Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Het huidige protocol beschrijft het voorbereiden en gebruiken van precisiegesneden longplakken van muizen om de luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spiercontractiliteit in een bijna in vivo omgeving te beoordelen.

Abstract

Gladde spiercellen (SMC) bemiddelen de samentrekking van de luchtwegen en de intrapulmonale slagader om respectievelijk de luchtstroomweerstand en de pulmonale circulatie te wijzigen, waardoor ze een cruciale rol spelen in de homeostase van het longsysteem. Deregulering van SMC-contractiliteit draagt bij aan verschillende longziekten, waaronder astma en pulmonale hypertensie. Vanwege de beperkte toegang tot weefsel en een gebrek aan kweeksystemen om in vivo SMC-fenotypen te behouden, blijven moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gedereguleerde SMC-contractiliteit bij deze ziekten echter volledig geïdentificeerd. De precision-cut lung slice (PCLS) biedt een ex vivo model dat deze technische problemen omzeilt. Als een levende, dunne longweefselsectie behoudt de PCLS SMC in een natuurlijke omgeving en maakt het in situ tracking van SMC-contractie en intracellulaire Ca2 + -signalering mogelijk die de SMC-contractiliteit reguleert. Hier wordt een gedetailleerd PCLS-voorbereidingsprotocol voor muizen verstrekt, dat intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders behoudt. Dit protocol omvat twee essentiële stappen voordat de longkwab aan snijwonden wordt onderworpen: het opblazen van de luchtweg met laagsmeltpunt agarose door de luchtpijp en het vullen van longvaten met gelatine door de rechter ventrikel. De PCLS bereid met behulp van dit protocol kan worden gebruikt voor bioassays om Ca2+-gemedieerde contractiele regulatie van SMC in zowel de luchtwegen als de intrapulmonale arteriële compartimenten te evalueren. Toegepast op muismodellen van luchtwegaandoeningen maakt dit protocol het functioneel onderzoek van SMC mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in het onderliggende mechanisme van SMC-contractiliteitsderegulatie bij ziekten.

Introduction

Gladde spiercel (SMC) is een belangrijk structureel celtype in de longen, voornamelijk woonachtig in de mediawand van luchtwegen en longvaten. SMC's trekken samen om het luminale kaliber te veranderen, waardoor de lucht- en bloedstroomwordt geregeld 1,2. Daarom is contractiele regulatie van SMC's essentieel om de homeostase van luchtventilatie en pulmonale circulatie te behouden. Afwijkende SMC-contractiliteit daarentegen veroorzaakt obstructieve luchtweg- of pulmonale vaatziekten zoals astma en pulmonale arteriële hypertensie. De functionele beoordeling van long-SMC's is echter uitgedaagd door beperkte toegang tot het longweefsel, met name die kleine luchtwegen en microvessels in het distale deel van de long 2,3. Huidige oplossingen nemen hun toevlucht tot indirecte testen, zoals het meten van luchtstroomweerstand door Flexivent om luchtwegvernauwing te weerspiegelen, en het controleren van pulmonale arteriële bloeddruk door rechterhartkatheterisatie om pulmonale vasocontractie te beoordelen 4,5. Deze indirecte testen hebben echter meerdere nadelen, zoals verward worden door structurele factoren, het niet vastleggen van de ruimtelijke diversiteit van luchtweg- of vasculaire reacties in de hele longschaal 6,7, en ongeschikt voor de mechanistische studie van contractiele regulatie op cellulair niveau. Daarom zijn alternatieve benaderingen met behulp van geïsoleerde primaire cellen, luchtpijp /bronchiën spierstrips 8,9 of grote vasculaire segmenten10 toegepast voor de SMC-studie in vitro. Toch hebben deze methoden ook beperkingen. Een snelle fenotypische aanpassing van primaire SMC's in de kweekconditie11,12 maakt het bijvoorbeeld problematisch om bevindingen uit celcultuur naar in vivo instellingen te extrapoleren. Bovendien vertegenwoordigt het contractiele fenotype van SMC's in de geïsoleerde proximale luchtweg- of vasculaire segmenten mogelijk niet de SMC's in de distale long 6,7. Bovendien blijft de spierkrachtmeting op weefselniveau losgekoppeld van moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die essentieel zijn voor mechanistisch inzicht in contractiele regulatie.

Precision-cut lung slice (PCLS), een levend longweefselgedeelte, biedt een ideaal ex vivo hulpmiddel om pulmonale SMC's te karakteriseren in een bijna in vivo micro-omgeving (d.w.z. bewaarde multicellulaire architectuur en interactie)13. Sinds Drs. Placke en Fisher voor het eerst de bereiding van longplakken van agarose-opgeblazen ratten- en hamsterlongen introduceerden in de jaren1980 14,15, is deze techniek voortdurend geavanceerd om PCLS'en te voorzien van hogere kwaliteit en grotere veelzijdigheid voor biomedisch onderzoek. Een belangrijke verbetering is de verbetering van pulmonale arteriële conservering door gelatine-infusie naast longinflatie met agarose via de luchtpijp. Als gevolg hiervan worden zowel de luchtweg als de longslagader intact gehouden in de PCLS voor ex vivo beoordeling16. Bovendien is de PCLS levensvatbaar voor een langere tijd in cultuur. Bijvoorbeeld, muis PCLS'en hadden geen significante verandering in de levensvatbaarheid van de cel en het metabolisme gedurende minimaal 12 dagen in cultuur, evenals, ze behielden de contractiliteit van de luchtwegen gedurende maximaal 7 dagen17. Bovendien houdt PCLS luchtwegen of bloedvaten van verschillende grootte bij voor contractie- en ontspanningstests. Bovendien kan intracellulaire Ca2+ signalering van SMC's, de determinante factor van celcontractiliteit, worden getest met Ca2+ reporterkleurstoffen afgebeeld door een confocale of 2-fotonenmicroscoop13.

Gezien de uitgebreide toepassing van het muismodel in longonderzoek, wordt hier een gedetailleerd protocol beschreven voor het voorbereiden van muis PCLS met intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders voor ex vivo longonderzoek. Met behulp van de voorbereide PCLS'en hebben we vervolgens aangetoond hoe we de luchtweg- en pulmonale arteriële reacties op vernauwende of ontspannende stimuli kunnen evalueren. Daarnaast wordt ook de methode beschreven om de PCLS te laden met Ca2+ reporterkleurstof en vervolgens Ca2+ signalering van SMC's geassocieerd met contractiele of relaxante reacties in beeld te brengen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierverzorging was in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Massachusetts General Hospital. Wild-type C57/B6 mannelijke muizen, 8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Bereid de werkoplossing voor.
    1. Bereid 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, met Ca2+ en Mg2+, en pH gebalanceerd met 20 mM HEPES, zie Materiaaltabel). Gebruik de HBSS-oplossing om de PCLS voor te bereiden en te verwerken. Houd de HBSS-oplossing koud op ijs bij het bereiden van PCLS'en.
  2. Bereid het kweekmedium van PCLS voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium en F-12 (DMEM-F12) aan te vullen met een antibioticum-antimycotisch middel (1:100 volumeverhouding, zie Materiaaltabel).
  3. Bereid 1,5% agarose en 6% gelatine-oplossing.
    1. Meng laagsmeltpunt (LMP) agarose of gelatinepoeder (zie materiaaltabel) met HBSS-oplossing afzonderlijk in steriele centrifugebuizen van 15 ml (of buizen van 50 ml als het volume van de oplossing >10 ml) tot de eindconcentraties.
      OPMERKING: Totaal volume agarose-oplossing = 5 ml / muis x aantal muizen; gelatine-oplossing = 2 ml/muis x aantal muizen.
    2. Verwarm de oplossingsbuizen in kokend water totdat het poeder volledig is opgelost. Bewaar zowel agarose als gelatine-oplossingen in een waterbad van 42 °C.
      OPMERKING: Een verwarmingslamp aan de snijtafel kan nuttig zijn om de werkomgeving warm te houden en te voorkomen dat de agarose-oplossing stolt voordat deze in de muizenlong wordt geïnjecteerd.
  4. Dompel alle dissectiegereedschappen onder, waaronder een paar ontleedscharen, twee paar gebogen micro-ontleedtangen en een paar hemostatische tangen in 70% ethanoloplossing gedurende ten minste 20 minuten voor sterilisatie.
  5. Houd een vibratoom klaar (zie Materiaaltabel) om het longweefsel in dunne plakjes te snijden.
  6. Houd een omgekeerde fasecontrastmicroscoop met een CCD-camera om de luchtweg- of vasculaire contractiele reacties te evalueren en een op maat gemaakte laserscanconfisculator (zie Materiaaltabel) om de Ca2+ signalering in pulmonale SMC'ste beoordelen 18.

2. Opblazen van muizenlongen met agarose en gelatine-oplossing

  1. Euthanaseer de muis.
    1. Plaats de muis in een plastic kamer (ongeveer 750 cm3) met 5% isofluraan. Houd de muis in de kamer totdat deze minstens 1 minuut stopt met ademen.
      OPMERKING: Andere primaire euthanasiemethoden, zoals intraperitoneale injectie van ketamine (240 mg / kg) en xylazine (32 mg / kg) 19 of pentobarbital (0,3 ml) 20, kunnen worden toegepast als alternatieven voor geïnhaleerd isofluraan.
    2. Plaats het muislichaam op een snijplank in rugligging. Bevestig het lichaam in positie door de staart, voorpoten en het hoofd vast te pinnen met 25 G spuitnaalden en ontsmet het lichaam met 70% ethanolspray.
    3. Knip de buik van de muis open met een chirurgische schaar (incisie, ~ 2 cm lang x 2 cm breed). Snijd vervolgens de abdominale aorta af om het bloedvolume uit te putten.
  2. Blaas longlobben op volgens de onderstaande stappen.
    1. Open de borstholte voorzichtig langs het borstbeen en de bilaterale inferieure ribbenkast boven het middenrif en observeer de longlobben die instorten wanneer de borstholte zich opent.
    2. Verwijder een deel van bilaterale ventrale ribbenkasten om het hart bloot te stellen. Voorkom longschade door de scherpe schaarpunt weg te wijzen van het longweefsel.
    3. Gebruik een tang om de thymus en het zachte weefsel in de muizenhals te scheiden om de luchtpijp bloot te leggen.
    4. Snijd een klein gaatje (1,2 mm in diameter) in het bovenste uiteinde van de luchtpijp waardoor de punt van een 20 G Y-vormige IV-katheter kan worden doorgelaten (zie Materiaaltabel).
    5. Sluit de ene adapterpoort van de Y-vormige katheter aan op een spuit van 3 ml, voorgevuld met 0,5 ml lucht, en de andere poort met een spuit van 3 ml voorgevuld met 2 ml warme 1,5% agarose-oplossing (42 °C).
    6. Injecteer agarose-oplossing om de katheter te vullen en duw de katheter vervolgens door de voorgesneden opening in de luchtpijp gedurende een lengte van 5-8 mm.
    7. Injecteer de agarose-oplossing langzaam op ongeveer 1 ml / 5 s. De long zal uitzetten langs de proximale-tot-distale as. Stop de injectie wanneer de rand van elke longkwab is opgeblazen.
      OPMERKING: Blaas de long niet te veel op, omdat dit deze kan scheuren. Het volume van agarose-oplossing om de hele long van een jongvolwassen muis op te blazen is ongeveer 1,3 ± 0,1 ml.
    8. Injecteer 0,2-0,3 ml lucht uit de andere spuit om de resterende agarose in de katheter en geleidende luchtwegen naar de distale longblaasjesruimte te duwen.
    9. Sluit de luchtpijp met een gebogen hemostatische tang (zie Materiaaltabel).
  3. Vul de pulmonale vasculatuur in.
    1. Vul een spuit van 1 ml met warme gelatine van 6%. Sluit aan op een naald hoofdhuidaderkatheter, vul de katheter met gelatine-oplossing en prik vervolgens de rechterkamer dicht bij de inferieure wand met de naald.
    2. Duw de naald in de rechter ventrikel gedurende 2-3 mm lang en richt de naaldpunt op de hoofdlongslagader.
    3. Injecteer 0,2 ml gelatine-oplossing langzaam in de rechter ventrikel en pulmonale arteriële vaten.
      OPMERKING: De longlobben lijken iets bleker met de juiste gelatine-inflatie.
    4. Houd de naald 5 minuten na injectie op zijn plaats, koel de longlobben door ijskoude HBSS-oplossing op het hart en de longen te gieten en plaats het lichaam vervolgens met de dissectieplank in een koelkast van 4 °C of op ijs gedurende in totaal 10 minuten.
    5. Verwijder de long en het hart van de muis uit de omliggende bindweefsels met een schaar. Scheid vervolgens elke longkwab en bewaar ze in HBSS-oplossing op ijs.

3. Doorsnede van longlobben tot dunne plakjes

  1. Trim en bevestig de longkwab aan de bovenkant van de monsterkolom met secondelijm en oriënteer de kwab (figuur 1A, B) zodat de snijrichting loodrecht op de meeste luchtwegen van de hila tot het longoppervlak kan staan.
  2. Gebruik een vibratoom met een vers dun scheermesje om de longkwab in plakjes van 150 μm te snijden. Verzamel de plakjes in steriele petrischalen van 100 mm, voorgevuld met koude HBSS-oplossing.
    OPMERKING: Stel de juiste bewegingensnelheid en oscillatiefrequentie van het blad in voordat u begint met snijden. Een typische instelling voor een Compresstom is Snelheidsniveau 4 en Oscillatieniveau 4.
  3. Breng plakjes over naar petrischalen gevuld met DMEM/F-12 kweekmedium (20 plakjes/15 ml medium/schaal) en bewaar ze een nacht voor experimenten in een incubator van 37 °C.
    OPMERKING: Muis-PCLS'en kunnen ongeveer 7 dagen in cultuur worden gehouden zonder de contractiele reacties van de luchtwegen te verliezen17. De levensduur van longslagaders is niet grondig geëvalueerd. In onze waarneming behouden ze intacte structuur en vasoreactie gedurende ten minste 3 dagen in DMEM / F12-medium. Voor langdurige opslag kunnen pcls'en van muizen worden geplaatst in cryovialen gevuld met DMEM/F12-medium met 10% DMSO (5 plakjes in 1 ml medium per injectieflacon), ingevroren in een met isopropylalcohol gevulde container bij -80 °C 's nachts en gecryopreserveerd in vloeibare stikstof gedurende weken tot maanden21.

4. Analyseren van contractiele reacties van intrapulmonale luchtwegen en slagaders

  1. Plaats PCLS'en in een hbss-gevulde kweekplaat met 24 putten, één in elke put. Plaats de PCLS in het midden van de put en verwijder de HBSS-oplossing met een pipet.
  2. Zoek de doelluchtweg en het vat in de plak onder de microscoop en bedek de plak vervolgens met een nylon gaas met een voorgesneden centraal gat (2-3 mm in diameter) om het doelgebied bloot te leggen.
  3. Leg een holle metalen ring bovenop het gaas om de plakjes op hun plaats te houden (figuur 2A).
  4. Voeg 600 μL HBSS-oplossing toe om de PCLS onder te dompelen. Laat het plakje 10 minuten rusten en noteer vervolgens de basislijnbeelden van luchtwegen of bloedvaten.
  5. Induceer de luchtweg- of vasculaire contractie door de blanco HBSS-oplossing voorzichtig met een pipet uit te zuigen en 600 μL HBSS toe te voegen met een agonist, zoals 1 μM methacholine (MCh) of 10 nM endotheline (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: KCl-stimulatie als standaard voor gereedschapssets is niet vereist voorafgaand aan blootstelling aan methacholine of endotheline. 100 mM KCl-stimulatie in de luchtwegen van muizen induceert alleen een kleine en onregelmatige samentrekking van de luchtwegen (10% -15%)20. Evenzo is een priming methacholine-stimulatie niet verplicht, omdat we hebben bevestigd dat dezelfde agonist, bijvoorbeeld methacholine of serotonine, een vergelijkbare luchtwegcontractie veroorzaakt bij de eerste en herhaalde blootstellingen 20,22.
  6. Observeer de reactie onder de microscoop totdat de luminale gebiedsverandering een equilibratory status bereikt en registreer vervolgens de luchtweg- of vasculaire beelden voor analyse.
  7. Verwijder MCh of endotheline-oplossing met een pipet en voeg een nieuwe HBSS-oplossing van 600 μL toe met dezelfde agonistenconcentratie en een relaxant; observeer en registreer de luchtweg of vasculaire ontspanning.
  8. Kwantificeer de luchtweg- of vasculaire reactie volgens de onderstaande stappen.
    1. Laad de afbeeldingen in de door nih gesponsorde gratis software FIJI.
    2. Selecteer de polygoonselectie op de werkbalk om het luchtweg- of vasculaire lumen op elk frame te schetsen.
    3. Kies Analyseren > Metingen instellen > gebied.
    4. Kies Analyseren > meten om het interessegebied te kwantificeren. De resultaten worden in een apart venster weergegeven voor statistische analyse.

5. Analyse van Ca2+ signalering van luchtweg- of vasculaire SMC's

  1. Bereid de Ca2+ kleurstoflaadbuffer voor.
    1. Los Ca2+ kleurstof op, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (zie Materiaaltabel), 50 μg (één injectieflacon) met 10 μL DMSO.
    2. Los 0,2 g Pluronic F-12 poeder (zie materiaaltabel) op in 1 ml DMSO om een pluronische oplossing van 20% te genereren.
    3. Meng 10 μL 20% pluronische oplossing met 10 μL Ca2+ kleurstof-DMSO-oplossing.
    4. Maak Ca2+ kleurstoflaadbuffer door 20 μL van het mengsel toe te voegen aan 2 ml HBSS-oplossing met 200 μM sulfobroomftaalline (zie materiaaltabel).
  2. Plaats 15 muis-PSOS'en in 2 ml Ca2+ laadbuffer en incubeer bij 30 °C gedurende 1 uur. Verplaats vervolgens de plakjes naar 2 ml HBSS-oplossing met 100 μM sulfobroomphthaleïne gedurende nog eens 30 minuten voor fluorescerende verestering van kleurstoffen bij kamertemperatuur.
  3. Detecteer Ca2+ signalering van SMC's.
    1. Leg Ca2+ plakjes met kleurstof op een groot dekglas.
    2. Vul een spuit van 3 ml met hoogvacuüm siliconenvet. Knijp het vet door een stompe naald van 18 G om twee parallelle lijnen over het afdekglas boven en onder de plak te tekenen.
    3. Bedek de plak met een nylon gaas tussen twee vetlijnen. Plaats het tweede afdekglas op het gaas om een kamer te genereren die aan de zijkanten is afgesloten met vet (figuur 3A).
      OPMERKING: Het nylon gaas is essentieel om de plak aan de onderste coverslip te houden en zo binnen de werkafstand van een omgekeerd objectief met een hoge magnitude te blijven, zoals 40x olie.
    4. Voeg HBSS- of agonistenoplossing vanaf het ene uiteinde toe aan de kamer door handmatig of via een perfusiesysteem te pipetteren. Verwijder de vloeistof uit de kamer door aan het andere uiteinde te zuigen met tissuepapier of vacuüm in het geval van continue vloeistofperfusie.
    5. Plaats de PCLS-kamer op het microscooppodium. Detecteer de Ca2+ signalering van SMC23 met een op maat gemaakte resonant scanning confocale microscoop met een laserscansnelheid van 15 of 30 beelden/s.
      OPMERKING: Als alternatief kan een high-speed commerciële laser scanning confocale microscoop, op grote schaal beschikbaar op dit moment, worden toegepast in de Ca2 + signaleringstest van pulmonale SMC's in PCLS.
  4. Kwantificeer de Ca2+ fluorescentie in SMC's.
    1. Laad de opgenomen afbeeldingsreeks naar FIJI en kies de afbeelding > Type > 8-bits grijswaarden.
    2. Selecteer de rechthoekige selectie op de werkbalk en definieer een interessegebied van 5 pixels x 5 pixels (ROI) in een cel met gladde spieren.
    3. Kies Metingen analyseren > Metingen instellen > gemiddelde grijswaarde , die de ca2+ fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigt.
    4. Als de positie van een ROI verandert met SMC-contractie, kiest u Analyseren > de Ca2+ fluorescerende intensiteit frame voor frame meten.
    5. Als de ROI van SMC op een vergelijkbare positie blijft in een stapel afbeeldingen, kiest u Afbeelding > stapels > Meetstapel van de Ca2+ fluorescerende intensiteit.
      OPMERKING: Een op maat geschreven macro kan worden aangesloten om de ROI binnen de SMC bij te houden wanneer deze met krimp in een afbeeldingsstack beweegt en meet automatisch de Ca2+ intensiteit (grijswaarde) van ROI frame voor frame.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pcls-preparaat bij muizen met behoud van intacte intrapulmonale luchtwegen en slagaders
Een 150 μm dikke PCLS werd waargenomen onder de omgekeerde fase-contrastmicroscoop. In muizenlongen gaan geleidende luchtwegen gepaard met intrapulmonale slagaders, die van de hilus naar de perifere long lopen. Een representatieve pulmonale luchtweg-slagaderbundel in een muis PCLS is weergegeven in figuur 2B. De luchtweg kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door kubusvormige epitheelcellen met actieve ciliale kloppen die het binnenoppervlak van het lumen bekleden. Daarentegen wordt de nabijgelegen longslagader gekenmerkt door plat endotheel. Bij het bereiken van het perifere longveld vertakken de geleidende luchtwegen zich in ademhalingskanalen en zakjes, rondom de kleine intra-acinaire arteriolen (figuur 2C).

Gebruik van muis PCLS om de pulmonale luchtweg en arteriële contractie te beoordelen
Methacholine (MCh, 1 μM) geïnduceerde luchtwegcontractie wordt aangetoond in figuur 2B. De contractiele reacties van de luchtwegen worden gekwantificeerd door het percentage luminale gebiedsreductie na blootstelling aan MCh (figuur 2D). De longslagader daarentegen reageert niet op MCh-stimuli (figuur 2B). Luchtwegen handhaven vergelijkbare dosisafhankelijke contractiele responsen op MCh in de PCLS na een kweek van 1 dag of 5 dagen (figuur 2D). Wanneer de PCLS wordt blootgesteld aan endotheline (10 nM), vernauwen zowel de luchtwegen als de longslagaders (figuur 2C, E), gevolgd door NOC-5 (100 μM) geïnduceerde ontspanning (figuur 2E).

Gebruik van muis PCLS om de Ca2+ signalering van de luchtweg en arteriële SMC te beoordelen
De Ca2+ kleurstof-geladen PCLS wordt waargenomen onder een confocale fluorescerende microscoop. De Ca2+ fluorescentie in de luchtweg (figuur 3B) en vasculaire (figuur 3C) SMC's is laag in ruststatus, zonder dat er een brandpuntsvonk van intracellulaire Ca2+ signalering opvalt. Bij blootstelling aan agonisten stijgt de Ca2+ fluorescentie-intensiteit in de SMC (figuur 3B,C), meestal vanaf één plek en vervolgens voortplantend naar de hele cel. De Ca2+ fluorescerende golven verschijnen herhaaldelijk in dezelfde cel als oscillerende signalen (figuur 3D,E). Over het algemeen neemt de frequentie van Ca2+ oscillatie toe naarmate de agonistconcentratie stijgt tot het bereiken van een plateauniveau24. Luchtweg SMC-ontspanning wordt geassocieerd met het verminderen of stoppen van Ca2+ oscillaties25.

Figure 1
Figuur 1: Oriëntatie van de longlobben van muizen voor het snijden van vibratomen. De longlobben van de muis zijn gescheiden in individuele lobben voor secties. (A) De linker (1), rechter schedel (2) en caudale lobben (3) worden in de buurt van het hilum langs de witte stippellijnen bijgesneden voordat het platte snijoppervlak op de monsterkolom wordt geplakt. De plaatsing van de linkerkwab wordt weergegeven in (4). (B) De rechtermiddenkwab kan direct op de monsterkolom worden gelijmd. De rechter accessoirelob werd niet vaak gebruikt vanwege het kleine formaat. De juiste oriëntatie van verschillende lobben zorgt ervoor dat de meeste luchtwegen en longvaten dwarssecties in de PCLS vertonen. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Contractiele en relaxante reacties van luchtwegen en longslagaders bij PCLS bij muizen. (A) Schematische weergave van de plaatsing van een PCLS in een kweekplaat goed voor contractietest. (B) Representatieve beelden van een luchtweg (zwarte pijlen) met een nabijgelegen longslagader (zwarte pijlpunten) in HBSS in rust en na blootstelling aan 1 μM methacholine (MCh). (C) Representatieve beelden van een intra-acinaire arteriole in HBSS in rust en bij blootstelling aan 10 nM endotheline (Endo). (D) Dosisafhankelijke luchtwegcontractiele responsen op MCh in PCLS'en na 1-daagse (grijze lijn) en 5-daagse (zwarte stippellijn) cultuur. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM van negen luchtwegen van twee muizen. (E) Representatieve beelden van 10 nM endotheline-geïnduceerde luchtweg- en pulmonale arteriële contractie, gevolgd door 100 μM NOC-5, een stikstofmonoxidedonor, geïnduceerde ontspanning. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Ca2+ signalering van luchtweg- en pulmonale arteriële SMC's in PCLS. (A) Schematische weergave van de opstelling van een kamer met een glas aan de boven- en onderkant, vetafdichting en een nylon gaas om een PCLS in het brandpuntsvlak te houden voor Ca2+ beeldvorming van SMC's. (B) Representatieve fluorescerende beelden die de Ca2+ signalering van luchtweg-SMC's in rust en na blootstelling aan 1 μM MCh laten zien. epitheelcel. (C) Ca2+ fluorescerende beelden van pulmonale arteriële SMC's in rust en na blootstelling aan 10 nM endozeline (Endo). De gedurfde witte pijlen geven de lengteas van de longslagader aan en de stippellijnen met eindpijlen geven de spiraalvormige verdeling van vasculaire SMC's rond de arteriële wand aan. Schaalbalk = 20 μm. Oscillerende verhoging van Ca2+ fluorescentie-intensiteit (Ft), in verhouding tot de fluorescentie-intensiteit in rustconditie (F0), in een SMC van de luchtwegen tot 1 μM MCh (D) en in een pulmonale arteriële SMC als reactie op 10 nM endothelinestimulatie (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De voorbereiding van PCLS omvat verschillende kritieke stappen. Ten eerste is het essentieel om de longkwab homogeen op te blazen om de variatie van weefselstijfheid door ongelijke agaroseverdeling te voorkomen. Aangezien de vloeistof snel in dunne katheters of luchtwegen gels bij een temperatuur onder 37 °C, kan het resulterende vuldefect in het distale longveld de ongelijkheid van longweefselstijfheid vergroten en weefselscheuren veroorzaken tijdens de vibratomsectie. Daarom kan worden geoefend om de laagsmeltende agarose-oplossing op 42 °C in een waterbad te houden en een verwarmingslamp aan de snijtafel te gebruiken om snel agarose-geleren te voorkomen. Een snelle injectie kan meer agarose naar het longparenchym duwen met een hogere naleving, daarom moet worden vermeden. De manuele agarose injectie duurt meestal ongeveer 5-7 s. Ten tweede is een noodzakelijke stap aan het einde van de agarose-invulling het duwen van een kleine hoeveelheid lucht (~ 0,2 ml) om de agarose van de geleidende luchtweg naar de distale longblaasjesruimte te spoelen. Anders zou de agarose gel en in het lumen blijven om de samentrekking van de luchtwegen te weerstaan. Het is ook vermeldenswaard dat de agarose-geleer in de longblaasjes op zijn plaats blijft en nooit meer smelt bij 37 °C in de incubator. De agarose-gel speelt een essentiële rol bij het vasthouden van de 3D-structuur van longweefsel zoals in vivo gehandhaafd door de negatieve intrathoracale druk. Ten derde is het perfuseren van longslagaders met gelatine-oplossing essentieel om het arteriële lumen open te houden in de PCLS. De gelatine-oplossing gels bij kamertemperatuur als een mechanische blokker om vasoconstrictie op chemische en fysische stimuli tijdens de weefselsectie te weerstaan. Zonder gelatine-inflatie storten de longslagaders in longplakken meestal in en maken ze los van het omliggende interstitiële weefsel, zelfs in de aanwezigheid van hoge doses gemengde vaatverwijdende middelen, waaronder fentolamine, epinefrine en nifedipine13,16. In tegenstelling tot een agarose-gel smelt gelatinegel bij 37 °C, stroomt uit het vasculaire lumen na nachtelijke incubatie, waardoor het arteriële lumen vrij blijft van obstructie voorafgaand aan de vasculaire reactietest.

Aangezien de PCLS pulmonale SMC's in situ behoudt en hun contractiele functie behoudt in een bijna in vivo toestand, is het toegepast als een krachtig platform om de regulatie van SMC-contractie te onderzoeken, met name de regulatie via Ca2 + afhankelijke mechanismen26. In het bijzonder, met een lage vergroting meerkanaals confocale of twee-fotonen microscoop, kan agonist-geïnduceerde Ca2+ signalering in luchtweg-SMC's en bijbehorende luminale vernauwing gelijktijdig worden vastgelegd voor mechanistisch onderzoek13,20. Luchtweg- of vasculaire responsiviteit gemeten met behulp van de PCLS-methode zal naar verwachting cellulaire eigenschappen weerspiegelen die vrij zijn van invloeden uit de longomgeving, zoals het inflammatoire milieu, en neurale innervatie van de respons in de long27,28. Als zodanig biedt het PLCS een experimenteel systeem om intrinsieke versus secundaire smcs modificatie. Naast het onderzoeken van de contractiele regulatie van SMC's in gezondheids- en ziektemodellen, zijn PCLS'en verzameld uit verschillende leeftijdsgroepen om de functionele aanpassing van luchtweg SMC tijdens postnatale longontwikkeling en als reactie op milieubeledigingen te onderzoeken27. Bovendien bevatten PCLS'en luchtwegen en bloedvaten van verschillende grootte van het perifere tot het proximale longveld, waardoor het onderzoek van een regiospecifiek mechanisme mogelijk is om de contractiliteit van pulmonale SMC's in homeostase en onder pathogene stimuli te reguleren. Bovendien, aangezien pcls'en van muizen gedurende 7 dagen17 de contractiliteit van de luchtwegen in het kweekmedium behouden, zijn ze gebruikt als een ex vivo model om risicofactoren voor SMC-deregulatie, zoals cytokine of virusblootstelling, te onderzoeken of te valideren29. Ten slotte biedt PCLS een ideaal platform om vaatverwijdende of bronchodicatiemedicijnen te screenen. Met name de bioassays met behulp van PCLS-bereiding zijn zeer kosteneffectief, omdat één volwassen muis honderden longplakken kan genereren. Het gebruik van neighbore PCLS'en in de controle- en behandelingsgroepen vermindert ook aanzienlijk de experimentele bias van intergroepsmonstervariatie.

Gezien het verschil tussen knaagdier- en menselijke longanatomie, is de menselijke PCLS een krachtiger hulpmiddel voor translationeel onderzoek. De beperkte beschikbaarheid van menselijk longweefsel, met name zieke longmonsters, blijft echter een uitdaging. Daarentegen worden longweefsel van muizen, muismodellen van menselijke ziekten en transgene muismodellen op grote schaal toegepast in biomedisch en farmacologisch onderzoek, waardoor muis-PCLS een toegankelijk en ziekterelevant systeemis 13,30. Bovendien is het behoud van intrapulmonale slagaders alleen succesvol geweest bij pcls-bereiding bij muizen, waardoor het een uniek hulpmiddel is om de vasculaire deregulatie bij pulmonale vaatziekten zoals pulmonale hypertensie te onderzoeken. Daarom is, ondanks kanttekeningen in verband met ziektemodellen, een protocol voor pcls-voorbereiding bij muizen van onschatbare waarde om een ex vivo platform op te zetten om luchtweg- en longslagaders in gezondheid en ziekte te onderzoeken. Wij en anderen hebben longonderzoek gemeld met menselijke PSOS'en 31,32,33,34. In onze ervaring is het protocol van menselijke PLCS-voorbereiding vergelijkbaar met het muisprotocol, behalve het toepassen van een hogere agaroseconcentratie van 2%, meer agarose-oplossing (3 L voor één long) en veel grotere katheters om hoofd-, lobaire of segmentale bronchiën te cannuleren voor agarose-injectie. Ervaring met de plcs-bereiding van muizen helpt enorm bij de bereiding van menselijke longplakjes.

Ondanks tal van voordelen van het gebruik van PCLS-preparaat in pulmonaal SMC-onderzoek, is het cruciaal om op de hoogte te zijn van de beperkingen van deze techniek. Ten eerste blijft de PCLS een statisch systeem, zonder fysiologische ademhalingscycli die periodiek de longparenchymaal en de luchtwegen uitrekken. Het bevat ook geen bloedcirculatie, die pulserende druk op de vasculaire SMC's en schuifkrachten op endotheelcellen genereert. Deze mechanische variaties in de PCLS zouden de contractiele regulatie van SMC's kunnen wijzigen. Hoewel een volledige vestiging van de luchtventilatie en bloedcirculatie in PCLS'en onhaalbaar is, althans voor de SMC-studie van de luchtwegen, zijn er in het afgelopen decennium vagale inspanningen geleverd om een "ademende" PCLS te genereren door het weefselgedeelte uit te rekken met een verscheidenheid aan apparaten 35,36,37. Ten tweede behouden pulmonale SMC's hun contractiliteit slechts voor een beperkte periode. Deze tijdslimiet voorkomt dat het PLCS de subacute veranderingen van SMC's modelleert, bijvoorbeeld een proces dat meer dan 6-7 dagen duurt om luchtweg-SMC's te wijzigen. Aangezien eerder onderzoek aantoont dat SMC's contractiliteit verliezen als gevolg van een afname van contractiele eiwitten, is aangetoond dat het optimaliseren van het kweekmedium met een extra lage dosis insuline de SMC-contractie van de luchtwegen tot 12 dagen ondersteunt17. Ten slotte blijft de genetische manipulatie van pulmonale SMC's door plasmide of siRNA-transfectie van de PCLS niet succesvol. De technische barrière voor transfecte SMC's in de PCLS rechtvaardigt zeker verder onderzoek, omdat deze methode een alternatieve benadering biedt voor het transgene diermodel voor de mechanistische studie van pulmonale SMC's. Wat nog belangrijker is, deze techniek is de exclusieve maatregel om genetische modulatie van menselijke pulmonale SMC's te bereiken in translationeel onderzoek.

Dit artikel geeft een uitgebreide beschrijving van het voorbereiden van pcls'en bij muizen met goed bewaarde luchtwegen en longslagaders en het toepassen ervan in de contractie- en Ca2+ signaleringstests. PCLS-voorbereiding ondersteunt de gladde spierfunctie in een levende longomgeving en geeft mechanistische studie toegang tot cellen in situ. Deze unieke eigenschap heeft de PCLS-voorbereiding tot een veelzijdig hulpmiddel gemaakt voor het bestuderen van de pulmonale luchtwegen en vasculaire SMC's in gezondheid en ziekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

Biologie Nummer 183
Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter