Summary
Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.
Abstract
Una delle sfide nella ricerca sulla retina è studiare il cross-talk tra diverse cellule retiniche come i neuroni retinici, le cellule gliali e le cellule vascolari. Isolare, coltivare e sostenere i neuroni retinici in vitro hanno limitazioni tecniche e biologiche. La coltura di espianti retinici può superare queste limitazioni e offrire un modello ex vivo unico per studiare il cross-talk tra varie cellule retiniche con parametri biochimici ben controllati e indipendenti dal sistema vascolare. Inoltre, gli espianti retinici sono un efficace strumento di screening per lo studio di nuovi interventi farmacologici in varie malattie vascolari e neurodegenerative della retina come la retinopatia diabetica. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura degli espianti retinici per un periodo prolungato. Il manoscritto presenta anche alcuni dei problemi tecnici durante questa procedura che possono influenzare i risultati desiderati e la riproducibilità della coltura retinica di espianto. L'immunocolorazione dei vasi retinici, delle cellule gliali e dei neuroni ha dimostrato capillari retinici e cellule neurogliali intatti dopo 2 settimane dall'inizio della coltura retinica di espianto. Ciò stabilisce che gli espianti retinici sono uno strumento affidabile per studiare i cambiamenti nella vascolarizzazione retinica e nelle cellule neurogliali in condizioni che imitano le malattie retiniche come la retinopatia diabetica.
Introduction
Sono stati presentati diversi modelli per studiare le malattie della retina, inclusi modelli sia in vivo che in vitro. L'uso degli animali nella ricerca è ancora oggetto di continuo dibattito etico e traslazionale1. I modelli animali che coinvolgono roditori come topi o ratti sono comunemente usati nella ricerca retinica 2,3,4. Tuttavia, le preoccupazioni cliniche sono sorte a causa delle diverse funzioni fisiologiche della retina nei roditori rispetto agli esseri umani, come l'assenza della macula o le differenze nella visione dei colori5. L'uso di occhi umani postmortem per la ricerca sulla retina ha anche molti problemi, inclusi ma non limitati a differenze nei background genetici dei campioni originali, la storia medica dei donatori e gli ambienti o gli stili di vita precedenti dei donatori6. Inoltre, l'uso di modelli in vitro nella ricerca retinica presenta anche alcuni inconvenienti. I modelli di coltura cellulare utilizzati per studiare le malattie della retina includono l'utilizzo di linee cellulari di origine umana, cellule primarie o cellule staminali7. I modelli di coltura cellulare utilizzati hanno dimostrato di avere problemi in termini di contaminazione, identificazione errata o dedifferenziazione 8,9,10,11. Recentemente, la tecnologia degli organoidi retinici ha mostrato progressi significativi. Tuttavia, la costruzione di retine altamente complesse in vitro ha diverse limitazioni. Ad esempio, gli organoidi retinici non hanno le stesse caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle retine mature in vivo. Per superare questa limitazione, la tecnologia degli organoidi retinici deve integrare più caratteristiche biologiche e cellulari, comprese le cellule muscolari lisce, la vascolarizzazione e le cellule immunitarie come la microglia12,13,14,15.
Gli espianti organotipici della retina sono emersi come uno strumento affidabile per lo studio delle malattie retiniche come la retinopatia diabetica e le malattie degenerative della retina16,17,18,19. Rispetto ad altre tecniche esistenti, l'uso di espianti retinici supporta sia colture cellulari retiniche in vitro che modelli animali in vivo attuali aggiungendo una caratteristica unica per studiare il cross-talk tra varie cellule retiniche sotto gli stessi parametri biochimici e indipendenti da variabili sistemiche. Le colture di espianti consentono di mantenere insieme diverse cellule retiniche nello stesso ambiente, consentendo la conservazione delle interazioni intercellulari retiniche20,21,22. Inoltre, uno studio precedente ha dimostrato che gli espianti retinici erano in grado di preservare la struttura morfologica e la funzionalità delle cellule retiniche in coltura23. Pertanto, gli espianti retinici possono fornire una piattaforma decente per studiare possibili bersagli terapeutici per un'ampia varietà di malattie retiniche24,25,26. Le colture di espianti retinici forniscono una tecnica controllabile e sono sostituti molto flessibili dei motod esistenti che consentono numerose manipolazioni farmacologiche e possono scoprire diversi meccanismi molecolari27.
L'obiettivo generale di questo articolo è quello di presentare la tecnica dell'espianto retinico come un ragionevole sistema di modelli intermedi tra colture cellulari in vitro e modelli animali in vivo . Questa tecnica può imitare le funzioni retiniche in un modo migliore rispetto alle cellule dissociate. Poiché vari strati retinici rimangono intatti, le interazioni intercellulari retiniche possono essere valutate in laboratorio in condizioni biochimiche ben controllate e indipendenti dal funzionamento del sistema vascolare28.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università di Oakland, Rochester, MI, USA e hanno seguito le linee guida stabilite dalla dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Preparazione degli animali
- Mantenere gli animali alloggiati a temperatura costante in un ambiente controllato dalla luce. Le impostazioni di temperatura per la stanza di stabulazione degli animali devono seguire le linee guida stabilite dalla "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio". L'intervallo di temperatura per i topi è compreso tra 18 °C e 26 °C. Mantenere i livelli di umidità controllati e impostati a circa il 42%.
- Per questo esperimento, utilizzare topi maschi C57BL / 6J (controllare la tabella dei materiali per i dettagli) che hanno più di 12 settimane di età (un topo adulto è stato utilizzato per questo protocollo).
NOTA: Un ceppo wild-type è stato utilizzato in questo protocollo per la dimostrazione, in quanto non presentava anomalie genetiche che colpivano la retina. Tuttavia, si potrebbero usare altri ceppi, compresi ceppi geneticamente manipolati, per la coltura di espianti retinici. - Fornire cicli luce/buio di 12 ore tramite il controllo dell'illuminazione nelle stanze di stabulazione degli animali.
- Ispezionare ogni animale per la salute e l'assunzione adeguata di cibo e acqua due volte al giorno durante la settimana e una volta al giorno nei fine settimana. Assicurati di fornire loro cibo fresco e acqua pulita.
- Se i livelli di cibo e acqua sono bassi durante la settimana, sciacquare la bottiglia d'acqua e riempirla. Aggiungi cibo fresco quando necessario. Cambiare le gabbie sporche ogni giorno o secondo necessità per la salute degli animali.
NOTA: Per studiare i fotorecettori e i cambiamenti indotti dalla luce nella retina, adattare i topi durante la notte in una speciale scatola oscura situata in una stanza buia nella struttura animale. - Eutanasia gli animali nella loro gabbia domestica per overdose di inalazione di CO 2 usando gas CO2 compresso in bombole collegate a una camera di CO2. Condurre la conferma della morte utilizzando un metodo secondario di eutanasia come la lussazione cervicale.
- Dopo aver completato la procedura, confermare la morte dell'animale con un metodo appropriato, come confermare l'arresto cardiaco e respiratorio o osservare le pupille fisse e dilatate dell'animale.
2. Preparazione dei tessuti
- Una volta che l'animale è stato eutanasiato, pulire l'area con etanolo al 70%. Quindi, aprire le palpebre con una mano in modo che l'occhio sia visibile. Applicare pressione alle parti superiore e inferiore dell'orbita con la mano opposta usando una pinza curva fino a quando il globo sporge.
- Per enucleare l'occhio, chiudere delicatamente la pinza sulla porzione posteriore dell'occhio e sollevare in un movimento continuo. Usando una pinza, tieni il bulbo oculare dal nervo ottico. Assicurarsi di utilizzare strumenti di dissezione sterilizzati per tutti i passaggi e di lavorare in condizioni completamente asettiche.
- Immergere ogni bulbo oculare in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di HBSS ghiacciato con penicillina-streptomicina (10.000 U/mL). Lavare il bulbo oculare in HBSS due volte per 5 minuti ciascuno.
- Trasferire il bulbo oculare in un tubo da 1,5-2 ml contenente mezzi completi (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutammina e 1% penicillina e streptomicina).
3. Dissezione dei tessuti
- Sezionare attentamente la retina al microscopio operatorio, come illustrato in sequenza nella Figura 1.
- Fai un'incisione circonferenziale intorno al limbus per aprire il bulbo oculare. Rimuovere la cornea sezionando circolarmente lungo il bordo della cornea e l'incisione (limbale), seguita dalla rimozione del segmento anteriore, della lente e del corpo vitreo, lasciando una coppa oculare vuota.
- Tenendo la regione della testa del nervo ottico con una pinza fine, staccare delicatamente il rivestimento esterno dell'occhio. Prestare molta attenzione durante la rimozione del mantello esterno per non ferire la retina neurale e per garantire che la retina rimanga totalmente intatta.
NOTA: La retina deve essere accuratamente staccata dall'epitelio pigmentato retinico (RPE) e deve essere eseguito un singolo taglio alla testa del nervo ottico per staccare la retina dal nervo ottico. Assicurarsi visivamente questo identificando il foro lasciato dal nervo ottico (la testa del nervo ottico). - Sezionare la retina radialmente in quattro pezzi di uguali dimensioni.
- Seguire i passaggi seguenti per gestire i piccoli pezzi della retina per garantire il corretto orientamento della coltura retinica.
- Utilizzando una lama a forbice da dissezione, aprire appena sotto il pezzo retinico (Table of Materials).
- Sollevare lentamente il pezzo retinico con la punta di una lama a forbice aperta e trasferirlo delicatamente sulla piastra di coltura.
- Trasferire separatamente gli espianti derivati dalla retina isolata su inserti di coltura cellulare in una piastra a 12 pozzetti, ciascuno contenente 300 μL di mezzo di espianto retinico, con il lato della cellula gangliare retinica (neuroretina) rivolto verso l'alto.
NOTA: Assicurarsi che il supporto sia DMEM con supplementi N2 e B27. Aggiungere penicillina-streptomicina (10.000 U / ml) al supporto come pure (Tabella dei materiali). La retina è formata da più strati di cellule neuronali interconnesse tramite sinapsi e sostenute dall'esterno dallo strato pigmentato dell'epitelio pigmentato retinico, che è lo strato nero che è stato rimosso durante la dissezione. - Rimuovere eventuali residui dell'epitelio pigmentato; Tuttavia, questi resti possono aiutare a identificare il corretto orientamento dell'espianto. Assicurarsi che la parte pigmentata sia rivolta verso il basso e che la parte non pigmentata sia rivolta verso l'alto.
- Incubare la coltura retinica di espianti in incubatori umidificati a 37 °C e 5% di CO2.
- Assicurarsi che la superficie retinica sia rivolta verso l'alto. Se il pezzo retinico è capovolto o piegato, prova a regolarlo delicatamente con l'orientamento corretto.
NOTA: Prestare molta attenzione al corretto orientamento dell'espianto retinico nella piastra di coltura. Evitare qualsiasi capovolgimento o piegatura dell'espianto nella piastra di coltura in quanto ciò comporterà il fallimento della corretta crescita delle cellule retiniche in coltura.
4. Coltura retinica di espianti
- Mantenere le colture di espianti retinici (preparate nelle fasi 3.2-3.3) in incubatori umidificati a 37 °C e 5% di CO2.
- Cambia metà dei media da ogni pozzetto a giorni alterni per 2 settimane. Fatelo pipettando con attenzione 150 μL dal pozzetto. Quindi, aggiungere 150 μL di terreno fresco nel pozzetto. Evitare di capovolgere l'espianto quando si cambia il supporto.
- Controllare attentamente l'espianto al microscopio prima di rimettere la piastra di coltura nell'incubatore. Esaminare l'integrità delle cellule e l'architettura retinica al microscopio a campo chiaro. Assicurarsi che l'espianto sia ancora orientato correttamente. Utilizzare sia l'obiettivo 4x che 20x per esaminare l'espianto.
NOTA: Evitare la completa immersione dell'espianto nel supporto.
5. Immunoistochimica
- Dopo 2 settimane, fissare l'espianto retinico rimuovendo il mezzo. Farlo lavando prima una volta con 200 μL di 1x PBS e quindi aggiungendo 300 μL di paraformaldeide al 4% in 0,1 M PBS, pH 7,4, al pozzetto contenente l'espianto e lasciandolo durante la notte.
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito senza rimuovere gli inserti di coltura dalla piastra. Gli espianti possono anche essere trasferiti in un tubo conico da 500 μL e il lavaggio e la fissazione possono essere effettuati all'interno del tubo. - Trasferire l'espianto in un tubo conico da 500 μL contenente 300 μL di 1x PBS-2,5% Triton X per il lavaggio.
- Lavare gli espianti fissi nel tubo tre volte per 5 minuti ciascuno utilizzando una velocità media su uno shaker (25 rpm).
- Bloccare le reazioni non specifiche attese incubando l'espianto con 300 μL di tampone bloccante 1x contenente thimerosal allo 0,02% per 1 ora a temperatura ambiente prima dell'incubazione dell'anticorpo.
- Incubare gli espianti fissi con gli anticorpi primari per una notte a 4 °C usando la velocità media su uno shaker.
NOTA: Rilevare le cellule endoteliali retiniche nell'espianto fisso mediante colorazione con anticorpi GSL I, BSL I (lectina) (7:1.000). Rilevare le cellule gliali negli espianti retinici colorando con l'anticorpo della proteina acida fibrillare gliare di coniglio (GFAP) (1:250). Rilevare i neuroni retinici colorando l'espianto con l'anticorpo NeuN di coniglio (1:250)29,30. Incubare s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome espianta con la combinazione lectina, NeuN e incuba altri con la combinazione lectina, GFAP. - Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario dalle provette mediante aspirazione con una pipetta. Lavare gli espianti con 1x PBS-2,5% Triton X tre volte per 5 minuti ciascuno utilizzando la velocità media su uno shaker.
- Aggiungere gli anticorpi secondari: Goat anti-Rabbit IgG (1:500) (secondario per GFAP e NeuN) e Texas Red (7:1.000) (per la lectina). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando velocità media su uno shaker.
NOTA: Gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce, quindi coprire il tubo con un foglio di alluminio. - Rimuovere gli anticorpi secondari mediante aspirazione, quindi lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS-2,5% Triton X.
- Trasferire l'espianto dal tubo a un vetrino usando una pipetta di trasferimento. Rimuovere il liquido in eccesso sulla slitta, quindi aggiungere una goccia di supporto di montaggio con DAPI alla diapositiva.
- Coprire il fazzoletto con un vetrino. Non lasciare bolle d'aria tra il copricapo e il fazzoletto.
- Porta i vetrini colorati al microscopio a fluorescenza e inizia a scattare le immagini. È importante coprire i vetrini colorati utilizzando una scatola di scorrimento poiché la colorazione a fluorescenza è sensibile alla luce.
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Representative Results
Sopravvivenza delle cellule retiniche neuronali e vascolari dell'espianto retinico in terreni di coltura ex vivo per un tempo prolungato
Coltivando un espianto retinico utilizzando il nostro protocollo, siamo riusciti a mantenere diverse cellule retiniche che erano vitali per un massimo di 2 settimane. Per verificare la presenza di diverse cellule retiniche, è stata eseguita la colorazione immunofluorescenza dell'espianto retinico utilizzando un marcatore di cellule neuronali (NeuN), un marcatore di cellule gliali (GFAP) e un marcatore vascolare (isolectina-B4) (Figura 2). La colorazione ha mostrato neuroni retinici e cellule gliali ben organizzati e ben sviluppati. Inoltre, i vasi sanguigni retinici erano strutturalmente intatti, come indicato dalla colorazione isolectina-B4. L'integrità morfologica dell'espianto retinico, come dimostrato dall'immunocolorazione, ha indicato che la coltura dell'espianto retinico è riuscita a mantenere cellule retiniche vitali che potrebbero essere utilizzate sperimentalmente come modello. Le diverse condizioni sperimentali da studiare utilizzando l'espianto possono essere valutate e analizzate mediante colorazione a immunofluorescenza per più marcatori cellulari utilizzando il software ImageJ. L'immunocolorazione consente di misurare i livelli di immunoreattività di ciascun marcatore cellulare e del numero di cellule specifiche, come il numero di cellule gangliari retiniche o fotorecettori, tra i vari gruppi sperimentali.
Importanza del corretto orientamento dell'espianto retinico nella piastra di coltura per gli esiti sperimentali
Il corretto orientamento dell'espianto retinico nella piastra di coltura si ottiene incubando la neuroretina rivolta verso l'alto. D'altra parte, il fallimento dell'espianto retinico può derivare dal capovolgimento o dal ripiegamento del tessuto retinico, che fa sì che la neuroretina sia rivolta verso il basso. La colorazione in immunofluorescenza dell'espianto retinico in coltura dopo 2 settimane utilizzando diversi marcatori retinici come l'esperimento precedente (NeuN, GFAP e isolectina-B4) ha dimostrato che il fallimento del corretto orientamento dell'espianto si traduce nel fallimento del corretto sviluppo dell'elemento neurovascolare (Figura 3).
Figura 1: Fasi di dissezione del bulbo oculare per creare l'espianto retinico. a) Il bulbo oculare enucleato viene immerso nel mezzo immediatamente dopo essere stato rimosso dall'animale. (b) Un'incisione circonferenziale viene praticata lungo il limbus per aprire il bulbo oculare. (c) La cornea viene rimossa sezionando lungo l'incisione limbare. (d) Tenendo il nervo ottico con una pinza sottile, il rivestimento esterno dell'occhio viene staccato delicatamente. (e) Il cristallino, il vitreo e il corpo ciliare vengono rimossi. (F) Solo la retina neurale viene lasciata indietro. (g) Nella retina vengono praticate quattro incisioni radiali per facilitarne il taglio nella fase successiva. h) La retina può essere tagliata in due o quattro pezzi e quindi trasferita nella piastra di coltura cellulare contenente l'inserto e il mezzo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Coltura retinica espiantato di successo con struttura retinica preservata. Colorazione a immunofluorescenza degli espianti retinici che erano rimasti in coltura per 2 settimane. Gli espianti sono stati fissati e colorati con (a) NeuN per i neuroni retinici (verde) e isolectina-B4 per i vasi sanguigni (rosso) e (b) GFAP per le cellule gliali (verde) e isolectina-B4 per i vasi sanguigni (rosso). La colorazione ha mostrato cellule retiniche e vasi retinici ben sviluppati. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Coltura di espianti retinici non riuscita con cellule retiniche difettose e sottosviluppate. Colorazione a immunofluorescenza di espianti retinici che erano rimasti in coltura per due settimane. Gli espianti sono stati fissati e colorati con GFAP per le cellule gliali (verde) e isolectina-B4 per i vasi sanguigni (rosso). Le immagini mostrano una colorazione difettosa e cellule retiniche e vasi retinici sottosviluppati. L'espianto retinico era piegato e non era orientato correttamente nella piastra di coltura. Grande attenzione dovrebbe essere data per garantire il corretto orientamento dell'espianto con la retina rivolta verso l'alto. Il mancato inserimento dell'espianto retinico nel giusto orientamento comporterà il fallimento del corretto sviluppo dell'espianto. Barra di scala = 100 μm Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il nostro laboratorio studia da anni i cambiamenti fisiopatologici che favoriscono la disfunzione microvascolare retinica 31,32,33,34,35,36. Gli espianti retinici sono una delle tecniche che possono essere di grande valore da utilizzare come modello per lo studio di malattie retiniche come la retinopatia diabetica o le malattie degenerative della retina. Avere un gruppo di controllo derivato dalla stessa singola retina o animale del gruppo o dei gruppi trattati dà a questa tecnica un grande vantaggio in termini di fornire confronti più affidabili di diverse condizioni sperimentali.
Una delle maggiori sfide durante la preparazione dell'espianto retinico è il ripiegamento dell'espianto o l'orientamento errato nella piastra di coltura con la superficie retinica rivolta verso il basso. Altri ricercatori hanno suggerito di pipettare la retina su e giù all'interno della pipetta di trasferimento per averla nell'orientamento corretto nella piastra37. Tuttavia, nel loro protocollo, hanno usato l'intera retina per un singolo espianto, ma in questo protocollo, una singola retina è stata tagliata in due o quattro pezzi, il che significa che i pezzi sono più piccoli ed è difficile fare questa manovra per il corretto orientamento. Tagliare una singola retina in due o quattro pezzi consente di ottenere da quattro a otto pezzi di retina dallo stesso animale che potrebbero essere utilizzati per un esperimento. Ciò consente esperimenti in cui il gruppo di controllo e i gruppi sperimentali sono derivati dallo stesso animale.
Tuttavia, tagliare la retina in piccoli pezzi rende la sua gestione più impegnativa. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica per la gestione di questi piccoli pezzi retinici per garantire il corretto orientamento della coltura retinica. Per fare questo, la lama a forbice dissecante aperta viene posizionata appena sotto il pezzo retinico, con la superficie retinica rivolta verso l'alto. Se il pezzo retinico viene capovolto o piegato, viene regolato delicatamente con l'orientamento corretto. Lentamente, il pezzo retinico viene sollevato con la punta di una lama a forbice aperta e inserito delicatamente nella piastra di coltura. Questa semplice tecnica assicura che ogni pezzo retinico sia nell'orientamento corretto con la retina rivolta verso l'alto e promuove risultati migliori per lo studio dei vasi retinici e delle cellule neurogliali (Figura 2). Il mancato posizionamento dell'espianto retinico nell'orientamento corretto con la neuroretina rivolta verso l'alto comporterà il fallimento della corretta crescita delle cellule retiniche in coltura, come mostrato in Figura 3. Si consiglia vivamente una formazione adeguata per evitare questo errore tecnico.
Questo protocollo descrive un espianto organotipico della retina di una retina di topo adulto; Tuttavia, la tecnica è stata precedentemente descritta anche per le retine di topo immature37 e le retine umane38. In uno studio precedente, sono state descritte colture di espianti retinici per lo studio dello sviluppo vascolare, in cui la manipolazione della funzione endoteliale è stata resa fattibile ex vivo27. Come esempio della valutazione morfologica di un espianto retinico, l'espianto retinico è stato lasciato in coltura per 2 settimane, quindi è stata eseguita l'immunocolorazione utilizzando NeuN (marcatore di cellule neuronali), GFAP (marcatore di cellule gliali) e isolectina-B4 (marcatore vascolare). La colorazione ha mostrato che le cellule retiniche e i vasi sanguigni erano ben sviluppati e ben conservati nell'espianto (Figura 2). Tuttavia, è possibile ottenere più dati di colorazione immunoistochimica per verificare la vitalità e la funzionalità di altre cellule retiniche nell'espianto.
La coltura di espianti stessa potrebbe essere stressante per le cellule retiniche. Tuttavia, le cellule potrebbero essere incubate in condizioni relativamente normali in modo che i cambiamenti morfologici che si verificano in varie condizioni sperimentali, come l'iperglicemia o l'ipossia, possano essere confrontati con la condizione basale. L'espianto, quindi, rappresenta un buon strumento per valutare varie cellule retiniche e testare le loro risposte a diversi agenti farmacologici o bersagli terapeutici contemporaneamente in un'ampia varietà di malattie retiniche.
La neovascolarizzazione retinica è un segno cardinale della retinopatia ischemica, come nella retinopatia della prematurità e nella retinopatia diabetica. Noi (Figura 2) e altri 27,39,40,41,42 abbiamo potuto osservare la vascolarizzazione retinica intatta negli espianti in coltura per un massimo di 2 settimane. Pertanto, l'espianto retinico è stato utilizzato per studiare la fisiopatologia della neovascolarizzazione retinica normale e patologica 41,42,43,44,45,46,47,48,49. È interessante notare che un gruppo di ricerca ha registrato la germinazione vascolare indotta da VEGF negli espianti retinici di topo mentre studiava i fattori proangiogenici che sono elevati nella retinopatia diabetica proliferativa43. Inoltre, gli espianti retinici sono stati incorporati in un gel tridimensionale, consentendo lo studio della germinazione delle cellule endoteliali retiniche in un orientamento spaziotemporale più dettagliato45,46,47.
Oltre agli studi morfologici, gli espianti retinici sono anche utilizzati in una certa misura per valutare le funzioni retiniche50,51,52,53. L'elettroretinogramma ex vivo (ERG) è stato eseguito su espianti retinici isolati di topo, consentendo lo studio delle diverse funzioni di una varietà di cellule retiniche, inclusi i fotorecettori sia a bastoncello che a cono54,55,56,57. È interessante notare che Calbiague et al. hanno riferito che, in risposta al trattamento ad alto contenuto di glucosio, le colture di espianti retinici derivate da topi o ratti hanno mostrato uno spessore sempre più ridotto degli strati retinici58. Tuttavia, le cellule bipolari retiniche, che sono tra le prime cellule sensibili alle condizioni diabetiche, hanno mantenuto non solo la loro morfologia ma anche le loro proprietà elettrofisiologiche in coltura per un massimo di 2 settimane58. In sintesi, riteniamo che questo protocollo potrebbe essere una base o un punto di partenza per ulteriori studi futuri per ottimizzare i benefici dell'uso degli espianti nella ricerca oculare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il National Institute of Health (NIH) Funding Grant al National Eye Institute (R01 EY030054) al Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Vorremmo ringraziare Kathy Wolosiewicz per averci aiutato con la narrazione del video. Vorremmo ringraziare il Dr. Ken Mitton del laboratorio di ricerca retinica pediatrica dell'Eye Research Institute, Università di Oakland, per il suo aiuto durante l'uso del microscopio chirurgico e la registrazione. Questo video è stato montato e diretto dal Dr. Khaled Elmasry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
References
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