Summary
Vi præsenterer en protokol for ex vivo dyrkning af humant ventrikulært myokardievæv. Det giver mulighed for detaljeret analyse af sammentrækningskraft og kinetik samt anvendelse af præ- og efterbelastning for at efterligne det in vivo fysiologiske miljø nærmere.
Abstract
Kardiomyocytdyrkning har set et stort antal udviklinger, lige fra todimensionel (2D) celledyrkning til iPSC-afledte organoider. I 2019 blev der demonstreret en ex vivo måde at dyrke myokardieskiver opnået fra humane hjerteprøver, mens man nærmer sig in vivo tilstand af myokardiekontraktion. Disse prøver stammer hovedsagelig fra hjertetransplantationer eller placeringer af venstre ventrikulær hjælpeanordning. Ved hjælp af en vibratom og et specielt udviklet dyrkningssystem placeres 300 μm tykke skiver mellem en fast og en fjedertråd, hvilket giver mulighed for stabil og reproducerbar dyrkning i flere uger. Under dyrkning stimuleres skiverne kontinuerligt i henhold til individuelle indstillinger. Sammentrækninger kan vises og registreres i realtid, og farmakologiske midler kan let påføres. Brugerdefinerede stimuleringsprotokoller kan planlægges og udføres for at vurdere vitale sammentrækningsparametre som post-pause-potensering, stimuleringstærskel, kraftfrekvensrelation og ildfast periode. Desuden muliggør systemet en variabel for- og efterbelastningsindstilling for en mere fysiologisk dyrkning.
Her præsenterer vi en trinvis vejledning om, hvordan man genererer en vellykket langsigtet dyrkning af menneskelige venstre ventrikulære myokardieskiver ved hjælp af en kommerciel biomimetisk dyrkningsløsning.
Introduction
I det sidste årti har in vitro-dyrkning af myokardieceller gjort store fremskridt, lige fra 2D og tredimensionelle (3D) teknikker til anvendelse af organoider og inducerede pluripotente stamceller differentieret i hjertemyocytter 1,2,3. Ex vivo og primærcelledyrkning har vist sig at være af stor værdi, især for genetiske undersøgelser og lægemiddeludvikling 4,5,6. Brug af humane væv forbedrer den translationelle værdi af resultaterne. Langsigtet 3D-dyrkning af myokardievæv med intakt geometri er imidlertid ikke veletableret. Den intakte geometri er en nøglefunktion til at efterligne in vivo-forhold, da korrekt hjertefunktion, kommunikation mellem forskellige celler samt cellematrixinteraktioner er forudsætninger. Myokardievævsdyrkning gennemgik forskellige udviklingsfaser. Succesraten og stabiliteten af ex vivo myokardievævsdyrkning var oprindeligt ret lav, men nylige tilgange har givet lovende resultater 7,8,9,10,11.
Blandt disse var Fischer et al. de første til at demonstrere, at levedygtighed og kontraktil ydeevne af humant myokardievæv kan opretholdes i ex vivocelledyrkning i mange uger7. Deres teknik var baseret på tynde vævsskiver skåret fra udplantet humant myokardium, som blev monteret i nyudviklede dyrkningskamre, der gav definerede biomekaniske forhold og kontinuerlig elektrisk stimulering. Denne dyrkningsmetode ligner meget myokardievævets in vivo-funktion og er blevet reproduceret af flere uafhængige forskergrupper 2,12,13,14,15. Det er vigtigt, at de kamre, der blev brugt af Fischer et al., også muliggjorde kontinuerlig registrering af udviklede kræfter i op til 4 måneder og dermed åbnede hidtil usete muligheder for fysiologisk og farmakologisk forskning i intakt humant myokardium7.
Lignende teknikker blev uafhængigt udviklet af andre grupper og anvendt på humant, rotte, svin og kaninmyokardium 7,10,11. Pitoulis et al. udviklede efterfølgende en mere fysiologisk metode, som reproducerer den normale kraftlængderelation under en sammentrækningscyklus, men er mindre egnet til analyse af høj kapacitet16. Som sådan kan den generelle tilgang til biomimetisk dyrkning betragtes som et yderligere skridt i reduktion, raffinement og erstatning (3R) af dyreforsøg.
Udnyttelsen af dette potentiale kræver imidlertid standardiserede procedurer, analyser af højt indhold og et højt gennemløbsniveau. Vi præsenterer en teknik, der kombinerer automatiseret udskæring af levende humant myokardium med in vitro-vedligeholdelse i et biomimetisk dyrkningssystem, der er blevet kommercielt tilgængeligt (se materialetabel). Med den foreslåede tilgang er antallet af individuelle skiver, der kan genereres fra en enkelt transmural myokardieprøve, kun begrænset af behandlingstiden. En prøve af tilstrækkelig størrelse og kvalitet (3 cm x 3 cm) giver ofte 20-40 vævsskiver, der bekvemt skæres med en automatiseret vibratom. Disse skiver kan placeres i dyrkningskamre, der tilhører systemet. Kamrene giver mulighed for elektrisk stimulering, hvis parametre kan moduleres (dvs. pulsvarighed, polaritet, hastighed og strøm) samt justering af for- og efterbelastning ved hjælp af fjedertråde inde i kamrene. Sammentrækningen af hver skive registreres fra bevægelsen af en lille magnet fastgjort til en fjedertråd og vises som en fortolkelig graf. Data kan til enhver tid registreres og analyseres ved hjælp af frit tilgængelig software. Bortset fra den konstante baseline pacing kan planlagte protokoller udføres for funktionelt at vurdere deres ildfaste periode, stimuleringstærskel, post-pause-potensering og kraftfrekvensrelation.
Denne langsigtede biomimetiske dyrkning af flere myokardieskiver fra et individuelt hjerte baner vejen for fremtidig ex vivo-forskning i både humant og animalsk væv og letter screeningen for terapeutiske og kardiotoksiske lægemiddeleffekter i kardiovaskulær medicin. Det er allerede blevet anvendt på forskellige eksperimentelle tilgange 2,12,13,15. Her giver vi en detaljeret trinvis beskrivelse af fremstillingen af humant væv og giver løsninger på ofte opståede dyrkningsproblemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vævsindsamling til de eksperimenter, der er beskrevet her, blev godkendt af institutional review boards ved universitetet i München og Ruhr-Universitetet Bochum. Undersøgelserne blev udført i henhold til Helsinki-retningslinjerne. Patienterne gav deres skriftlige informerede samtykke forud for vævsindsamling.
1. Erhvervelse af væv
- Få humant væv fra patienter, der gennemgår hjertetransplantation eller hjertekirurgi.
- Før udtagning af vævet skal der forberedes 2 liter kardioplegisk opløsning (yderligere benævnt skærebuffer (tabel 1)).
- Efter at have fået foretaget en 4 cm x 4 cm stor transmural venstre ventrikulær (LV) biopsi anbringes vævet straks (inden for 5 minutter efter udskæring) i et plastisk engangsbægerglas indeholdende ca. 70 ml kold (4 °C) skærebuffer. Opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Den udskæringsbuffer, der anvendes i denne protokol, giver mulighed for kold opbevaring (4 °C) af vævet i op til 36 timer. Dette tillader kold transport af vævet fra klinikker, der ikke er tæt på laboratoriet. Transporttider ≤ 24 timer har dog vist sig at være optimale.
2. Forberedelse af agarose og vibratom
- Sørg for, at der forberedes og steriliseres tilstrækkelige dyrkningskamre (figur 1A).
- Nedsænk kamrene og grafitelektroderne i 1 liter af en 10% isopropanolopløsning og omrør natten over. Den følgende dag overføres kamrene til en 100% isopropanolopløsning i 3 minutter og autoklaver grafitelektroderne ved 120 ° C i 10 minutter.
- Lad kamrene og grafitelektroderne lufttørre under en laminær flowhætte.
- Fastgør et printkort til hvert af kamrene i henhold til de tilgængelige positioner på vipperen. Placer to grafitelektroder på printkortet i henhold til producentens anvisninger.
- Læg et 35 mm petriskålslåg oven på kammeret for at forhindre forurening.
- Opsæt Myodish-dyrkningssystemet (se Materialetabel) i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 ved at forbinde systemet til en computer (figur 1B).
- Forbered 4% lavsmeltet agarose i udskæringsbuffer (uden glucose; Tabel 2). Agarosen kan opbevares ved 4 °C i 6 måneder.
- På forsøgsdagen smeltes et lagervolumen af agaroseopløsning ved hjælp af et vandbad indstillet til 80 °C. Afhængigt af mængden tager smeltning ca. 30 min.
- Når agarosen er flydende, skal du trække 8 ml flydende agarose op i en 10 ml sprøjte med yderligere 2 ml luft. Luk sprøjten med en steril hætte, og læg den på hovedet i et 37 °C vandbad i 20 minutter for at forhindre, at agarosen størkner, og for at afbalancere dens temperatur for at forhindre hypertermiskader på prøven.
- Hvis det er til stede, skal du tænde for vibratomets vandkøleanordning mindst 30 minutter før vævsskæring for at give tilstrækkelig kølekapacitet. Temperaturen på vandcirkulationen indstilles til 4 °C.
BEMÆRK: Skærebakken og kølepladen, der blev brugt her, indeholdt begge en indbygget vandcirkulation. Dette anbefales stærkt til afkøling og for at mindske forureningsrisikoen. Det er dog også muligt at bruge is som køleteknik. Vandkøleenheden behøver heller ikke at være tilsluttet vibratomens skærebakke og/eller køleplade på dette tidspunkt i protokollen. - Rengør vibratomets udskæringsbakke og prøveplade ved at skylle alle overflader med 100% isopropanol i mindst 3 minutter.
BEMÆRK: Afhængigt af det anvendte vibratomsystem kan vibratomopsætningen variere. Se manualen til vibratomet, der findes i laboratoriet for information om opsætnings- og vingekalibreringsmetoder. - Fyld skærebakken op til 90%-95% med skærebuffer. I det aktuelt anvendte set-up svarer det til ca. 400 ml. Tilslut slangen til vandkølingsanordningen til ventilerne på vibratomens skærebakke og køleplade.
- Desinficere alle værktøjer, der er nødvendige til forberedelsen, ved at nedsænke dem i en 100% isopropanolopløsning i 5 s. Fjern værktøjerne fra isopropanolopløsningen, og lufttørre under laminær flowhætten.
3. Trimning og indlejring af prøverne
- Vævsprøven overføres til en 100 mm petriskål fyldt med kold udskæringsbuffer. Opbevar fadet på en køleplade ved 4 °C (tilsluttet køler eller anbragt på is).
- Fjern endokardial trabeculae ved at holde endokardiet med pincet og bruge saks til at skære ca. 3 mm endokardialt væv væk. På samme måde skal du fjerne overdreven fedtvæv under epikardiet, hvis det er til stede.
- Fastgør den afskårne vævsprøve, endokardial side opad, til en 2 cm x 2 cm gummiplaster ved hjælp af fire 0,9 mm x 70 mm 20 G nåle, der er fastgjort i kvadratisk position (0,9 cm x 0,9 cm; Figur 1C, D). Sørg for, at den diagonale kant af hver nålespids peger indad. Dette forbedrer fiksering og forhindrer skade på myokardiet.
FORSIGTIG: Orienteringen af ovennævnte firkant skal være ortogonal i forhold til den forventede dominerende myofiberretning. - Skær alt overskydende væv væk uden for firkanten med fire nåle ved hjælp af en skalpel. Hvis størrelsen af den oprindelige prøve tillader det, skal du bruge to myokardievævsprøver under dette præparat fra den samme rå prøve.
- Brug pincet til at placere den trimmede prøve på et sterilt stykke væv for at fjerne overskydende skærebuffer, der er tilbage på prøven. For at forhindre udtørring af prøven må prøven ikke opbevares på vævet i mere end 10 s.
- Prøven(erne) anbringes i en 35 mm petriskål, således at bladet skærer vinkelret på kardiomyocytjusteringen, og epikardiet vender nedad. Hvis præparatet indeholder to prøver, skal du sørge for, at prøverne er centreret og ikke rører hinanden.
- Tag agarosesprøjten fra vandbadet, og nedsænk prøven/prøverne i agarose. (Figur 2A). Lad agarosen størkne i 5 minutter på en køleplade. Prøven /prøverne skal forblive i kontakt med petriskålen, hvilket sikrer, at skæreplanet vil være parallelt med den fremherskende myokardiefiberretning.
FORSIGTIG: Tøm ikke sprøjten helt for at forhindre luftbobler. Vær opmærksom på mængden af agarose, der er tilbage i sprøjten under nedsænkning af prøverne. I tilfælde af luftbobler i skålen med prøverne skal du forsigtigt trække luftbobler tilbage i sprøjten.
4. Placering af prøverne på skærebakke
- Den størknede agarose, der indeholder prøven/prøverne, fjernes fra 35 mm petriskålen ved hjælp af en spatel eller et lignende værktøj ved at kile den fast mellem prøven og siden af petriskålen. Skær noget af agarosen væk ved hjælp af en skalpel, mens prøverne holdes dækket.
FORSIGTIG: Fjern ikke for meget af agarosen. Der skal være mindst 5 mm agarose tilbage på den lange og korte side i X/Z-planet.
BEMÆRK: Trin 4.2-4.4 skal udføres hurtigt efter hinanden (dvs. maksimalt 5 s). Hav alle nødvendige værktøjer inden for rækkevidde inden start. Det er ikke muligt at omplacere prøven efter anbringelsen. Prøv at begrænse limens eksponering for luft og fugt. Kontakt med luft eller væsker vil størkne limen, hvilket gør den ubrugelig. - Med en pipette anbringes og fordeles 60 μL lim i og omkring midten af skæreplatformen.
- Epikardiesiden af prøven i agarose anbringes oven på det limede område ved hjælp af en pincet. Flyt ikke. Endokardialsiden af prøven skal være synlig i agarosen. Lad limen størkne i 1 min. Tryk forsigtigt på agarosen, der indeholder prøven, fra toppen med et stumpt værktøj (f.eks. Pincet), mens du forhindrer at skære i eller beskadige agarosen.
- Prøveplatformen anbringes på sin angivne plads i vibratomets skærebakke, fyldt med skærebuffer.
5. Start af vibratomet
- Indstil vibrationsamplitude til 1 mm og den indledende skærehastighed til 0,07 mm/s. Indstil tykkelsen af skiven til 300 μm for at skære skiver.
- Så længe bladet kun skærer agarosen, skal du øge skærehastigheden til sit maksimum, som i dette tilfælde er 1,50 mm / s. Så snart vibratomet begynder at skære vævet, skal hastigheden straks reduceres til 0,07 mm/s.
BEMÆRK: Hvis vævet ikke skæres glat, for eksempel hvis der er store fibrotiske områder i prøven, kan det bidrage til at øge skæreamplituden op til 1,5 mm og reducere skærehastigheden til 0,04 mm / s.
6. Medium og inkubator forberedelse under udskæringsproceduren
- Fyld hvert dyrkningskammer med 2,4 ml komplet dyrkningsmedium (tabel 3).
- Placer dyrkningskamrene fyldt med medium på dyrkningssystemet i inkubatoren indstillet til 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 og en fugtighed på 80%. Ligevægt mediet i mindst 20 min.
- Tilslut dyrkningssystemet med en computer og start det tilsvarende softwareprogram.
- Indstil vippehastigheden til 60 o / min, og forudindstil stimuleringsparametrene (stimuleringsimpulser og frekvens). For humane hjerteskiver skal du indstille standardstimuleringen til bifasiske impulser med 50 mA strøm, hver bestående af 3 ms positiv strøm, en 1 ms pause og en 3 ms puls af omvendt strøm med en tempohastighed på 30 slag pr. Minut (BPM).
BEMÆRK: I velbevarede væv er den typiske stimuleringstærskel omkring 15 mA. For at sikre pålidelig stimulering og for at tage højde for enhver mulig stigning i stimuleringstærsklen anbefales det at indstille strømmen til en værdi, der overstiger stimuleringstærsklen med to til tre gange. - Kontroller elektrodeindikatorerne for softwaren for at kontrollere, at elektroderne i dyrkningskamrene fungerer korrekt.
BEMÆRK: Handling er nødvendig, når kanalindikatoren i dyrkningssoftwaren bliver rød. I dette tilfælde er de bipolære pulsladninger ikke afbalancerede.
7. Forberedelse af skiverne
BEMÆRK: Indledende subendokardieskiver er normalt ikke egnede til vævsdyrkning og skal kasseres på grund af ujævn morfologi. Efter de første fem til 10 skiver forbedres skivetekstur og morfologi. Den ideelle skive er mindst 1 cm x 1 cm, har ingen eller kun begrænsede fibrotiske pletter, er ikke fragmenteret og har homogen fiberjustering (figur 2B, D). Interstitiel fibrose, der ligger mellem myocytfibrene, er ofte til stede i svigtende humant myokardium. Overraskende nok er dette ikke en negativ forudsigelse for dyrkningssucces.
- Hæld en tilstrækkelig mængde kold skærebuffer i et 5 cm petriskålslåg for at sikre, at skiverne ikke tørrer ud. Læg skiverne i petriskålslåget, der indeholder den kolde skærebuffer.
- Adskil agarosen fra vævet ved hjælp af en pincet. Undgå at røre ved vævet. Håndter vævet omhyggeligt, da enhver skade på vævet vil reducere dyrkningens succesrate.
- Bestem myokardiefibrenes retning ved nøje inspektion mod en lyskilde. Dette er vigtigt, når plasttrekanterne knyttes til vævet i trin 7.6.
BEMÆRK: Trin 7.4 og 7.5 skal udføres hurtigt efter hinanden inden for 5 s. - Fastgør to plasttrekanter til en prøve ved hjælp af lim for at forankre vævet inde i dyrkningskamrene.
- Læg 1 μL lim på et sterilt petriskålslåg. Brug en kroget pincet til at hente en af de autoklaverede plasttrekanter. Dyp hurtigt trekantens forkant i limen og indsæt trekanten på prøven vinkelret på kardiomyocytjusteringen. Gentag for den anden trekant.
- Trim væv, der overstiger trekantbredden, med en skalpel (figur 2C). Læg skiven med de to monterede trekanter tilbage i skærebakkens skærebuffer.
BEMÆRK: Gentag trin 7.2 til 7.5, indtil der er forberedt nok skiver til at fylde dyrkningskamrene. Vi anbefaler at forberede et par ekstra skiver for at muliggøre udskiftning af skiver med dårlig sammentrækning.
8. Montering af skiverne
BEMÆRK: Efterbelastningen bestemmes af stivheden af fjedertråden i dyrkningskamrene. Tre forskellige typer er tilgængelige, baseret på tykkelsen af fjedertråden.
- Tag et mediumfyldt dyrkningskammer fra inkubatoren. Vælg en af de forberedte skiver og indsæt den i kammeret ved at forbinde en trekant til hver stift.
- Juster afstanden mellem monteringsstifterne i henhold til prøvestørrelsen. Sørg for, at prøven er nedsænket i medium. Placer kammeret tilbage i dets udpegede stik i dyrkningssystemet i inkubatoren.
FORSIGTIG: Overstræk ikke vævet og bøj ikke fjedertråden for meget! - Indstil forspændingsspændingen efter placering af skålen på vipperen.
- Reducer forspændingen ved at dreje justeringsskruen mod uret. Gør dette, indtil basislinjen for den tilsvarende graf på computerskærmen ikke længere ændres.
- Forøg forsigtigt forspændingen (dvs. øg spændingen) ved at dreje justeringsskruen med uret. For kamrene med den højeste stivhed skal du fortsætte, indtil den tilsvarende basislinje i grafen er steget med 1000-1200 enheder, hvilket svarer til 1 mN forspænding.
BEMÆRK: Den nøjagtige justering afhænger af den enkelte fjederkonstant i et dyrkningskammer, som kan bestemmes ved kalibrering forud for et forsøg i henhold til producentens anvisninger. Optagelsessoftwaren gør det muligt at overveje den enkelte kammerkalibrering, så kræfterne vises ensartet i μN. Det anbefales at anvende elektrisk stimulering fra starten af dyrkningen. Som sådan er det godt muligt, at skiven begynder at trække sig sammen under forudbelastningsjusteringen. I dette tilfælde skal du fokusere på den diastoliske baseline for at vurdere forudbelastningen.
9. Ændring af mediet
- Forbered dyrkningsmedium i henhold til opskriften i tabel 3. Kort før brug af mediet tilsættes 50 μL β-mercaptoethanol (50 mM) til et 50 ml rør. Opbevares ved 4 °C.
- En gang hver 2. dag udveksles delvist dyrkningsmediet. Opdater mediet hver 2. dag, hvis der ønskes langsigtet dyrkning af myokardieskiverne.
- Forvarm det friske medium i et vandbad eller varmluftinkubator ved 37 °C i 30-45 min. Fjern et dyrkningskammer fra inkubatoren og læg det under en laminær flowhætte.
FORSIGTIG: Det er vigtigt at holde kammeret såvel som mediet varmt ved 37 ° C (> 35 ° C) for at forhindre hyperkontrakturer på grund af lav temperatur. Mindre tydelig skade kan være til stede som en stigning i diastolisk spænding inden for få timer efter medium udveksling. Dette kan synes at komme sig, men gentagen stress kan resultere i akkumulerende forringelse. - Fjern medium fra dyrkningskammeret, og efterlad ca. 0,8 ml i kammeret. Tilsæt 1,6 ml frisk medium til det samme kammer. Det samlede volumen af medium skal være omkring 2,4 ml pr. Kammer.
- Placer kammerets dæksel tilbage, og placer dyrkningskammeret tilbage i sin respektive position.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammentrækningen af myokardieskiverne blev vist på computerskærmen efter indsættelse af dyrkningskammeret i dets tilsvarende stik (figur 3). Sammentrækning af de menneskelige myokardieskiver startede umiddelbart efter stimulering. Skiverne hyperkontrakterede i 5-10 min. Dette var synligt som en stigning i diastoliske kræfter forårsaget af en tonisk kontraktur af beskadigede vævsfraktioner. Denne proces blev vendt tilbage i varierende grad inden for 1-1,5 time. Efter stabilisering viste humane LV-vævsskiver trækkræfter, der varierede mellem 1 mN og 3 mN ved stimulering. Systole er vist som en stærk stigning i sammentrækningskraft efterfulgt af diastol med et lige så stejlt fald i sammentrækningskraften.
Sammentrækning af myokardieskiverne blev registreret af dyrkningssoftwaren og gemt i en udpeget fil. Hver af de genererede rådatafiler blev konverteret til et læsbart Axon binært filformat (.abf) for nem analyse og kvantificering af dataene. Til den indledende analyse blev .abf-filen åbnet i et passende program. Ca. 5 minutters kontraktionsdata blev valgt for at bestemme den gennemsnitlige kontraktionsamplitude i denne periode. Dette blev gjort for flere tidspunkter i den registrerede datafil. Plotning af disse kontraktionsværdier over tid gav en nyttig graf til at sammenligne kontraktionsudvikling i en kontrol- og eksperimentel indstilling. For at få en mere avanceret indsigt i ydeevnen af de genererede skiver blev stimuleringsprotokoller kørt. Under disse protokoller, som tager ca. 45 minutter, blev stimuleringsparametrene ændret for at vurdere parametre for sammentrækningskobling.
Den nuværende stimuleringsprotokol bestod af fire forskellige sektioner: post-pause-potensering, stimuleringstærskel, kraftfrekvensrelation og ildfast periode (figur 4, tabel 4). Under post-pause-potenseringen genoptages stimuleringen efter et kort stop på enten 3, 12, 50 eller 120 s. For at bestemme stimuleringstærsklen øges stimuleringsstrømmen i trin på 3 mA hver 10 s, startende ved 8 mA og stigende til 90 mA. Med denne test kan den minimale stimuleringsstrøm bestemmes for hver skive. Dette ændrer ikke de generelle stimuleringsindstillinger uden for stimuleringsprotokollen. Kraftfrekvensforholdet vurderes ved en trinvis forøgelse af stimuleringsfrekvensen (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 og 240 BPM), mens den respektive varighed af hvert trin forkortes parallelt. Bortset fra de to første frekvensindstillinger giver dette regime mellem 20-40 sammentrækninger under hvert trin. Den ildfaste periode for hver skive vurderes ved at sende en for tidlig stimulus (S2) efter en normal stimulus (S1; 30 BPM). S1-S2-intervallet forkortes hver 10 s.
For at demonstrere potentialet i det præsenterede dyrkningssystem som et værktøj til test af farmakologiske interventioner blev ex vivo humane LV-vævsskiver fremstillet fra den samme patient og underkastet farmakologiske midler, der påvirker de intracellulære calciumionniveauer (Ca2+) (n = 1) efter 2 ugers dyrkning. L-type Ca2+-kanal antagonist nifedipin hæmmer Ca2+ tilstrømningen til myokardiecellerne og sænker derfor den intracellulære tilgængelighed af Ca2+ og reducerer kontraktiliteten17. På grund af dets vasodilatorvirkning anvendes nifedipin som et antihypertensivt lægemiddel. For at demonstrere farmakologiske forskelle mellem Ca2+-kanalantagonister blev calciseptin undersøgt til sammenligning. Calciseptin er også en L-type Ca2+-kanal antagonist, ekstraheret fra Dendroaspis p. polylepis gift18. Derfor deler den den negative inotropiske virkning af nifedipin. Calciseptin har imidlertid forskellige bindingsegenskaber og er mere potent sammenlignet med nifedipin19. For at studere de positive og negative modulationer af Ca2+ tilgængelighed testede vi også calciumkanalagonisten Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-[trifluormethyl]phenyl)pyridin-3-carboxylsyremethylester)20.
Tre skiver blev behandlet med henholdsvis nifedipin (125 nM), calciseptin (70,8 nM) og Bay-K8644 (417 nM), mens den fjerde skive ikke modtog noget lægemiddel (kontrol). Sammentrækningskræfterne under generelle stimuleringsparametre (50 mA strøm, bifasiske impulser 3 ms varighed, 1 ms interval og 30 BPM pacing rate) blev sammenlignet før og efter behandlingen. Desuden blev der før behandlingen kørt en stimuleringsprotokol for at vurdere baselineværdierne for post-pause-potensering, stimuleringstærskel, kraftfrekvensrelation og ildfast periode. Efter 30 minutters behandling blev en anden stimuleringsprotokol kørt. For at eliminere interindividuelle forskelle blev kontraktionsamplitude for hver skive normaliseret til dets baseline-niveau før behandling. Baseline (dvs. 100%) blev bestemt ved at analysere de sidste fem sammentrækningscyklusser før starten af stimuleringsprotokollen før behandlingen.
Ved analyse af sammentrækningen af skiverne ved generel stimulering blev det observeret, at sammentrækningskraften af skiverne behandlet med Ca2+ antagonister (nifedipin og calciseptin) faldt inden for 10 minutters efterbehandling (figur 5), og effekten var til stede op til 20 minutter efter behandlingen. I modsætning hertil øgede den spændingsstyrede Ca2+ kanalagonist Bay-K8644 sammentrækningskraften af den behandlede skive. Kontrolskiven viste ikke en bemærkelsesværdig ændring. De sammentrækningsdata, der blev genereret under stimuleringsprotokollerne, blev analyseret på en lignende måde. Her blev de data, der genereres af stimuleringsprotokollen udført før behandlingen (forbehandling), sammenlignet med postbehandlingsdata for den samme stimuleringsprotokol.
Som diskuteret før startede stimuleringsprotokollen med vurderingen af post-pause-potenseringen. Under pausen optages yderligere Ca2+ af det sarkoplasmatiske retikulum (SR), som frigives ved første stimulering efter pausen. Derfor afspejler post-pause-potensering intracellulær Ca2+ frigivelse fra SR. Som sådan kan denne parameter bruges til at vurdere det relative bidrag fra Ca2+ frigivet fra SR af ryanodinreceptoren. For at vurdere potenseringen af skiverne efter en stimuleringspause blev styrken af den første sammentrækning efter pausen divideret med den gennemsnitlige sammentrækning før den respektive pause. Kontrolskiven viste ingen nævneværdig ændring (figur 6A). Det blev observeret, at inhiberingen af L-type Ca2+ kanalerne førte til potensering af den første sammentrækning efter en pause på mindst 50 s (figur 6B,D), hvilket afspejler et højere relativt bidrag af intracellulær Ca2+ frigivelse til total kontraktilitet. Den modsatte effekt blev set i skiven behandlet med Bay-K8644, som stimulerer indgangen af ekstracellulær Ca2+ via L-type Ca2+ kanaler (figur 6C).
Kraftfrekvensrelationen blev vurderet ved successivt at øge tempohastigheden op til 180 BPM. For bedre visualisering blev sammentrækningskraften ved forskellige stimuleringsfrekvenser normaliseret til baselinekontraktionen ved 30 BPM inden for samme protokol (= 100%). Dataanalyse viste, at behandlingen med calciseptin ikke ændrede skivens evne til at følge stimuli ved stigning i stimuleringsfrekvensen ved sammenligning af data før og efter behandling (figur 7B). Der blev ikke observeret nogen ændring i kontrolskiven (figur 7A). I modsætning til calciseptin forhindrede nifedipin en stigning i kontraktiliteten ved højere tempohastigheder og reducerede den maksimale indfangningshastighed til 80 BPM (figur 7D). Skiven behandlet med Ca2+ kanalagonisten Bay-K8644 viste en øget sammentrækningskraft ved meget lave stimuleringsfrekvenser (figur 7C). Ved frekvenser højere end 50 BPM syntes sammentrækningskraften imidlertid at være lavere end under forbehandlingstilstanden. Stimuleringstærsklen og den ildfaste periode blev også bestemt før og efter behandling. Der blev dog ikke observeret forskelle, og dataene vises derfor ikke.
Figur 1: Oversigt over de krævede materialer og dyrkningssystemet. (A) Et tomt dyrkningskammer forbundet til et grønt printkort. Printkortet (1) måler sammentrækningen med en sensor og overfører dataene til controlleren. (B) Otte fyldte kamre placeret på den vippende hovedplade. Petriskål låg (35 mm) bruges til at dække kamrene. (C) De (kirurgiske) værktøjer, der er nødvendige for at trimme den transmurale myokardieprøve. Afbildet er forskellige pincetter, de knive, der er nødvendige for vibratomet, og en gummiplaster til at hjælpe med trimning. (D) Fire 0,9 mm x 70 mm 20 G nåle, der er fastgjort i kvadratisk position (0,9 cm x 0,9 cm) af en solid plastblok. Brug af denne konstruktion forhindrer beskadigelse og bevægelse af prøven ved trimning og giver en vævsblok med de krævede dimensioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Behandling af to LV-prøver. (A) To myokardievævsblokke (ca. 1 cm x 1 cm x 1 cm) indlejret i størknet lavsmeltet agarose i en 35 mm petriskål. Til demonstrationsformål blev svine LV-væv anvendt. (B) Agaroseblokken med de indlejrede prøver blev fjernet fra petriskålen, trimmet og limet på vibratomens skæreplatform. Her blev svinevæv brugt til demonstrationsformål. Bemærk den ensartede vævsfarve og fraværet af hvidt fibrotisk væv, angivet med den røde pil. (C) Efter udskæring fjernes agarosen omhyggeligt, og plasttrekanter (1) er forbundet vinkelret på myokardiefibrenes retning. De røde linjer angiver retningen af myokardiefibrene. (D) Humant LV-væv blev fremstillet, som viste hvidt fibrotisk væv i skiverne. Dette sænker ikke nødvendigvis succesraten for dyrkning; det anbefales dog at bruge skiver, der ikke viser fibrose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dyrkningssoftwaren. Afhængigt af antallet af anvendte kanaler (maks. Otte) visualiseres sammentrækningsregistreringen i op til tre udpegede vinduer (to synlige i figuren). Hvert dyrkningskammer vises som en kontraktionsgraf. I indstillingsvinduet kan stimuleringsparametre ændres og skræddersys til den ønskede eksperimentelle situation. Dette vindue giver også mulighed for at starte eller stoppe den stimuleringsprotokol / tidsplan, der er valgt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Aflæsning af sammentrækningen af fem myokardieskiver under en typisk stimuleringsprotokol. I alle paneler vises hver enkelt skive i samme farve. (A) Post-pause-potensering vurderer den første sammentrækning efter en kort stimuleringspause på henholdsvis 3, 12, 50 og 120 sekunder. (B) Bestemmelse af stimuleringstærsklen ved at øge stimuleringsstrømmen i trin på 3 mA hver 10 s fra 8 mA til 80 mA. (C) Kraftfrekvensforholdet for hver skive vurderes ved trinvise stigninger i stimuleringsfrekvensen fra 12 BPM til 240 BPM. Varigheden af stimuleringsperioder bliver kortere ved højere frekvenser for at holde antallet af slag konstant ved hver frekvens. (D) For at vurdere den ildfaste periode udsættes skiverne for for tidlige stimuleringer (S2) med faldende intervaller til den foregående stimulus (S1). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Analyse af sammentrækningskraft før og efter behandling med L-type Ca2+ kanalpåvirkende midler. Alle data (n = 1) blev normaliseret til baselinekontraktiliteten (gennemsnit af fem separate slag før behandling (0)). L-type Ca2+ kanalantagonister nifedipin (125 nM), calciseptin (70,8 nM) og L-type Ca2+ kanalagonist Bay-K8644 (417 nM) blev tilsat til kontraherende humane LV myokardieskiver. Kontrolskiven modtog ingen behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Potensering efter pause af de behandlede skiver og kontrolskiver. Forskelle i post-pause-potensering blev observeret (baseline vs efterbehandling; n = 1). Her blev amplituden af den første sammentrækning efter en pause normaliseret til den gennemsnitlige sammentrækningsamplitude før den respektive pause. Baseline blev indstillet til 100% og ligner den gennemsnitlige sammentrækningsstyrke i de sidste fem cyklusser, før den første pause begynder. Y-aksen viser den normaliserede første sammentrækning efter en pause af forskellig varighed. X-aksen viser grundlinje- og pauselængderne. (A) Kontrolskive uden behandling. (B) Calciseptinbehandling. (C) Bay-K8644 behandling. (D) Behandling af nifedipin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Analyse af kraftfrekvensrelationen. Kontraktionsdata (n = 1) blev normaliseret til sammentrækningskraften ved 30 BPM inden for den respektive protokol (= 100%). (A) kontrolskiven blev ikke behandlet med noget stof; alle andre aspekter af dyrkningen var imidlertid de samme som for de behandlede skiver. (B) Calciseptinbehandling af en LV myokardieskive. (C) Bay-K8644 behandling. (D) Behandling af nifedipin. Data om sammentrækningskraften af denne skive under stimuleringsfrekvenser over 80 BPM blev udeladt, da sammentrækningen ikke fulgte stimuleringsfrekvensen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætningen af den udskæringsbuffer, der anvendes til transport og under udskæringsproceduren. Til fremstilling af agarose udelades glucose. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Sammensætning af 4% agarosegel. Denne glukosefri lavsmeltende agarosegel bruges til indlejring af vævsprøverne. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Forberedelse af mediet til dyrkning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Detaljer om stimuleringsprotokollen. Stimuleringsprotokollen består af fire dele, som alle kan ændres, så de passer til projektets behov. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere har kardiovaskulær forskning gjort store fremskridt inden for dyrkning af kardiomyocytter. Imidlertid er 3D-dyrkning af kardiomyocytter med intakt geometri endnu ikke veletableret. Sammenlignet med tidligere protokoller, der blev anvendt til ex vivo-dyrkning af myokardievæv, ligner den protokol, som vi beskrev her, vævets in vivo-miljø nærmere. Desuden giver anvendelsen af for- og efterbelastning mulighed for et mere biomimetisk miljø. Vi er i stand til fuldt ud at analysere og forstå den kontinuerlige registrering af vævets sammentrækningsdata og sammentrækningsparametre.
Antallet af ex vivo kardiovaskulære vævsdyrkningsteknikker, der anvender lignende opsætninger, er begrænset 11,21,22. En lignende teknik til myokardieskivedyrkning, der er offentliggjort, bruger en 6-brøndplade til dyrkning af myokardieskiver10. En vigtig begrænsning ved netop denne opsætning er imidlertid, at skiverne ikke udsættes for for- og efterbelastning, og det er heller ikke i stand til at give et detaljeret overblik over sammentrækningen over tid uden behov for håndtering af vævet. Metoden, vi beskrev her, reducerer risikoen for vævsskade eller infektion. Desuden giver den et samlet overblik over de mulige ændringer i kontraktil kraft, når et stof af interesse tilføjes til dyrkningen. Ud over analysen af den normale sammentrækningskraft for hver skive giver den nuværende opsætning mulighed for regelmæssigt at køre foruddefinerede protokoller. Dette muliggør dataindsamling af forskellige relevante parametre for det dyrkede væv.
Kritiske trin i protokollen
Vævsskader skal undgås, og dette kan allerede forekomme under den eksplorative operation. Hvis vævet ikke straks overføres til køleopbevaringsopløsningen efter udskæring, kan dette resultere i beskadigede vævsprøver. Den beskrevne protokol indeholder flere trin, der er kritiske for at opnå pålidelige og reproducerbare resultater. Agarosevævsindlejringsforbindelsen skal fremstilles ved hjælp af udskæringsbufferen uden glucose for at forhindre mulig karamellisering af glucosen under smelteprocessen inden protokollens start. Det er vigtigt at undgå skader på grund af hypertermi forårsaget af anvendelse af agarose direkte fra 80 °C vandbadet i stedet for at inkubere agarosen i en sprøjte ved 37 °C. Temperaturen bør være 4 °C under opbevaring og skæring for at reducere stofskiftet og minimere iskæmi. Væv skal også håndteres med forsigtighed ved at gribe agarosen i stedet for selve vævet, når det flyttes mellem skærebakken og petriskålen for at fastgøre plasttrekanterne. Det er yderst vigtigt, at disse trekanter er knyttet i den rigtige retning med hensyn til myokardiefibrenes retning. Forkert justering af trekanterne vil resultere i vævsskade.
Generelt er stimuleringstærsklen for nyskårne skiver mellem 10-20 mA, og strømmen skal øges omhyggeligt. Overstimulering af vævet med en strøm, der er for høj, kan også føre til irreversibel prøveskade. Når stimuleringen er startet, er vævsryitation ved at rokke dyrkningskamrene nødvendig og bør aldrig standses i mere end 5 minutter for at sikre tilstrækkelig tilgængelighed af ilt og næringsstoffer til vævet.
Fejlfinding og ændringer
Hyper kontraktur
Hyperkontraktur af myokardievævsprøven er et af de vigtigste udelukkelseskriterier for den diskuterede protokol. Dette kan forekomme før og efter forberedelsen af myokardieskiverne. I tilfælde, hvor vævet før præparatet føltes stift ved palpation, blev der observeret hyperkontraktion i mindst 70% af præparaterne. Hyperkontraktur af vævsprøven kan også forekomme ved indsættelse på vipperen, hvilket sandsynligvis afhænger af vævets kvalitet eller patientens sygdomstilstand. Hyperkontraktur kan ses som en stigning i diastolisk tone under stimulering af vævet, svarende til den toniske forkortelse af beskadigede kardiomyocytter i hjerteiskæmi. Hyperkontraktur under stimulering kan være progressiv, hvorved sammentrækningen overstiger detektionsgrænsen på 12 mN. Hyperkontrakturen kan dog også vende spontant inden for 30-60 minutter, hvilket tyder på, at vævet kan komme sig. For at forbedre genopretningen af vævet skal forudindlæsningsindstillingerne justeres (dvs. gentag trin 8.3) efter 1 times inkubation samt på dag 2, 4 og 6 efter tilberedning. Hyperkontraktur kan være til stede både med og uden den stimulerede sammentrækning af prøverne. Men hvis der ikke observeres nogen sammentrækning inden for 1 time, bør prøven ikke anvendes. I dette tilfælde har vævet hyperkontrakt i en grad, hvorfra det ikke kan komme sig eller er blevet beskadiget på anden måde. Generelt har dyrkning af humane myokardieskiver i henhold til den præsenterede protokol vist sig at have en succesrate på 90%.
Forventede ændringer i kontraktionskraften
Afhængigt af en lang række faktorer (f.eks. Patient, forberedelse, vævsskade) er det muligt, at myoslices, der oprindeligt viste acceptabel sammentrækning, vil gennemgå et progressivt fald i kontraktile amplituder i løbet af de første 24 timer. Faktisk kan denne adfærd endda betragtes som normal for skiver opnået fra menneskelige slutstadie svigtende hjerter. Justering af forspændingen af skiverne hver dag i de følgende 3 dage har vist sig at lindre dette problem og forbedre sammentrækningen. Efter 24 til 48 timer skal kontraktiliteten dog begynde at stige igen. Bemærk, at sammentrækningen ikke vender tilbage til sit oprindeligt observerede niveau inden for de første dage efter dyrkning.
Kort efter medium udveksling, når prøverne returneres til inkubatoren, viser sammentrækningen typisk markant øgede amplituder. Åbning og lukning af inkubatoren bidrager til denne stigning, da det får CO2 -niveauet til at falde. Dette øger pH inde i det bicarbonatbufferede dyrkningsmedium, hvilket forårsager et positivt inotropisk respons af skiverne. Efter mediumudvekslingen falder skivernes kontraktile kraft ofte i flere timer, indtil den når eller overgår sin oprindelige værdi. For at forhindre, at stimuleringsprotokoller påvirkes af medium udveksling, bør stimuleringsprotokoller ikke udføres før mindst 1 time efter medium udveksling.
Begrænsninger af metoden
En fordel ved den nuværende teknik sammenlignet med tidligere dyrkningsmetoder for humant myokardievæv er muligheden for at anvende (og modulere) præ- og efterbelastning på det kontraherende væv. Det er imidlertid vanskeligt at kvantificere den påførte belastning med hensyn til vægspænding, selvom denne belastning kunne estimeres ud fra fjederkonstanten og skivedimensionerne. Det antages, at der er en positiv sammenhæng mellem myokardievævets levedygtighed og sammentrækningsamplituden af vævsprøven. Alligevel er der i øjeblikket ingen metode, der tillader levedygtighedstest af hver enkelt skive, før den monteres i kamrene. En kolorimetrisk MTT-farvning kan udføres på udskårne skiver, der ikke anvendes til dyrkning, for at bestemme myokardiecellernes levedygtighed. I celler, der er levedygtige, vil NADPH reducere det gule MTT-salt i lilla formazankrystaller. En anden begrænsning er, at næringsstofferne i dyrkningsmediet i øjeblikket er begrænset til basale ingredienser. Derfor er næringsstoffer og cirkulerende faktorer forskellige fra det in vivo-miljø , hvorfra vævet blev opnået. Medium kan dog suppleres eller ændres efter behov.
Potentielle anvendelser af metoden
Der er flere potentielle anvendelser af metoden både med hensyn til kardiotoksicitet og lægemiddeltest samt forståelse af sygdommens patofysiologi. For det første kan det system, der anvendes i den diskuterede protokol, bruges til lægemiddel- og kardiotoksicitetsscreeninger. Ved hjælp af de programmerbare stimuleringsprotokoller kan fysiologiske ændringer analyseres som reaktion på lægemiddeladministration. Med hensyn til fortolkningen af ildfast periode skal det overvejes, at dette er en funktionel parameter, som ikke strengt afspejler virkningen af lægemidler på handlingspotentialets varighed. For det andet kan dyrkningskamrene bruges til forskellige samdyrkningsforsøg med myokardium i kombination med immunceller. Ved at anvende denne samdyrkning kan de direkte virkninger af immuncelleudskilte faktorer på myokardiekontraktionen vurderes. Endelig kan ikke-transplanterede kardiomyopatiprøver også dyrkes, selvom disse ikke-transplanterede vævsprøver generelt er mindre og derfor vanskeligere at behandle. Ikke desto mindre kan dette åbne muligheder for identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af målrettede lægemidler. Det er også tænkeligt at bruge teknikken til patientspecifik vævskarakterisering, hvilket bringer os et skridt tættere på personlig medicin. Desuden kan den præsenterede metode anvendes til ikke-humant myokardievæv, hvoraf eksempler er svin og kanin. Det skal tages i betragtning, at den høje fysiologiske puls hos små pattedyr (mus/rotte) ikke kan opnås, fordi det efterfølgende højereO2-krav ikke kan opfyldes under betingelserne for myokardiedyrkning ved hjælp af den diskuterede opsætning. Derved er et næsten fysiologisk miljø svært at efterligne i disse tilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JH, PS, DM og KL har intet at oplyse. AD og TS er aktionærer i InVitroSys GmbH, som leverer Myodish dyrkningssystemet.
Acknowledgments
Forskning blev finansieret af DZHK-tilskud 81Z0600207 (JH, PS og DM) og 81X2600253 (AD og TS).
Forfatterne vil gerne takke Claudia Fahney, Mei-Ping Wu og Matthias Semisch for deres støtte til forberedelsen af opsætningerne samt til regelmæssig vedligeholdelse af vævsdyrkningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
