색으로 염색되었다(도 1A). 빨간색 영역은 심근 경색의 AAR입니다.

LAD 결찰을 위한 위치의 정확도는 연구 동물 사이의 AAR 백분율의 변화를 정량화함으로써 추가로 평가되었습니다. 심장을 수평으로 슬라이스한 후, AAR을 전체 심근 종괴로 나누어 AAR 백분율을 결정하였다(도 1B). 연구 동물 중 AAR 백분율의 낮은 변동은 LAD 결찰의 정확한 위치를 나타냅니다.

심근 경색 크기는 급성 심근 IR 연구의 주요 결과입니다. 이 파라미터를 정량화하기 위해, 슬라이스된 심장 절편을 30분 동안 37°C의 생리 식염수 중의 1% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)에서 배양한 다음, 3일 동안 10% 포름알데히드에서 배양하였다. 경색 부위는 흰색이었다. 경색 크기 백분율은 AAR에 대한 경색 면적의 비율로 계산되었습니다(그림 2).

그림 1: Evan's blue를 사용한 LAD 결찰 품질 검증. (A) 심근경색에 대한 AAR은 Evan's blue를 주사한 후에도 빨간색으로 남아 있는 비관류 심근 종괴로, 안전한 LAD 결찰을 확인했습니다. (B) AAR 백분율은 AAR(적색 영역)을 전체 심근 종괴(적색 및 청색 면적)로 나누어 계산하였다; 연구 동물 중 AAR 백분율의 낮은 변동은 LAD 결찰의 정확한 위치를 입증했습니다. 더 작은 경색 크기는 처리되지 않은 그룹에 비해 약물 치료 그룹에서 입증되었습니다. AAR, 위험 지역; LAD, 왼쪽 전방 하행 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: TTC 치료에서 심근 경색 크기의 정량화. 경색 크기는 LAD 결찰 그룹에서 AAR(적색 영역)에 대한 경색 영역(흰색 영역)의 비율로 추정되었습니다. AAR, 위험 지역; TTC, 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

제안된 프로토콜은 LAD 결찰을 위한 정확한 위치 식별, 단일 봉합사에서 올가미 루프를 제어하는 장치 생성, 조직 손상을 줄이기 위한 수정된 수술 조작 지원과 같은 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있어 연구자들이 LAD를 정확하고 안전하며 일관되게 결찰할 수 있을 뿐만 아니라 급성 심근 IR 연구를 위해 올가미 루프의 상태를 즉시 제어할 수 있습니다.

LAD 결찰의 위치는 심근 경색의 면적과 크기에 영향을 미칩니다. 결찰은 일반적으로 근위 LAD^27,28에서 특정 거리에서 제안됩니다. 관상동맥 분기 패턴의 분산을 간과하면 심근 경색의 가변성이 증가할 수 있다^23,24. 이 연구에서 LAD는 LMCA의 1차 분지 바로 원위부에 결찰되어 좌측 곡절 동맥 또는 중격 동맥의 우발적인 결찰을 방지하고 경색 크기가 일정하고 치명적인 부정맥 가능성이 낮아졌습니다 29,30,31.

안전한 LAD 결찰은 LAD 폐색에 필수적입니다. 전문가들은 LAD를 넥타이로 결찰하여 1-3 노트를 만들거나 관상 동맥 32,33,34,35,36을 압박하기 위해 작은 튜브 조각으로 결찰해야한다고 권장했습니다. 이 논문에서는 단일 봉합사에서 LAD를 결찰하기 위해 스네어 루프가 있는 제어 가능한 장치를 제안합니다. 이 접근 방식은 반복적인 심근 천자, 동맥 결찰 및 합자 해제 동안 조직 열상, 출혈 및 봉합사 강도의 파손을 방지하면서 안전한 LAD 결찰과 루프 폐쇄 및 해제의 즉각적인 제어를 가능하게 합니다. 따라서 이 접근법은 급성 심근 IR 연구의 실험 및 검증 절차에 유용합니다.

수술 중 해부학적 특징과 조직학적 특성을 인식하는 것은 조직 손상을 줄이고 연구 복제를 개선하는 데 도움이 됩니다. 흉부 개방과 관련하여 학자들은 가위, 견인기, 집게, 둔한 핀셋 또는 바늘을 사용하여 흉부 근육과 흉곽을 옆으로 당겨 가슴과 3 또는 4 늑간 근육을 분리 할 것을 제안했습니다 32,33,35,37,38. 본 연구는 피부 장선(피부의 결합 조직 골격)을 따라 절개하고^39,40, 무혈성 유연한 결합 조직⁽⁴¹)을 포함하는 단일 갈비뼈의 연골을 절단하고^, 흉부 근육과 흉곽을 걸어 흉벽을 여는 것을 제안합니다. 이 접근법은 조직 무결성을 유지하고 출혈 위험을 줄이는 데 도움이 됩니다. 또한 터치를 통해 신뢰할 수 있는 표면 제작자를 식별하여 접근 방식을 시작한다는 것은 피부 절개를 활용한 수술 절차가 매우 반복 가능하고 일관성이 있음을 의미합니다.

LAD 결찰에 의해 유도된 심근경색의 질을 확인하는 것은 급성 심근 IR 연구에서 병태생리학적 변화를 조사하기 전에 중요한 단계입니다. 문헌에서, LAD 결찰술 후 심근 경색의 발생은 심근의 갑작스런 국소 창백함을 관찰함으로써 확인된다^28,33; 기준선으로부터 심전도 상승의 급성 ST 분절³³; CK-MB, 트로포닌 I 및 트로포닌 T ^28,32,42와 같은 혈청 심장 효소 수치 상승; 또는 경색 된 영역은 거시적으로⁴². LAD 결찰의 일관성은 Phthalo 또는 Evan의 청색 염료^32,35,37,38을 사용하여 경색에 대한 AAR을 결정함으로써 추가로 검증되어야 합니다. 샘플 중 AAR 비율의 낮은 변동성은 급성 심근 IR 연구 절차의 일관성과 품질을 입증합니다. 또한, 경색 영역은 TTC^28,36으로 심근 경색 영역을 구분함으로써 AAR과 구별 될 수 있습니다. Evans blue/TTC 이중 염색은 이전에 생체 외 심근 IR 연구의 품질을 평가하기 위해 사용되었습니다 ³⁷. 분리된 심장을 Langendorff 장치 하에서 관류해야 하는 생체 외 평가의 요구 사항과 비교할 때, 이 연구는 결과를 얻는 생체 내 평가의 동물 프로토콜을 지원하며 연구의 품질은 즉각적이고 직접적으로 검증됩니다.

더 중요한 것은 경색 영역을 AAR로 정의하기 위해 Evan's blue 및 TTC를 사용하면 교란 요인을 배제하고 급성 심근 IR 연구에서 정확한 결과를 얻기 위한 요구 사항인 생화학적 분석을 위한 경색 심근의 사용을 배제한다는 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator