Summary
우리는 인간 심실 심근 조직의 생체 외 배양을 위한 프로토콜을 제시한다. 수축력 및 동역학에 대한 상세한 분석뿐만 아니라 생체 내 생리 환경을보다 면밀히 모방하기 위해 사전 및 후부하의 적용을 허용합니다.
Abstract
심근세포 배양은 2차원(2D) 세포 배양에서 iPSC 유래 오가노이드에 이르기까지 방대한 수의 발전을 이뤘다. 2019 년에는 심근 수축의 생체 내 상태에 접근하면서 인간 심장 샘플에서 얻은 심근 절편을 배양하는 생체 외 방법이 입증되었습니다. 이 샘플은 주로 심장 이식 또는 좌심실 보조 장치 배치에서 비롯됩니다. 비브라톰과 특별히 개발된 재배 시스템을 사용하여 300μm 두께의 슬라이스를 고정된 와이어와 스프링 와이어 사이에 배치하여 몇 주 동안 안정적이고 재현 가능한 재배가 가능합니다. 재배하는 동안 조각은 개별 설정에 따라 지속적으로 자극됩니다. 수축은 실시간으로 표시되고 기록 될 수 있으며 약리학 적 제제를 쉽게 적용 할 수 있습니다. 사용자-정의된 자극 프로토콜은 일시정지-강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터를 평가하기 위해 스케줄링되고 수행될 수 있다. 더욱이, 상기 시스템은 보다 생리학적 재배를 위한 가변 사전-후 하중 설정을 가능하게 한다.
여기에서, 우리는 상업적 생체 모방 재배 용액을 사용하여 인간 좌심실 심근 절편의 성공적인 장기 배양을 생성하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제시합니다.
Introduction
지난 10년 동안, 심근 세포의 시험관내 배양은 2D 및 3차원(3D) 기술에서부터 심장 심근세포 1,2,3으로 분화된 오가노이드 및 유도만능 줄기 세포의 사용에 이르기까지 큰 발전을 이루었다. Ex vivo 및 일차 세포 배양은 특히 유전 연구 및 약물 개발 4,5,6에 큰 가치를 지닌다. 인간 조직을 사용하면 결과의 번역 값이 향상됩니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 조직의 장기적인 3D 배양은 잘 확립되어 있지 않습니다. 손상되지 않은 기하학은 적절한 심장 기능, 다른 세포 간의 의사 소통 및 세포 - 매트릭스 상호 작용이 전제 조건이기 때문에 생체 내 조건을 모방하는 핵심 기능입니다. 심근 조직 재배는 다양한 발달 단계를 거쳤습니다. 생체외 심근 조직 배양의 성공률과 안정성은 처음에는 상당히 낮았지만, 최근의 접근법은 유망한 결과 7,8,9,10,11을 산출했다.
그 중에서도, Fischer 등은 인간 심근 조직의 생존력 및 수축성 성능이수년 7주 동안 생체외 세포 배양에서 유지될 수 있다는 것을 최초로 입증하였다. 그들의 기술은 외래 된 인간 심근에서 절단 된 얇은 조직 조각을 기반으로했으며, 이는 정의 된 생체 역학 조건과 지속적인 전기 자극을 제공하는 새로 개발 된 재배 챔버에 장착되었습니다. 이 배양 방법은 심근 조직의 생체 내 기능과 매우 유사하며 여러 독립적 인 연구 그룹2,12,13,14,15에 의해 재현되었습니다. 중요하게도, Fischer et al.이 사용하는 챔버는 또한 최대 4 개월 동안 개발 된 힘의 지속적인 등록을 가능하게하여 손상되지 않은 인간 심근에 대한 생리 학적 및 약리학 적 연구를위한 전례없는 기회를 열었습니다7.
유사한 기술이 다른 그룹에 의해 독립적으로 개발되어 인간, 래트, 돼지 및 토끼 심근7,10,11에 적용되었다. Pitoulis et al.은 수축 사이클 동안 정상적인 힘-길이 관계를 재현하는 보다 생리학적인 방법을 개발했지만, 고처리량 분석(16)에는 덜 적합하다. 이와 같이, 생체모방 재배의 일반적인 접근법은 동물 실험의 감소, 정제 및 대체(3R)를 위한 추가의 단계로 간주될 수 있다.
그러나 이러한 잠재력을 활용하려면 표준화된 절차, 높은 콘텐츠 분석 및 높은 처리량 수준이 필요합니다. 우리는 상용화 된 생체 모방 재배 시스템에서 살아있는 인간 심근의 자동화 된 슬라이싱과 시험관 내 유지 보수를 결합한 기술을 제시합니다 ( 재료 표 참조). 제안된 접근법으로, 단일 경막 심근 표본으로부터 생성될 수 있는 개별 슬라이스의 수는 처리 시간에 의해서만 제한된다. 충분한 크기와 품질 (3cm x 3cm)의 표본은 종종 자동화 된 vibratome으로 편리하게 절단되는 20-40 개의 조직 조각을 산출합니다. 이들 슬라이스는 시스템에 속하는 재배 챔버에 배치될 수 있다. 챔버는 전기 자극을 허용하며, 그 파라미터는 변조 될 수 있습니다 (즉, 펄스 지속 시간, 극성, 속도 및 전류), 챔버 내부의 스프링 와이어를 사용하여 사전 및 후부하의 조정. 각 슬라이스의 수축은 스프링 와이어에 부착 된 작은 자석의 움직임으로부터 등록되고 해석 가능한 그래프로 표시됩니다. 데이터는 항상 기록되고 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 일정한 기준선 페이싱을 제외하고, 스케줄링된 프로토콜은 그들의 내화 기간, 자극 임계치, 포스트-일시정지-강화 및 힘-주파수 관계를 기능적으로 평가하기 위해 수행될 수 있다.
개별 심장에서 여러 심근 절편의 이러한 장기간의 생체 모방 배양은 인간과 동물 조직 모두에서 미래의 생체 외 연구를위한 길을 열어주고 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한 스크리닝을 용이하게합니다. 이미 다양한 실험적 접근법 2,12,13,15에 적용되었다. 여기에서는 인간 조직 준비에 대한 자세한 단계별 설명을 제공하고 자주 발생하는 재배 문제에 대한 솔루션을 제공합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 실험을위한 조직 수집은 뮌헨 대학 (University of Munich)과 루르 대학 보훔 (Ruhr-University Bochum)의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았다. 연구는 헬싱키 선언 지침에 따라 수행되었습니다. 환자들은 조직 수집 전에 서면 정보에 입각 한 동의를했습니다.
1. 조직 획득
- 심장 이식 또는 심장 수술을받는 환자로부터 인간 조직을 얻습니다.
- 조직을 조달하기 전에 2 L의 심흉막 용액 (슬라이스 버퍼 (표 1)이라고도 함)을 준비하십시오.
- 4 cm x 4 cm 크기의 경막 좌심실 (LV) 생검을 얻은 후, 조직을 즉시 (절제 후 5 분 이내) 대략 70 mL의 차가운 (4°C) 슬라이스 완충액을 함유하는 클로서블 플라스틱 일회용 멸균 비이커에 넣는다. 4°C에서 유지하십시오.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 슬라이싱 버퍼는 최대 36시간 동안 조직의 냉장 보관(4°C)을 허용합니다. 이것은 실험실에 가깝지 않은 클리닉에서 조직의 차가운 수송을 허용합니다. 그러나 24 시간≤ 운송 시간이 최적 인 것으로 입증되었습니다.
2. 아가로스와 비브라톰 준비
- 충분한 재배 챔버가 준비되고 멸균되었는지 확인하십시오 (그림 1A).
- 챔버 및 흑연 전극을 1 L의 10% 이소프로판올 용액에 침지시키고 밤새 교반한다. 다음날, 챔버를 3분 동안 100% 이소프로판올 용액으로 옮기고 흑연 전극을 120°C에서 10분 동안 오토클레이브한다.
- 챔버와 흑연 전극을 층류 후드 아래에서 공기 건조시키십시오.
- 로커의 사용 가능한 위치에 따라 회로 기판을 각 챔버에 부착하십시오. 제조업체의 지침에 따라 두 개의 흑연 전극을 회로 기판에 놓습니다.
- 오염을 방지하기 위해 챔버 위에 35mm 페트리 접시 뚜껑을 놓습니다.
- 시스템을 컴퓨터에 연결하여 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 Myodish 재배 시스템(재료 표 참조)을 설정합니다(그림 1B).
- 4% 저용융 아가로스를 슬라이싱 완충액 (글루코스 없이; 표 2). 상기 아가로오스는 4°C에서 6개월 동안 보관될 수 있다.
- 실험 당일에, 80°C에서 설정된 수조를 사용하여 스톡 부피의 아가로스 용액을 용융시킨다. 양에 따라 녹는 데 약 30 분이 걸립니다.
- 아가로스가 액체일 때, 액체 아가로스 8 mL를 10 mL 주사기에 넣고 2 mL의 공기를 추가로 넣는다. 주사기를 멸균 캡으로 닫고 37°C 수조에 20분 동안 거꾸로 놓고, 아가로오스가 응고되는 것을 방지하고, 그 온도를 평형화시켜 샘플의 온열 손상을 방지한다.
- 존재하는 경우, 조직 슬라이싱 적어도 30분 전에 비브라톰의 수냉 장치를 켜서 충분한 냉각 용량을 허용한다. 물 순환의 온도를 4 °C로 설정하십시오.
참고: 여기에 사용된 절단 트레이와 냉각판에는 모두 물 순환 기능이 내장되어 있었습니다. 이는 냉각 및 오염 위험을 낮추기 위해 적극 권장됩니다. 그러나 얼음을 냉각 기술로 사용하는 것도 가능합니다. 또한, 수냉 장치는 프로토콜의 이 시점에서 비브라톰의 절단 트레이 및/또는 냉각 플레이트에 연결될 필요가 없다. - 비브라톰의 슬라이싱 트레이와 샘플 플레이트를 청소하려면 모든 표면을 100% 이소프로판올로 3분 이상 플러싱합니다.
참고: 사용되는 비브라톰 시스템에 따라 비브라톰 설정이 다를 수 있습니다. 설치 및 블레이드 교정 방법에 대한 정보는 실험실에 있는 비브라톰의 설명서를 참조하십시오. - 절단 트레이를 최대 90 % -95 %까지 슬라이싱 버퍼로 채 웁니다. 현재 사용되는 셋업에서, 이것은 대략 400 mL에 해당한다. 수냉 장치의 튜브를 비브라톰의 절단 트레이 및 냉각 플레이트의 밸브에 연결합니다.
- 준비에 필요한 모든 도구를 5 초 동안 100 % 이소프로판올 용액에 담그면 소독됩니다. 이소프로판올 용액에서 공구를 제거하고 층류 후드 아래에서 공기 건조하십시오.
3. 트리밍 및 샘플 임베딩
- 조직 샘플을 차가운 슬라이싱 버퍼로 채워진 100 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 접시를 4 °C의 냉각 플레이트 위에 보관하십시오 (냉각기에 연결하거나 얼음 위에 놓으십시오).
- 핀셋으로 심내막을 잡고 가위를 사용하여 약 3mm의 심내막 조직을 잘라내어 심내막 섬유주를 제거합니다. 같은 방법으로, 심외막 아래의 과도한 지방 조직이있는 경우 제거하십시오.
- 절단된 조직 샘플을 상향 조정하고, 정사각형 위치에 고정되는 네 개의 0.9 mm x 70 mm 20 G 바늘을 사용하여 2 cm x 2 cm 고무 패치로 고정시킨다 (0.9 cm x 0.9 cm; 그림 1C, D). 각 바늘 팁의 대각선 가장자리가 안쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. 이것은 고정을 강화하고 심근의 손상을 방지합니다.
주의: 위에서 언급한 사각형의 방향은 예상되는 우세한 근섬유 방향에 직교해야 합니다. - 메스를 사용하여 네 바늘 사각형 외부의 모든 과도한 조직을 잘라냅니다. 원래 샘플의 크기가 허용하는 경우 동일한 원시 샘플에서이 준비 중에 두 개의 심근 조직 샘플을 사용하십시오.
- 핀셋을 사용하여 트리밍된 샘플을 멸균된 조직 조각에 올려 놓고 샘플에 남아 있는 과도한 슬라이싱 버퍼를 제거합니다. 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 샘플을 10초 이상 조직에 보관하지 마십시오.
- 샘플을 35mm 페트리 접시에 넣어 블레이드가 심근세포 정렬에 수직으로 절단되고 심외막이 아래쪽을 향하도록 합니다. 준비물에 두 개의 샘플이 포함되어 있는 경우 샘플이 가운데에 있는지 확인하고 서로 만지지 마십시오.
- 수조에서 아가로스 주사기를 가져 와서 샘플을 아가로스에 담그십시오. (그림 2A). 아가로스를 냉각판에서 5 분 동안 응고시키십시오. 샘플은 페트리 접시와 접촉해야합니다.이 접시는 절단면이 지배적 인 심근 섬유 방향과 평행 할 수 있도록합니다.
주의: 기포를 방지하기 위해 주사기를 완전히 비우지 마십시오. 샘플의 침수 중에 주사기에 남아있는 아가로스의 양에주의하십시오. 샘플이있는 접시에 기포가있는 경우 조심스럽게 기포를 주사기로 다시 당깁니다.
4. 절단 트레이에 샘플을 배치
- 주걱 또는 유사한 도구를 사용하여 35 mm 페트리 접시로부터 샘플(들)을 함유하는 고형화된 아가로스를 제거하고, 이를 샘플과 페트리 접시의 측면 사이에 엮어서 제거한다. 샘플을 덮은 채로 메스를 사용하여 아가로스 중 일부를 잘라냅니다.
주의: 아가로스를 너무 많이 제거하지 마십시오. X/Z 평면의 길고 짧은 면에 최소 5mm의 아가로오스가 남아 있어야 합니다.
참고: 4.2-4.4단계는 빠른 연속(즉, 최대 5초)으로 수행해야 합니다. 시작하기 전에 필요한 모든 도구를 손이 닿는 곳에 두십시오. 배치 후 샘플의 재배치는 불가능합니다. 접착제의 공기와 습기에 대한 노출을 제한하십시오. 공기 또는 유체와의 접촉은 접착제를 응고시켜 사용할 수 없게 만듭니다. - 피펫으로 60μL의 접착제를 절단 플랫폼의 중앙 안팎에 놓고 분배합니다.
- 족집게를 사용하여 접착 된 부위 위에 아가로스에 포함 된 샘플의 심외경면을 놓습니다. 위치를 바꾸지 마십시오. 샘플의 심내막 측면은 아가로스에서 볼 수 있어야합니다. 접착제가 1 분 동안 굳어지게하십시오. 상단으로부터 샘플을 함유하는 아가로스를 무딘 도구(예를 들어, 핀셋)로 부드럽게 누르면서 아가로스로 절단되거나 손상되는 것을 방지한다.
- 샘플 플랫폼을 슬라이싱 버퍼로 채워진 비브라톰의 절단 트레이에 지정된 위치에 놓습니다.
5. 비브라톰 시작
- 진동 진폭을 1mm로 설정하고 초기 절삭 속도를 0.07mm/s로 설정합니다. 슬라이스의 두께를 300μm로 설정하여 슬라이스를 절단합니다.
- 블레이드가 아가로오스 만 자르는 한, 절삭 속도를 최대로 높이십시오.이 경우 1.50mm / s입니다. 비브라톰이 조직을 절단하기 시작하자마자 즉시 속도를 0.07 mm / s로 줄이십시오.
참고: 조직이 매끄럽게 슬라이스되지 않은 경우(예: 샘플에 섬유성 영역이 큰 경우) 절단 진폭을 최대 1.5mm까지 높이고 절삭 속도를 0.04mm/s로 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 슬라이싱 절차 중 중간 및 인큐베이터 준비
- 각 배양 챔버를 2.4 mL의 완전한 배양 배지로 채운다(표 3).
- 배지가 채워진 배양 챔버를 37°C, 5%CO2, 21% O2, 및 80%의 습도로 설정된 배양기에서 배양 시스템 위에 놓는다. 배지를 적어도 20분 동안 평형화시킨다.
- 재배 시스템을 컴퓨터와 연결하고 해당 소프트웨어 프로그램을 시작하십시오.
- 로커 속도를 60rpm으로 설정하고 자극 파라미터(자극 펄스 및 주파수)를 미리 설정합니다. 인간의 심장 조각의 경우, 표준 자극을 50mA 전류로 설정하고, 각각 3ms 포지티브 전류, 1ms 일시 중지 및 반전 전류의 3ms 펄스로 구성된 이단계 임펄스로 분당 30비트(BPM)의 페이싱 속도로 설정합니다.
참고: 잘 보존된 조직에서 일반적인 자극 임계값은 약 15mA입니다. 신뢰할 수 있는 자극을 보장하고 자극 역치의 임의의 가능한 증가를 설명하기 위해, 자극 역치를 두 배 내지 세 배로 초과하는 값으로 전류를 설정하는 것이 좋다. - 소프트웨어의 전극 표시기를 확인하여 재배 챔버의 전극이 올바르게 작동하는지 확인하십시오.
참고: 재배 소프트웨어의 채널 표시기가 빨간색으로 바뀔 때마다 조치가 필요합니다. 이 경우, 바이폴라 펄스 전하들은 균형이 잡히지 않는다.
7. 슬라이스 준비
참고 : 초기 심내막 하부 조각은 일반적으로 조직 배양에 적합하지 않으며 고르지 않은 형태 때문에 폐기해야합니다. 처음 다섯 개에서 10 개의 슬라이스 후에 슬라이스 텍스처와 형태가 향상됩니다. 이상적인 슬라이스는 적어도 1 cm x 1 cm이고, 섬유성 패치가 없거나 단지 제한되고, 단편화되지 않으며, 균질한 섬유 정렬을 갖는다 (도 2B, D). 심근 세포 섬유 사이에 위치한 간질성 섬유증은 종종 실패한 인간 심근에 존재합니다. 놀랍게도, 이것은 재배 성공의 부정적인 예측 인자가 아닙니다.
- 5cm 페트리 접시 뚜껑에 적절한 양의 차가운 슬라이싱 버퍼를 부어 조각이 마르지 않도록하십시오. 차가운 슬라이싱 버퍼가 들어있는 페트리 접시 뚜껑에 조각을 넣으십시오.
- 핀셋을 사용하여 조직에서 아가로스를 분리하십시오. 조직에 닿지 않도록하십시오. 조직에 대한 손상이 배양의 성공률을 감소시킬 것이므로 조직을 조심스럽게 다루십시오.
- 광원에 대한 면밀한 검사로 심근 섬유의 방향을 결정하십시오. 이는 7.6단계에서 플라스틱 삼각형을 조직에 부착할 때 중요합니다.
참고: 7.4단계와 7.5단계는 5초 이내에 연속해서 빠르게 수행해야 합니다. - 재배 챔버 내부의 조직을 고정시키기 위해 접착제를 사용하여 샘플에 두 개의 플라스틱 삼각형을 부착하십시오.
- 멸균 된 페트리 접시 뚜껑에 접착제 1 μL를 놓습니다. 후크 핀셋을 사용하여 오토클레이브 플라스틱 삼각형 중 하나를 집어 들으십시오. 삼각형의 앞 가장자리를 접착제에 빠르게 담그고 삼각형을 심근 세포 정렬에 수직인 샘플에 붙여 넣으십시오. 다른 삼각형에 대해 반복합니다.
- 삼각형 너비를 초과하는 조직을 메스로 다듬습니다(그림 2C). 두 개의 장착된 삼각형이 있는 슬라이스를 절단 트레이의 슬라이스 버퍼에 다시 넣습니다.
참고: 재배실을 채우기에 충분한 조각이 준비될 때까지 7.2~7.5단계를 반복합니다. 슬라이스를 수축이 불량한 상태로 교체할 수 있도록 몇 가지 추가 슬라이스를 준비하는 것이 좋습니다.
8. 슬라이스 장착
참고 : 후하중은 재배 챔버의 스프링 와이어의 강성에 의해 결정됩니다. 스프링 와이어의 두께에 따라 세 가지 유형을 사용할 수 있습니다.
- 인큐베이터에서 배지가 채워진 재배 챔버를 가져 가라. 준비된 슬라이스 중 하나를 선택하고 각 핀에 삼각형 하나를 연결하여 챔버에 삽입하십시오.
- 샘플 크기에 따라 장착 핀 사이의 거리를 조정합니다. 샘플이 중간체에 잠겨 있는지 확인합니다. 챔버를 인큐베이터의 재배 시스템의 지정된 소켓에 다시 넣으십시오.
주의: 조직을 과도하게 펴지 말고 스프링 와이어를 과도하게 구부리지 마십시오! - 접시를 로커에 놓은 후 프리로드 장력을 설정하십시오.
- 조정 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 프리로드를 줄입니다. 컴퓨터 화면의 해당 그래프의 기준선이 더 이상 변경되지 않을 때까지 이 작업을 수행하십시오.
- 조정 나사를 시계 방향으로 돌려 프리로드를 조심스럽게 증가시킵니다 (즉, 장력을 높입니다). 강성이 가장 높은 챔버의 경우, 그래프의 해당 기준선이 1mN의 프리로드에 해당하는 1000-1200 단위만큼 증가할 때까지 계속하십시오.
참고 : 정확한 조정은 재배 챔버의 개별 스프링 상수에 따라 다르며, 이는 제조업체의 지침에 따라 실험 전에 교정을 통해 결정할 수 있습니다. 기록 소프트웨어는 힘이 μN으로 균일하게 표시되도록 개별 챔버 교정을 고려할 수 있도록 합니다. 재배 시작부터 전기 자극을 적용하는 것이 좋습니다. 따라서 슬라이스가 프리로드 조정 중에 수축을 시작할 가능성이 큽니다. 이 경우, 이완기 기준선에 초점을 맞추어 예비하중을 평가한다.
9. 매체 변경
- 표 3의 제조법에 따라 배양배지를 준비한다. 배지를 사용하기 직전에 50 μL의 β-메르캅토에탄올 (50 mM)을 50 mL 튜브에 첨가한다. 4°C에서 보관한다.
- 2 일에 한 번씩 재배 배지를 부분적으로 교환하십시오. 심근 조각의 장기 재배가 필요한 경우 2 일마다 배지를 새로 고칩니다.
- 신선한 배지를 30-45분 동안 37°C의 수조 또는 열풍 인큐베이터에서 예열한다. 인큐베이터에서 배양 챔버를 제거하고 층류 후드 아래에 놓습니다.
주의: 저온으로 인한 과수축을 방지하기 위해 챔버뿐만 아니라 매체를 37°C(> 35°C)에서 따뜻하게 유지하는 것이 중요합니다. 덜 뚜렷한 손상은 중간 교환 후 몇 시간 이내에 이완기 긴장의 증가로 존재할 수 있습니다. 이것은 회복되는 것처럼 보일지 모르지만 반복적 인 스트레스는 악화를 축적 할 수 있습니다. - 배양 챔버에서 배지를 제거하고 챔버에 약 0.8 mL를 남겨 둡니다. 1.6 mL의 신선한 배지를 동일한 챔버에 넣으십시오. 배지의 총 부피는 챔버 당 약 2.4 mL이어야합니다.
- 챔버의 덮개를 다시 놓고 재배 챔버를 다시 각각의 위치에 놓습니다.
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Representative Results
심근 조각의 수축은 재배 챔버를 해당 커넥터에 삽입 한 후 컴퓨터 화면에 표시되었습니다 (그림 3). 인간 심근 조각의 수축은 자극 즉시 시작되었습니다. 조각은 5-10 분 동안 과도하게 수축되었습니다. 이것은 손상된 조직 분획의 강장제 수축으로 인한 이완기 힘의 증가로 나타났습니다. 이 과정은 1-1.5 h 내에서 다양한 정도로 되돌렸다. 안정화 후, 인간 LV 조직 절편은 자극시 1 mN과 3 mN 사이에서 변하는 트위치 힘을 나타내었다. 수축력의 강한 증가로 수축력이 증가한 것으로 나타나며, 수축력의 똑같이 가파른 감소와 함께 디아스톨이 뒤 따른다.
심근 조각의 수축은 재배 소프트웨어에 의해 기록되고 지정된 파일에 저장되었습니다. 생성된 각 원시 데이터 파일은 데이터를 쉽게 분석하고 정량화할 수 있도록 읽을 수 있는 Axon 바이너리 파일 형식(.abf)으로 변환되었습니다. 초기 분석을 위해 .abf 파일이 적절한 프로그램에서 열렸습니다. 이 기간 동안 평균 수축 진폭을 확립하기 위해 약 5분의 수축 데이터가 선택되었다. 이 작업은 기록된 데이터 파일의 여러 시점에 대해 수행되었습니다. 시간에 따른 이러한 수축 값을 플로팅하면 제어 및 실험 환경에서 수축 현상을 비교하는 데 유용한 그래프가 생성되었습니다. 생성된 슬라이스의 성능에 대한 보다 진보된 통찰력을 얻기 위해, 자극 프로토콜이 실행되었다. 약 45분이 걸리는 이러한 프로토콜 동안, 자극 파라미터는 수축 커플링의 파라미터를 평가하기 위해 변경되었다.
현재의 자극 프로토콜은 네 개의 별개의 섹션들로 구성되었다: 사후 일시정지-강화, 자극 임계치, 힘-주파수 관계, 및 내화 기간(그림 4, 표 4). 일시정지-후 강화 동안, 자극은 3, 12, 50 또는 120 s의 짧은 정지 후에 재개된다. 자극 임계값을 결정하기 위해, 자극 전류는 8mA에서 시작하여 90mA까지 증가하여 매 10초마다 3mA씩 증가한다. 이 테스트를 통해, 각각의 슬라이스에 대해 최소 자극 전류가 결정될 수 있다. 이것은 자극 프로토콜 외부의 일반적인 자극 설정을 변경하지 않는다. 힘-주파수 관계는 자극 주파수(20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 및 240 BPM)의 단계적 증가에 의해 평가되는 반면, 각 단계의 각 지속 시간은 병렬로 단축된다. 처음 두 개의 주파수 설정을 제외하고,이 요법은 각 단계 동안 20-40 개의 수축을 산출합니다. 각 슬라이스의 내화 기간은 정상 자극(S1; 30 BPM) 후에 조기 자극(S2)을 전송함으로써 평가된다. S1-S2 간격은 10초마다 단축됩니다.
약리학적 개입을 시험하기 위한 도구로서 제시된 배양 시스템의 가능성을 입증하기 위해, 생체외 인간 LV 조직 절편을 동일한 환자로부터 제조하고, 배양 2주 후에 세포내 칼슘 이온(Ca2+) 수준(n=1)에 영향을 미치는 약리학적 제제를 실시하였다. L형 Ca2+-채널 길항제 니페디핀은 심근 세포로의 Ca2+ 유입을 억제하고, 따라서Ca2+의 세포내 이용가능성을 낮추고 수축성(17)을 감소시킨다. 혈관 확장제 작용 때문에 니페디핀은 항 고혈압 약물로 사용됩니다. Ca2+-채널 길항제의 약리학적 차이를 입증하기 위해, 칼시셉틴을 비교를 위해 조사하였다. 칼시셉틴은 또한 L형Ca2+-채널 길항제이며, 덴드로아스피스 p. 폴리레피스 독18로부터 추출된다. 따라서, 그것은 니페디핀의 부정적인 수축 작용을 공유합니다. 그러나 칼시셉틴은 다른 결합 특성을 가지고 있으며 니페디핀19에 비해 더 강력합니다. Ca2+ 가용성의 양성 및 음성 조절을 연구하기 위해, 우리는 또한 칼슘 채널 작용제 Bay-K8644 (1,4-디히드로-2,6-디메틸-5-니트로-4-(2-[트리플루오로메틸]페닐)피리딘-3-카복실산 메틸 에스테르)20을 시험하였다.
세 조각은 각각 니페디핀 (125 nM), 칼시셉틴 (70.8 nM) 및 Bay-K8644 (417 nM)로 처리되었고, 네 번째 슬라이스는 약물 (대조군)을 받지 않았다. 일반적인 자극 파라미터들(50 mA 전류, 이phasic 펄스 3 ms 지속기간, 1 ms 간격 및 30 BPM 페이싱 속도) 하에서의 수축력을 치료 전후에 비교하였다. 더욱이, 치료 전에, 자극 프로토콜이 실행되어 사후-일시정지-강화, 자극 역치, 힘-주파수 관계, 및 난치성 기간에 대한 기준선 값을 평가하였다. 치료 30분 후, 두 번째 자극 프로토콜이 실행되었다. 개인간 차이를 제거하기 위해, 각 슬라이스의 수축 진폭을 치료 전에 그의 기준선 수준으로 정규화하였다. 기준선(즉, 100%)은 전처리 자극 프로토콜의 시작 전에 마지막 다섯 개의 수축 사이클을 분석함으로써 결정되었다.
일반적인 자극에서 슬라이스의 수축을 분석하였을 때,Ca2+ 길항제(니페디핀 및 칼시셉틴)로 처리된 슬라이스의 수축력이 처리 후 10분 이내에 감소하는 것을 관찰하였고(도 5), 치료 후 20분까지 효과가 나타났다. 대조적으로, 전압 게이팅된Ca2+ 채널 작용제 Bay-K8644는 처리된 슬라이스의 수축력을 증가시켰다. 컨트롤 조각에 주목할 만한 변경 내용이 표시되지 않았습니다. 자극 프로토콜 동안 생성된 수축 데이터는 유사한 방식으로 분석되었다. 여기서, 치료 전(pre-treatment) 전에 수행된 자극 프로토콜에 의해 생성된 데이터는 동일한 자극 프로토콜의 치료 후 데이터와 비교되었다.
앞서 논의된 바와 같이, 자극 프로토콜은 사후-일시정지-강화의 평가로 시작되었다. 일시정지 동안, 추가적인Ca2+는 사르코플라스마 망상(SR)에 의해 흡수되며, 이는 일시정지 후 첫 번째 자극시에 방출된다. 따라서, 일시정지 후 강화는 SR로부터의 세포내Ca2+ 방출을 반영한다. 이와 같이, 이러한 파라미터는 리아노딘 수용체에 의한 SR로부터 방출된Ca2+의 상대적 기여도를 평가하는데 사용될 수 있다. 자극 일시 정지 후 슬라이스의 강화를 평가하기 위해, 일시정지 후 첫 번째 수축의 강도를 각각의 일시정지 전의 평균 수축으로 나눴다. 대조군 슬라이스는 주목할 만한 변화를 나타내지 않았다(도 6A). L형 Ca2+ 채널의 억제가 적어도 50초의 정지 후 첫 번째 수축의 강화를 가져왔다는 것이 관찰되었고(도 6B,D), 전체 수축성에 대한 세포내 Ca2+ 방출의 더 높은 상대적 기여를 반영한다. 반대의 효과는 Bay-K8644로 처리된 슬라이스에서 나타났으며, 이는 L형 Ca2+ 채널을 통해 세포외Ca2+의 진입을 자극한다(도 6C).
힘-주파수 관계는 최대 180BPM의 페이싱 속도를 연속적으로 증가시킴으로써 평가되었다. 더 나은 시각화를 위해, 상이한 자극 주파수에서의 수축력은 동일한 프로토콜 내에서 30 BPM에서의 기준선 수축(=100%)으로 정규화되었다. 데이터 분석은 칼시셉틴을 사용한 치료가 치료 전후 및 사후 데이터를 비교할 때 자극 빈도의 증가시 자극을 따르는 슬라이스의 능력을 변화시키지 않았다는 것을 보여주었다 (도 7B). 대조군 슬라이스에서는 변화가 관찰되지 않았다(도 7A). 칼시셉틴과는 달리, 니페디핀은 더 높은 페이싱 속도에서 수축성의 증가를 방지하고 최대 포획률을 80BPM으로 감소시켰다(그림 7D). Ca2+ 채널 작용제 Bay-K8644로 처리된 슬라이스는 매우 낮은 자극 주파수에서 증가된 수축력을 나타내었다(도 7C). 그러나, 50 BPM보다 높은 주파수에서, 수축력은 전처리 조건에서보다 낮은 것으로 나타났다. 자극 역치 및 불응성 기간은 또한 치료 전 및 후-결정되었다. 그러나 차이는 관찰되지 않았으며 따라서 데이터는 표시되지 않습니다.
그림 1 : 필요한 재료와 재배 시스템의 개요. (A) 녹색 회로 기판에 연결된 빈 재배 챔버. 회로기판(1)은 센서로 수축을 측정하고 컨트롤러로 데이터를 전송한다. (B) 흔들리는 주판에 놓인 여덟 개의 채워진 방. 페트리 접시 뚜껑 (35mm)은 챔버를 덮는 데 사용됩니다. (C) 경막 심근 샘플을 다듬는 데 필요한 (수술) 도구. 다양한 핀셋, 비브라토메에 필요한 블레이드 및 트리밍을 돕는 고무 패치가 묘사되어 있습니다. (d) 플라스틱의 고체 블록에 의해 정사각형 위치 (0.9 cm x 0.9 cm)에 고정되는 네 개의 0.9 mm x 70 mm 20 G 바늘. 이 구축물을 사용하면 트리밍 할 때 샘플의 손상 및 이동을 방지하고 필요한 치수의 조직 블록을 산출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 2개의 LV 샘플 처리. (A) 35mm 페트리 접시에 응고된 저용융 아가로스에 내장된 2개의 심근 조직 블록(약 1cm x 1cm x 1cm). 입증 목적을 위해, 돼지 LV 조직이 사용되었다. (B) 포매된 샘플이 있는 아가로스 블록을 페트리 접시에서 제거하고, 트리밍하고, 비브라토메의 절단 플랫폼 상에 접착시켰다. 여기서, 돼지 LV 조직은 입증 목적으로 사용되었다. 균일 한 조직 색상과 빨간색 화살표로 표시된 흰색 섬유성 조직의 부재에 주목하십시오. (C) 슬라이스 후, 아가로스를 조심스럽게 제거하고, 플라스틱 삼각형 (1)은 심근 섬유의 방향에 수직으로 연결된다. 빨간색 선은 심근 섬유의 방향을 나타냅니다. (d) 인간 LV 조직을 제조하였고, 이는 슬라이스 내에 백색 섬유성 조직을 나타냈다. 이것은 반드시 재배의 성공률을 낮추지는 않습니다. 그러나 섬유증을 표시하지 않는 슬라이스를 사용하는 것이 좋습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 재배 소프트웨어. 사용된 채널 수(최대 여덟 개)에 따라 수축 등록은 최대 세 개의 지정된 창(그림에 두 개 표시)으로 시각화됩니다. 각 재배 챔버는 하나의 수축 그래프로 표시됩니다. 설정 창에서 자극 파라미터를 변경하고 원하는 실험 상황에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 창은 또한 선택된 자극 프로토콜/스케줄을 시작하거나 중지할 수 있게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전형적인 자극 프로토콜 동안 다섯 개의 심근 슬라이스의 수축에 대한 판독. 모든 패널에서 각 개별 슬라이스는 동일한 색상으로 표시됩니다. (A) 일시정지 후 강화는 각각 3, 12, 50 및 120초의 짧은 자극 정지 후 첫 번째 수축을 평가한다. (b) 8 mA에서 80 mA로 매 10 s마다 3 mA의 단계에서 자극 전류를 증가시킴으로써 자극 역치의 결정. (c) 각 슬라이스의 힘-주파수 관계는 자극 주파수를 12 BPM에서 240 BPM으로 단계적으로 증가시킴으로써 평가된다. 자극 기간의 지속 시간은 각 주파수에서 비트 수를 일정하게 유지하기 위해 더 높은 주파수에서 짧아집니다. (d) 불응성 기간을 평가하기 위해, 슬라이스는 선행 자극(S1)에 대한 감소 간격으로 조기 자극(S2)에 노출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: L형Ca2+ 채널 영향제제를 사용한 처리 전후의 수축력 분석. 모든 데이터(n=1)는 기준선 수축성(치료 전 다섯 개의 개별 비트의 평균(0))으로 정규화되었다. L형 Ca2+ 채널 길항제 니페디핀 (125 nM), 칼시셉틴 (70.8 nM), 및 L형Ca2+ 채널 작용제 Bay-K8644 (417 nM)를 수축된 인간 LV 심근 절편에 첨가하였다. 대조군 슬라이스는 처리를 받지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 처리된 슬라이스 및 대조군 슬라이스의 일시정지 후 효능. 일시정지 후-강화의 차이가 관찰되었다(기준선 대 치료 후; n=1). 여기서, 일시정지 후 첫 번째 수축의 진폭은 각각의 일시정지 전의 평균 수축 진폭으로 정규화되었다. 기준선은 100%로 설정되었으며 첫 번째 일시 중지가 시작되기 전의 마지막 다섯 사이클의 평균 수축 강도와 유사합니다. Y축은 다양한 지속 시간의 일시 중지 후 정규화된 첫 번째 수축을 표시합니다. X축은 기준선 및 일시 중지 길이를 표시합니다. (A) 처리없이 슬라이스를 제어하십시오. (B) 칼시셉틴 처리. (C) 베이-K8644 처리. (D) 니페디핀 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 힘 주파수 관계의 분석. 수축 데이터(n=1)는 각각의 프로토콜 내에서 30 BPM에서의 수축력(=100%)으로 정규화되었다. (a) 대조군 슬라이스는 어떠한 물질로도 처리되지 않았다; 그러나 재배의 다른 모든 측면은 처리 된 조각의 측면과 동일했습니다. (b) 하나의 LV 심근 슬라이스의 칼시셉틴 치료. (C) 베이-K8644 처리. (D) 니페디핀 처리. 80 BPM 이상의 자극 주파수들 동안 이 슬라이스의 수축력에 관한 데이터는 수축이 자극 주파수를 따르지 않았기 때문에 생략되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 슬라이싱 절차 동안 및 수송에 사용되는 슬라이싱 버퍼의 조성. 아가로스의 제조를 위해, 글루코스는 생략된다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 4% 아가로스 겔의 조성. 이 무글루코스 저용융 아가로스 겔은 조직 샘플의 임베딩에 사용된다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 배양용 배지의 제조. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 자극 프로토콜의 세부사항. 자극 프로토콜은 네 부분으로 구성되며, 모두 프로젝트의 요구에 맞게 변경할 수 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
과거에는 심혈관 연구가 심근 세포 배양에 큰 발전을 이루었습니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 세포의 3D 배양은 아직 잘 확립되지 않았습니다. 심근 조직의 생체 외 배양에 적용된 이전의 프로토콜과 비교하여, 우리가 여기서 기술한 프로토콜은 조직의 생체내 환경과 더 밀접하게 닮았다. 또한, 사전 및 후부하의 적용은 더 많은 생체 모방 환경을 허용합니다. 우리는 조직의 수축 데이터 및 수축 매개 변수의 지속적인 기록을 완전히 분석하고 이해할 수 있습니다.
유사한 셋업을 이용한 생체외 심혈관계 조직 배양 기술의 수는11,21,22개로 제한된다. 발표된 심근 슬라이스 재배를 위한 유사한 기술은 심근 슬라이스(10)의 배양을 위해 6-웰 플레이트를 사용한다. 그러나, 이러한 특정 셋업의 중요한 한계는 슬라이스가 전후 부하에 노출되지 않고, 조직을 취급할 필요 없이 시간에 따른 수축에 대한 상세한 뷰를 산출할 수 없다는 것이다. 여기에 설명 된 방법은 조직 손상 또는 감염의 위험을 줄입니다. 또한, 관심있는 물질이 재배에 첨가 될 때마다 수축력의 가능한 변화에 대한 포괄적 인 시각을 제공합니다. 각 슬라이스의 정상적인 수축력 분석 외에도 현재 설정을 통해 미리 정의된 프로토콜을 정기적으로 실행할 수 있습니다. 이것은 배양 된 조직의 다른 관련 매개 변수의 데이터 수집을 허용합니다.
프로토콜 내의 중요한 단계
조직 손상은 피해야하며, 이는 이미 이식 수술 중에 발생할 수 있습니다. 조직이 절제 후 즉시 냉장 저장 용액으로 옮겨지지 않으면, 이것은 손상된 조직 샘플을 초래할 수 있다. 설명된 프로토콜에는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요한 몇 가지 단계가 포함되어 있습니다. 아가로스 조직 매립 화합물은 프로토콜의 개시 전에 용융 과정 동안 글루코스의 가능한 캐러멜화를 방지하기 위해 글루코스가 없는 슬라이싱 버퍼를 사용하여 제조되어야 한다. 아가로스를 37°C의 주사기에서 인큐베이션하는 대신 80°C 수조에서 직접 아가로스를 사용함으로써 발생하는 고열로 인한 손상을 피하는 것이 중요하다. 온도는 신진 대사를 줄이고 허혈을 최소화하기 위해 보관 및 절단 중에 4 °C이어야합니다. 또한 조직은 플라스틱 삼각형을 부착하기 위해 절단 트레이와 페트리 접시 사이를 이동할 때 조직 자체보다는 아가로스를 움켜 잡고주의해서 다루어야합니다. 이러한 삼각형이 심근 섬유의 방향과 관련하여 적절한 방향으로 부착되는 것이 가장 중요합니다. 삼각형의 정렬이 잘못되면 조직 손상이 발생합니다.
일반적으로, 새로 절단된 슬라이스의 자극 임계값은 10-20 mA 사이이며, 전류는 조심스럽게 증가되어야 한다. 너무 높은 전류에 의한 조직의 과잉 자극은 또한 돌이킬 수 없는 샘플 손상을 초래할 수 있다. 일단 자극이 시작되면, 배양 챔버를 흔들어서 조직 교반이 필요하며, 조직에 산소와 영양소의 적절한 이용가능성을 보장하기 위해 5분 이상 중단되어서는 안 된다.
문제 해결 및 수정
하이퍼 계약
심근 조직 샘플의 하이퍼 수축은 논의된 프로토콜에 대한 주요 배제 기준 중 하나이다. 이것은 심근 슬라이스의 준비 전후에 발생할 수 있습니다. 제제 전에, 촉진시 조직이 뻣뻣하게 느껴지는 경우, 제제의 적어도 70 %에서 과다 수축이 관찰되었다. 조직 샘플의 하이퍼 수축은 또한 로커에 삽입시 발생할 수 있으며, 이는 조직의 품질 또는 환자의 질병 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 하이퍼 수축은 심장 허혈에서 손상된 심근 세포의 강장제 단축에 해당하는 조직의 자극 동안 이완기 톤의 증가로 볼 수 있습니다. 자극 동안 하이퍼 수축은 진행성일 수 있고, 이에 의해 수축은 12 mN의 검출 한계를 초과한다. 그러나 하이퍼 수축은 또한 30-60 분 이내에 자발적으로 역전될 수 있으며, 이는 조직이 회복 될 수 있음을 시사합니다. 조직의 회복을 향상시키기 위해, 프리로드 설정은 인큐베이션 1시간 후, 제제 후 2, 4, 6일째에 재조정(즉, 단계 8.3 반복)되어야 한다. 하이퍼 수축은 샘플의 자극된 수축의 유무에 관계없이 존재할 수 있다. 그러나 1 시간 이내에 수축이 관찰되지 않으면 샘플을 사용해서는 안됩니다. 이 경우 조직은 회복 할 수없는 정도로 과도하게 수축되었거나 그렇지 않으면 손상되었습니다. 일반적으로, 제시된 프로토콜에 따른 인간 심근 절편의 배양은, 90%의 성공률을 갖는 것으로 나타났다.
예상되는 수축력 변화
다수의 인자들(예를 들어, 환자, 준비, 조직 손상)에 따라, 초기에 수용가능한 수축을 보였던 근슬라이스는 처음 24시간 동안 수축성 진폭의 점진적인 감소를 겪을 수 있다. 사실,이 행동은 심지어 인간의 말기 실패 심장에서 얻은 조각에 대해서도 정상적인 것으로 간주 될 수 있습니다. 다음 3 일 동안 매일 조각의 프리로드를 재조정하면이 문제를 완화하고 수축을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 24 ~ 48 시간이 지나면 수축성이 다시 증가하기 시작해야합니다. 수축은 재배 첫날 이내에 처음 관찰 된 수준으로 돌아 가지 않습니다.
배지 교환 직후, 샘플이 인큐베이터로 반환될 때, 수축은 전형적으로 현저하게 증가된 진폭을 나타낸다. 인큐베이터의 개폐는CO2 수준을 떨어 뜨리기 때문에 이러한 증가에 기여합니다. 이것은 중탄산염 완충된 배양 배지 내부의 pH를 증가시키고, 이는 슬라이스의 양성 수축 반응을 일으킨다. 중간 교환 후, 슬라이스의 수축력은 초기 값에 도달하거나 초과 할 때까지 몇 시간 동안 감소합니다. 자극 프로토콜이 매체 교환에 의해 영향을 받는 것을 방지하기 위해, 자극 프로토콜은 매체 교환 후 적어도 1시간까지 실행되어서는 안 된다.
방법의 제한 사항
본 기술의 장점은 인간 심근 조직에 대한 이전의 배양 방법과 비교하여, 수축 조직에 사전 및 후부하를 적용(및 변조)할 수 있다는 것이다. 그러나 벽 장력 측면에서 적용된 하중을 정량화하는 것은 어렵지만이 하중은 스프링 상수 및 슬라이스 치수에서 추정 될 수 있습니다. 심근 조직의 생존력과 조직 샘플의 수축 진폭 사이에 긍정적 인 관계가 있다고 가정합니다. 그러나 현재 챔버에 장착하기 전에 각 개별 슬라이스의 생존력 테스트를 허용하는 방법은 없습니다. 비색 MTT 염색은 심근 세포의 생존력을 결정하기 위해 배양에 사용되지 않는 절단 슬라이스에 대해 수행 될 수 있습니다. 생존 가능한 세포에서, NADPH는 보라색 포르마잔 결정에서 황색 MTT 염을 감소시킬 것이다. 또 다른 한계는 현재 배양 배지의 영양소가 기본 성분으로 제한된다는 것입니다. 따라서, 영양소 및 순환 인자는 조직이 수득된 생체내 환경과 상이하다. 그러나, 배지는 필요에 따라 보충되거나 변형될 수 있다.
이 방법의 잠재적 인 응용 프로그램
심장 독성 및 약물 검사뿐만 아니라 심장 질환의 병리 생리학을 이해하는 데이 방법의 몇 가지 잠재적 인 적용이 있습니다. 첫째, 논의된 프로토콜에 사용되는 시스템은 약물 및 심장 독성 스크리닝에 사용될 수 있다. 프로그램가능한 자극 프로토콜의 도움으로, 생리학적 변화는 약물 투여에 반응하여 분석될 수 있다. 내화 기간의 해석과 관련하여, 이것은 작용 잠재적 인 기간에 대한 약물의 효과를 엄격하게 반영하지 않는 기능적 매개 변수라고 간주 될 필요가 있습니다. 둘째, 배양실은 면역세포와 결합하여 심근의 다양한 공동배양 실험에 활용될 수 있다. 이 공동 재배를 사용함으로써, 심근 수축에 대한 면역 세포 분비 인자의 직접적인 영향을 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 비이식 심근병증 샘플도 배양될 수 있지만, 이러한 비이식 조직 샘플은 일반적으로 더 작아서 처리하기가 더 어렵다. 그럼에도 불구하고, 이것은 새로운 치료 표적의 확인과 표적 약물의 개발을위한 가능성을 열어 줄 수 있습니다. 또한 환자 특정 조직 특성화를위한 기술을 사용하여 개인화 된 의학에 한 걸음 더 가까이 다가 갈 수 있다고 생각할 수 있습니다. 또한, 제시된 방법은 비인간 심근 조직에 사용될 수 있으며, 그 예는 돼지 및 토끼이다. 작은 포유류 (마우스 / 쥐)의 높은 생리적 심박수를 얻을 수 없다는 것이 고려되어야하며, 그 이유는 논의 된 설정을 사용하여 심근 재배의 조건 하에서 후속 더 높은O2 요구 사항을 충족시킬 수 없기 때문입니다. 따라서, 거의 생리적 인 환경은 이러한 경우에 모방하기가 어렵습니다.
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Disclosures
JH, PS, DM 및 KL은 공개 할 것이 없습니다. AD와 TS는 Myodish 재배 시스템을 제공하는 InVitroSys GmbH의 주주입니다.
Acknowledgments
연구는 DZHK 보조금 81Z0600207 (JH, PS 및 DM) 및 81X2600253 (AD 및 TS)이 자금을 지원했습니다.
저자들은 Claudia Fahney, Mei-Ping Wu 및 Matthias Semisch에게 셋업 준비와 조직 재배의 정기적 인 유지 보수에 대한 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
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- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
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