Summary
本プロトコールは、マウスの精密切断肺スライスを調製し、利用して、ほぼ in vivo環境における 気道および肺内動脈平滑筋収縮性を評価することを記載している。
Abstract
平滑筋細胞(SMC)は、気道および肺内動脈の収縮を媒介して、それぞれ気流抵抗および肺循環を変化させ、したがって肺系の恒常性において重要な役割を果たしている。SMC収縮性の調節解除は、喘息および肺高血圧症を含むいくつかの肺疾患に寄与する。しかしながら、組織アクセスが制限され、インビボSMC表現型を維持するための培養系の欠如のために、これらの疾患における制御解除されたSMC収縮性の根底にある分子機構は完全に同定されたままである。精密切断肺スライス(PCLS)は、これらの技術的困難を回避するex vivoモデルを提供します。生きた薄い肺組織切片として、PCLSは自然環境においてSMCを保持し、SMC収縮およびSMC収縮性を調節する細胞内Ca2+シグナル伝達のその場での追跡を可能にする。ここでは、無傷の気道および肺内動脈を保存する詳細なマウスPCLS調製プロトコルが提供される。このプロトコルには、肺葉をスライスする前に、気管を通る低融点アガロースで気道を膨張させることと、右心室を通して肺血管にゼラチンを充填することの2つの重要なステップが含まれます。このプロトコルを使用して調製されたPCLSは、気道および肺内動脈区画の両方におけるSMCのCa2+媒介性収縮調節を評価するためのバイオアッセイに使用することができる。呼吸器疾患のマウスモデルに適用すると、このプロトコルはSMCの機能的調査を可能にし、それによって疾患におけるSMC収縮性調節緩和の根底にあるメカニズムへの洞察を提供する。
Introduction
平滑筋細胞(SMC)は、肺の主要な構造細胞型であり、主に気道および肺血管の培地壁に常在する。SMCは管腔口径を変化させるために収縮し、空気と血流を調節する 1,2.したがって、SMCの収縮性調節は、空気換気および肺循環の恒常性を維持するために不可欠である。対照的に、異常なSMC収縮性は、閉塞性気道または喘息および肺動脈性高血圧症のような肺血管疾患を引き起こす。しかしながら、肺SMCの機能評価は、肺組織、特に肺の遠位部にあるそれらの小さな気道および微小血管への限られたアクセスによって挑戦されてきた2,3。現在のソリューションは、気道狭窄を反映するためにFlexiventによって気流抵抗を測定し、肺血管収縮を評価するために右心カテーテル法によって肺動脈血圧をチェックするなどの間接アッセイに頼っています4,5。しかし、これらの間接アッセイには、構造的要因によって交絡される、肺スケール全体における気道または血管応答の空間的多様性を捉えることができない、細胞レベルでの収縮調節の機構的研究に適さないなど、複数の欠点がある。したがって、単離された初代細胞、気管/気管支筋ストリップ8、9、または大きな血管セグメント10を使用する代替アプローチが、インビトロでのSMC研究に適用されている。それにもかかわらず、これらの方法にも制限があります。例えば、培養条件11、12における初代SMCの迅速な表現型適応は、細胞培養からインビボ設定への所見を推定することを問題にする。加えて、単離された近位気道または血管セグメントにおけるSMCsの収縮表現型は、遠位肺におけるSMCsを表していなくてもよい6,7。さらに、組織レベルでの筋力測定は、収縮調節への機構的洞察に不可欠な分子的および細胞的事象から解離したままである。
生きた肺組織切片である精密切断肺スライス(PCLS)は、生体内に近い微小環境(すなわち、保存された多細胞構造と相互作用)で肺SMCを特徴付けるための理想的なエクスビボツールを提供します13。Placke博士とFisher博士が1980年代にアガロースで膨張したラットとハムスターの肺からの肺スライスの調製を初めて導入して以来、14,15、この技術はPCLSに生物医学研究のためのより高い品質と汎用性を提供するために継続的に進歩してきました。1つの重要な改善は、気管を介したアガロースによる肺膨張に加えて、ゼラチン注入による肺動脈保存の増強である。その結果、気道および肺動脈の両方が、エクスビボアッセイ16のためのPCLSにおいて無傷に保たれる。さらに、PCLSは、培養において長期間にわたって生存可能である。例えば、マウスPCLSは、培養において最低12日間、細胞生存率および代謝に有意な変化を示さず、ならびに、気道収縮性を最大7日間保持した17。さらに、PCLSは収縮およびリラクゼーションアッセイのために異なるサイズの気道または血管を保持します。さらに、SMCsの細胞内Ca2+シグナル伝達は、細胞収縮性の決定因子であり、共焦点または2光子顕微鏡13によって画像化されたCa2+レポーター色素を用いてアッセイすることができる。
肺研究におけるマウスモデルの広範な適用を考慮すると、 エクスビボ 肺研究のために無傷の気道および肺内動脈を有するマウスPCLSを調製するための詳細なプロトコルがここに記載されている。調製したPCLSを用いて、我々はその後、狭窄性または弛緩性刺激に対する気道および肺動脈応答を評価する方法を実証した。さらに、PCLSにCa2+ レポーター色素をロードし、次いで収縮性または弛緩性応答に関連するSMCのCa2+ シグナル伝達をイメージングする方法も記載されている。
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Protocol
すべての動物ケアは、マサチューセッツ総合病院の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていました。野生型C57/B6雄マウス(8週齢)を本研究に使用した。
1. 実験準備
- 作業ソリューションを準備します。
- 1x ハンクス平衡塩溶液(HBSS、Ca2+およびMg2+ 、およびpHを20mM HEPESと平衡、 材料表を参照)を調製する。HBSS ソリューションを使用して、PCLS を準備および処理します。PCLSを準備するときは、氷上でHBSS溶液を冷たく保ちます。
- ダルベッコ改変イーグル培地およびF-12(DMEM-F12)に抗生物質 - 抗真菌剤(1:100容量比、 材料表を参照)を添加して、PCLSの培養培地を調製する。
- 1.5%アガロースおよび6%ゼラチン溶液を調製する。
- 低融点(LMP)アガロースまたはゼラチン粉末( 材料表を参照)とHBSS溶液を15 mL滅菌遠沈管(溶液容量が10 mLの場合は50 mLチューブ)で最終濃度まで別々に混合します(または、溶液容量>10 mLの場合は50 mLチューブ)。
注:アガロース溶液の全体積= 5mL/マウス×マウス数;ゼラチン溶液=2mL/マウス×マウス数。 - 粉末が完全に溶解するまで、溶液チューブを沸騰水中で加熱する。アガロースとゼラチンの両方の溶液を42°Cの水浴中に保管してください。
注:解剖テーブルの加熱ランプは、動作環境を暖かく保ち、マウス肺に注入される前にアガロース溶液が固化するのを防ぐのに役立ちます。
- 低融点(LMP)アガロースまたはゼラチン粉末( 材料表を参照)とHBSS溶液を15 mL滅菌遠沈管(溶液容量が10 mLの場合は50 mLチューブ)で最終濃度まで別々に混合します(または、溶液容量>10 mLの場合は50 mLチューブ)。
- 一対の解剖はさみ、2対の湾曲した微小解剖鉗子、および一対の止血鉗子を含むすべての解剖ツールを、滅菌のために少なくとも20分間、70%エタノール溶液に沈める。
- ビブラトームを準備して( 材料表を参照)、肺組織を薄いスライスに分割します。
- CCDカメラを備えた倒立位相差顕微鏡を気道または血管収縮応答を評価し、カスタムメイドのレーザー走査共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用して肺SMCのCa2+ シグナル伝達を評価します18。
2.アガロースおよびゼラチン溶液によるマウス肺の膨張
- マウスを安楽死させる。
- マウスを5%イソフルランを含むプラスチックチャンバー(約750cm3)に入れます。マウスが少なくとも1分間呼吸を停止するまで、マウスをチャンバー内に保持します。
注:ケタミン(240 mg/Kg)およびキシラジン(32 mg/Kg)19 またはペントバルビタール(0.3 mL)20の腹腔内注射などの他の一次安楽死方法は、吸入イソフルランの代替として適用することができます。 - マウス本体を離剖ボードの上に置き、仰臥位に置きます。尾、前足、および頭を25Gシリンジ針で固定して体を所定の位置に固定し、70%エタノールスプレーで体を消毒します。
- マウスの腹部を外科用ハサミ(切開、長さ約2cm×幅2cm)で切り開きます。その後、腹部大動脈を切り取って血液量を枯渇させます。
- マウスを5%イソフルランを含むプラスチックチャンバー(約750cm3)に入れます。マウスが少なくとも1分間呼吸を停止するまで、マウスをチャンバー内に保持します。
- 以下の手順に従って肺葉を膨らませます。
- 胸骨と横隔膜の上の両側下胸郭に沿って胸腔を注意深く開き、胸腔が開いたときに肺葉が崩壊するのを観察します。
- 両側腹側胸郭の一部を取り外して心臓を露出させます。鋭いはさみの先端を肺組織から遠ざけることによって肺の損傷を避けてください。
- 鉗子を使用してマウス首の胸腺と軟部組織を分離し、気管を露出させます。
- 気管の上端に小さな穴(直径1.2mm)を切断し、20G Y字型のIVカテーテルの先端を通過させます( 材料表を参照)。
- Y字型カテーテルの一方のアダプターポートを0.5 mLの空気でプレフィルされた3 mLシリンジに接続し、もう1つのポートを2 mLの温かい1.5%アガロース溶液(42°C)でプレフィルした3 mLシリンジに接続します。
- アガロース溶液を注入してカテーテルを満たし、カテーテルを予め切断された開口部から気管内に5〜8mmの長さで押し込む。
- アガロース溶液を約1mL/5秒でゆっくりと注入する。肺は近位から遠位軸に沿って拡張します。各肺葉の縁が膨らんだら注射を停止します。
注:肺を過度に膨らませないでください, これはそれを破裂させる可能性があるため、.若年成人マウスの肺全体を膨張させるアガロース溶液の体積は、約1.3±0.1mLである。 - 他のシリンジから0.2〜0.3mLの空気を注入して、カテーテル内の残留アガロースおよび導電性気道を遠位肺胞空間に押し込む。
- クリップは、一対の湾曲した止血鉗子で気管を閉じます( 材料表を参照)。
- 肺血管系を充填する。
- 1mLのシリンジに暖かい6%ゼラチンを充填する。針頭皮静脈カテーテルに接続し、カテーテルにゼラチン溶液を充填し、下壁に近い右心室を針で穿刺する。
- 針を右心室に長さ2〜3mm押し込み、針先を主肺動脈に向けます。
- 0.2mLのゼラチン溶液を右心室および肺動脈血管にゆっくりと注入する。
注:肺葉は、適切なゼラチン膨張でわずかに薄く見えます。 - 注射後5分間針を所定の位置に保ち、氷冷HBSS溶液を心臓と肺に注いで肺葉を冷やし、解剖ボードで体を4°Cの冷蔵庫または氷の上に合計10分間置きます。
- はさみで周囲の結合組織からマウスの肺と心臓を取り除きます。次に、各肺葉を分離し、氷上のHBSS溶液に保管します。
3. 肺葉を細いスライスに切断する
- 肺ローブをスーパーグルーで試料カラムの上部にトリミングして取り付け、葉の向きを合わせ(図1A、B)、切断方向がヒラから肺表面までのほとんどの気道に対して垂直になるようにします。
- 新鮮な細いカミソリの刃でビブラトームを使用して、肺葉を150μmのスライスに切断します。冷たいHBSS溶液を予め充填した100mm滅菌ペトリ皿にスライスを集める。
メモ:スライスを開始する前に、適切なブレード移動速度と振動周波数を設定してください。圧縮トムの一般的な設定は、速度レベル4と発振レベル4です。 - DMEM/F-12培養液(20スライス/15mL培地/ディッシュ)を充填したシャーレにスライスを移し、実験前に37°Cのインキュベーター内で一晩維持する。
注:マウスPCLSは、気道収縮応答を失うことなく約7日間培養中に維持することができる17。肺動脈の寿命は十分に評価されていない。我々の観察では、それらはDMEM/F12培地中で少なくとも3日間、無傷の構造および血管反応を保持する。長期保存のために、マウスPCLSを10%DMSOを含むDMEM/F12培地で満たされたクライオバイアル(バイアルあたり1mL培地中に5スライス)に入れ、-80°Cのイソプロピルアルコール充填容器で一晩凍結し、液体窒素中で数週間から21ヶ月間凍結保存することができる。
4. 肺内気道・動脈の収縮応答の解析
- PCLSをHBSS充填24ウェル培養プレートに各ウェルに1つずつ入れます。ウェルの中央にあるPCLSの位置を確認し、ピペットでHBSS溶液を取り出します。
- 顕微鏡下でスライス内のターゲット気道と血管を見つけ、ターゲット領域を露出させるために予めカットされた中央穴(直径2〜3mm)を備えたナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。
- メッシュの上に中空の金属ワッシャーを置き、スライスを所定の位置に保持します(図2A)。
- 600 μLのHBSS溶液を加えてPCLSを沈めます。スライスを10分間休ませてから、気道または血管のベースライン画像を記録します。
- 空のHBSS溶液をピペットで慎重に吸引し、1μMのメタコリン(MCh)または10nMのエンドセリンなどのアゴニストを含む600μLのHBSSを添加することによって、気道または血管収縮を誘導する( 材料表を参照)。
注:ツールセット標準としてのKCl刺激は、メタコリンまたはエンドセリン曝露の前には必要ではない。マウス気道における100mMのKCl刺激は、小さくて不規則な気道収縮(10%〜15%)を誘導するだけである20。同様に、同じアゴニスト、例えばメタコリンまたはセロトニンが、最初で反復的な曝露で同様の気道収縮を引き起こすことを確認したので、プライミングメタコリン刺激は義務ではない20,22。 - 内腔領域の変化が平衡状態に達するまで顕微鏡下で反応を観察し、気道または血管画像を記録して分析します。
- ピペットでMChまたはエンドセリン溶液を除去し、同じアゴニスト濃度および弛緩剤を有する新しい600μL HBSS溶液を加える。気道または血管の弛緩を観察し、記録する。
- 以下のステップに従って気道または血管反応を定量化する。
- NIHが後援するフリーソフトウェアFIJIに画像をロードします。
- ツールバーの 「ポリゴン選択」 を選択して、各フレームの気道または血管内腔の輪郭を描きます。
- [分析] を選択 >、面積>測定値を設定します。
- [分析>測定] を選択して、対象領域を定量化します。結果は、統計分析のために別のウィンドウに表示されます。
5. 気道または血管SMCのCa2+ シグナル伝達の解析
- Ca2+色素ローディングバッファーを用意する。
- Ca2+染料、オレゴングリーン488 BAPTA-1-AM(材料表を参照)、50μg(バイアル1本)、10μLのDMSOで溶解する。
- 0.2gのプルロニックF-12粉末( 材料表を参照)を1mLのDMSOに溶解し、20%プルロニック溶液を生成する。
- 10 μL の 20% プルロニック溶液と 10 μL のCa2+ 色素-DMSO 溶液を混合します。
- 200 μM のスルホブロモフタレインを含む 2 mL の HBSS 溶液に 20 μL の混合物を加えて、Ca2+ 色素担持バッファーを作ります (材料表を参照)。
- 2mLのCa2+ ローディングバッファーに15匹のマウスPCLSを入れ、30°Cで1時間インキュベートする。次いで、スライスを100μMのスルホブロモフタレインを含む2mLのHBSS溶液に、室温で蛍光色素脱エステル化のためにさらに30分間移動させる。
- SMCのCa2+ シグナリングを検出します。
- Ca2+染料を装填したスライスを大きなカバーガラスの上に置きます。
- 3mLシリンジに高真空シリコーングリースを充填します。グリースを 18 G の鈍い針で絞って、スライスの上下のカバーガラスに 2 本の平行線を描きます。
- 2本のグリースラインの間にナイロンメッシュを使用してスライスを覆います。メッシュの上に第2のカバーガラスを置き、側面にグリースで密封されたチャンバを発生させる(図3A)。
注:ナイロンメッシュは、スライスをボトムカバースリップに取り付けたままにし、40xオイルなどの高サイズの反転対物レンズの作動距離内にとどまるために不可欠です。 - HBSSまたはアゴニスト溶液を、手動または灌流システム を介して ピペッティングすることによって、一端からチャンバーに入れる。連続流体灌流の場合には、ティッシュペーパーまたは真空で他方の端から吸引することによって、チャンバから流体を除去する。
- PCLSチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。SMC23のCa2+ シグナリングを、15または30 画像/秒のレーザースキャンレートを備えたカスタムメイドの共振走査型共焦点顕微鏡で検出します。
注:また、現在広く入手可能な高速市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡を、PCLSにおける肺SMCのCa2+ シグナル伝達アッセイに適用することができます。
- SMCにおけるCa2+ 蛍光を定量化する。
- 記録された画像シーケンスをFIJIにロードし、 8ビットグレースケール>画像>タイプを選択します。
- ツールバーの [ 四角形の選択] を選択し、平滑筋セルに 5 ピクセル x 5 ピクセルの関心領域 (ROI) を定義します。
- [分析] >選択して、Ca2+ 蛍光強度を表す平均グレー値>測定値を設定します。
- SMCの収縮に伴ってROIの位置が変化する場合は、[ 分析> Ca2+ 蛍光強度をフレームごとに測定]を選択します。
- SMCのROIが画像のスタック内で同様の位置にとどまる場合は、[ 画像>スタック> Ca2+ 蛍光強度の測定スタック]を選択します。
メモ:カスタム記述のマクロを差し込むと、SMC内のROIがイメージスタック内で収縮しながら移動し、ROIのCa2+ 強度(グレー値)をフレームごとに自動的に測定するときに、SMC内のROIを追跡できます。
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Representative Results
無傷の肺内気道および動脈を保存するマウスPCLS調製物
厚さ150μmのPCLSを倒立位相差顕微鏡で観察した。マウス肺では、伝導性気道は肺内動脈を伴い、丘陵から末梢肺まで走る。マウスPCLSにおける代表的な肺気道 - 動脈束を 図2Bに示す。気道は、内腔の内面を覆う活発な繊毛拍動を有する直方体上皮細胞によって容易に同定することができる。対照的に、近くの肺動脈は、平坦な内皮によって特徴付けられる。末梢肺野に到達すると、導電性気道は呼吸管および嚢に分岐し、小さな腺房内細動脈を囲む(図2C)。
マウスPCLSを利用して肺気道と動脈収縮を評価する
メタコリン(MCh、1μM)誘導気道収縮は、 図2Bに実証される。気道収縮応答は、MChばく露後の管腔面積減少の割合によって定量化される(図2D)。対照的に、肺動脈はMCh刺激に対して応答を示さない(図2B)。気道は、1日または5日間の培養後、PCLSにおいてMChに対する同様の用量依存性収縮応答を維持する(図2D)。PCLSがエンドセリン(10nM)に曝露されると、気道および肺動脈の両方が収縮し(図2C、E)、続いてNOC-5(100μM)が弛緩を誘導した(図2E)。
マウスPCLSを利用して気道および動脈SMCのCa2+シグナル伝達を評価する
Ca2+色素装填PCLSを共焦点蛍光顕微鏡下で観察する。気道(図3B)および血管(図3C)におけるCa2+蛍光SMCは、安静状態では低く、細胞内Ca2+シグナル伝達の焦点スパークは注目に値しない。アゴニストに曝露すると、Ca2+蛍光強度はSMC内で上昇し(図3B、C)、通常は1つのスポットから細胞全体に伝播する。Ca2+蛍光波は、振動信号と同じセルに繰り返し現れます(図3D,E)。一般に、Ca2+振動の頻度は、アゴニスト濃度がプラトーレベル24に達するまで上昇するにつれて増加する。気道SMC弛緩は、Ca2+振動25の減少または停止と関連している。
図1:ビブラトームスライスのためのマウス肺葉の向き。 マウス肺葉は、セクションごとに個々のものに分離される。(A)左(1)、右頭蓋(2)、および尾葉(3)は、平らな切断面をサンプルカラムに貼り付ける前に、白い点線に沿ってヒラムの近くでトリミングされます。左葉の配置を(4)に示す。(B)右中央ローブは、サンプルカラムに直接接着することができます。右のアクセサリーローブは、そのサイズが小さいため、一般的に使用されていませんでした。異なる葉の適切な向きは、ほとんどの気道および肺血管がPCLSに横断部を提示することを確実にする。スケール バー = 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスPCLSにおける気道および肺動脈の収縮性および弛緩性応答 (A)収縮アッセイのための培養プレートウェルにおけるPCLSの配置を示す概略図。(B)HBSSの肺動脈(黒い矢印)が近くにある気道(黒い矢印)を、安静時および1μMメタコリン(MCh)への曝露後に示す代表的な画像。(c)安静時および10nMエンドセリン(Endo)への曝露時のHBSSにおける腺房内細動脈を示す代表的な画像。(D)1日(灰色の線)および5日目(黒い点線)培養後のPCLSにおけるMChに対する用量依存性気道収縮応答。各点は、2匹のマウスからの9つの気道の平均±SEMを表す。(e)10nMエンドセリン誘発気道および肺動脈収縮、続いて一酸化窒素ドナーである100μM NOC-5が誘導された弛緩を示す代表的な画像。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PCLSにおける気道および肺動脈SMCのCa2+ シグナル伝達。 (A)SMCのCa2+ イメージングのためにPCLSを焦点面に保持するための上部および下部カバーガラス、グリースシール、およびナイロンメッシュを備えたチャンバのセットアップを示す概略図。 (B)1μM MChへの曝露時および曝露後の気道SMCのCa2+ シグナル伝達を示す代表的な蛍光画像。 上皮細胞。(C)安静時および10nMエンドセリン(Endo)への曝露後の肺動脈SMCのCa2+ 蛍光画像。太字の白い矢印は肺動脈の縦軸を示し、端矢印の付いた点線は動脈壁周りの血管SMCのらせん分布を示す。スケールバー = 20 μm。Ca2+ 蛍光強度(Ft)の振動上昇は、安静状態(F0)における蛍光強度に対する比で、気道SMCにおいて1μM MCh(D)に、および肺動脈SMCにおいて10nMエンドセリン刺激に応答して(E)に応答する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PCLSの準備には、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、不均一なアガロース分布からの組織剛性の変動を避けるために、肺葉を均質に膨張させることが不可欠である。液体アガロースは、37°C未満の温度で薄いカテーテルまたは気道で急速にゲル化するので、結果として生じる遠位肺野の充填欠陥は、肺組織の硬さの格差を増加させ、ビブラトーム切片中に組織を引き裂く可能性がある。したがって、低融点アガロース溶液をウォーターバス中で42°Cに保ち、解剖テーブルで加熱ランプを使用して、迅速なアガロースゲル化を回避することができる。迅速な注射は、より高いコンプライアンスでより多くのアガロースを肺実質に押し込むことができるので、避ける必要があります。手動アガロース注射は、通常、約5〜7秒かかります。第2に、アガロース充填の最後に必要なステップは、少量の空気(〜0.2mL)を押して、アガロースを導電性気道から遠位肺胞腔に洗い流すことである。さもなければ、アガロースはゲル化し、気道収縮に抵抗するために内腔にとどまるであろう。また、肺胞内でゲル化したアガロースが所定の位置にとどまり、インキュベーター内の37°Cで再び溶けないことも注目に値します。アガロースゲルは、負の胸腔内圧によって維持されるin vivoのように肺組織の3D構造を保持する上で不可欠な役割を果たす。第三に、肺動脈をゼラチン溶液と灌流することは、PCLSにおいて動脈内腔を開いたままにするために不可欠である。ゼラチン溶液は、組織切片中の化学的および物理的刺激による血管収縮に抵抗するための機械的遮断剤として室温でゲル化する。ゼラチンの膨張がなければ、肺スライス中の肺動脈は、フェントラミン、エピネフリン、およびニフェジピンを含む高用量の混合血管拡張剤の存在下でも、通常、周囲の間質組織から崩壊および剥離する13,16。アガロースゲルとは対照的に、ゼラチンゲルは37°Cで溶融し、一晩のインキュベーション後に血管内腔から流出し、血管反応アッセイの前に動脈内腔に閉塞のないままにする。
PCLSは肺SMCをその場で保存し、ほぼin vivo状態で収縮機能を保持するため、SMC収縮の調節、特にCa2+依存メカニズムを介した調節を調査するための強力なプラットフォームとして適用されている26。特に、低倍率のマルチチャンネル共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡を用いて、気道SMCにおけるアゴニスト誘発Ca2+シグナル伝達および関連する管腔狭窄を同時に捕捉して、機構的研究に役立てることができる13、20。PCLS法を用いて測定された気道または血管応答性は、炎症性環境などの肺環境からの影響のない細胞特性、および肺における応答の神経神経支配を反映することが期待される27、28。そのため、PLCSは、本質的なものと本質的なものを区別するのに役立つ実験システムを提供します。セカンダリ SMC の変更。健康および疾患モデルにおけるSMCの収縮性調節の調査に加えて、PCLSは、出生後の肺発達中および環境侮辱への応答として気道SMCの機能的適応を探求するために、異なる年齢層から収集されてきた27。さらに、PCLSは末梢から近位肺野まで異なるサイズの気道および血管を含み、恒常性および病原性刺激下での肺SMCの収縮性を調節する領域特異的メカニズムの探索を可能にする。さらに、マウスPCLSは培養培地中の気道収縮性を7日間保持するため17、サイトカインやウイルス曝露などのSMC調節解除の危険因子を検査または検証するためのエクスビボモデルとして使用されてきた29。最後に、PCLSは血管拡張薬または気管支拡張薬をスクリーニングするための理想的なプラットフォームを提供します。特に、PCLS調製物を用いたバイオアッセイは、1匹の成体マウスが数百の肺スライスを生成することができるため、非常に費用対効果が高い。対照群および治療群で近傍PCLSを使用すると、群間サンプル変動による実験バイアスも有意に減少する。
げっ歯類とヒト肺解剖学の違いを考慮すると、ヒトPCLSはトランスレーショナルリサーチのためのより強力なツールです。しかしながら、ヒト肺組織、特に罹患した肺サンプルの入手が限られていることは、依然として課題である。対照的に、マウス肺組織、ヒト疾患のマウスモデル、およびトランスジェニックマウスモデルは、生物医学的および薬理学的研究において広く適用されており、マウスPCLSをアクセス可能で疾患に関連するシステムにしている13,30。また、肺内動脈の保存はマウスPCLS製剤においてのみ成功しており、肺高血圧症などの肺血管疾患における血管調節解除を探るユニークなツールとなっています。したがって、あらゆる疾患モデルに関連する警告にもかかわらず、マウスPCLS調製のためのプロトコルは、健康および疾患における気道および肺動脈を調査するためのex vivoプラットフォームを確立するために非常に貴重である。私たちと他の人々は、ヒトPCLSによる肺研究を報告しています31,32,33,34.私たちの経験では、ヒトPLCS製剤のプロトコルは、2%のより高いアガロース濃度、より多くのアガロース溶液(1つの肺に対して3L)、およびアガロース注射のためのメイン、ロバー、または分節気管支をカニューレを作るためのはるかに大きなサイズのカテーテルを適用することを除いて、マウスのものと類似している。マウスPLCS調製の経験は、ヒト肺スライス調製に非常に役立ちます。
肺SMC研究でPCLS製剤を使用することの多くの利点にもかかわらず、この技術の限界を認識することが重要です。第一に、PCLSは依然として静的なシステムであり、肺実質および気道を周期的に伸張する生理学的呼吸サイクルを欠いている。また、血管SMCに脈動圧および内皮細胞にせん断力を生成する血液循環も含まれていません。PCLSにおけるこれらの機械的変動は、SMCの収縮性調節を変更する可能性がある。PCLSにおける空気換気および血液循環の完全な確立は達成不可能であるにもかかわらず、少なくとも気道SMC研究のために、様々な装置で組織切片を伸ばすことによって「呼吸」PCLSを生成するために過去10年間に迷走的な努力が払われてきた35,36,37。第二に、肺SMCは限られた期間だけ収縮性を維持する。この時間制限により、PLCSはSMCの亜急性変化、例えば気道SMCの修正に6〜7日以上かかるプロセスをモデル化できなくなります。以前の研究では、SMCが収縮性タンパク質の減少のために収縮性を失うことが明らかにされているので、追加の低用量インスリンで培養培地を最適化すると、気道SMC収縮を最大12日間維持することが示されている17。最後に、PCLSのプラスミドまたはsiRNAトランスフェクションによる肺SMCの遺伝子操作は依然として成功していない。PCLSにおけるSMCのトランスフェクトに対する技術的障壁は、この方法が肺SMCの機構的研究のためのトランスジェニック動物モデルへの代替アプローチを提供するので、確かにさらなる調査を正当化する。さらに重要なことに、この技術は、トランスレーショナルリサーチにおいてヒト肺SMCの遺伝的調節を達成するための排他的な尺度である。
この記事では、よく保存された気道および肺動脈を有するマウスPCLSを調製し、それらを収縮およびCa2+ シグナル伝達アッセイに適用することについて包括的に説明する。PCLS調製は、生きた肺環境での平滑筋機能をサポートしながら、 その場で細胞への機械的な研究アクセスを可能にします。このユニークな特徴により、PCLS製剤は、健康および疾患における肺気道および血管SMCを研究するための汎用性の高いツールとなっています。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、NIH grants, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
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