Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute, Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

Abstract

אחד האתגרים בחקר הרשתית הוא חקר ההצלבה בין תאי רשתית שונים כגון תאי עצב ברשתית, תאי גליה ותאי כלי דם. לבידוד, התרבות ושמירה על תאי עצב ברשתית במבחנה יש מגבלות טכניות וביולוגיות. גידולי רשתית עשויים להתגבר על מגבלות אלה ולהציע מודל ex vivo ייחודי לחקר השיחות הצולבות בין תאי רשתית שונים עם פרמטרים ביוכימיים מבוקרים היטב ובלתי תלויים במערכת כלי הדם. יתר על כן, צמחי רשתית הם כלי סינון יעיל לחקר התערבויות פרמקולוגיות חדשניות במחלות שונות של כלי דם ברשתית ומחלות נוירודגנרטיביות כגון רטינופתיה סוכרתית. במאמר זה נתאר פרוטוקול מפורט לבידוד ותרבית רשתית לתקופה ממושכת. כתב היד מציג גם כמה מהבעיות הטכניות במהלך הליך זה שעשויות להשפיע על התוצאות הרצויות ועל יכולת השחזור של תרבית יציאת הרשתית. החיסון של כלי הרשתית, תאי הגליה והנוירונים הדגים נימי רשתית ותאי נוירוגליה שלמים לאחר שבועיים מתחילת תרבית הרשתית. זה מבסס את התפשטות הרשתית ככלי אמין לחקר שינויים בכלי הדם של הרשתית ובתאי הנוירוגליה בתנאים המחקים מחלות רשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

Introduction

מודלים שונים הוצגו כדי לחקור מחלות רשתית, כולל מודלים in vivo ו- in vitro. השימוש בבעלי חיים במחקר הוא עדיין עניין של ויכוח אתי ותרגומי מתמשך1. מודלים של בעלי חיים הכוללים מכרסמים כגון עכברים או חולדות משמשים בדרך כלל במחקר רשתית 2,3,4. עם זאת, חששות קליניים התעוררו בגלל הפונקציות הפיזיולוגיות השונות של הרשתית במכרסמים בהשוואה לבני אדם, כגון היעדר המקולה או הבדלים בראיית צבעים5. לשימוש בעיניים אנושיות לאחר המוות לצורך מחקר ברשתית יש גם בעיות רבות, כולל אך לא רק הבדלים ברקע הגנטי של הדגימות המקוריות, בהיסטוריה הרפואית של התורמים ובסביבות הקודמות או באורח החיים של התורמים6. יתר על כן, לשימוש במודלים חוץ-גופיים בחקר הרשתית יש גם כמה חסרונות. מודלים של תרביות תאים המשמשים לחקר מחלות רשתית כוללים שימוש בקווי תאים ממקור אנושי, תאים ראשוניים או תאי גזע7. מודלים של תרביות תאים שבהם נעשה שימוש הוכחו כבעלי בעיות במונחים של זיהום 8,9,10,11. לאחרונה, טכנולוגיית האורגנואיד של הרשתית הראתה התקדמות משמעותית. עם זאת, לבניית רשתיות מורכבות ביותר במבחנה יש מספר מגבלות. לדוגמה, לאורגנואידים ברשתית אין את אותם מאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים כמו לרשתיות in vivo בוגרות. כדי להתגבר על מגבלה זו, טכנולוגיית האורגנואיד של הרשתית חייבת לשלב תכונות ביולוגיות ותאיות יותר, כולל תאי שריר חלק, כלי דם ותאי חיסון כמו מיקרוגליה12,13,14,15.

צמחי רשתית אורגנוטיפיים התגלו ככלי אמין לחקר מחלות רשתית כגון רטינופתיה סוכרתית ומחלות רשתית ניווניות16,17,18,19. בהשוואה לטכניקות קיימות אחרות, השימוש בצמחי רשתית תומך הן בתרביות תאי רשתית במבחנה והן במודלים עדכניים של חיות in vivo על ידי הוספת תכונה ייחודית לחקר השיחות הצולבות בין תאי רשתית שונים תחת אותם פרמטרים ביוכימיים ובלתי תלויים במשתנים מערכתיים. תרביות הרשתית מאפשרות לתאי רשתית שונים להישמר יחד באותה סביבה, ומאפשרות שימור של אינטראקציות בין-תאיות ברשתית20,21,22. יתר על כן, מחקר קודם הראה כי explants הרשתית היו מסוגלים לשמר את המבנה המורפולוגי ואת הפונקציונליות של תאי הרשתית בתרבית23. לפיכך, צמחי רשתית יכולים לספק פלטפורמה הגונה לחקר מטרות טיפוליות אפשריות למגוון רחב של מחלות רשתית24,25,26. תרביות צמח הרשתית מספקות טכניקה ניתנת לשליטה והן מהוות תחליף גמיש מאוד לעשבים קיימים המאפשרים מניפולציות פרמקולוגיות רבות ויכולים לחשוף מספר מנגנונים מולקולריים27.

המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג את טכניקת התפשטות הרשתית כמערכת מודל ביניים סבירה בין תרביות תאים במבחנה לבין מודלים של בעלי חיים in vivo . טכניקה זו יכולה לחקות תפקודי רשתית בצורה טובה יותר מאשר תאים מנותקים. מכיוון ששכבות רשתית שונות נשארות שלמות, ניתן להעריך את האינטראקציות הבין-תאיות של הרשתית במעבדה בתנאים ביוכימיים מבוקרים היטב וללא תלות בתפקוד מערכת כלי הדם28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת אוקלנד, רוצ'סטר, מישיגן, ארה"ב ופעלו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי האגודה למחקר בראייה ורפואת עיניים (ARVO) הצהרה לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וראייה.

1. הכנת בעלי חיים

  1. שמור את בעלי החיים שוכנים בטמפרטורה קבועה בסביבה מבוקרת אור. הגדרות הטמפרטורה של חדר המגורים לבעלי חיים צריכות לפעול בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי "המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה". טווח הטמפרטורות לעכברים הוא בין 18 °C (66 °F) ל 26 °C (76 °F). שמרו על רמות לחות מבוקרות וקבועות על כ-42%.
  2. לניסוי זה, השתמשו בעכברי C57BL/6J זכרים (בדקו את טבלת החומרים לקבלת פרטים) שגילם עולה על 12 שבועות (בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכבר בוגר).
    הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בזן מסוג בר לצורך ההדגמה, מכיוון שלא היו לו מומים גנטיים המשפיעים על הרשתית. עם זאת, ניתן להשתמש בזנים אחרים, כולל זנים שעברו מניפולציה גנטית, עבור תרבית השתלה ברשתית.
  3. ספק מחזורי אור/חושך של 12 שעות באמצעות בקרת תאורה בחדרי מגורי בעלי החיים.
  4. בדקו את בריאותו של כל בעל חיים ואת צריכת המזון והמים המספקת פעמיים ביום במהלך השבוע ופעם ביום בסופי השבוע. הקפידו לספק להם מזון טרי ומים נקיים.
  5. אם מפלס המזון והמים נמוך במהלך השבוע, שטפו את בקבוק המים ומלאו אותו מחדש. הוסיפו מזון טרי בכל עת. החליפו כלובים מלוכלכים מדי יום או לפי הצורך לבריאות בעלי החיים.
    הערה: כדי לחקור את הפוטורצפטורים והשינויים הנגרמים על ידי אור ברשתית, התאימו את העכברים למשך הלילה בקופסה חשוכה מיוחדת הממוקמת בחדר חשוך במתקן לבעלי החיים.
  6. הרדמת בעלי החיים בכלוב הביתי שלהם על ידי מנת יתר של שאיפת CO 2 באמצעות גז CO 2 דחוס בצילינדרים המחוברים לתא CO2. ביצוע אישור מוות באמצעות שיטה משנית של המתת חסד כגון נקע צוואר הרחם.
  7. לאחר השלמת ההליך, אשר את מות החיה בשיטה מתאימה, כגון אישור דום לב ונשימה או התבוננות בתלמידים קבועים ומורחבים של החיה.

2. הכנת רקמות

  1. ברגע שהחיה מורדמת, נקו את האזור עם 70% אתנול. לאחר מכן, פתחו את העפעפיים ביד אחת כך שהעין נראית לעין. הפעל לחץ על החלקים העליונים והנחותים של המסלול ביד הנגדית באמצעות מלקחיים מעוקלים עד שכדור הארץ בולט.
  2. כדי לעטוף את העין, סגרו בעדינות את המלקחיים בחלק האחורי של העין, והתרוממו בתנועה מתמשכת. באמצעות מלקחיים, החזיקו את גלגל העין מעצב הראייה. הקפד להשתמש בכלי דיסקציה מעוקרים לכל השלבים ולעבוד בתנאים אספטיים מלאים.
  3. יש לטבול כל גלגל עיניים בצינורית של 1.5 מ"ל המכילה 1 מ"ל של HBSS קר כקרח עם פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL). שטפו את גלגל העין ב-HBSS פעמיים למשך 5 דקות כל אחת.
  4. מעבירים את גלגל העין לצינור של 1.5-2 מ"ל המכיל מדיה מלאה (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין).

3. דיסקציה של רקמות

  1. נתחו את הרשתית בזהירות תחת מיקרוסקופ הפעלה, כפי שמודגם ברצף באיור 1.
    1. בצע חתך היקפי סביב הלימבוס כדי לפתוח את גלגל העין. הסר את הקרנית על ידי חיתוך מעגלי לאורך גבול הקרנית והחתך (הלימבלי), ולאחר מכן הסרת המקטע הקדמי, העדשה וגוף הזגוגית, תוך השארת עין ריקה.
    2. על ידי החזקת האזור של ראש עצב הראייה עם מלקחיים עדינים, לקלף את הפרווה החיצונית של העין בעדינות. הקדישו תשומת לב רבה במהלך הסרת הפרווה החיצונית על מנת לא לפגוע ברשתית העצבית ולהבטיח שהרשתית תישאר שלמה לחלוטין.
      הערה: יש לקלף בזהירות את הרשתית מאפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), ויש לבצע חתך בודד בראש עצב הראייה כדי לנתק את הרשתית מעצב הראייה. ודא זאת באופן חזותי על ידי זיהוי החור שהותיר עצב הראייה (ראש עצב הראייה).
    3. נתחו את הרשתית באופן רדיאלי לארבעה חלקים שווים בגודלם.
  2. בצע את השלבים הבאים לטיפול בחלקים הקטנים של הרשתית כדי להבטיח כיוון נכון של תרבות הרשתית.
    1. באמצעות להב מספריים מנתח, יש לפתוח ממש מתחת לפיסת הרשתית (Table of Materials).
    2. הרימו באיטיות את חתיכת הרשתית עם קצה של להב מספריים פתוח, והעבירו אותה בעדינות לצלחת התרבית.
  3. מעבירים את הצמחים שמקורם ברשתית המבודדת בנפרד לתוספות תרבית תאים בצלחת של 12 בארות, שכל אחת מהן מכילה 300 μL של מדיית התפשטות הרשתית, כאשר צד תא הגנגליון של הרשתית (נוירורטינה) פונה כלפי מעלה.
    הערה: ודא שהמדיה היא מדיית DMEM עם תוספי N2 ו- B27. הוסיפו פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) גם למדיה (טבלת חומרים). הרשתית נוצרת משכבות מרובות של תאים עצביים המחוברים זה לזה באמצעות סינפסות ונתמכים מבחוץ על ידי השכבה הפיגמנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית, שהיא השכבה השחורה שהוסרה במהלך הנתיחה.
  4. הסר כל שרידים של אפיתל פיגמנטי; עם זאת, שרידים אלה יכולים לסייע בזיהוי הכיוון הנכון של המוצל. ודאו שהחלק הפיגמנטי פונה כלפי מטה ושהחלק שאינו פיגמנטי פונה כלפי מעלה.
  5. דגירה של תרבית צמח הרשתית באינקובטורים לחים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  6. יש לוודא שמשטח הרשתית פונה כלפי מעלה. אם פיסת הרשתית הפוכה או מקופלת, נסו להתאים אותה בעדינות לכיוון הנכון.
    הערה: הקדישו תשומת לב רבה לכיוון הנכון של יציאת הרשתית בצלחת התרבית. יש להימנע מכל היפוך או קיפול של הצמח בצלחת התרבית, שכן הדבר יגרום לכשל בצמיחה תקינה של תאי הרשתית בתרבית.

4. תרבית השתלת רשתית

  1. שמור על תרביות יציאת הרשתית (מוכנות בשלבים 3.2-3.3) באינקובטורים לחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  2. החליפו מחצית מהמדיה מכל באר כל יומיים למשך שבועיים. עשה זאת על ידי צינורית 150 μL מהבאר בזהירות. לאחר מכן, הוסיפו 150 μL של מדיה טרייה בחזרה לבאר. הימנע מלהעיף את ההדגשה בעת החלפת המדיה.
  3. בדקו היטב את השתל מתחת למיקרוסקופ לפני שאתם מחזירים את צלחת התרבית לאינקובטור. לבחון את שלמות התאים ואת ארכיטקטורת הרשתית תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. וודאו שהאקסצ'יל עדיין מכוון נכון. השתמש הן בעדשות המטרה 4x והן בעדשות המטרה 20x כדי לבחון את ההדגשה.
    הערה: הימנעו מטבילה מלאה של השתל במדיה.

5. אימונוהיסטוכימיה

  1. לאחר שבועיים, לתקן את explant הרשתית על ידי הסרת התקשורת. עשו זאת על ידי שטיפה פעם אחת עם 200 μL של 1x PBS ולאחר מכן הוספת 300 μL של 4% paraformaldehyde ב 0.1 M PBS, pH 7.4, לבאר המכילה את explant ולהשאיר אותו לילה.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה מבלי להסיר את תוספות התרבית מהצלחת. ניתן גם להעביר את הצמחים לצינור חרוטי של 500 μL, ואת הכביסה והקיבוע ניתן לבצע בתוך הצינור.
  2. מעבירים את האקסצ'ר לצינור חרוטי 500 μL המכיל 300 μL של 1x PBS-2.5% Triton X לשטיפה.
  3. שטפו את השקעים הקבועים בצינור שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד באמצעות מהירות בינונית על שייקר (25 סל"ד).
  4. חסום את התגובות הלא ספציפיות הצפויות על ידי דגירה של הצמח עם 300 μL של מאגר חוסם 1x המכיל 0.02% תימרוסל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני הדגירה של הנוגדנים.
  5. לדגום את הצמחים הקבועים עם הנוגדנים העיקריים במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות מהירות בינונית על שייקר.
    הערה: זהה את תאי האנדותל ברשתית בפתח הקבוע על ידי צביעה בנוגדן GSL I, BSL I (לקטינים) (7:1,000). זהה את תאי הגליה ברשתית על ידי צביעה בנוגדן חלבון חומצי (GFAP) של גליית ארנב (1:250). זהה את נוירוני הרשתית על ידי צביעת הצמח עם נוגדן NeuN ארנב (1:250)29,30. Incubate s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explants עם הלקטינים, שילוב NeuN, ודגירה של אחרים עם שילוב לקטינים, GFAP.
  6. למחרת, להסיר את הנוגדן העיקרי מן הצינורות על ידי שאיפה עם פיפטה. שטפו את הצמחים עם 1x PBS-2.5% Triton X שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד באמצעות מהירות בינונית על שייקר.
  7. הוסף את הנוגדנים המשניים: עז נגד ארנב IgG (1:500) (משני עבור GFAP ו- NeuN) וטקסס אדום (7:1,000) (עבור לקטינים). דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מהירות בינונית על שייקר.
    הערה: הנוגדנים המשניים רגישים לאור, לכן יש לכסות את הצינור ברדיד אלומיניום.
  8. הסר את הנוגדנים המשניים לפי שאיפה, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS-2.5% Triton X.
  9. העבר את השתל מהצינור למגלשת זכוכית באמצעות פיפטה העברה. הסר את עודפי הנוזלים בשקופית ולאחר מכן הוסף טיפה אחת של מדיית הרכבה עם DAPI לשקופית.
  10. מכסים את הרקמה בכיסוי. אין לאפשר בועות אוויר בין הכיסוי לרקמה.
  11. קח את השקופיות המוכתמות למיקרוסקופ הפלואורסצנטי, והתחל לצלם את התמונות. חשוב לכסות את השקופיות המוכתמות באמצעות תיבת שקופיות מכיוון שהכתמים הפלואורסצנטיים רגישים לאור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הישרדותם של תאי הרשתית העצביים וכלי הדם של הרשתית בתרבית מדיה ex vivo למשך זמן ממושך
על-ידי גידול צמח רשתית תוך שימוש בפרוטוקול שלנו, הצלחנו לשמור על תאי רשתית שונים שהיו ברי קיימא במשך עד שבועיים. כדי לאמת את נוכחותם של תאי רשתית שונים, בוצע צביעה אימונופלואורסצנטית של הרשתית באמצעות סמן תא עצבי (NeuN), סמן תאי גליה (GFAP) וסמן כלי דם (איזולקטין-B4) (איור 2). הכתמים הראו תאי עצב רשתית מפותחים ומאורגנים היטב ותאי גלייה. בנוסף, כלי הדם ברשתית היו שלמים מבחינה מבנית, כפי שצוין על ידי מכתים איזולקטין-B4. השלמות המורפולוגית של צמח הרשתית, כפי שהוכח על ידי החיסון, הצביעה על כך שתרבית הרשתית הצליחה לשמור על תאי רשתית בני קיימא שיכולים לשמש באופן ניסיוני כמודל. ניתן להעריך ולנתח את תנאי הניסוי השונים שיש לחקור באמצעות explant על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה עבור סמנים תאיים מרובים באמצעות תוכנת ImageJ. Immunostaining מאפשר למדוד את רמות הפעילות החיסונית של כל סמן תאי ושל מספר התאים הספציפיים, כגון מספר תאי הגנגליון ברשתית או פוטורצפטורים, בקרב קבוצות ניסוי שונות.

חשיבות ההתמצאות הנכונה של יציאת הרשתית בצלחת התרבית לתוצאות הניסוי
הכיוון הנכון של יציאת הרשתית בצלחת התרבית מושג על ידי דגירה של הנוירו-רטינה הפונה כלפי מעלה. מצד שני, כישלון של יציאת הרשתית עשוי לנבוע מהיפוך או קיפול רקמת הרשתית, מה שגורם לנוירו-רטינה לפנות כלפי מטה. הכתם האימונופלואורסצנטי של צמח הרשתית בתרבית לאחר שבועיים תוך שימוש בסמנים שונים ברשתית, כפי שהניסוי הקודם (NeuN, GFAP ואיזולקטין-B4) הראה כי הכישלון של כיוון תקין של הצמח גורם לכישלון ההתפתחות התקינה של האלמנט הנוירו-וסקולרי (איור 3).

Figure 1
איור 1: שלבים של ניתוח גלגל העין כדי ליצור את יציאת הרשתית . (א) גלגל העין השקוע במדיה מיד לאחר הוצאתו מהחיה. (ב) חתך היקפי נעשה לאורך הלימבוס כדי לפתוח את גלגל העין. (ג) הקרנית מוסרת על ידי ניתוח לאורך החתך הלימבלי. (ד) על ידי החזקת עצב הראייה במלקחיים עדינים, הפרווה החיצונית של העין מתקלפת בעדינות. (ה) העדשה, הזגוגית והגוף הציליארי מוסרים. (F) רק הרשתית העצבית נשארת מאחור. (ז) ארבעה חתכים רדיאליים נעשים ברשתית כדי להקל על חתכתה בשלב הבא. (ח) ניתן לחתוך את הרשתית לשניים או ארבעה חלקים ולאחר מכן להעביר אותה לצלחת תרבית התא המכילה את התוספת ואת המדיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תרבית מוצלחת של התפשטות הרשתית עם מבנה רשתית משומר. הכתמה אימונופלואורסצנטית של צמחי הרשתית שנשארו בתרבית במשך שבועיים. האקסים היו קבועים ומוכתמים ב-(a) NeuN עבור נוירונים ברשתית (ירוק) ואיזולקטין-B4 עבור כלי דם (אדום), ו-(b) GFAP עבור תאי גליה (ירוק) ואיזולקטין-B4 עבור כלי דם (אדום). הכתמים הראו תאי רשתית וכלי רשתית מפותחים היטב. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תרבית השתלת רשתית לא מוצלחת עם תאי רשתית פגומים ולא מפותחים. צביעה אימונופלואורסצנטית של צמחי רשתית שנשארו בתרבית במשך שבועיים. הדגלים היו קבועים ומוכתמים ב-GFAP לתאי גליה (ירוק) ואיזולקטין-B4 לכלי דם (אדום). התמונות מראות כתמים פגומים ותאי רשתית וכלי רשתית לא מפותחים. פתח הרשתית היה מקופל ולא היה מכוון נכון בצלחת התרבית. יש לתת תשומת לב רבה כדי להבטיח את הכיוון הנכון של explant עם הרשתית פונה כלפי מעלה. אי הצבת יציאת הרשתית בכיוון הנכון תגרום לכישלון ההתפתחות התקינה של השתל. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המעבדה שלנו חוקרת את השינויים הפתופיזיולוגיים המקדמים תפקוד לקוי של כלי הדם ברשתית במשך שנים 31,32,33,34,35,36. צמחי רשתית הם אחת הטכניקות שיכולות להיות בעלות ערך רב לשימוש כמודל לחקר מחלות רשתית כגון רטינופתיה סוכרתית או מחלות רשתית ניווניות. קיום קבוצת ביקורת הנגזרת מאותה רשתית בודדת או חיה כמו הקבוצה או הקבוצות שטופלו נותן לטכניקה זו יתרון גדול במונחים של מתן השוואות אמינות יותר של תנאי ניסוי שונים.

אחד האתגרים הגדולים במהלך הכנת יציאת הרשתית הוא קיפול של הצמח או כיוון שגוי בלוח התרבית כאשר משטח הרשתית פונה כלפי מטה. חוקרים אחרים הציעו לצינור את הרשתית למעלה ולמטה בתוך הפיפטה המעבירה כדי שהיא תהיה בכיוון הנכון בצלחת37. עם זאת, בפרוטוקול שלהם, הם השתמשו בכל הרשתית עבור explant אחד, אבל בפרוטוקול זה, רשתית אחת נחתכה לשניים עד ארבעה חלקים, כלומר החלקים קטנים יותר וקשה לעשות את התמרון הזה עבור הכיוון הנכון. חיתוך רשתית אחת לשניים עד ארבעה חלקים מאפשר לקבל ארבעה עד שמונה חלקי רשתית מאותה חיה שיכולה לשמש לניסוי. זה מאפשר ניסויים שבהם קבוצת הביקורת וקבוצות הניסוי נגזרות מאותה חיה.

עם זאת, חיתוך הרשתית לחתיכות קטנות הופך את הטיפול בה למאתגר יותר. לכן, פיתחנו טכניקה לטיפול בחלקי הרשתית הקטנים האלה כדי להבטיח אוריינטציה נכונה של תרבות הרשתית. כדי לעשות זאת, להב המספריים החותך הפתוח ממוקם ממש מתחת לחתיכת הרשתית, כאשר משטח הרשתית פונה כלפי מעלה. אם חתיכת הרשתית הפוכה או מקופלת, היא מותאמת בעדינות לכיוון הנכון. לאט לאט, חתיכת הרשתית מוגבהת עם קצה של להב מספריים פתוח ומכניסים בעדינות לצלחת התרבית. הטכניקה הפשוטה הזו מבטיחה שכל פיסת רשתית תהיה בכיוון הנכון כשהרשתית פונה כלפי מעלה ומקדמת תוצאות טובות יותר לחקר כלי הרשתית ותאי נוירוגליה (איור 2). אי מיקום יציאת הרשתית בכיוון הנכון כאשר הנוירו-רטינה פונה כלפי מעלה תגרום לכישלון בצמיחה התקינה של תאי הרשתית בתרבית, כפי שניתן לראות באיור 3. מומלץ מאוד להתאמן נכון כדי למנוע טעות טכנית זו.

פרוטוקול זה מתאר השתלת רשתית אורגנוטיפית של רשתית עכבר בוגרת; עם זאת, הטכניקה תוארה בעבר גם עבור רשתיות עכבר לא בשלות37 וגם עבור רשתיות אנושיות38. במחקר קודם תוארו תרביות של התפשטות הרשתית לחקר התפתחות כלי הדם, שבהן מניפולציה של תפקוד האנדותל נעשתה אפשרית ex vivo27. כדוגמה להערכה מורפולוגית של צמח רשתית, צמח הרשתית הושאר בתרבית למשך שבועיים, ולאחר מכן בוצע אימונוסטינינג באמצעות NeuN (סמן תא עצבי), GFAP (סמן תאי גליה) ואיזולקטין-B4 (סמן כלי דם). הכתמים הראו שתאי הרשתית וכלי הדם היו מפותחים היטב והשתמרו היטב בצמח (איור 2). עם זאת, ניתן לקבל יותר נתונים על צביעת אימונוהיסטוכימיה כדי לבדוק את הכדאיות והפונקציונליות של תאי רשתית אחרים גם באקספלנטה.

תרבית הצמחים עצמה עלולה להלחיץ את תאי הרשתית. עם זאת, התאים יכולים להיות מודגרים בתנאים נורמליים יחסית, כך שניתן להשוות את השינויים המורפולוגיים המתרחשים בתנאי ניסוי שונים, כגון היפרגליקמיה או היפוקסיה, למצב הבסיס. ההדגשה, אם כן, מהווה כלי טוב להערכת תאי רשתית שונים ולבדיקת תגובותיהם לסוכנים פרמקולוגיים שונים או למטרות טיפוליות בו זמנית במגוון רחב של מחלות רשתית.

ניאו-וסקולריזציה של הרשתית היא סימן קרדינלי לרטינופתיה איסכמית, כגון ברטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית. אנחנו (איור 2) ואחרים 27,39,40,41,42 יכולנו לצפות בכלי דם שלמים ברשתית בצמחים מתורבתים במשך עד שבועיים. לפיכך, explant הרשתית שימש כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של neovascularization רשתית נורמלית ופתולוגית 41,42,43,44,45,46,47,48,49. באופן מעניין, קבוצת מחקר תיעדה הנבטה של כלי דם הנגרמים על-ידי VEGF בצמחי רשתית של עכברים, תוך שהיא חוקרת את הגורמים הפרואנגיוגניים המוגברים ברטינופתיה סוכרתית מתרבה43. יתר על כן, צמחי הרשתית הוטמעו בג'ל תלת מימדי, המאפשר לחקור את הנביטה של תאי אנדותל ברשתית בכיוון מרחבי-טמפורלי מפורט יותר45,46,47.

בנוסף למחקרים מורפולוגיים, explants רשתית משמשים גם במידה מסוימת כדי להעריך את תפקודי הרשתית50,51,52,53. הדמיית אלקטרורטינוגרמה Ex vivo (ERG) בוצעה על גבי מרחיקי רשתית של עכברים מבודדים, ומאפשרת לחקור את התפקודים השונים של מגוון תאי רשתית, כולל פוטורצפטורים מוט וחרוט54,55,56,57. באופן מעניין, Calbiague et al. דיווחו כי בתגובה לטיפול בגלוקוז גבוה, תרביות רשתית שמקורן בעכברים או בחולדות הראו עובי מופחת יותר ויותר של שכבות הרשתית58. עם זאת, תאים דו-קוטביים ברשתית, שהם בין התאים הרגישים המוקדמים ביותר למצבי סוכרת, שמרו לא רק על המורפולוגיה שלהם אלא גם על התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם בתרבית למשך עד שבועיים58. לסיכום, אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול להיות בסיס או נקודת מוצא למחקרים עתידיים נוספים כדי לייעל את היתרונות של שימוש explant במחקר עיניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות למענק המימון של המכון הלאומי לבריאות (NIH) למכון העיניים הלאומי (R01 EY030054) לד"ר מוחמד אל-שברווי. ברצוננו להודות לקתי וולוסביץ' שעזרה לנו בקריינות הווידאו. ברצוננו להודות לד"ר קן מיטון מהמעבדה לחקר הרשתית בילדים של המכון לחקר העיניים, אוניברסיטת אוקלנד, על עזרתו במהלך השימוש במיקרוסקופ הכירורגי ובהקלטה. הסרטון נערך ובוים על ידי ד"ר חאלד אלמשרי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Tags

רפואה גיליון 190
השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל <em>ex vivo</em> לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elmasry, K., Moustafa, M.,… More

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter