Summary
Presentiamo un protocollo per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico ventricolare umano. Consente un'analisi dettagliata della forza di contrazione e della cinetica, nonché l'applicazione di pre- e postcarico per imitare più da vicino l'ambiente fisiologico in vivo .
Abstract
La coltivazione di cardiomiociti ha visto un vasto numero di sviluppi, che vanno dalla coltivazione cellulare bidimensionale (2D) agli organoidi derivati da iPSC. Nel 2019 è stato dimostrato un modo ex vivo per coltivare fette di miocardio ottenute da campioni di cuore umano, mentre si avvicinava alla condizione in vivo di contrazione miocardica. Questi campioni provengono principalmente da trapianti di cuore o posizionamenti di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra. Utilizzando un vibratoma e un sistema di coltivazione appositamente sviluppato, fette spesse 300 μm vengono posizionate tra un filo fisso e uno a molla, consentendo una coltivazione stabile e riproducibile per diverse settimane. Durante la coltivazione, le fette vengono continuamente stimolate in base alle singole impostazioni. Le contrazioni possono essere visualizzate e registrate in tempo reale e gli agenti farmacologici possono essere prontamente applicati. I protocolli di stimolazione definiti dall'utente possono essere programmati ed eseguiti per valutare i parametri di contrazione vitali come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. Inoltre, il sistema consente un'impostazione variabile pre e postcarico per una coltivazione più fisiologica.
Qui, presentiamo una guida passo-passo su come generare una coltivazione a lungo termine di successo di fette miocardiche ventricolari sinistre umane, utilizzando una soluzione di coltivazione biomimetica commerciale.
Introduction
Nell'ultimo decennio, la coltivazione in vitro di cellule miocardiche ha fatto grandi progressi, che vanno dalle tecniche 2D e tridimensionali (3D) all'uso di organoidi e cellule staminali pluripotenti indotte differenziate in miociti cardiaci 1,2,3. Le coltivazioni ex vivo e primarie di cellule hanno dimostrato di essere di grande valore, soprattutto per gli studi genetici e lo sviluppo di farmaci 4,5,6. L'uso di tessuti umani migliora il valore traslazionale dei risultati. La coltivazione 3D a lungo termine di tessuti miocardici con geometria intatta, tuttavia, non è ben consolidata. La geometria intatta è una caratteristica chiave per imitare le condizioni in vivo, poiché la corretta funzione cardiaca, la comunicazione tra cellule diverse e le interazioni cellula-matrice sono prerequisiti. La coltivazione del tessuto miocardico ha attraversato varie fasi di sviluppo. Il tasso di successo e la stabilità della coltivazione di tessuti miocardici ex vivo erano inizialmente piuttosto bassi, ma gli approcci recenti hanno prodotto risultati promettenti 7,8,9,10,11.
Tra questi, Fischer et al. sono stati i primi a dimostrare che la vitalità e le prestazioni contrattili del tessuto miocardico umano possono essere mantenute nella coltivazione cellulare ex vivo per molte settimane7. La loro tecnica si basava su sottili fette di tessuto tagliate dal miocardio umano espiantato, che erano montate in camere di coltivazione di nuova concezione che fornivano condizioni biomeccaniche definite e stimolazione elettrica continua. Questo metodo di coltivazione assomiglia molto alla funzione in vivo del tessuto miocardico ed è stato riprodotto da diversi gruppi di ricerca indipendenti 2,12,13,14,15. È importante sottolineare che le camere utilizzate da Fischer et al. hanno anche permesso la registrazione continua delle forze sviluppate per un massimo di 4 mesi, aprendo così opportunità senza precedenti per la ricerca fisiologica e farmacologica sul miocardio umano intatto7.
Tecniche simili sono state sviluppate indipendentemente da altri gruppi e applicate al miocardio umano, di ratto, suino e di coniglio 7,10,11. Pitoulis et al. hanno successivamente sviluppato un metodo più fisiologico, che riproduce la normale relazione forza-lunghezza durante un ciclo di contrazione, ma è meno adatto per l'analisi ad alto rendimento16. In quanto tale, l'approccio generale della coltivazione biomimetica può essere considerato come un ulteriore passo verso la riduzione, l'affinamento e la sostituzione (3R) degli esperimenti sugli animali.
Tuttavia, lo sfruttamento di questo potenziale richiede procedure standardizzate, analisi ad alto contenuto e un elevato livello di throughput. Presentiamo una tecnica che combina l'affettamento automatizzato del miocardio umano vivente con il mantenimento in vitro in un sistema di coltivazione biomimetico che è diventato disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Con l'approccio proposto, il numero di singole fette che possono essere generate da un singolo campione miocardico transmurale è limitato solo dal tempo di elaborazione. Un campione di dimensioni e qualità sufficienti (3 cm x 3 cm) produce spesso 20-40 fette di tessuto che vengono comodamente tagliate con un vibratoma automatizzato. Queste fette possono essere collocate in camere di coltivazione appartenenti al sistema. Le camere consentono la stimolazione elettrica, i cui parametri possono essere modulati (cioè durata dell'impulso, polarità, velocità e corrente), nonché la regolazione del pre- e postcarico, utilizzando fili a molla all'interno delle camere. La contrazione di ogni fetta è registrata dal movimento di un piccolo magnete attaccato a un filo a molla e visualizzato come un grafico interpretabile. I dati possono essere registrati in ogni momento e analizzati utilizzando un software disponibile gratuitamente. Oltre alla stimolazione costante al basale, è possibile eseguire protocolli programmati per valutare funzionalmente il loro periodo refrattario, la soglia di stimolazione, il potenziamento post-pausa e la relazione forza-frequenza.
Questa coltivazione biomimetica a lungo termine di più fette miocardiche da un singolo cuore apre la strada a future ricerche ex vivo sia nel tessuto umano che in quello animale e facilita lo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci nella medicina cardiovascolare. È già stato applicato a vari approcci sperimentali 2,12,13,15. Qui, forniamo una descrizione dettagliata passo-passo della preparazione del tessuto umano e forniamo soluzioni per i problemi di coltivazione frequentemente incontrati.
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Protocol
La raccolta di tessuti per gli esperimenti qui descritti è stata approvata dai comitati di revisione istituzionale dell'Università di Monaco e dell'Università della Ruhr di Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.
1. Acquisizione tissutale
- Ottenere tessuto umano da pazienti sottoposti a trapianto di cuore o cardiochirurgia.
- Prima di procurare il tessuto, preparare 2 L di soluzione cardioplegica (ulteriormente indicato come tampone di affettamento (Tabella 1)).
- Dopo aver ottenuto una biopsia ventricolare sinistra transmurale (LV) di dimensioni 4 cm x 4 cm, posizionare immediatamente il tessuto (entro 5 minuti dall'escissione) in un becher sterile monouso di plastica richiudibile contenente circa 70 ml di tampone per affettatura fredda (4 °C). Conservare a 4 °C.
NOTA: il tampone di affettamento utilizzato in questo protocollo consente la conservazione a freddo (4 °C) del tessuto per un massimo di 36 ore. Ciò consente il trasporto a freddo del tessuto da cliniche che non sono vicine al laboratorio. Tuttavia, i tempi di trasporto ≤ 24 ore si sono dimostrati ottimali.
2. Preparare l'agarosio e il vibratoma
- Assicurarsi che siano preparate e sterilizzate camere di coltivazione sufficienti (Figura 1A).
- Immergere le camere e gli elettrodi di grafite in 1 L di una soluzione di isopropanolo al 10% e agitare durante la notte. Il giorno seguente, trasferire le camere in una soluzione di isopropanolo al 100% per 3 minuti e autoclave gli elettrodi di grafite a 120 °C per 10 minuti.
- Lasciare asciugare all'aria le camere e gli elettrodi di grafite sotto una cappa a flusso laminare.
- Collegare un circuito stampato a ciascuna delle camere in base alle posizioni disponibili sul bilanciere. Posizionare due elettrodi di grafite sul circuito stampato secondo le istruzioni del produttore.
- Posizionare un coperchio della capsula di Petri da 35 mm sulla parte superiore della camera per evitare contaminazioni.
- Impostare il sistema di coltivazione Myodish (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 collegando il sistema a un computer (Figura 1B).
- Preparare l'agarosio a bassa fusione al 4% in tampone di affettamento (senza glucosio; Tabella 2). L'agarosio può essere conservato a 4 °C per 6 mesi.
- Il giorno dell'esperimento, sciogliere un volume di riserva di soluzione di agarosio usando un bagno d'acqua impostato a 80 °C. A seconda della quantità, la fusione richiede circa 30 minuti.
- Quando l'agarosio è liquido, aspirare 8 mL di agarosio liquido in una siringa da 10 mL, con ulteriori 2 mL di aria. Chiudere la siringa con un tappo sterile e metterla a testa in giù a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti, per evitare che l'agarosio si solidifichi e per equilibrare la sua temperatura per evitare danni da ipertermia del campione.
- Se presente, accendere il dispositivo di raffreddamento ad acqua del vibratoma almeno 30 minuti prima dell'affettamento dei tessuti per consentire una capacità di raffreddamento sufficiente. Impostare la temperatura della circolazione dell'acqua a 4 °C.
NOTA: Il vassoio di taglio e la piastra di raffreddamento utilizzati qui contenevano entrambi una circolazione dell'acqua incorporata. Questo è altamente raccomandato per il raffreddamento e per ridurre i rischi di contaminazione. È comunque possibile utilizzare il ghiaccio anche come tecnica di raffreddamento. Inoltre, il dispositivo di raffreddamento ad acqua non deve essere collegato al vassoio di taglio e/o alla piastra di raffreddamento del vibratomo a questo punto del protocollo. - Pulire il vassoio di affettatura e la piastra di campionamento del vibratome lavando tutte le superfici con isopropanolo al 100% per almeno 3 minuti.
NOTA: a seconda del sistema di vibratomi utilizzato, la configurazione del vibratoma potrebbe essere diversa. Fare riferimento al manuale del vibratoma presente in laboratorio per informazioni sui metodi di set-up e calibrazione della lama. - Riempire il vassoio di taglio fino al 90% -95% con tampone di affettatura. Nel set-up attualmente utilizzato, questo corrisponde a circa 400 ml. Collegare il tubo del dispositivo di raffreddamento ad acqua alle valvole sul vassoio di taglio e sulla piastra di raffreddamento del vibratoma.
- Disinfettare tutti gli strumenti necessari per la preparazione immergendoli in una soluzione di isopropanolo al 100% per 5 s. Rimuovere gli utensili dalla soluzione di isopropanolo e asciugarli all'aria sotto la cappa a flusso laminare.
3. Tagliare e incorporare i campioni
- Trasferire il campione di tessuto in una capsula di Petri da 100 mm riempita con tampone per affettatura a freddo. Tenere la parabola su una piastra di raffreddamento a 4 °C (collegata al refrigeratore o posta sul ghiaccio).
- Rimuovere le trabecole endocardiche tenendo l'endocardio con una pinzetta e usando le forbici per tagliare via circa 3 mm di tessuto endocardico. Allo stesso modo, rimuovere il tessuto adiposo in eccesso sotto l'epicardio, se presente.
- Fissare il campione di tessuto tagliato, lato endocardico verso l'alto, a un cerotto di gomma di 2 cm x 2 cm utilizzando quattro aghi da 0,9 mm x 70 mm da 20 G fissati in posizione quadrata (0,9 cm x 0,9 cm; Figura 1C, D). Assicurarsi che il bordo diagonale di ciascuna punta dell'ago sia rivolto verso l'interno. Ciò migliora la fissazione e previene danni al miocardio.
ATTENZIONE: L'orientamento del quadrato sopra menzionato deve essere ortogonale alla direzione predominante della miofibra prevista. - Tagliare via tutto il tessuto in eccesso al di fuori del quadrato a quattro aghi usando un bisturi. Se la dimensione del campione originale lo consente, utilizzare due campioni di tessuti miocardici durante questa preparazione dallo stesso campione grezzo.
- Usando una pinzetta, posizionare il campione tagliato su un pezzo di tessuto sterile per rimuovere qualsiasi tampone di affettamento in eccesso lasciato sul campione. Per evitare l'essiccazione del campione, non tenere il campione sul tessuto per più di 10 s.
- Posizionare il campione o i campioni in una capsula di Petri da 35 mm, in modo tale che la lama tagli perpendicolarmente all'allineamento dei cardiomiociti e l'epicardio sia rivolto verso il basso. Se la preparazione include due campioni, assicurarsi che i campioni siano centrati e non si tocchino.
- Prelevare la siringa di agarosio dal bagno d'acqua e immergere il campione o i campioni in agarosio. (Figura 2A). Lasciare solidificare l'agarosio per 5 minuti su una piastra di raffreddamento. Il campione o i campioni devono rimanere in contatto con la capsula di Petri, il che garantirà che il piano di taglio sia parallelo alla direzione predominante della fibra miocardica.
ATTENZIONE: Non svuotare completamente la siringa per evitare bolle d'aria. Prestare attenzione alla quantità di agarosio che viene lasciata nella siringa durante l'immersione dei campioni. Nel caso di bolle d'aria nel piatto con i campioni, estrarre con attenzione le bolle d'aria nella siringa.
4. Posizionamento dei campioni sul vassoio di taglio
- Rimuovere l'agarosio solidificato contenente il campione o i campioni dalla capsula di Petri da 35 mm utilizzando una spatola o uno strumento simile, incastrandolo tra il campione e il lato della capsula di Petri. Tagliare via parte dell'agarosio usando un bisturi mantenendo i campioni coperti.
ATTENZIONE: Non rimuovere troppo dell'agarosio. Dovrebbero essere rimasti almeno 5 mm di agarosio sui lati lungo e corto nel piano X / Z.
NOTA: i passaggi 4.2-4.4 devono essere eseguiti in rapida successione (ad esempio, massimo 5 s). Avere tutti gli strumenti necessari a portata di mano prima di iniziare. Nessun riposizionamento del campione è possibile dopo il posizionamento. Cerca di limitare l'esposizione della colla all'aria e all'umidità. Il contatto con aria o fluidi solidificherà la colla, rendendola inutilizzabile. - Con una pipetta, posizionare e distribuire 60 μL di colla all'interno e intorno al centro della piattaforma di taglio.
- Posizionare il lato epicardico del campione contenuto nell'agarosio sopra l'area incollata usando una pinzetta. Non riposizionare. Il lato endocardico del campione deve essere visibile nell'agarosio. Lasciare solidificare la colla per 1 minuto. Premere delicatamente l'agarosio contenente il campione dall'alto con uno strumento smussato (ad esempio, una pinzetta) evitando di tagliare o danneggiare l'agarosio.
- Posizionare la piattaforma campione nella posizione designata nel vassoio di taglio del vibratoma, riempito con tampone di affettatura.
5. Avvio del vibratoma
- Impostare l'ampiezza delle vibrazioni a 1 mm e la velocità di taglio iniziale a 0,07 mm/s. Impostare lo spessore della fetta a 300 μm per tagliare le fette.
- Finché la lama taglia solo l'agarosio, aumentare la velocità di taglio al massimo, che in questo caso è di 1,50 mm/s. Non appena il vibrame inizia a tagliare il tessuto, diminuire immediatamente la velocità a 0,07 mm/s.
NOTA: Se il tessuto non viene affettato senza intoppi, ad esempio se nel campione sono presenti grandi aree fibrotiche, può essere utile aumentare l'ampiezza di taglio fino a 1,5 mm e ridurre la velocità di taglio a 0,04 mm/s.
6. Preparazione del mezzo e dell'incubatrice durante la procedura di affettatura
- Riempire ogni camera di coltivazione con 2,4 ml di terreno di coltivazione completo (Tabella 3).
- Posizionare le camere di coltivazione riempite con mezzo sul sistema di coltivazione nell'incubatore impostato a 37 °C, 5% CO2, 21% O2 e un'umidità dell'80%. Equilibrare il mezzo per almeno 20 min.
- Collegare il sistema di coltivazione con un computer e avviare il programma software corrispondente.
- Impostare la velocità del bilanciere a 60 giri/min e preimpostare i parametri di stimolazione (impulsi di stimolazione e frequenza). Per le fette cardiache umane, impostare la stimolazione standard su impulsi bifasici con corrente di 50 mA, ciascuno costituito da corrente positiva di 3 ms, una pausa di 1 ms e un impulso di 3 ms di corrente invertita, ad una velocità di stimolazione di 30 battiti al minuto (BPM).
NOTA: Nei tessuti ben conservati, la soglia di stimolazione tipica è di circa 15 mA. Per garantire una stimolazione affidabile e per tenere conto di qualsiasi possibile aumento della soglia di stimolazione, si raccomanda di impostare la corrente su un valore che superi la soglia di stimolazione da due a tre volte. - Controllare gli indicatori degli elettrodi del software per verificare che gli elettrodi delle camere di coltivazione funzionino correttamente.
NOTA: è necessario intervenire ogni volta che l'indicatore di canale nel software di coltivazione diventa rosso. In questo caso, le cariche dell'impulso bipolare non sono bilanciate.
7. Preparazione delle fette
NOTA: Le fette subendocardiche iniziali non sono comunemente adatte alla coltivazione di tessuti e devono essere scartate a causa della morfologia irregolare. Dopo le prime cinque o 10 fette, la consistenza e la morfologia della fetta migliorano. La fetta ideale è di almeno 1 cm x 1 cm, non ha macchie fibrotiche o solo limitate, non è frammentata e ha un allineamento omogeneo delle fibre (Figura 2B, D). La fibrosi interstiziale, situata tra le fibre dei miociti, è spesso presente nel miocardio umano difettoso. Sorprendentemente, questo non è un predittore negativo del successo della coltivazione.
- Versare una quantità adeguata di tampone per affettatura fredda in un coperchio della piastra di Petri da 5 cm per assicurarsi che le fette non si asciughino. Mettere le fette nel coperchio della capsula di Petri contenente il tampone di affettatura a freddo.
- Separare l'agarosio dal tessuto usando una pinzetta. Evitare di toccare il tessuto. Maneggiare il tessuto con attenzione poiché qualsiasi danno al tessuto ridurrà il tasso di successo della coltivazione.
- Determinare la direzione delle fibre miocardiche mediante un'ispezione ravvicinata contro una fonte di luce. Questo è importante quando si attaccano i triangoli di plastica al tessuto nel passaggio 7.6.
NOTA: i passaggi 7.4 e 7.5 devono essere eseguiti in rapida successione, entro 5 s. - Attaccare due triangoli di plastica a un campione usando la colla per ancorare il tessuto all'interno delle camere di coltivazione.
- Posizionare 1 μL di colla su un coperchio sterile della capsula di Petri. Usa una pinzetta agganciata per raccogliere uno dei triangoli di plastica autoclavati. Immergere rapidamente il bordo anteriore del triangolo nella colla e incollare il triangolo sul campione, perpendicolare all'allineamento dei cardiomiociti. Ripetere l'operazione per l'altro triangolo.
- Tagliare il tessuto che supera la larghezza del triangolo con un bisturi (Figura 2C). Riposizionare la fetta con i due triangoli montati nel tampone di taglio del vassoio di taglio.
NOTA: ripetere i passaggi da 7.2 a 7.5 fino a quando non viene preparato un numero sufficiente di fette per riempire le camere di coltivazione. Si consiglia di preparare alcune fette aggiuntive per consentire la sostituzione delle fette con scarsa contrazione.
8. Montare le fette
NOTA: Il postcarico è determinato dalla rigidità del filo della molla nelle camere di coltivazione. Sono disponibili tre diversi tipi, in base allo spessore del filo della molla.
- Prendi una camera di coltivazione a riempimento medio dall'incubatrice. Selezionare una delle fette preparate e inserirla nella camera collegando un triangolo a ciascun perno.
- Regolare la distanza tra i pin di montaggio in base alle dimensioni del campione. Assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo. Riposizionare la camera nella presa designata del sistema di coltivazione nell'incubatore.
ATTENZIONE: non allungare eccessivamente il tessuto e non piegare eccessivamente il filo della molla! - Impostare la tensione di precarico dopo il posizionamento del piatto sul bilanciere.
- Diminuire il precarico ruotando la vite di regolazione in senso antiorario. Fallo fino a quando la linea di base del grafico corrispondente sullo schermo del computer non cambia più.
- Aumentare con attenzione il precarico (cioè aumentare la tensione) ruotando la vite di regolazione in senso orario. Per le camere con la massima rigidità, continuare fino a quando la linea di base corrispondente nel grafico è aumentata di 1000-1200 unità, che corrisponde a 1 mN di precarico.
NOTA: la regolazione esatta dipenderà dalla singola costante di molla di una camera di coltivazione, che può essere determinata mediante calibrazione prima di un esperimento secondo le istruzioni del produttore. Il software di registrazione consente di prendere in considerazione la calibrazione della singola camera in modo che le forze vengano visualizzate uniformemente in μN. Si consiglia di applicare la stimolazione elettrica dall'inizio della coltivazione. Pertanto, è ben possibile che la fetta inizi a contrarsi durante la regolazione del precarico. In questo caso, concentrarsi sulla linea di base diastolica per valutare il precarico.
9. Cambiare il mezzo
- Preparare il terreno di coltivazione secondo la ricetta nella Tabella 3. Poco prima dell'uso del mezzo, aggiungere 50 μL di β-mercaptoetanolo (50 mM) a un tubo da 50 ml. Conservare a 4 °C.
- Una volta ogni 2 giorni, scambiare parzialmente il terreno di coltivazione. Aggiornare il mezzo ogni 2 giorni, se si desidera la coltivazione a lungo termine delle fette miocardiche.
- Preriscaldare il mezzo fresco a bagnomaria o in un incubatore ad aria calda a 37 °C per 30-45 min. Rimuovere una camera di coltivazione dall'incubatore e posizionarla sotto una cappa a flusso laminare.
ATTENZIONE: È essenziale mantenere la camera, così come il mezzo, calda a 37 °C (> 35 °C) per evitare iper contratture dovute alla bassa temperatura. Un danno meno distinto può essere presente come un aumento della tensione diastolica entro poche ore dallo scambio medio. Questo può sembrare recuperare, ma lo stress ripetuto potrebbe causare un deterioramento accumulato. - Rimuovere il mezzo dalla camera di coltivazione, lasciando circa 0,8 ml nella camera. Aggiungere 1,6 ml di mezzo fresco alla stessa camera. Il volume totale del mezzo dovrebbe essere di circa 2,4 ml per camera.
- Riposizionare il coperchio della camera e riposizionare la camera di coltivazione nella rispettiva posizione.
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Representative Results
La contrazione delle fette miocardiche è stata visualizzata sullo schermo del computer dopo l'inserimento della camera di coltivazione nel connettore corrispondente (Figura 3). La contrazione delle fette miocardiche umane è iniziata immediatamente dopo la stimolazione. Le fette ipercontrastratte per 5-10 min. Ciò era visibile come un aumento delle forze diastoliche, causato da una contrattura tonica delle frazioni tissutali danneggiate. Questo processo è stato ripristinato a vari livelli entro 1-1,5 ore. Dopo la stabilizzazione, le fette di tessuto LV umano hanno mostrato forze di contrazione variabili tra 1 mN e 3 mN al momento della stimolazione. La sistole è mostrata come un forte aumento della forza di contrazione, seguita dalla diastole con una diminuzione altrettanto ripida della forza di contrazione.
La contrazione delle fette miocardiche è stata registrata dal software di coltivazione e salvata in un file designato. Ciascuno dei file di dati grezzi generati è stato convertito in un formato di file binario Axon leggibile (.abf) per una facile analisi e quantificazione dei dati. Per l'analisi iniziale, il file .abf è stato aperto in un programma appropriato. Sono stati selezionati circa 5 minuti di dati di contrazione per stabilire l'ampiezza media della contrazione durante questo periodo. Questo è stato fatto per più punti temporali nel file di dati registrato. Tracciare questi valori di contrazione nel tempo ha prodotto un grafico utile per confrontare lo sviluppo della contrazione in un ambiente di controllo e sperimentale. Per ottenere una visione più avanzata delle prestazioni delle fette generate, sono stati eseguiti protocolli di stimolazione. Durante questi protocolli, che durano circa 45 minuti, i parametri di stimolazione sono stati modificati per valutare i parametri di accoppiamento di contrazione.
L'attuale protocollo di stimolazione consisteva in quattro sezioni distinte: post-pausa-potenziamento, soglia di stimolazione, relazione forza-frequenza e periodo refrattario (Figura 4, Tabella 4). Durante il potenziamento post-pausa, la stimolazione viene ripresa dopo una breve interruzione di 3, 12, 50 o 120 s. Per determinare la soglia di stimolazione, la corrente di stimolazione viene aumentata in passi di 3 mA ogni 10 s, a partire da 8 mA e aumentando a 90 mA. Con questo test, la corrente di stimolazione minima può essere determinata per ogni fetta. Ciò non altera le impostazioni generali di stimolazione al di fuori del protocollo di stimolazione. La relazione forza-frequenza è valutata da un aumento graduale della frequenza di stimolazione (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 e 240 BPM), mentre la rispettiva durata di ogni passo viene ridotta in parallelo. Ad eccezione delle prime due impostazioni di frequenza, questo regime produce tra 20-40 contrazioni durante ogni passaggio. Il periodo refrattario di ogni fetta viene valutato inviando uno stimolo prematuro (S2) dopo uno stimolo normale (S1; 30 BPM). L'intervallo S1-S2 viene accorciato ogni 10 s.
Per dimostrare le potenzialità del sistema di coltivazione presentato come strumento per testare interventi farmacologici, sono state preparate fette di tessuto LV umano ex vivo dallo stesso paziente e sottoposte ad agenti farmacologici che influenzano i livelli intracellulari di ione calcio (Ca2+) (n = 1) dopo 2 settimane di coltivazione. L'antagonista del canale Ca2+ di tipo L nifedipina inibisce l'afflusso di Ca2+ nelle cellule miocardiche e quindi abbassa la disponibilità intracellulare di Ca2+ e riduce la contrattilità17. A causa della sua azione vasodilatatore, la nifedipina è usata come farmaco anti-ipertensivo. Per dimostrare le differenze farmacologiche degli antagonisti del canale Ca2+, la calciseptina è stata studiata per il confronto. La calciseptina è anche un antagonista del canale Ca2+ di tipo L, estratto dal veleno dendroaspis p. polylepis 18. Pertanto, condivide l'azione inotropa negativa della nifedipina. Tuttavia, la calciseptina ha diverse caratteristiche di legame ed è più potente rispetto alla nifedipina19. Al fine di studiare le modulazioni positive e negative della disponibilità di Ca2+ , abbiamo anche testato l'agonista dei canali del calcio Bay-K8644 (estere metilico dell'acido 1,4-diidro-2,6-dimetil-5-nitro-4-(2-[trifluorometil]fenil)piridina-3-carbossilico)20.
Tre fette sono state trattate rispettivamente con nifedipina (125 nM), calciseptina (70,8 nM) e Bay-K8644 (417 nM), mentre la quarta fetta non ha ricevuto alcun farmaco (controllo). Le forze di contrazione sotto i parametri generali di stimolazione (corrente di 50 mA, impulsi bifasici durata 3 ms, intervallo di 1 ms e velocità di stimolazione di 30 BPM) sono state confrontate prima e dopo il trattamento. Inoltre, prima del trattamento, è stato eseguito un protocollo di stimolazione per valutare i valori basali per post-pausa-potenziamento, soglia di stimolazione, relazione forza-frequenza e periodo refrattario. Dopo 30 minuti di trattamento, è stato eseguito un secondo protocollo di stimolazione. Per eliminare le differenze interindividuali, l'ampiezza di contrazione di ciascuna fetta è stata normalizzata al suo livello basale prima del trattamento. Il basale (cioè il 100%) è stato determinato analizzando gli ultimi cinque cicli di contrazione prima dell'inizio del protocollo di stimolazione pre-trattamento.
Analizzando la contrazione delle fette alla stimolazione generale, è stato osservato che la forza di contrazione delle fette trattate con antagonisti di Ca2+ (nifedipina e calciseptina) è diminuita entro 10 minuti dopo il trattamento (Figura 5) e l'effetto era presente fino a 20 minuti dopo il trattamento. Al contrario, l'agonista a2 canali Ca 2+ voltaggio-gated Bay-K8644 ha aumentato la forza di contrazione della fetta trattata. La sezione di controllo non ha mostrato una modifica degna di nota. I dati di contrazione generati durante i protocolli di stimolazione sono stati analizzati in modo simile. Qui, i dati generati dal protocollo di stimolazione eseguito prima del trattamento (pre-trattamento) sono stati confrontati con i dati post-trattamento dello stesso protocollo di stimolazione.
Come discusso in precedenza, il protocollo di stimolazione è iniziato con la valutazione del potenziamento post-pausa. Durante la pausa, l'ulteriore Ca2+ viene assorbito dal reticolo sarcoplasmatico (SR), che viene rilasciato alla prima stimolazione dopo la pausa. Quindi, il potenziamento post-pausa riflette il rilascio intracellularedi Ca 2+ dalla SR. Come tale, questo parametro può essere utilizzato per valutare il contributo relativo di Ca2+ rilasciato dalla SR dal recettore della rianodina. Per valutare il potenziamento delle fette dopo una pausa di stimolazione, la forza della prima contrazione dopo la pausa è stata divisa per la contrazione media prima della rispettiva pausa. La sezione di controllo non ha mostrato alcuna modifica degna di nota (Figura 6A). È stato osservato che l'inibizione dei canali Ca2+ di tipo L ha portato al potenziamento della prima contrazione dopo una pausa di almeno 50 s (Figura 6B,D), riflettendo un maggiore contributo relativo del rilascio intracellulare di Ca2+ alla contrattilità totale. L'effetto opposto è stato osservato nella fetta trattata con Bay-K8644, che stimola l'ingresso di Ca2+ extracellulare attraverso i canali Ca2+ di tipo L (Figura 6C).
La relazione forza-frequenza è stata valutata aumentando successivamente la velocità di stimolazione fino a 180 BPM. Per una migliore visualizzazione, la forza di contrazione a diverse frequenze di stimolazione è stata normalizzata alla contrazione basale a 30 BPM all'interno dello stesso protocollo (= 100%). L'analisi dei dati ha mostrato che il trattamento con calciseptina non ha modificato la capacità della fetta di seguire gli stimoli all'aumentare della frequenza di stimolazione quando si confrontano i dati pre e post-trattamento (Figura 7B). Non è stato osservato alcun cambiamento nella sezione di controllo (Figura 7A). Contrariamente alla calciseptina, la nifedipina ha impedito un aumento della contrattilità a velocità di stimolazione più elevate e ha ridotto la velocità massima di cattura a 80 BPM (Figura 7D). La fetta trattata con l'agonista del canale Ca2+ Bay-K8644 ha mostrato un aumento della forza di contrazione a frequenze di stimolazione molto basse (Figura 7C). Tuttavia, a frequenze superiori a 50 BPM, la forza di contrazione sembrava essere inferiore rispetto alla condizione di pre-trattamento. Anche la soglia di stimolazione e il periodo refrattario sono stati determinati prima e dopo il trattamento. Tuttavia, non sono state osservate differenze e i dati non sono quindi mostrati.
Figura 1: Panoramica dei materiali richiesti e del sistema di coltivazione. (A) Una camera di coltivazione vuota collegata a un circuito verde. Il circuito stampato (1) misura la contrazione con un sensore e trasmette i dati al controller. (B) Otto camere riempite poste sulla piastra principale a dondolo. I coperchi della capsula di Petri (35 mm) vengono utilizzati per coprire le camere. (C) Gli strumenti (chirurgici) necessari per tagliare il campione miocardico transmurale. Sono raffigurate varie pinzette, le lame necessarie per il vibratome e una patch di gomma per aiutare nel taglio. (D) Quattro aghi da 0,9 mm x 70 mm 20 G fissati in posizione quadrata (0,9 cm x 0,9 cm) da un blocco solido di plastica. L'uso di questo costrutto previene il danneggiamento e il movimento del campione durante il taglio e produce un blocco di tessuto con le dimensioni richieste. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lavorazione di due campioni di LV. (A) Due blocchi di tessuto miocardico (circa 1 cm x 1 cm x 1 cm) incorporati in agarosio solidificato a bassa fusione in una capsula di Petri da 35 mm. A scopo dimostrativo, è stato utilizzato tessuto LV suino. (B) Il blocco di agarosio con i campioni incorporati è stato rimosso dalla capsula di Petri, tagliato e incollato sulla piattaforma di taglio del vibratoma. Qui, il tessuto LV suino è stato utilizzato a scopo dimostrativo. Si noti il colore uniforme del tessuto e l'assenza di tessuto fibrotico bianco, indicato dalla freccia rossa. (C) Dopo l'affettamento, l'agarosio viene accuratamente rimosso e i triangoli di plastica (1) sono collegati perpendicolarmente alla direzione delle fibre miocardiche. Le linee rosse indicano la direzione delle fibre miocardiche. (D) È stato preparato tessuto LV umano, che ha mostrato tessuto fibrotico bianco all'interno delle fette. Ciò non riduce necessariamente il tasso di successo della coltivazione; tuttavia si consiglia di utilizzare fette che non mostrano fibrosi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il software di coltivazione. A seconda del numero di canali utilizzati (massimo otto), la registrazione della contrazione verrà visualizzata in un massimo di tre finestre designate (due visibili nella figura). Ogni camera di coltivazione viene visualizzata come un grafico di contrazione. Nella finestra delle impostazioni, i parametri di stimolazione possono essere modificati e adattati alla situazione sperimentale desiderata. Questa finestra consente anche di avviare o interrompere il protocollo / programma di stimolazione selezionato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Lettura della contrazione di cinque fette miocardiche durante un tipico protocollo di stimolazione. In tutti i pannelli, ogni singola fetta viene mostrata nello stesso colore. (A) Il post-pausa-potenziamento valuta la prima contrazione dopo una breve pausa di stimolazione rispettivamente di 3, 12, 50 e 120 secondi. (B) Determinazione della soglia di stimolazione aumentando la corrente di stimolazione in passi di 3 mA ogni 10 s da 8 mA a 80 mA. (C) La relazione forza-frequenza di ciascuna fetta è valutata mediante aumenti graduali della frequenza di stimolazione da 12 BPM a 240 BPM. La durata dei periodi di stimolazione diventa più breve a frequenze più alte per mantenere costante il numero di battiti ad ogni frequenza. (D) Per valutare il periodo refrattario, le fette sono esposte a stimolazioni premature (S2) a intervalli decrescenti rispetto allo stimolo precedente (S1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi della forza di contrazione prima e dopo il trattamento con agenti che influenzano il canale Ca2+ di tipo L. Tutti i dati (n = 1) sono stati normalizzati alla contrattilità basale (media di cinque battiti separati prima del trattamento (0)). Gli antagonisti del canale Ca2+ di tipo L nifedipina (125 nM), calciseptina (70,8 nM) e l'agonista del canale Ca2+ di tipo L Bay-K8644 (417 nM) sono stati aggiunti alla contrazione di fette miocardiche LV umane. La fetta di controllo non ha ricevuto alcun trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Post-pausa-potenziamento delle fette trattate e di controllo. Sono state osservate differenze nel potenziamento post-pausa (basale vs post-trattamento; n = 1). Qui, l'ampiezza della prima contrazione dopo una pausa è stata normalizzata all'ampiezza media di contrazione prima della rispettiva pausa. La linea di base è stata impostata al 100% e assomiglia alla forza di contrazione media degli ultimi cinque cicli prima dell'inizio della prima pausa. L'asse Y visualizza la prima contrazione normalizzata dopo una pausa di varie durate. L'asse X mostra la linea di base e le lunghezze di pausa. (A) Fetta di controllo senza trattamento. (B) Trattamento con calciseptina. (C) Trattamento Bay-K8644. (D) Trattamento con nifedipina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi della relazione di frequenza della forza. I dati di contrazione (n = 1) sono stati normalizzati alla forza di contrazione a 30 BPM all'interno del rispettivo protocollo (= 100%). A) la fetta di controllo non è stata trattata con alcuna sostanza; tuttavia, tutti gli altri aspetti della coltivazione erano gli stessi di quelli delle fette trattate. (B) Trattamento con calciseptina di una fetta miocardica LV. (C) Trattamento Bay-K8644. (D) Trattamento con nifedipina. I dati sulla forza di contrazione di questa fetta durante le frequenze di stimolazione superiori a 80 BPM sono stati omessi, poiché la contrazione non seguiva la frequenza di stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Composizione del tampone di affettamento utilizzato per il trasporto e durante la procedura di affettamento. Per la preparazione dell'agarosio, il glucosio viene omesso. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Composizione del gel di agarosio al 4%. Questo gel di agarosio a basso fuso privo di glucosio viene utilizzato per l'incorporamento dei campioni di tessuto. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Preparazione del terreno per la coltivazione. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Dettagli del protocollo di stimolazione. Il protocollo di stimolazione è composto da quattro parti, che possono essere modificate per soddisfare le esigenze del progetto. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
In passato, la ricerca cardiovascolare ha fatto grandi progressi nella coltivazione dei cardiomiociti. Tuttavia, la coltivazione 3D di cardiomiociti con geometria intatta non è ancora ben consolidata. Rispetto ai precedenti protocolli applicati per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico, il protocollo che abbiamo descritto qui assomiglia più da vicino all'ambiente in vivo del tessuto. Inoltre, l'applicazione di pre e postcarico consente un ambiente più biomimetico. Siamo in grado di analizzare e comprendere appieno la registrazione continua dei dati di contrazione e dei parametri di contrazione del tessuto.
Il numero di tecniche di coltivazione di tessuti cardiovascolari ex vivo che utilizzano strutture simili è limitatoa 11,21,22. Una tecnica simile per la coltivazione di fette miocardiche che è stata pubblicata utilizza una piastra a 6 pozzetti per la coltivazione di fette miocardiche10. Tuttavia, un importante limite di questo particolare set-up è che le fette non sono esposte al pre- e post-carico, né è in grado di produrre una visione dettagliata della contrazione nel tempo senza la necessità di maneggiare il tessuto. Il metodo che abbiamo descritto qui riduce il rischio di danni ai tessuti o infezioni. Inoltre, fornisce una visione completa dei possibili cambiamenti nella forza contrattile ogni volta che una sostanza di interesse viene aggiunta alla coltivazione. Oltre all'analisi della normale forza di contrazione di ogni fetta, l'impostazione corrente consente di eseguire regolarmente protocolli predefiniti. Ciò consente la raccolta di dati di diversi parametri rilevanti del tessuto coltivato.
Passaggi critici all'interno del protocollo
Il danno tissutale deve essere evitato e questo può già verificarsi durante l'intervento chirurgico di espianto. Se il tessuto non viene immediatamente trasferito alla soluzione di conservazione a freddo dopo l'escissione, ciò può causare campioni di tessuto danneggiati. Il protocollo descritto contiene diversi passaggi fondamentali per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Il composto incorporante del tessuto di agarosio deve essere preparato utilizzando il tampone di affettamento senza glucosio, per evitare la possibile caramellizzazione del glucosio durante il processo di fusione prima dell'inizio del protocollo. È importante evitare danni dovuti all'ipertermia causati dall'uso di agarosio direttamente dal bagno d'acqua a 80 °C, invece di incubare l'agarosio in una siringa a 37 °C. La temperatura deve essere di 4 °C durante la conservazione e il taglio per ridurre il metabolismo e ridurre al minimo l'ischemia. Inoltre, il tessuto deve essere maneggiato con cura, afferrando l'agarosio piuttosto che il tessuto stesso, quando lo si sposta tra il vassoio di taglio e la piastra di Petri per attaccare i triangoli di plastica. È della massima importanza che questi triangoli siano attaccati nella direzione corretta rispetto alla direzione delle fibre miocardiche. Il disallineamento dei triangoli comporterà danni ai tessuti.
In generale, la soglia di stimolazione delle fette appena tagliate è compresa tra 10-20 mA e la corrente dovrebbe essere attentamente aumentata. La sovrastimolazione del tessuto da parte di una corrente troppo elevata può portare anche a danni irreversibili al campione. Una volta iniziata la stimolazione, l'agitazione dei tessuti oscillando le camere di coltivazione è necessaria e non deve mai essere interrotta per più di 5 minuti per garantire un'adeguata disponibilità di ossigeno e sostanze nutritive al tessuto.
Risoluzione dei problemi e modifiche
Iper contrattura
L'iperretrazione del campione di tessuto miocardico è uno dei principali criteri di esclusione per il protocollo discusso. Ciò può verificarsi prima e dopo la preparazione delle fette miocardiche. Nei casi in cui, prima della preparazione, il tessuto si sentiva rigido alla palpazione, è stata osservata ipercontrazione in almeno il 70% dei preparati. L'iperretrazione del campione di tessuto può verificarsi anche al momento dell'inserimento sul bilanciere, che probabilmente dipende dalla qualità del tessuto o dallo stato di malattia del paziente. L'iperretrazione può essere vista come un aumento del tono diastolico durante la stimolazione del tessuto, corrispondente all'accorciamento tonico dei cardiomiociti danneggiati nell'ischemia cardiaca. L'iperretrazione durante la stimolazione può essere progressiva, per cui la contrazione supera il limite di rilevamento di 12 mN. Tuttavia, l'iperretrazione può anche invertirsi spontaneamente entro 30-60 minuti, suggerendo che il tessuto può recuperare. Per migliorare il recupero del tessuto, le impostazioni di precarico devono essere regolate (ad esempio, ripetere il passaggio 8.3) dopo 1 ora di incubazione, nonché nei giorni 2, 4 e 6 dopo la preparazione. L'ipercatritura può essere presente sia con che senza la contrazione stimolata dei campioni. Tuttavia, se non si osserva alcuna contrazione entro 1 ora, il campione non deve essere utilizzato. In questo caso, il tessuto ha ipercontratto a un livello da cui non può recuperare o è stato danneggiato altrimenti. In generale, la coltivazione di fette miocardiche umane secondo il protocollo presentato, ha dimostrato di avere un tasso di successo del 90%.
Variazioni previste della forza di contrazione
A seconda di una moltitudine di fattori (ad esempio, paziente, preparazione, danno tissutale), è possibile che le mioslice che inizialmente hanno mostrato una contrazione accettabile, subiscano un progressivo declino delle ampiezze contrattili durante le prime 24 ore. In effetti, questo comportamento può anche essere considerato normale per le fette ottenute da cuori umani che falliscono allo stadio terminale. È stato riscontrato che riadattare il precaricamento delle fette ogni giorno per i successivi 3 giorni per alleviare questo problema e migliorare la contrazione. Dopo 24-48 ore, tuttavia, la contrattilità dovrebbe ricominciare ad aumentare. Si noti che la contrazione non tornerà al livello inizialmente osservato entro i primi giorni di coltivazione.
Poco dopo lo scambio medio, quando i campioni vengono restituiti all'incubatrice, la contrazione mostra tipicamente ampiezze marcatamente aumentate. L'apertura e la chiusura dell'incubatore contribuiscono a questo aumento, in quanto provoca la caduta del livello di CO2 . Ciò aumenta il pH all'interno del terreno di coltivazione tamponato con bicarbonato, che provoca una risposta inotropa positiva delle fette. Seguendo lo scambio medio, la forza contrattile delle fette spesso diminuisce per diverse ore fino a raggiungere o superare il suo valore iniziale. Per evitare che i protocolli di stimolazione siano influenzati dallo scambio medio, i protocolli di stimolazione non devono essere eseguiti fino ad almeno 1 ora dopo lo scambio medio.
Limitazioni del metodo
Un vantaggio della tecnica attuale rispetto ai precedenti metodi di coltivazione per il tessuto miocardico umano, è la possibilità di applicare (e modulare) pre e postcarico al tessuto contraente. Tuttavia, è difficile quantificare il carico applicato in termini di tensione della parete, sebbene questo carico possa essere stimato dalla costante della molla e dalle dimensioni della fetta. Si presume che esista una relazione positiva tra la vitalità del tessuto miocardico e l'ampiezza di contrazione del campione di tessuto. Eppure attualmente non esiste un metodo che consenta di testare la fattibilità di ogni singola fetta prima di montarla nelle camere. Una colorazione MTT colorimetrica può essere eseguita su fette tagliate che non vengono utilizzate per la coltivazione, per determinare la vitalità delle cellule miocardiche. Nelle cellule che sono vitali, NADPH ridurrà il sale MTT giallo in cristalli di formazan viola. Un'altra limitazione è che attualmente, i nutrienti nel terreno di coltivazione sono limitati agli ingredienti di base. Quindi, i nutrienti e i fattori circolanti sono diversi dall'ambiente in vivo da cui è stato ottenuto il tessuto. Tuttavia, il mezzo può essere integrato o modificato secondo necessità.
Potenziali applicazioni del metodo
Esistono diverse potenziali applicazioni del metodo sia in termini di cardiotossicità e test antidroga, sia nella comprensione della fisiopatologia delle malattie cardiache. In primo luogo, il sistema utilizzato nel protocollo discusso può essere utilizzato per screening di farmaci e cardiotossicità. Con l'aiuto dei protocolli di stimolazione programmabili, i cambiamenti fisiologici possono essere analizzati in risposta alla somministrazione del farmaco. Per quanto riguarda l'interpretazione del periodo refrattario, è necessario considerare che si tratta di un parametro funzionale, che non riflette strettamente l'effetto dei farmaci sulla durata del potenziale d'azione. In secondo luogo, le camere di coltivazione possono essere utilizzate per vari esperimenti di co-coltivazione del miocardio in combinazione con le cellule immunitarie. Utilizzando questa co-coltivazione, è possibile valutare gli effetti diretti dei fattori secreti dalle cellule immunitarie sulla contrazione miocardica. Infine, possono essere coltivati anche campioni di cardiomiopatia non trapiantati, sebbene questi campioni di tessuto non trapiantati siano generalmente più piccoli e quindi più difficili da elaborare. Tuttavia, ciò può aprire possibilità per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di farmaci mirati. È anche concepibile utilizzare la tecnica per la caratterizzazione tissutale specifica del paziente, portandoci un passo più vicino alla medicina personalizzata. Inoltre, il metodo presentato può essere utilizzato per il tessuto miocardico non umano, esempi dei quali sono maiale e coniglio. Va considerato che l'elevata frequenza cardiaca fisiologica dei piccoli mammiferi (topo/ratto) non può essere ottenuta, perché il successivo requisito più elevato di O2 non può essere soddisfatto nelle condizioni di coltivazione miocardica utilizzando l'impostazione discussa. In tal modo, un ambiente quasi fisiologico è difficile da imitare in questi casi.
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Disclosures
JH, PS, DM e KL non hanno nulla da rivelare. AD e TS sono azionisti di InVitroSys GmbH, che fornisce il sistema di coltivazione Myodish.
Acknowledgments
La ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Gli autori desiderano ringraziare Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch per il loro supporto nella preparazione degli allestimenti, nonché per il regolare mantenimento della coltivazione dei tessuti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
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