Summary
El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .
Abstract
Las células del músculo liso (SMC) median la contracción de las vías respiratorias y la arteria intrapulmonar para modificar la resistencia al flujo de aire y la circulación pulmonar, respectivamente, desempeñando así un papel crítico en la homeostasis del sistema pulmonar. La desregulación de la contractilidad de SMC contribuye a varias enfermedades pulmonares, incluyendo el asma y la hipertensión pulmonar. Sin embargo, debido al acceso limitado a los tejidos y la falta de sistemas de cultivo para mantener fenotipos de SMC in vivo , los mecanismos moleculares subyacentes a la contractilidad desregulada de SMC en estas enfermedades permanecen completamente identificados. La rodaja pulmonar cortada con precisión (PCLS) ofrece un modelo ex vivo que evita estas dificultades técnicas. Como una sección de tejido pulmonar delgado y vivo, el PCLS retiene SMC en un entorno natural y permite el seguimiento in situ de la contracción de SMC y la señalización intracelular de Ca2 + que regula la contractilidad de SMC. Aquí, se proporciona un protocolo detallado de preparación de PCLS de ratón, que preserva las vías respiratorias intactas y las arterias intrapulmonares. Este protocolo implica dos pasos esenciales antes de someter el lóbulo pulmonar a corte: inflar la vía aérea con agarosa de bajo punto de fusión a través de la tráquea y rellenar los vasos pulmonares con gelatina a través del ventrículo derecho. El PCLS preparado utilizando este protocolo se puede utilizar para bioensayos para evaluar la regulación contráctil mediada por Ca2+ de SMC tanto en la vía aérea como en los compartimentos arteriales intrapulmonares. Cuando se aplica a modelos de ratón de enfermedades respiratorias, este protocolo permite la investigación funcional de SMC, proporcionando así información sobre el mecanismo subyacente de desregulación de la contractilidad de SMC en enfermedades.
Introduction
La célula del músculo liso (SMC) es un tipo de célula estructural importante en el pulmón, que reside principalmente en la pared media de las vías respiratorias y los vasos pulmonares. Los SMC se contraen para alterar el calibre luminal, regulando así el aire y el flujo sanguíneo 1,2. Por lo tanto, la regulación contráctil de los SMC es esencial para mantener la homeostasis de la ventilación del aire y la circulación pulmonar. Por el contrario, la contractilidad aberrante de SMC provoca enfermedades vasculares pulmonares o obstructivas de las vías respiratorias como el asma y la hipertensión arterial pulmonar. Sin embargo, la evaluación funcional de los SMC pulmonares se ha visto desafiada por el acceso limitado al tejido pulmonar, especialmente aquellas vías respiratorias pequeñas y microvasos en la parte distal del pulmón 2,3. Las soluciones actuales recurren a ensayos indirectos, como la medición de la resistencia al flujo de aire por Flexivent para reflejar la constricción de las vías respiratorias, y la comprobación de la presión arterial pulmonar mediante cateterismo cardíaco derecho para evaluar la vasocontracción pulmonar 4,5. Sin embargo, estos ensayos indirectos tienen múltiples desventajas, como ser confundidos por factores estructurales, no capturar la diversidad espacial de las respuestas respiratorias o vasculares en toda la escala pulmonar 6,7, e inadecuados para el estudio mecanicista de la regulación contráctil a nivel celular. Por lo tanto, se han aplicado enfoques alternativos utilizando células primarias aisladas, tiras musculares de tráquea / bronquios 8,9 o grandes segmentos vasculares10 para el estudio SMC in vitro. Sin embargo, estos métodos también tienen limitaciones. Por ejemplo, una rápida adaptación fenotípica de los SMC primarios en la condición de cultivo11,12 hace que sea problemático extrapolar los hallazgos del cultivo celular a los entornos in vivo. Además, el fenotipo contráctil de las CME en los segmentos aislados de la vía aérea proximal o vascular puede no representar las CME en el pulmón distal 6,7. Además, la medición de la fuerza muscular a nivel tisular permanece disociada de los eventos moleculares y celulares que son esenciales para la comprensión mecanicista de la regulación contráctil.
La rebanada pulmonar cortada con precisión (PCLS), una sección de tejido pulmonar vivo, proporciona una herramienta ex vivo ideal para caracterizar las SMC pulmonares en un microambiente casi in vivo (es decir, arquitectura e interacción multicelular preservada)13. Desde que los doctores Placke y Fisher introdujeron por primera vez la preparación de rodajas pulmonares a partir de pulmones de rata y hámster inflados con agarosa en ladécada de 1980 14,15, esta técnica se ha avanzado continuamente para proporcionar a los PCLS una mayor calidad y una mayor versatilidad para la investigación biomédica. Una mejora significativa es la mejora de la preservación arterial pulmonar mediante infusión de gelatina, además de la inflación pulmonar con agarosa a través de la tráquea. Como resultado, tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se mantienen intactas en el PCLS para la evaluación ex vivo 16. Además, el PCLS es viable durante un tiempo prolongado en cultivo. Por ejemplo, los PCLS de ratón no tuvieron cambios significativos en la viabilidad celular y el metabolismo durante un mínimo de 12 días en cultivo, así como, retuvieron la contractilidad de las vías respiratorias durante un máximo de 7 días17. Además, PCLS mantiene vías respiratorias o vasos de diferentes tamaños para ensayos de contracción y relajación. Además, la señalización intracelular de Ca2+ de las SMC, el factor determinante de la contractilidad celular, se puede ensayar con colorantes reporteros de Ca2+ fotografiados por un microscopio confocal o de 2 fotones13.
Teniendo en cuenta la amplia aplicación del modelo de ratón en la investigación pulmonar, aquí se describe un protocolo detallado para preparar PCLS de ratón con vías respiratorias y arterias intrapulmonares intactas para la investigación pulmonar ex vivo . Utilizando los PCLS preparados, posteriormente demostramos cómo evaluar las respuestas arteriales respiratorias y pulmonares a estímulos constrictivos o relajantes. Además, también se describe el método de carga del PCLS con colorante reportero Ca2+ y luego la obtención de imágenes de la señalización ca2+ de los SMC asociados con respuestas contráctiles o relajantes.
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Protocol
Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/B6 de tipo salvaje, de 8 semanas de edad.
1. Preparación experimental
- Prepare la solución de trabajo.
- Preparar 1 solución de sal equilibrada de Hank (HBSS, con Ca2+ y Mg2+, y pH equilibrado con 20 mM HEPES, ver Tabla de Materiales). Utilice la solución HBSS para preparar y procesar el PCLS. Mantenga la solución de HBSS fría sobre hielo cuando prepare PCLS.
- Preparar el medio de cultivo de PCLS complementando el Medio Águila Modificada de Dulbecco y F-12 (DMEM-F12) con un agente antibiótico-antimicótico (relación volumen 1:100, ver Tabla de Materiales).
- Preparar solución de agarosa al 1,5% y gelatina al 6%.
- Mezcle agarosa o gelatina en polvo de bajo punto de fusión (LMP) (consulte la Tabla de materiales) con solución de HBSS por separado en tubos de centrífuga estériles de 15 ml (o tubos de 50 ml si el volumen de solución >10 ml) hasta las concentraciones finales.
NOTA: Volumen total de solución de agarosa = 5 ml/ratón x número de ratones; solución de gelatina = 2 ml/ratón x número de ratones. - Calentar los tubos de solución en agua hirviendo hasta que el polvo se disuelva por completo. Mantenga las soluciones de agarosa y gelatina en un baño de agua a 42 °C.
NOTA: Una lámpara de calentamiento en la mesa de disección puede ser útil para mantener el ambiente de operación caliente y evitar que la solución de agarosa se solidifique antes de inyectarse en el pulmón del ratón.
- Mezcle agarosa o gelatina en polvo de bajo punto de fusión (LMP) (consulte la Tabla de materiales) con solución de HBSS por separado en tubos de centrífuga estériles de 15 ml (o tubos de 50 ml si el volumen de solución >10 ml) hasta las concentraciones finales.
- Sumerja todas las herramientas de disección, incluido un par de tijeras de disección, dos pares de pinzas curvas de microdisección y un par de pinzas hemostáticas en una solución de etanol al 70% durante al menos 20 minutos para la esterilización.
- Mantenga un vibratome listo (ver Tabla de Materiales) para seccionar el tejido pulmonar en rodajas delgadas.
- Mantenga un microscopio de contraste de fase invertido con una cámara CCD para evaluar las respuestas contráctiles vasculares o de las vías respiratorias y un microscopio confocal de barrido láser personalizado (consulte la Tabla de materiales) para evaluar la señalización de Ca2+ en las SMC pulmonares18.
2. Inflado de los pulmones del ratón con solución de agarosa y gelatina
- Sacrificar al ratón.
- Coloque el ratón en una cámara de plástico (alrededor de 750 cm3) con 5% de isoflurano. Mantenga al ratón en la cámara hasta que deje de respirar durante al menos 1 minuto.
NOTA: Otros métodos de eutanasia primaria, como la inyección intraperitoneal de ketamina (240 mg/Kg) y xilazina (32 mg/Kg)19 o pentobarbital (0,3 ml)20, se pueden aplicar como alternativas al isoflurano inhalado. - Coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección en posición supina. Fije el cuerpo en su posición fijando la cola, las patas delanteras y la cabeza con agujas de jeringa de 25 G, y desinfecte el cuerpo con un aerosol de etanol al 70%.
- Corte el abdomen del ratón con tijeras quirúrgicas (incisión, ~ 2 cm de largo x 2 cm de ancho). Luego, corte la aorta abdominal para agotar el volumen de sangre.
- Coloque el ratón en una cámara de plástico (alrededor de 750 cm3) con 5% de isoflurano. Mantenga al ratón en la cámara hasta que deje de respirar durante al menos 1 minuto.
- Infle los lóbulos pulmonares siguiendo los pasos a continuación.
- Abra la cavidad torácica con cuidado a lo largo del esternón y la caja torácica inferior bilateral por encima del diafragma, y observe cómo los lóbulos pulmonares colapsan cuando se abre la cavidad torácica.
- Retire parte de las cajas torácicas ventrales bilaterales para exponer el corazón. Evite el daño pulmonar apuntando la punta de la tijera afilada lejos del tejido pulmonar.
- Use fórceps para separar el timo y el tejido blando en el cuello del ratón para exponer la tráquea.
- Cortar un pequeño orificio (1,2 mm de diámetro) en el extremo superior de la tráquea que permita el paso de la punta de un catéter intravenoso en forma de Y de 20 G (ver Tabla de Materiales).
- Conecte un puerto adaptador del catéter en forma de Y con una jeringa de 3 ml precargada con 0,5 ml de aire y el otro puerto con una jeringa de 3 ml precargada con 2 ml de solución tibia de agarosa al 1,5 % (42 °C).
- Inyecte una solución de agarosa para llenar el catéter y luego empuje el catéter a través de la abertura precortada en la tráquea durante 5-8 mm de longitud.
- Inyecte lentamente la solución de agarosa a alrededor de 1 ml/5 s. El pulmón se expandirá a lo largo del eje proximal a distal. Detenga la inyección cuando se infle el borde de cada lóbulo pulmonar.
NOTA: No sobreinfle el pulmón, ya que esto podría romperlo. El volumen de solución de agarosa para inflar todo el pulmón de un ratón adulto joven es de aproximadamente 1,3 ± 0,1 ml. - Inyecte 0.2-0.3 ml de aire de la otra jeringa para empujar la agarosa residual en el catéter y las vías respiratorias conductoras hasta el espacio de los alvéolos distales.
- Cierre la tráquea con un par de pinzas hemostáticas curvas (consulte la Tabla de materiales).
- Rellenar la vasculatura pulmonar.
- Llene una jeringa de 1 ml con gelatina tibia al 6%. Conéctese a un catéter de vena del cuero cabelludo con aguja, llene el catéter con solución de gelatina y luego perfore el ventrículo derecho cerca de la pared inferior con la aguja.
- Empuje la aguja en el ventrículo derecho durante 2-3 mm de longitud y apunte la punta de la aguja a la arteria pulmonar principal.
- Inyecte 0,2 ml de solución de gelatina lentamente en el ventrículo derecho y los vasos arteriales pulmonares.
NOTA: Los lóbulos pulmonares parecen ligeramente más pálidos con la inflación de gelatina adecuada. - Mantenga la aguja en su lugar durante 5 minutos después de la inyección, enfríe los lóbulos pulmonares vertiendo una solución de HBSS helada sobre el corazón y el pulmón, luego coloque el cuerpo con la placa de disección en un refrigerador de 4 ° C o en hielo durante un total de 10 minutos.
- Retire el pulmón y el corazón del ratón de los tejidos conectivos circundantes con tijeras. Luego, separe cada lóbulo pulmonar y manténgalos en solución HBSS en hielo.
3. Seccionamiento de lóbulos pulmonares a rodajas finas
- Recorte y fije el lóbulo pulmonar en la parte superior de la columna de la muestra con superpegamento, y oriente el lóbulo (Figura 1A, B) para permitir que la dirección de corte sea perpendicular a la mayoría de las vías respiratorias desde la hila hasta la superficie pulmonar.
- Use un vibratome con una cuchilla de afeitar fina y fresca para cortar el lóbulo pulmonar en rodajas de 150 μm. Recoger las rodajas en placas de Petri estériles de 100 mm prellenadas con solución fría de HBSS.
NOTA: Establezca la velocidad de movimiento de la cuchilla y la frecuencia de oscilación adecuadas antes de comenzar a cortar. Una configuración típica para un Compresstom es el nivel de velocidad 4 y el nivel de oscilación 4. - Transfiera las rebanadas a placas de Petri rellenas con medio de cultivo DMEM/F-12 (20 rebanadas/15 ml de medio/plato) y manténgalas en una incubadora de 37 °C durante la noche antes de los experimentos.
NOTA: Los PCLS de ratón se pueden mantener en cultivo durante aproximadamente 7 días sin perder las respuestas contráctiles de las vías respiratorias17. La longevidad de las arterias pulmonares no se ha evaluado a fondo. En nuestra observación, conservan la estructura intacta y la vasoreacción durante al menos 3 días en medio DMEM/F12. Para el almacenamiento a largo plazo, los PCLS de ratón se pueden colocar en crioviales llenos de medio DMEM/F12 que contienen 10% de DMSO (5 rodajas en medio de 1 ml por vial), congelados en un recipiente lleno de alcohol isopropílico a -80 °C durante la noche y criopreservados en nitrógeno líquido durante semanas a meses21.
4. Análisis de las respuestas contráctiles de las vías respiratorias y arterias intrapulmonares
- Coloque los PCLS en una placa de cultivo de 24 pocillos llena de HBSS, una en cada pozo. Ubique el PCLS en el centro del pozo y, a continuación, retire la solución HBSS con una pipeta.
- Encuentre la vía aérea y el vaso objetivo en la rebanada bajo el microscopio, luego cubra la rebanada con una malla de nylon con un orificio central precortado (2-3 mm de diámetro) para exponer el área objetivo.
- Coloque una arandela de metal hueca en la parte superior de la malla para mantener las rodajas en su lugar (Figura 2A).
- Añadir 600 μL de solución HBSS para sumergir el PCLS. Descanse la rebanada durante 10 minutos, luego registre las imágenes de referencia de las vías respiratorias o los vasos.
- Induzca la contracción de las vías respiratorias o vascular succionando cautelosamente la solución de HBSS en blanco con una pipeta y agregando 600 μL de HBSS con un agonista, como 1 μM de metacolina (MCh) o 10 nM de endotelina (ver Tabla de Materiales).
NOTA: La estimulación de KCl como estándar de conjunto de herramientas no es necesaria antes de la exposición a metacolina o endotelina. 100 mM de estimulación de KCl en las vías respiratorias del ratón sólo induce una contracción pequeña e irregular de las vías respiratorias (10%-15%)20. Del mismo modo, una estimulación cebadora de metacolina no está obligada, ya que hemos confirmado que el mismo agonista, por ejemplo, metacolina o serotonina, desencadena una contracción similar de las vías respiratorias en la primera y repetitiva exposición20,22. - Observe la reacción bajo el microscopio hasta que el cambio en el área luminal alcance un estado equilibrante, y luego registre las imágenes de las vías respiratorias o vasculares para su análisis.
- Retire la solución de MCh o endotelina con una pipeta y agregue una nueva solución hbSS de 600 μL con la misma concentración de agonistas y un relajante; observar y registrar la relajación de las vías respiratorias o vascular.
- Cuantifique la reacción vascular o de las vías respiratorias siguiendo los pasos a continuación.
- Cargue las imágenes en el software gratuito FIJI patrocinado por los NIH.
- Seleccione la Selección de polígono en la barra de herramientas para delinear la luz de las vías respiratorias o vascular en cada fotograma.
- Elija Analizar > Establecer medidas > área.
- Elija Analizar > medir para cuantificar el área de interés. Los resultados se muestran en una ventana separada para el análisis estadístico.
5. Análisis de la señalización de Ca2+ de las SMC de las vías respiratorias o vasculares
- Prepare el tampón de carga de tinte Ca2+ .
- Disolver el colorante Ca2+ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (ver Tabla de Materiales), 50 μg (un vial) con 10 μL de DMSO.
- Disolver 0,2 g de polvo de Pluronic F-12 (ver Tabla de Materiales) en 1 mL de DMSO para generar una solución Pluronic al 20%.
- Mezclar 10 μL de solución plurónica al 20% con 10 μL de solución de colorante Ca2+ -DMSO.
- Haga tampón de carga de colorante Ca2+ agregando 20 μL de la mezcla a 2 ml de solución HBSS con 200 μM de sulfobromoftaleína (ver Tabla de materiales).
- Coloque 15 PCLS de ratón en 2 ml de tampón de carga Ca2+ e incube a 30 °C durante 1 h. Luego mueva las rodajas a 2 ml de solución de HBSS con 100 μM de sulfobromoftaleína durante 30 minutos adicionales para la desesterificación de colorantes fluorescentes a temperatura ambiente.
- Detectar la señalización de Ca2+ de los SMC.
- Coloque las rodajas cargadas de tinte Ca2+ en un vaso de cubierta grande.
- Llene una jeringa de 3 ml con grasa de silicona de alto vacío. Exprima la grasa a través de una aguja embotada de 18 G para dibujar dos líneas paralelas a través del vidrio de la cubierta por encima y por debajo de la rebanada.
- Cubra la rebanada con una malla de nylon entre dos líneas de grasa. Coloque el vidrio de la segunda cubierta en la parte superior de la malla para generar una cámara sellada por grasa en los lados (Figura 3A).
NOTA: La malla de nylon es esencial para mantener la rebanada unida a la cubierta inferior y así mantenerse dentro de la distancia de trabajo de un objetivo invertido de alta magnitud, como el aceite 40x. - Agregue HBSS o solución agonista a la cámara desde un extremo mediante pipeteo manual o a través de un sistema de perfusión . Retire el líquido de la cámara succionando desde el otro extremo con papel de seda o vacío en el caso de perfusión continua de líquido.
- Coloque la cámara PCLS en el escenario del microscopio. Detecte la señalización Ca2+ de SMC23 con un microscopio confocal de barrido resonante personalizado con una velocidad de escaneo láser de 15 o 30 imágenes/s.
NOTA: Alternativamente, se puede aplicar un microscopio confocal de escaneo láser comercial de alta velocidad, ampliamente disponible en la actualidad, en el ensayo de señalización Ca2 + de SMC pulmonares en PCLS.
- Cuantificar la fluorescencia de Ca2+ en SMC.
- Cargue la secuencia de imágenes grabadas en FIJI y elija el Tipo de > de imagen > escala de grises de 8 bits.
- Seleccione la Selección de rectángulo en la barra de herramientas y defina una región de interés (ROI) de 5 píxeles x 5 píxeles en una célula muscular lisa.
- Elija Analizar > Establecer mediciones > valor gris medio , que representa la intensidad de fluorescencia Ca2+ .
- Si la posición de un ROI cambia con la contracción de SMC, elija Analizar > Medir la intensidad fluorescente Ca2+ fotograma a fotograma.
- Si el ROI de SMC permanece en una posición similar en una pila de imágenes, elija > pilas de > medir de la intensidad fluorescente Ca2+ .
NOTA: Se puede conectar una macro escrita a medida para realizar un seguimiento del ROI dentro del SMC cuando se mueve con contracción en una pila de imágenes y mide automáticamente la intensidad de Ca2+ (valor gris) del ROI fotograma a fotograma.
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Representative Results
Preparación de PCLS de ratón que preserva intactas las vías respiratorias y arterias intrapulmonares
Se observó un PCLS de 150 μm de espesor bajo el microscopio de contraste de fase invertido. En los pulmones de ratón, las vías respiratorias conductoras se acompañan de arterias intrapulmonares, que van desde el hilio hasta el pulmón periférico. En la Figura 2B se muestra un haz representativo de las vías respiratorias pulmonares-arteria en un PCLS de ratón. Las vías respiratorias se pueden identificar fácilmente por las células epiteliales cuboidales con latidos ciliales activos que recubren la superficie interna de la luz. En contraste, la arteria pulmonar cercana se presenta por endotelio plano. Al llegar al campo pulmonar periférico, las vías respiratorias conductoras se ramifican en conductos y sacos respiratorios, rodeando las pequeñas arteriolas intraacinares (Figura 2C).
Utilización de PCLS de ratón para evaluar las vías respiratorias pulmonares y la contracción arterial
La contracción de las vías respiratorias inducida por metacolina (MCh, 1 μM) se demuestra en la Figura 2B. Las respuestas contráctiles de las vías respiratorias se cuantifican por el porcentaje de reducción del área luminal después de la exposición a MCh (Figura 2D). Por el contrario, la arteria pulmonar no presenta respuesta a los estímulos de MCh (Figura 2B). Las vías respiratorias mantienen respuestas contráctiles similares dependientes de la dosis a la MCh en el PCLS después de un cultivo de 1 o 5 días (Figura 2D). Cuando el PCLS se expone a la endotelina (10 nM), tanto las vías respiratorias como las arterias pulmonares se contraen (Figura 2C,E), seguidas de NOC-5 (100 μM) inducida por la relajación (Figura 2E).
Utilización de PCLS de ratón para evaluar la señalización de Ca2+ de la vía aérea y el SMC arterial
El PCLS cargado con colorante Ca2+ se observa bajo un microscopio fluorescente confocal. La fluorescencia de Ca2+ en los SMC de las vías respiratorias (Figura 3B) y vascular (Figura 3C) es baja en estado de reposo, sin chispa focal de señalización intracelular de Ca2+ notable. Tras la exposición a agonistas, la intensidad de fluorescencia de Ca2+ se eleva en el SMC (Figura 3B, C), generalmente desde un punto y luego se propaga a toda la célula. Las ondas fluorescentes Ca2+ aparecen repetidamente en la misma célula como señales oscilatorias (Figura 3D,E). En general, la frecuencia de oscilación de Ca2+ aumenta a medida que aumenta la concentración de agonistas hasta alcanzar un nivel de meseta24. La relajación del SMC de las vías respiratorias se asocia con la disminución o el cese de las oscilaciones de Ca2+ 25.
Figura 1: Orientación de los lóbulos pulmonares del ratón para el corte de vibratome. Los lóbulos pulmonares del ratón se separan en individuales por secciones. (A) Los lóbulos izquierdo (1), craneal derecho (2) y caudal (3) se recortan cerca del hilio a lo largo de las líneas punteadas blancas antes de pegar la superficie de corte plana en la columna de muestra. La colocación del lóbulo izquierdo se muestra en (4). (B) El lóbulo medio derecho se puede pegar directamente a la columna de muestra. El lóbulo accesorio derecho no se usaba comúnmente debido a su pequeño tamaño. La orientación adecuada de los diferentes lóbulos asegura que la mayoría de las vías respiratorias y los vasos pulmonares presenten secciones transversales en el PCLS. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Respuestas contráctiles y relajantes de las vías respiratorias y las arterias pulmonares en PCLS de ratón. (A) Esquema que muestra la colocación de un PCLS en una placa de cultivo bien para el ensayo de contracción. (B) Imágenes representativas que muestran una vía aérea (flechas negras) con una arteria pulmonar cercana (puntas de flecha negras) en HBSS en reposo y después de la exposición a 1 μM de metacolina (MCh). (C) Imágenes representativas que muestran una arteriola intraacinar en HBSS en reposo y tras la exposición a 10 nM de endotelina (Endo). (D) Respuestas contráctiles de las vías respiratorias dependientes de la dosis a la MCh en PCLS después de un cultivo de 1 día (línea gris) y 5 días (línea punteada negra). Cada punto representa el promedio ± SEM de nueve vías respiratorias de dos ratones. (E) Imágenes representativas que muestran 10 nM de contracción arterial pulmonar y de las vías respiratorias inducida por endotelina, seguida de 100 μM de NOC-5, un donante de óxido nítrico, indujeron relajación. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Señalización de Ca2+ de las SMC arteriales respiratorias y pulmonares en el PCLS. (A) Esquema que muestra la configuración de una cámara con un vidrio de cubierta superior e inferior, sello de grasa y una malla de nylon para sostener un PCLS en el plano focal para imágenes de Ca2+ de SMC. (B) Imágenes fluorescentes representativas que muestran la señalización de Ca2+ de los SMC de las vías respiratorias en reposo y después de la exposición a 1 μM MCh. Epi, célula epitelial. (C) Imágenes fluorescentes de Ca2+ de SMC arteriales pulmonares en reposo y después de la exposición a 10 nM de endotelina (Endo). Las flechas blancas en negrita indican el eje longitudinal de la arteria pulmonar, y las líneas punteadas con flechas finales indican la distribución helicoidal de los SMC vasculares alrededor de la pared arterial. Barra de escala = 20 μm. Elevación oscilatoria de la intensidad de fluorescencia Ca2+ (Ft), en relación con la intensidad de fluorescencia en condición de reposo (F0), en un SMC de la vía aérea a 1 μM MCh (D) y en un SMC arterial pulmonar en respuesta a la estimulación de endotelina de 10 nM (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La preparación de PCLS implica varios pasos críticos. En primer lugar, es esencial inflar el lóbulo pulmonar de manera homogénea para evitar la variación de la rigidez del tejido por la distribución desigual de la agarosa. A medida que la agarosa líquida se gelifica rápidamente en catéteres delgados o vías respiratorias a una temperatura inferior a 37 ° C, el defecto de llenado resultante en el campo pulmonar distal podría aumentar la disparidad de rigidez del tejido pulmonar y causar desgarro del tejido durante la sección del vibratoma. Por lo tanto, se puede practicar mantener la solución de agarosa de baja fusión a 42 ° C en un baño de agua y usar una lámpara de calentamiento en la mesa de disección para evitar la gelificación rápida de agarosa. Una inyección rápida podría empujar más agarosa al parénquima pulmonar con mayor cumplimiento, por lo tanto, debe evitarse. La inyección manual de agarosa generalmente toma alrededor de 5-7 s. En segundo lugar, un paso necesario al final del relleno de agarosa es empujar una pequeña cantidad de aire (~ 0.2 ml) para enjuagar la agarosa desde la vía aérea conductora hasta el espacio de los alvéolos distales. De lo contrario, la agarosa se gelificaría y permanecería en la luz para resistir la contracción de las vías respiratorias. También vale la pena señalar que la gelificación de agarosa dentro de los alvéolos permanece en su lugar y nunca se derrite nuevamente a 37 ° C en la incubadora. El gel de agarosa juega un papel esencial en la retención de la estructura 3D del tejido pulmonar como in vivo mantenido por la presión intratorácica negativa. En tercer lugar, la perfusión de las arterias pulmonares con solución de gelatina es esencial para mantener la luz arterial abierta en el PCLS. La solución de gelatina se gelifica a temperatura ambiente como un bloqueador mecánico para resistir la vasoconstricción sobre los estímulos químicos y físicos durante la sección del tejido. Sin inflación de gelatina, las arterias pulmonares en las rodajas pulmonares generalmente colapsan y se desprenden del tejido intersticial circundante, incluso en presencia de altas dosis de agentes vasodilatadores mixtos, incluyendo fentolamina, epinefrina y nifedipino13,16. A diferencia de un gel de agarosa, el gel de gelatina se derrite a 37 ° C, fluyendo fuera de la luz vascular después de la incubación durante la noche, dejando la luz arterial libre de obstrucción antes del ensayo de reacción vascular.
Como el PCLS preserva los SMC pulmonares in situ y conserva su función contráctil en una condición casi in vivo, se ha aplicado como una plataforma poderosa para investigar la regulación de la contracción SMC, especialmente la regulación a través de mecanismos dependientes de Ca2+ 26. En particular, con un microscopio confocal multicanal o de dos fotones de bajo aumento, la señalización de Ca2+ inducida por agonistas en las SMC de las vías respiratorias y la constricción luminal asociada se pueden capturar simultáneamente para el estudio mecanicista13,20. Se espera que la capacidad de respuesta respiratoria o vascular medida mediante el método PCLS refleje las propiedades celulares libres de influencias del entorno pulmonar, como el medio inflamatorio y la inervación neural de la respuesta en el pulmón27,28. Como tal, el PLCS proporciona un sistema experimental para ayudar a distinguir lo intrínseco de lo intrínseco de lo que es. modificación de SMC secundarios. Además de investigar la regulación contráctil de los SMC en modelos de salud y enfermedad, se han recogido PCLS de diferentes grupos de edad para explorar la adaptación funcional del SMC de las vías respiratorias durante el desarrollo pulmonar postnatal y en respuesta a los insultos ambientales27. Además, los PCLS contienen vías respiratorias y vasos sanguíneos de diferentes tamaños desde el campo pulmonar periférico hasta el proximal, lo que permite la investigación de un mecanismo específico de la región para regular la contractilidad pulmonar de las SMC en la homeostasis y bajo estímulos patógenos. Además, como los PCLS de ratón retienen la contractilidad de las vías respiratorias en el medio de cultivo durante 7 días17, se han utilizado como modelo ex vivo para examinar o validar los factores de riesgo para la desregulación de SMC, como la exposición a citoquinas o virus29. Por último, PCLS proporciona una plataforma ideal para detectar medicamentos vasodilatadores o broncodilatadores. En particular, los bioensayos que utilizan la preparación de PCLS son altamente rentables, ya que un ratón adulto puede generar cientos de cortes de pulmón. El uso de PCLS vecinos en los grupos de control y tratamiento también reduce significativamente el sesgo experimental de la variación de la muestra intergrupal.
Teniendo en cuenta la diferencia entre la anatomía pulmonar humana y de roedores, el PCLS humano es una herramienta más poderosa para la investigación traslacional. Sin embargo, la disponibilidad limitada de tejido pulmonar humano, especialmente muestras de pulmón enfermas, sigue siendo un desafío. En contraste, el tejido pulmonar de ratón, los modelos de ratón de enfermedades humanas y los modelos de ratón transgénico se aplican ampliamente en la investigación biomédica y farmacológica, lo que hace que el PCLS de ratón sea un sistema accesible y relevante para la enfermedad13,30. Además, la preservación de las arterias intrapulmonares ha tenido éxito solo en la preparación de PCLS de ratón, lo que la convierte en una herramienta única para explorar la desregulación vascular en enfermedades vasculares pulmonares como la hipertensión pulmonar. Por lo tanto, a pesar de las advertencias asociadas con cualquier modelo de enfermedad, un protocolo para la preparación de PCLS en ratones es invaluable para establecer una plataforma ex vivo para investigar las vías respiratorias y las arterias pulmonares en la salud y la enfermedad. Nosotros y otros hemos reportado investigación pulmonar con PCLS humanos 31,32,33,34. En nuestra experiencia, el protocolo de preparación de PLCS humanos es similar al del ratón, excepto la aplicación de una mayor concentración de agarosa del 2%, más solución de agarosa (3 L para un pulmón) y catéteres de mucho mayor tamaño para cannular bronquios principales, lobares o segmentarios para la inyección de agarosa. La experiencia en la preparación de PLCS de ratón ayuda enormemente con la preparación de rodajas de pulmón humano.
A pesar de las numerosas ventajas de usar la preparación de PCLS en la investigación pulmonar de SMC, es crucial ser consciente de las limitaciones de esta técnica. En primer lugar, el PCLS sigue siendo un sistema estático, carente de ciclos fisiológicos de respiración que estiran periódicamente el parénquima pulmonar y las vías respiratorias. Tampoco contiene circulación sanguínea, lo que genera presión pulsiva sobre los SMC vasculares y fuerzas de cizallamiento sobre las células endoteliales. Estas variaciones mecánicas en el PCLS podrían modificar la regulación contráctil de los SMC. A pesar de que un establecimiento completo de la ventilación del aire y la circulación sanguínea en los PCLS es inalcanzable, al menos para el estudio SMC de las vías respiratorias, se han realizado esfuerzos vagarios en la última década para generar un PCLS de "respiración" mediante el estiramiento de la sección de tejido con una variedad de dispositivos 35,36,37. En segundo lugar, las SMC pulmonares mantienen su contractilidad solo por un período limitado. Este límite de tiempo impide que el PLCS modele los cambios subagudos de los SMC, por ejemplo, un proceso que tarda más de 6-7 días en modificar los SMC de las vías respiratorias. Dado que investigaciones anteriores revelan que las SMC pierden contractilidad debido a una disminución de las proteínas contráctiles, se ha demostrado que la optimización del medio de cultivo con una dosis baja adicional de insulina mantiene la contracción de SMC de las vías respiratorias durante un máximo de 12 días17. Por último, la manipulación genética de los SMC pulmonares por transfección por plásmido o siRNA del PCLS sigue sin tener éxito. La barrera técnica para transfectar las SMC en el PCLS ciertamente justifica una mayor investigación, ya que este método proporciona un enfoque alternativo al modelo animal transgénico para el estudio mecanicista de las SMC pulmonares. Más importante aún, esta técnica es la medida exclusiva para lograr la modulación genética de las SMC pulmonares humanas en la investigación traslacional.
Este artículo proporciona una descripción completa de la preparación de PCLS de ratón con vías respiratorias y arterias pulmonares bien conservadas y su aplicación en los ensayos de contracción y señalización de Ca2+ . La preparación de PCLS apoya el funcionamiento del músculo liso en un entorno pulmonar vivo al tiempo que permite el acceso del estudio mecanicista a las células in situ. Esta característica única ha hecho de la preparación de PCLS una herramienta versátil para estudiar las vías respiratorias pulmonares y las SMC vasculares en la salud y las enfermedades.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo está respaldado por subvenciones de los NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
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