Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rekonstitution af membranbundne minimale actin-kortika på understøttede lipiddobbeltlag

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63968
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Centre for Mechanochemical Cell Biology and Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, 2National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

Summary

Denne protokol beskriver dannelsen af understøttede lipiddobbeltlag og tilsætningen af cytoskeletale filamenter og motorproteiner for at studere dynamikken i rekonstituerede, membranbundne cytoskeletale netværk ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Abstract

Overfladen af en levende celle giver en alsidig aktiv platform for adskillige cellulære processer, der opstår som følge af samspillet mellem plasmamembranen og den underliggende actin cortex. I de sidste årtier har rekonstituerede, minimale systemer baseret på understøttede lipiddobbeltlag i kombination med actinfilamentnetværk vist sig at være meget medvirkende til at optrævle grundlæggende mekanismer og konsekvenser af membranbundne actinnetværk samt til at studere funktionerne af individuelle membranassocierede proteiner. Her beskriver vi, hvordan man rekonstituerer sådanne aktive sammensatte systemer in vitro , der består af væskeunderstøttede lipiddobbeltlag koblet via membranassocierede actinbindende proteiner til dynamiske actinfilamenter og myosinmotorer, der let kan observeres via total intern refleksionsfluorescensmikroskopi. Et åbent kammerdesign gør det muligt at samle systemet trin for trin og systematisk kontrollere mange parametre såsom linkerproteinkoncentration, actinkoncentration, actinfilamentlængde, actin / myosinforhold samt ATP-niveauer. Endelig diskuterer vi, hvordan man kontrollerer systemets kvalitet, hvordan man opdager og fejlfinder almindeligt forekommende problemer og nogle begrænsninger i dette system i forhold til den levende celleoverflade.

Introduction

Plasmamembranen i en levende dyrecelle interagerer konstant med det tilstødende actincytoskelet, og sammen danner de et aktivt kompositmateriale, der opfylder en lang række cellulære funktioner 1,2. For at studere processer ved denne lipidmembran-actin-grænseflade har rekonstitutionen af cytoskeletale netværk oven på understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er) vist sig at være meget nyttig. Denne minimale systemtilgang tillader præcis kontrol af cytoskeletnetværkskomponenter og lipidsammensætning. Sammenlignet med de fritstående lipidmembraner i gigantiske unilamellar vesikler muliggør SLB'ernes plane geometri effektiv anvendelse af avancerede mikroskopiteknikker såsom superopløsning3,4, total intern refleksionsfluorescens (TIRF)5,6,7 eller interferometrisk spredning 8 at studere den rumlige organisation og dynamik i cytoskeletale netværk. TIRF giver den højeste kontrast for fluorescerende mærkede komponenter, da signalet af ubundne mærkede molekyler i opløsningen, der bidrager til baggrundssignalet, er minimalt.

Her beskriver vi en grundlæggende protokol for dannelsen af actomyosinnetværk bundet til understøttede lipiddobbeltlag, som i vid udstrækning anvendes i marken til at studere fysikken i aktive, kvasi-2D-netværk 9,10,11 og deres virkning på membranorganisation 3,5,12,13,14,15,16 (figur 1 ). Denne tilgang er ikke begrænset til actinbaserede netværk, men kan også let tilpasses til at udforske mikrotubuli, mellemliggende filamenter eller sammensatte netværk af blandet natur og til at studere en række interaktioner mellem lipidmembranproteiner og cytoskeletale komponenter ved hjælp af overfladefølsomme mikroskopimetoder.

For at holde denne protokol fokuseret har vi udelukket en detaljeret beskrivelse af oprensning og mærkning af actin- og myosinproteiner eller detaljer om, hvordan man indstiller og kontrollerer kontraktiliteten og organisationen af actomyosin-netværk. Man bør henvise til andre protokoller, der er offentliggjort sammen med denne i JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over in vitro actin-membran aktivt sammensat system. Oprettet med Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Reagenser og udstyr

  1. Forbered friske buffere som anført i tabel 1. Brug ultrarent, deioniseret vand med en resistivitet på 18,2 MΩ·cm ved 25 °C. Steriliser alle buffere ved at føre dem gennem 0,22 μm filtre under et vakuum. Afgasning af buffere, der anvendes til søjlekromatografi.
  2. Rens skeletmuskulatur actin som beskrevet tidligere18,19. Tilsæt 20% glycerol til den endelige oprensede G-actinopløsning og lav alikvoter på 500 μL (til mærkning eller bulkforsøg) og 10 μL (til individuelle forsøg) volumen. Flash fryser aliquoterne ved at dyppe rørene i flydende nitrogen i 30 s og derefter opbevare dem ved -80 ° C i op til 18 måneder.
    BEMÆRK: Alternativt kan renset actin eller acetonepulver købes kommercielt.
  3. Mærk renset skeletmuskulatur G-actin med fluorescerende maleimidfarvestoffer som beskrevet tidligere5. Koncentrationen og graden af mærkning af proteinet ved hjælp af spektrofotometri bestemmes ved hjælp af korrigeret A290nm for actin (εactin = 26.600 M-1 cm-1) og Aλmax af farvestoffet. Der fremstilles alikvoter på 10 μL og lynfryses ved at dyppe rørene i flydende nitrogen i 30 s og opbevares ved -80 °C i op til 18 måneder.
    BEMÆRK: Mærkning med lysinkonjugerende NHS-estere vil skabe ikke-funktionel actin og bør undgås.
  4. Rens skeletmuskulatur myosin II ved at følge protokollen20. Kør SDS-PAGE ved hjælp af 10% polyacrylamid gel efterfulgt af Coomassie farvning for at bestemme renhedsniveauet for proteinet21. Opbevar renset skeletmuskulatur myosin-II ved -20 °C i flydende form i myosin II-buffer med 50% glycerol.
    BEMÆRK: Den lagrede myosin II kan bruges i op til 2 år.
  5. Mærk renset myosin-II med fluorescerende maleimidfarvestoffer som beskrevet tidligere5. Undgå at mærke myosinmotorer med NHS-estere farvestoffer. Bestem koncentrationen og graden af mærkning ved spektrofotometri ved hjælp af korrigeret A280nm myosin II og Aλmax af farvestoffet. Opbevar den genanvendte myosin II (mørk eller mærket) ved 4 °C og brug inden for 6 uger.
  6. Oprensning af capping protein
    1. Få murine capping protein ved at følge en tidligere protokol22. Kør SDS-PAGE ved hjælp af 10% polyacrylamid gel efterfulgt af Coomassie farvning for at bestemme renhedsniveauet af proteinet. Koncentrationen måles ved hjælp af A280 nm capping-protein (εCP = 99.530 M-1 cm-1).
    2. Tilsæt 20% glycerol til proteinopløsningen og lav 5 μL alikvoter i 200 μL PCR-rør. Rør hældes i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i op til 2 år.
      BEMÆRK: Capping proteinaktivitet kontrolleres ved polymerisering af faste mængder fluorescerende G-actin i nærværelse af forskellige capping proteinmængder. Filamenterne afbildes derefter under et mikroskop, og deres længdefordeling kvantificeres. Jo højere den relative koncentration af capping protein, jo kortere er actinfilamentfordelingerne. Se Köster et al.5.
  7. Udtryk et fluorescerende membran-actin-linkerprotein, f.eks. til denne protokol, brug 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), udtryk det i Bl21DE3* Escherichia Coli, og rens som beskrevet tidligere23. Bestem koncentrationen af proteinet ved spektrofotometri.
  8. Proteinet opbevares i små alikvoter i gelfiltreringskromatografibuffer (eller enhver anden passende buffer) med 20% glycerol ved -80 °C. Under disse forhold er proteinet stabilt i over 2 år.
    BEMÆRK: Valget af actin-membran linker protein og fluorescerende markør afhænger af typen af spørgsmål, man behandler. En bred vifte af lipid-linking strategier er blevet udviklet i de seneste år, herunder histidin-mærkede proteiner24, biotin-streptavidin25, og single-stranded DNA26.
  9. Fremstilling af multi-lamellære vesikler (MLV'er)
    BEMÆRK: Arbejdsgangen fra MLV'er til understøttede lipiddobbeltlag er vist i figur 2.
    1. Læg 5-10 gule glasflasker i et 200 ml glasbægerglas. Fyld bægerglasset med 2% rengøringsopløsning, lige nok til at nedsænke glasflaskerne. Soniker dem i et vandbad i 30 minutter ved fuld puls og 65 °C.
    2. Tag hætteglassene ud af opløsningen og skyl dem grundigt med destilleret vand. Hætteglassene anbringes i et glasbægerglas indeholdende 2 N NaOH og sonikat i 20 min. Der kræves ingen opvarmning under dette trin.
    3. Tag hætteglassene ud af NaOH-opløsningen og skyl grundigt med destilleret vand. Tør hætteglassene inde i en varmluftsovn, der er indstillet til 65 °C i 2 timer eller længere.
    4. Opbevar de rensede hætteglas i et rent bægerglas forseglet med gennemsigtig film i op til 6 uger.
      FORSIGTIG: Udfør følgende trin inde i en kemisk røghætte. Håndter chloroform og lipidopløsningerne med gastætte Hamilton glassprøjter for at undgå forurening med plast.
    5. Skyl Hamilton-sprøjterne og et par gule glasflasker flere gange med ren chloroform. Tag lipidpulveret, der opbevares i glasampuller, fra -20 ° C-fryseren og tilsæt tilstrækkelige mængder chloroform til at opløse lipidpulveret til koncentrationer på 10-25 mg / ml.
    6. Overfør opløsningen fra ampullen til et friskrenset gult glasflaske og mærk det korrekt. Udfør dette trin på is for at reducere fordampning af chloroform.
    7. Lav en DOPC-stamopløsning med en koncentration på 10-25 mg / ml og DGS-NTA-Ni2+ med en koncentration på 1-10 mg / ml.
    8. For at lave en fungerende lipidblanding skal du tage et rent glasglas og skylle det 2x med chloroform. Tilsæt 300 μL ren chloroform til hætteglasset for at tjene som base for bedre blanding af komponenterne. Dette vil ikke påvirke de endelige koncentrationer af lipiderne, da al chloroform vil blive tørret ud i de næste trin.
    9. Tilsæt målte mængder stamlipidopløsninger til hætteglasset for at fremstille de ønskede arbejdslipidblandinger. Mållipidkoncentrationen i lipidrehydreringsbuffer er 4 mM. Tør lipidblandingen under en langsom strøm af N2-gas inde i kemikaliehætten ved stuetemperatur. Dette trin kan tage op til 30 minutter for hvert hætteglas.
    10. Når alt opløsningsmidlet er tørret ud, vakuumtørres lipidfilmen i >2 timer ved stuetemperatur for at fjerne eventuelle spor af chloroform tilbage. Resuspender den udtørrede lipidblanding i lipidrehydreringsbuffer for en endelig lipidkoncentration på 4 mM.
    11. Inkubere i 5-10 minutter for at tillade rehydrering af lipiderne. Vortex lipidopløsningen i ca. 30 s til dannelse af MLV'er.
    12. Lav 0,5-1 ml alikvoter af MLV'erne i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Rør i flydende nitrogen, forsegles med en gennemsigtig film, og opbevares ved -20 ° C (i op til 6 uger).
      BEMÆRK: Lipidbestandskoncentrationer vælges for at tillade tilstrækkeligt store volumener, der muliggør pålidelig pipettering ved hjælp af Hamilton-sprøjterne. Hvis de mængder, der er nødvendige for at fremstille bestanden, er for store til at opløse det tørrede lipidpulver, skal du foretage flere fortyndinger af stammen for at sikre reproducerbar blanding af forskellige lipider.
  10. Forberedelse af små unilamellar vesikler (SUV'er)
    1. Tag en aliquot af MLV'er ud af -20 ° C opbevaring og tø den op ved stuetemperatur. Flashfrys vesiklerne ved at stikke mikrocentrifugerøret i flydende nitrogen i 15-30 s og straks lægge det i et vandbad indstillet til 45 °C, indtil opløsningen er optøet helt (1-2 min). Gentag ovenstående fryse-optøningscyklus 10x-15x, indtil opløsningen ser mindre uklar ud.
      BEMÆRK: Indstil temperaturen på vandbadet højere end overgangstemperaturen for lipidblandingen, der optøes, for at tillade ensartet lipidblanding.
    2. Ligevægte en sprøjtebaseret miniekstruder udstyret med en 80 nm polycarbonatfiltermembran i porestørrelse med SUV-rehydreringsbuffer. Sørg for, at der ikke er lækage eller bobler i systemet. Mens ekstruderingsmetoden giver monodisperse SUV'er med minimal lipidskade, kan lipidblandinger med negativ ladning klæbe til polycarbonatmembranen.
    3. Før forsigtigt den optøede lipidopløsning gennem den præ-ligevægtede ekstruder fra den ene side til den anden og derefter tilbage. Gentag cyklussen 5x-10x, indtil lipidopløsningen bliver synligt klar, hvilket indikerer dannelsen af SUV'er med ~ 100 nm diameter.
    4. Centrifuger den ekstruderede suspension (eller tip-sonikerer opløsningen; se bemærkning nedenfor) ved 15.000 x g i 60 minutter ved 4 °C for at pelletere lipidaffaldet ned. Saml de øverste 80% af opløsningen uden at forstyrre pelleten og uden at skabe bobler. Overfør supernatanten indeholdende SUV'erne til et frisk mikrocentrifugerør og opbevar på is i op til 6 dage.
      BEMÆRK: Et alternativ til centrifugering er tip sonikering udført som følger. Tænd en mikrotip sonikator og indstil følgende indstillinger: Amplitude = 30% af maksimum, ON tid = 10 s, OFF tid = 60 s. Rengør spidsen af mikro-sonikatoren med deioniseret vand efterfulgt af 2 N NaOH, chloroform og igen deioniseret vand. Dyp sonikatorspidsen i hver af disse opløsninger og sonikat i 1-2 cyklusser ved hjælp af ovenstående indstillinger. Dyp den rene spids i den fryseoptøede vesikelopløsning og sonikat i 3-6 cyklusser på is, indtil opløsningen bliver klar.
    5. Efter centrifugering kontrolleres for tegn på høj lipidnedbrydning eller en mislykket lipidekstrudering som dannelse af en tynd hvidlig film og / eller en tydeligt synlig pellet. I disse tilfælde skal du ikke fortsætte og gentage SUV-forberedelsestrinnene igen.
      BEMÆRK: Holdbarheden af SUV'er kan variere for forskellige lipidblandinger. SUV'er lavet af DOPC: DGS-NTA-Ni2+ er stabile i op til 6 dage med henblik på disse eksperimenter. Tip til løsning af almindelige problemer findes i tabel 2.

Figure 2
Figur 2: Skematisk viser arbejdsgangen fra fremstilling af multilamellar vesikler og små unilamellar vesikler til dannelse af understøttede lipid dobbeltlag. Oprettet med Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Rekonstitution af membranbundne actinnetværk

  1. Forberedelse af prøvekamre
    1. Tag 3-5 rektangulære glasdæksler og læg dem i en Coplin-krukke. Tænd for badesonikatoren, og indstil temperaturen til 65 °C. Fyld Coplin-krukken med 2% rengøringsopløsning for at nedsænke dækslerne helt, og læg den i sonikatoren i 30 minutter ved fuld pulstilstand.
    2. Brug stump PTFE-belagt tang til at fjerne dækslikkerne en efter en fra krukken. Skyl dem grundigt med destilleret vand og læg dem i en anden Coplin-krukke fyldt med 2 N NaOH.
    3. Sonicer dækslikkerne i 20 minutter ved fuld pulstilstand. Fjern dækslikkerne en efter en, skyl grundigt med destilleret vand, og læg dem i en anden Coplin-krukke fyldt med destilleret vand.
      BEMÆRK: Eventuelt sonikeres dækslikkerne i destilleret vand i 20 minutter og skylles dem derefter igen med destilleret vand.
    4. Umiddelbart før eksperimentet påbegyndes, skal du tage krukken med dækslerne i en kemisk hætte udstyret med en N2 gasforsyning.
    5. Optimer lufttrykket i N 2-gasstrømmen ved forsøg og fejl, så det er lige nok til at fortrænge vand fra dækslipoverfladen uden at bryde det. Juster strømmen af N2-gas parallelt med dækslipplanet for at reducere muligheden for at bryde dækslippet.
    6. Brug handsker og tang til at fjerne dækslerne en efter en fra krukken for at tørre dem under N2-strømmen . Tør begge sider af hver dæksel og læg dem på et rent plastgitter med et dæksel. Placer kassen med dækslikkerne i en tørremiddel for at undgå kontakt med støvpartikler i luften.
      BEMÆRK: De N 2-tørrede dækslips kan opbevares i en ekssikkator, hvor de kan forblive hydrofile i op til2 dage. Denne strategi kan være nyttig, når der kræves mange dobbeltlag til eksperimentet, eller hvis eksperimentet tager længere tid end 8 timer.
    7. Tag autoklaverede PCR-rør og skær deres låg ud og nedre koniske halvdele med et skarpt kirurgisk blad. Tag de cylindriske halvskårne rør et efter et, påfør UV-hærdeligt klæbemiddel på den glatte kant af hvert skåret rør, og læg det omvendt på en nyrenset dækslip, så kanten sidder fladt på dækslippen.
    8. Flyt ikke cylinderen sideværts, når den er placeret på dækslippet for at sikre, at limen ikke spildes til kammerets centrale rum. Rektangulære dæksler kan komfortabelt rumme op til tre reaktionskamre, og de runde kan kun rumme et i midten (figur 1).
    9. Sæt de kammerbærende dæksler inde i en UV-ozonrenser med en O2-forsyning og støvsugning (eller brug en UV-belysning). Tænd UV-lyset og lys i 3-5 minutter for at lade klæbemidlet polymerisere. Udfør længere belysning (10-15 min) for at forbedre dækglassets hydrofilicitet og dermed kvaliteten af lipiddobbeltlaget.
    10. Opbevar de tørre UV-belyste prøvekamre i op til 8 timer inde i små plastkasser (såsom tomme rektangulære dæksletkasser) indpakket i gennemsigtig film for at reducere kontakt med støvpartikler i luften.
      BEMÆRK: En jævn strøm afO2 i nærværelse af UV-lys danner ozon og iltradikaler, der kan fjerne organiske urenheder fra overfladen af dækslippet. Et vakuum forhindrer lækage af giftig ozon, der dannes under processen.
    11. Tag dækslikkerne ud og test kamrene for lækage ved at fylde dem op med destilleret vand. Hvert kammer kan rumme op til ~ 150 μL prøve. Kassér de utætte kamre.
      BEMÆRK: En anden god og sikker rengøringsmulighed er plasmarenseren. Tids- og strømindstillingerne afhænger af modellen, men sørg for ikke at overbehandle glasdiasene med plasma, da dette vil resultere i en reduktion af lipidmobiliteten. Overfladebehandlingen kan påvirke mobiliteten af lipider27, som det er blevet observeret ved langvarig behandling med rengøringsopløsningen (>45 min) eller NaOH (>30 min).
  2. Fremstilling af understøttede lipid dobbeltlag
    1. Vask hvert kammer med SLB-dannelsesbuffer (eller 1x PBS) for at fjerne eventuelle overfladeforurenende stoffer, hvilket efterlader 100 μL buffer i enden. Marker bufferniveauet ved 100 μL med en permanent markør for reproducerbart at spore ændringer i volumenet.
    2. Tilsæt 2 μL 0,1 MCaCl2 til kammeret. Dette forbedrer adsorptionen af vesiklerne til glasoverfladen, hvilket forbedrer dobbeltlagsdannelsen i næste trin. Der tilsættes 8 μL SUV-opløsning (fra trin 1.10.) til hvert kammer, og der inkuberes i 15 minutter ved 25 °C.
      BEMÆRK: Volumenet af SUV-blandingen, der skal tilføjes, kan estimeres ved at beregne det samlede antal lipider (med et gennemsnitligt areal på 0,72 nm2), der er nødvendige for fuldstændigt at dække det udsatte hydrofile område af brønden med to lipidlag.
    3. Vask de ubundne vesikler af med actinmotilitetsbuffer (1x KMEH). Først fjernes 50 μL af SLB-formationsbufferen, og der efterlades kun 50 μL i prøvekammeret. For det andet tilsættes 100 μL 1x KMEH til kammeret. Bland forsigtigt, og fjern derefter 100 μL af bufferen uden at røre bunden.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at være skånsom under vask. Sørg for, at pipettespidsen ikke rører bunden af kammeret. Hold pipetten tilbøjelig til at lede bufferstrømmen til kammerets væg og ikke direkte ved dobbeltlaget, da en direkte strømning kan forstyrre dobbeltlaget. Pas på ikke at introducere luftbobler, mens du pipetterer, da luft kan nå lipiddobbeltlaget og forårsage defekter i det.
    4. Gentag vaskene 10x ved at tilføje 100 μL 1x KMEH og fjerne 100 μL.
    5. Tilsæt 10 μL 1 mg/ml β-kasein til dobbeltlaget, bland forsigtigt og inkuber i 5-10 min. β-kasein blokerer de områder på dækslippen, hvor dobbeltlaget ikke er dannet. β-kasein 3x vaskes af med 1x KMEH som beskrevet i trin 2.2.3. og bringe bufferniveauet tilbage til 100 μL-mærket.
  3. Tilsætning af membran-actin linker
    1. Under inkubationen af β-kasein (trin 2.2.5.) tages en alikvote af membran-actinlinkerprotein ud fra -80 °C, optøes hurtigt ved 37 °C, og derefter opbevares den på is. Aliquoten fortyndes med proteinfortyndingsbuffer til en koncentration på 1 μM.
    2. Tilsæt linkerproteinet i en defineret slutkoncentration (typisk 5-20 nM) og bland forsigtigt. For at sikre en hurtig ligevægt af proteinet i kammeret tilsættes volumener, der er større end 20 μL ved at blande linkerproteinet med 1x KMEH.
    3. Inkuberes i 40 minutter ved stuetemperatur. Vask 3x med 1x KMEH-buffer for at fjerne det ubundne HSE-protein (som i trin 2.2.3.). Bufferniveauet i hvert kammer bringes tilbage til 100 μL-mærket. Prøven er nu klar til billedbehandling.
  4. Kvalitetsvurdering af lipiddobbeltlaget
    BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin, der ikke skal udføres hver gang. Vi anbefaler, at denne vurdering udføres, hver gang friske SUV'er fremstilles af frosne MLV-lagre.
    1. Tænd mikroskopet, excitationslaserne og detektionskameraerne. Sørg for, at laseren er justeret, at målet er renset, og at softwaren er klar til at hente billeder.
    2. Sæt olie på 100x målet, monter prøven på mikroskoptrinnet, og fokuser målet på dobbeltlaget. Sørg for, at laserpositionen er sådan, at den gennemgår total intern refleksion på prøven. Brug en 488 nm excitationslaser til at kontrollere fluorescensintensitetsfordelingen af den dobbeltlagsbundne 10xHis-YFP-EzrinABD.
      BEMÆRK: Dobbeltlag af god kvalitet viser en storstilet, ensartet fordeling af fluorescensintensitet. Dårlige dobbeltlag viser intense og ujævne fluorescerende pletter.
    3. For at bestemme dobbeltlagets integritet skal du udføre et FRAP-assay.
      1. Vælg et interesseområde på dobbeltlaget, og optag et par billeder af synsfeltet ved hjælp af billeddannelsesforhold, der giver et signal/støj-forhold på 5: 1 eller højere. Sæt optagelsen på pause, og luk feltmembranen på TIRF-mikroskopet for at fokusere en koncentreret laserstråle på et lille cirkulært område af dobbeltlaget for lokalt at blegge fluorophorerne.
      2. Tænd laseren til dens maksimale output for at fotoblege det lille område i 3-10 sekunder, og sluk derefter laseren. Åbn feltmembranen igen til dens oprindelige radius, juster billedtilstanden tilbage til (forblegemiddel) indstillinger, og genoptag straks gendannelsen af fluorescerende signal i synsfeltet.
    4. Kontroller, om dobbeltlaget er flydende. Gode dobbeltlag med normal lateral diffusion kommer sig hurtigt, mens dårlige dobbeltlag kommer sig langsomt eller slet ikke kommer sig (figur 3). Hvis dobbeltlaget ikke gendannes, skal du kontrollere fejlfindingsafsnittet og genstarte. Gem billederne som 16-bit TIFF-filer. For en kvantitativ estimering af diffusionskoefficienten skal du kontrollere trin 3. under.
  5. Polymerisation af fluorescerende actin
    BEMÆRK: For at spare tid skal du begynde at polymerisere actin under inkubationstiden for HSE-proteinbindingen til dobbeltlaget (trin 2.3.) eller under kvalitetsvurderingen af dobbeltlaget (trin 2.4.).
    1. Bland umærket og fluorescerende mærket G-actin i et 10: 1 molært forhold og fyld det op med G-buffer, så koncentrationen af G-actin er 20 μM. Koncentrationen, ved hvilken actin endelig polymeriseres, vil være 1/4 af denne værdi. Tilsæt 1/10 10x ME-buffer til blandingen til en 1x opløsning og inkuber i 2 min. Dette trin erstatter Ca 2+ ionerne bundet til G-actin med Mg2+ ioner. Sørg for, at det endelige volumen er i multipla af 10 μL.
    2. Tilsæt den ønskede mængde capping protein som følger. Optø hurtigt et hætteglas med capping proteinlager ved 37 ° C, og hold det derefter på is. Fortynd med G-buffer, således at koncentrationen af capping-protein nu er dobbelt så stor som den ønskede endelige koncentration i polymerisationsblandingen. Der tilsættes et tilsvarende volumen af den fortyndede capping-proteinopløsning til actinblandingen fra trin 2.5.1.
    3. Til sidst tilsættes et tilsvarende volumen frisk 2x målbuffer til reaktionsblandingen. Det endelige volumen af opløsningen skal være fire gange volumenet af actinblandingen ved afslutningen af trin 2.5.2. Sørg for, at den endelige koncentration af KMEH er 1x, af ATP er 1 mM, af BSA er 1 mg / ml, og af G-actin er 5 μM.
      Inkuberes i mørke ved 25 °C i 45-60 minutter for at tillade polymerisation at ske.
      BEMÆRK: Dette kaldes målbufferstrategien, hvor et volumen Mg2+ G-actin (trin 2.5.1.) blandes med et volumen capping proteinblanding (trin 2.5.2.) og to volumener 2x målbuffer (trin 2.5.3.). Dette gør det lettere at skalere mængden af actin op eller ned og ændre den relative koncentration af capping protein (eller enhver anden actin modulator; Figur 4).
  6. Tilsætning af fluorescerende actinfilamenter
    1. Klip et par 200 μL spidser med et skarpt blad eller en saks for at gøre dem stumpe endte. Der udledes forsigtigt det krævede volumen af 5 μM polymeriseret actin (fra trin 2.5.3.) med en stump pipettespids (for at forhindre klipning af actinfilamenter), og der tilsættes det til et rent autoklaveret PCR-rør.
    2. Tilsæt 1x KMEH til røret for at gøre volumen >20 μL og bland forsigtigt for at undgå klipning af F-actin. Fra det monterede prøvekammer fjernes et lige stort volumen af bufferen.
    3. Tilsæt den polymeriserede actinopløsning til kammeret og pipetter forsigtigt op og ned 3x uden at røre dobbeltlaget i bunden. Dette gør det muligt for actinfilamenter at fordele ensartet på dobbeltlaget. Prøven monteres på TIRF-mikroskopet (se trin 2.4.1 og trin 2.4.2).
    4. Man kan registrere processen med F-actinbinding til dobbeltlaget. Inkuberes i 20-30 min. Optag et par billeder fra forskellige synsfelter, efter at F-actin desuden har nået en stabil tilstand. Overhold ændringer i den rumlige organisation af 10xHis-YFP-EzrinABD før (homogen) og efter actinorganisation.
      BEMÆRK: HYE er ensartet fordelt over lipiddobbeltlaget i fravær af actin. Ved tilsætning af actinfilamenter colocalizes HYE med F-actin. Omfanget af colokalisering afhænger af linkerproteinets actinbindende affinitet; jo stærkere affinitet, jo højere er kolokaliseringen og jo langsommere linkerproteinets laterale mobilitet (figur 5).
  7. Tilsætning af myosin II
    1. Efter 30 minutters actinkubation monteres prøven tilbage på mikroskopet (hvis den ikke blev monteret). Kontroller signalet i linkerprotein- og F-actinkanalerne. Juster billeddannelsesbetingelserne, hvis det er nødvendigt.
    2. Vælg et godt område med ensartet linkerproteinsignal og ensartet spredte actinfilamenter og ingen artefakter til en lang time-lapse-optagelse. Optag 10-15 billeder ved 0,1-0,2 Hz før myosintilsætning, og sæt optagelsen på pause. Pipetter den nødvendige mængde genanvendt muskelmyosin-II ud af hætteglasset med en stump pipettespids (for at forhindre klipning af myosinfilamenter) og tilsæt til et rent autoklaveret PCR-rør.
    3. Tilsæt straks 1x KMEH til røret for at gøre volumen >20 μL og bland forsigtigt. Man kan også tilføje ATP, ATP-regenererende mix, fotostabiliserende midler osv. i løbet af dette trin. Fjern forsigtigt et lige stort volumen af bufferen fra det monterede prøvekammer uden at forstyrre det.
    4. Tilsæt forsigtigt myosinopløsningen til prøvekammeret. Pipetter ikke op og ned, da det vil forstyrre de overfladebundne filamenter. Genoptag straks time-lapse-registreringen og observer systemet, når det udvikler sig fra præ-myosin-tilstanden til ATP-drevne kontraktile acto-myosinstrømme og asterdannelse til en ATP-udtømt fastklemt tilstand (se repræsentative resultater).
    5. Tag baggrundsbilleder for alle kanaler ved hjælp af en bufferprøve. Gem alle billederne som 16-bit .tiff filer. Se tabel 2 for tip til løsning af almindelige problemer.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsvurdering af dobbeltlagene med hurtig FRAP-analyse. Understøttede lipid dobbeltlag (SLB'er) fremstillet af DOPC og Ni-NTA lipider (98: 2 mol%) er belagt med HYE (10xHis-YFP-mærket membran-actin linker). Efter at det ubundne protein er vasket ud, afbildes det fluorescerende dobbeltlag under et TIRF-mikroskop. Et lille område på dobbeltlaget er fotoblecheret med høj lasereffekt, og genvindingen af fluorescens registreres. (A) Et godt dobbeltlag genoprettes altid hurtigt med en forventet diffusionskoefficient på 1-1,5 μm2/s for den lipidsammensætning, der anvendes i dette tilfælde. (B) Dårlige dobbeltlag kommer sig meget langsomt eller kommer sig slet ikke. (C) Repræsentative billeder af dårlige dobbeltlag: (C-i) et dobbeltlag med huller, (C-ii) et dobbeltlag med store, immobile lipidpletter og (C-iii) et dobbeltlag med små, immobile prikker. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skematisk, der viser, hvordan man polymeriserer actin ved hjælp af målbuffermetoden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Rumlig organisering af HYE ved binding til F-actin. TIRF-snapshots, der viser den rumlige organisering af HYE før og efter tilsætning af actinfilamenter (mærket med Atto-635 maleimid). HYE-organisationen er homogen før tilføjelsen af F-actin og bliver colokaliseret og coaligned langs actinfilamenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Dataanalyse

  1. Brug Fiji-software (https://imagej.net) til at trække baggrunden fra linkerproteinbillederne (fra trin 2.4.). Middelintensitetsværdierne måles fra det blegede sted og et referenceområde.
  2. Normaliser tidssporene fra det blegede sted og referenceområdet til intensiteten af deres respektive intensitetsværdier før blegning. Divider hvert tidspunkt i de normaliserede værdier for bleget område med de respektive tidspunkter i det normaliserede referenceområdes tidsspor. Korriger det resulterende normaliserede tidsspor for baggrund og for eventuelle systematiske udsving i intensitet under erhvervelse (global fotobleaching, z-drift osv.).
    1. Brug en tilpasningsfri, manuel metode28 til at estimere diffusionskoefficienten for de tolags bundne proteiner. Kort fortalt kan halvtiden for gendannelsesprofilen, τ1/2, beregnes ved at se på det tidspunkt, hvor den normaliserede gendannelsesprofil når halvdelen af sin stabile tilstand:
      Equation 1
      Her er F 0 middelintensiteten i det blegede område i den første ramme efter fotoblegning, og F∞ er den langsigtede steady state-værdi af genvinding af dobbeltlaget.
    2. Anslå den effektive blegemiddelradius, re, en parameter, der korrigerer for diffusion under fotoblegning, fra en linjescanning af postblegemiddelpletprofilen29. Den halve bredde ved halvt minimum af denne linjescanning, der passerer gennem midten af blegemiddelstedet, r1/2, vedrører re som følger:
      Equation 2
      τ1/2 beregnet i trin 2.8.3., r e beregnet i trin 2.8.4., og den oprindeligt indstillede blegemiddelradius, rn, bruges til at beregne diffusionskoefficienten (D) ved hjælp af følgende formel:
      Equation 3
  3. Billedanalyse af actomyosin asters
    1. Brug Fiji til at trække baggrunden fra alle de optagede billeder i alle kanalerne. Korriger billederne for ethvert ikke-ensartet belysnings- eller interferensmønster ved hjælp af fladfeltkorrektion.
      BEMÆRK: Man kan bruge farvede plastikdias, som er gode flade prøver til at foretage sådanne korrektioner. For linkerproteinet og actinfilamenterne på et plant dobbeltlag kan man også bruge den gennemsnitlige projektion af flere præmyosinbilleder til at oprette kanalspecifikke belysningskorrektionskort.
      1. For HYE-kanalen, der vises her, skal du tage en gennemsnitlig intensitetsprojektion af flere HYE-billeder (optaget fra forskellige regioner i lipiddobbeltlaget før myosintilsætning). Anvend et passende gaussisk filter (σ = 50 pixels til 80 pixels) på den gennemsnitlige projektion (fra præ-myosinbilleder eller en hvilken som helst standard flad prøve).
      2. Konverter det filtrerede billede til et 32-bit billede. Opdel alle pixelværdierne med gennemsnittet af hele billedet. Dette vil give et normaliseret korrektionskort for HYE-kanalen. Opdel alle billederne i HYE-kanalen med dette kort til korrektion af fladt felt. Opret korrektionskort for andre kanaler ved hjælp af den samme strategi.
    2. Korrekt for fotoblegning ved hjælp af en eksponentiel eller simpel forholdsmetode (afhængigt af intensitetshenfaldsprofilen) i Fiji.
      1. For at korrigere for enhver tidsmæssig x-y-fejljustering (translationel bevægelse) skal du flette alle de fotobleach-korrigerede kanaler til en enkelt Hyperstack. Brug Hyperstack-Reg-pluginet i Fiji til at anvende en stiv krops- eller oversættelsestransformation.
      2. Til sidst skal du opdele den justerede Hyperstack i individuelle kanaler og gemme dem separat som 16-bit TIFF-stakke til yderligere analyse.

Representative Results

Til repræsentation vises her en typisk postblegemiddelprofil fra 1. billede efter fotoblegning (billede ved t = 0 s i figur 3A) og dets pasform til følgende funktion28 (se figur 6A):

Equation 4

Værdien af r e (23,94 μm) beregnet ved tilpasning til denne kurve svarer meget til re beregnet i trin 2.8.4. (23,24 μm). Her er K en blegemiddeldybdeparameter, der kan estimeres direkte fra F0 (beskrevet i trin 2.8.4.). Tilsvarende viser figur 6B genoprettelsesprofilen og dens tilpasning til følgende funktion28:

Equation 5

Vi finder, at den tilpassede værdi af diffusionskoefficienten er 1,34 μm 2/s, en værdi, der er tæt overensstemmelse med værdien på 1,39 μm 2/s, der beregnes ved hjælp af formlen i trin2.8.4. Her står MF for den mobile fraktion af lipiddobbeltlaget, der repræsenterer den brøkdel af den blegede befolkning, der kommer sig tilbage. Mobiliteten af lipidforankrede molekyler afhænger naturligvis af lipidsammensætningen og dens fysiske tilstand (væske- eller gelfase). For vores eksperimenter med DOPC-baserede lipidmembraner skal mobiliteten være >1 μm2/s, og den mobile fraktion bør ikke være mindre end 0,9 for at indikere et godt lipiddobbeltlag. Vi anbefaler brugen af den manuelle monteringsfri metode til en hurtig test af dobbeltlagets kvalitet og mobilitet. Tilpasningsmetoden kan være nyttig, mens analysen automatiseres for mange FRAP-kurver. Yderligere, hvis man ønsker at udføre et mere sofistikeret FRAP-eksperiment for systematisk at karakterisere diffusion i systemet, anbefaler vi læseren til denne anmeldelse fra Lorén et al.30 for flere detaljer om monteringsmodeller og potentielle faldgruber i eksperimentelt design.

Figure 6
Figur 6: Kvantificering af diffusionskoefficienten for lipiddobbeltlag. (A) Linjeprofil for det første billede efter fotoblegning (t = 0 s i figur 3A) og dets egnethed til ligning 4 for at beregne den effektive blegemiddelradius. (B) Genfindingsprofilen for det blegede område og dets egnethed til ligning 5 til beregning af diffusionskoefficienten og mobilfraktionen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Et typisk resultat af de ovenfor beskrevne eksperimenter, der viser den dynamiske samling og organisering af et acto-myosin-netværk forbundet på et understøttet lipiddobbeltlag afbildet af TIRF-mikroskopi, er afbildet i figur 7 og supplerende video S1.

Figur 7 viser en billedmontage af linkerproteinet, F-actin og myosin-II.

Figure 7
Figur 7: Kontraktile actomyosinstrømme driver lokal klyngedannelse af membran-actin-linkerproteinet HYE. TIRF-snapshots af HYE (YFP-mærket), actinfilamenter (mærket med Atto-635 maleimid) og myosin II-filamenter (mærket med Atto-565 maleimid) ved tilsætning af myosin II til en SLB indeholdende HYE og F-actin. Tiden er angivet øverst: 0 min er umiddelbart før fluorescerende myofilamenter begyndte at dukke op i TIRF-feltet. HYE og F-actin fordeles homogent over lipiddobbeltlaget inden myosintilsætning (0 min). Myosinaktivitet inducerer kontraktile actomyosinstrømme, som dukker op i asterlignende strukturer ved steady state (15 min), hvilket driver lokal klyngedannelse af den koblede membrankomponent (HYE). Den nederste række er en sammensmeltning af actin (gul) og myosin II (magenta) billeder, der viser organisationen af actin og myosin på forskellige tidspunkter. Billederne, der blev brugt til at lave disse montager, blev korrigeret i Fiji for baggrundssignal, ikke-ensartede intensitetsmønstre og translationel bevægelse. Skala bar = 10 μm. For detaljer, se Supplerende Video S1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Buffer navn Sammensætning
Lipid rehydrering buffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% saccharose, pH 7,5
SLB-formationsbuffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6
SLB Opbevaring buffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2
Buffer til proteinfortynding 20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP eller DTT, pH 7,2
1X ME- eller Actin-ionbytterbuffer 50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (opbevares ved 4 °C)
1X KMEH eller Actin polymerisationsbuffer 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2
100 mM ATP-materiel 100 mM ATP dinatriumsalt, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (opbevares ved -20 °C)
2x målbuffer 2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (opbevares ved 4°C)
G-buffer 2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (opbevares ved 4 °C)
Myosin II buffer 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0
Gelfiltreringskromatografibuffer 50 mM Tris-HCI, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5
Buffer til opbevaring af protein 10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glycerol

Tabel 1: Liste over buffersammensætninger anvendt i denne protokol.

Almindelige problemer og fejlfinding af dem Problem Årsag Mulige løsninger
1 Lipid dobbeltlag viser ingen diffusion Den mest sandsynlige årsag til dette problem er snavset dækglas, der kan ske, når rengøringsopløsningen er ældet, eller opvarmningen ikke fandt sted under badsonikering. Disse dobbeltlag har et 'vesikulært' udseende, fordi de sprængte vesikler klæber til dækglasset, men ikke smelter sammen med hinanden. Brug af MLV'er, der er ældre end 6 uger eller SUV'er, der er ældre end 6 dage, eller tilføjelse af lave mængder SUV'er kan også føre til vesikulær tolagsdannelse. Brug frisk rengøringsopløsning. Sørg for, at varmeapparatet er tændt, og at temperaturen er mellem 45-65 °C. Brug friske lipidblandinger. (Brug af en fluorescerende lipidsonde versus en fluorescerende proteinsonde kan undertiden manifestere sig forskelligt. Hvis dobbeltlaget f.eks. har subdiffraktionsdefekter, og overfladepassiveringstrinnet springes over (eller ikke virker), vil lipidsonden vise en ensartet intensitetsfordeling, men den fluorescerende proteinsonde kan vise lyse fluorescerende pletter.)
2 Lipid dobbeltlag har lyse pletter Lang inkubation af SUV'er til tolagsdannelse kan skabe et lipiddobbeltlag, der generelt er diffust, men med lejlighedsvis lyse pletter. Disse patches kan være flerlags dobbeltlag, der kan tiltrække store mængder fluorescerende sonde. 15-20 minutters inkubation med SUV'er er nok. Sørg for, at sonden ikke aggregerer: et hurtigt hårdt spin af linkerproteinet (300 x g i 15 minutter ved 4 °C) kan fjerne aggregaterne
3 Lipid dobbeltlag har mørke huller Dette sker, når dobbeltlaget er lavet af gamle SUV'er og afbildet i længere tid (> 4 timer efter dannelsen), eller opløsningens pH ændres drastisk på grund af langvarig billeddannelse (f.eks. i høj ATP-tilstand og i nærværelse af visse iltrensningsanlæg), eller når overfladen er over-passiveret med beta-kasein (tilføjer for meget beta-kasein i mere end 10-15 minutter og eller ikke vasker det ud). Brug friske lipider. Reducer billedbilledhastigheden eller den effektive laserbelysningstid. Brug buffere med højere bufferkapacitet.
4 Lipid dobbeltlag viser langsom diffusion Lipid dobbeltlag med høj procentdel af kolesterol, lange mættede lipider eller ladede lipider diffunderer langsommere. I sådanne tilfælde skal du forberede din prøve ved en høj temperatur. Man kan også bruge en simpel, testet lipidsammensætning som en kontrol sammen med komplekse og uprøvede lipidsammensætninger. Sørg for, at glasset er rent.
5 Actin polymeriserer ikke Målbuffer er gammel, G-actin-lager er for gammelt, gammelt og nyt G-actin blev co-polymeriseret. Sørg for, at Ca 2+ erstattes af Mg2+ før polymerisation (ved hjælp af ME-buffer). Brug frisk ATP-Mg2+ lager. Brug friskgenanvendt G-actin. Sørg for, at koncentrationen af F-actin (i form af G-actin) tilsat dobbeltlaget er højere end 0,2 μM. For lavere koncentrationer, brug phalloidin stabiliseret F-actin.
6 Actin er ikke bundet til dobbeltlaget Membran-actin-linker tilsættes eller tilsættes ikke ved meget lav koncentration - dette kan udledes af fluorescensen af linkerproteinet. Hvis fluorescensen er anstændig, har membran-actin-linkeren mistet actinbindende kapacitet. Hvis linkerproteinet ikke er specifikt bundet til glasoverfladen (når dobbeltlaget er dårligt), rekrutterer det muligvis ikke actinfilamenter. Sørg for, at dobbeltlaget diffunderer. Brug frisk linkerprotein
7 Fluorescerende F-actinsignal er svagt Forholdet mellem mærket og mørk actin er for lavt. Enten er den mærkede actin eller den umærkede actin for gammel, og de copolymeriserer ikke med hinanden. Genbrug actin igen, og prøv ploymeriseringen igen med friskgenanvendt actin. Fotoskade kan ødelægge eller depolymerisere F-actin; Brug om muligt røde eller langt røde farvestoffer til actin (og myosin).
8 Myosin viser ikke kontraktilitet det kan observeres, at efter tilsætning af ATP til det myosin-infunderede system er der ingen kontraktilitet af acto-myosin. Kontroller, om myosinkoncentrationen eller renhedsniveauet er godt. Brug frisk genanvendt myosin (brug inden for 6 uger efter genbrug). Tilføjelse af frisk ATP til myosinblandingen kan hjælpe. Afgasning af buffere og brug af iltfangere osv. kan reducere fotoskader af motorerne.  Yderligere oplysninger kan findes i protokollerne fra Plastino et al. eller Stam et al. af samme metodesamling
9 Coverglass er ikke hydrofilt Coverglass rengøres ikke ordentligt. Rent hydrofilt dækglas er afgørende for dannelsen af lipiddobbeltlag. En nyttig, visuel aflæsning af dækglassets hydrofilicitet efter rengøringsprotokollen er at observere befugtningen af glasset med vand. Tilsæt en lille mængde vand til en fladt liggende dækslip. Vandet forbliver i form af en rund dråbe, hvis dækslet ikke rengøres ordentligt. Imidlertid spredes den samme mængde vand ud og danner et tyndt lag på et behandlet hydrofilt dækglas. Denne befugtningsadfærd af vandet på dækglasoverfladen kan bruges til at fastslå, om rengøringstrinnene med rengøringsopløsningen / NaOH har fungeret.

Tabel 2: Fejlfindingsvejledning, der opsummerer almindelige problemer og tilsvarende løsninger.

Supplerende Video S1: Kontraktile actomyosinstrømme driver lokal klyngedannelse af membran-actin-linkerproteinet HYE. TIRF-timelapse af HYE (YFP-mærket), actinfilamenter (mærket med Atto-635 maleimid) og myosin II-filamenter (mærket med Atto-565 maleimid) ved tilsætning af myosin II til en SLB indeholdende HYE og F-actin. Tiden er angivet øverst: 0 min er umiddelbart før fluorescerende myofilamenter begyndte at dukke op i TIRF-feltet. Skala bar = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol præsenterer en alsidig platform og et udgangspunkt for at designe eksperimenter til at studere membran-cortex-grænsefladen mellem celler. Kritiske trin er forberedelsen af rene glasglas ved hjælp af friske lipider til effektiv SUV-dannelse (begge påvirker kvaliteten af SLB'er) og brugen af friskgenanvendte myosin II-proteiner til dynamisk omorganisering af actinfilamenter. Ved billeddannelse af dynamik over lang tid er det meget vigtigt at inkorporere et iltrensningssystem (f.eks. Protocatechuinsyre og protocatechuat 3 4-dioxygenase 5,31).

Det åbne kammerdesign tillader sekventiel tilføjelse af komponenter til et eksisterende system uden at inducere lipidstrømme. Dette kan være en vigtig fordel i forhold til almindeligt anvendte, lukkede kammertilgange eller arbejde ved hjælp af indkapslede proteiner i liposomer36. Modstridende virkninger såsom proteininduceret membrandeformation kan ikke undersøges med glasadsorberede lipiddobbeltlag.

Lipiddobbeltlagene kan dannes med en bred vifte af lipidsammensætninger. Det begynder med adsorption af lipidvesiklerne til den hydrofile glasoverflade efterfulgt af enten spontan vesikelbrud på grund af overflade-vesikel og direkte vesikel-vesikelinteraktioner eller de adsorberede vesikler, der når en kritisk dækning, hvorefter en lille brøkdel af vesikler brister og danner aktive kanter, hvilket til sidst fører til dobbeltlagsdannelsen32 . Udover glas kan forskellige substrater bruges til at danne understøttede lipiddobbeltlag, såsom glimmer (f.eks. Til atomkraftmikroskopi), bløde substrater (f.eks. Poly-di-methyl-siloxan), polymerpuder33,34,35, der spænder mellem huller i elektronmikroskopigitter 14. Droplet interface dobbeltlag er en anden interessant metode til at skabe stabile, fritstående lipid dobbeltlag36. Inkluderingen af acto-myosin-netværk i vesikler eller emulsioner er en meget kraftfuld metode til at studere dette minimale system i en cellelignende geometri37,38, og som er beskrevet detaljeret andetsteds 39.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af AXA-forskningsfonden og Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) for DVK, NCBS-TIFR for AB og ST og Wellcome-DBT Margdarshi-stipendiet (IA/M/15/1/502018) for SM. DVK vil også gerne takke Biophysical Society for at muliggøre den virtuelle netværksbegivenhed "Udfordringer med at forstå multikomponent cytoskeletale netværk fra molekylær til meso-skala", hvilket bidrog til oprettelsen af denne protokolsamling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) Avanti Polar Lipids 810158 16:0 RhoPE
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404 DGS-NTA-Ni2+
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375 DOPC
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850355 DPPC
Amber glass vials ThermoFisher B7990-2A
ATP disodium salt Sigma Aldrich A26209
Attofluor cell chamber ThermoFisher A7816
Bath sonicator GT Sonic 1860QTS
beta-casein Sigma Aldrich C6905
CaCl2 ThermoFisher 12135
chloroform Sigma Aldrich 650471 alternatively from Electron Microscopy Sciences, 50980296
Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal Harvard Apparatus 64-0705B
Cover slips, #1, 40x22 mm, Gold Seal ThermoFisher 48404-031
EDTA ThermoFisher G12635
EGTA Himedia MB130
Gas tight glass syringes, with removebla needle, blunt, volumes 10 µL, 100 µL, 500 µL Hammilton 1700 series
Hellmanex III Hellma Analytics Z805939 cleaning solution
HEPES Himedia RM380
KaH2PO4 ThermoFisher G13405
KCl ThermoFisher G13305
KOH ThermoFisher G26708
Lipid extruder Avanti Polar Lipids 61000-1EA
MgCl2 ThermoFisher G15535
Microtip sonicator Sonics VC750 3 mm Tip diameter
Na2CO3 ThermoFisher G15955
NaCl Himedia GRM853
NaH2PO4 ThermoFisher G15825
NaOH ThermoFisher G27815
Nikon Ti Eclipse TIRF microscope Nikon With a TIRF unit connected through a polarization-conserving optical fibre to an Agilent monolithic laser combiner MLC400 with multiple laser lines with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512)
NOA88 Norland Products 8801
PTFE Coated Tweezer Style #2A Structure Probe 0S2AT-XD
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5424R
Sucrose ThermoFisher G15925
UV-illuminator Novascan PSD PRO-UV needs vacuum and O2 supply

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Köster, D. V., Mayor, S. Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined. Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).
  2. Rao, M., Mayor, S. Active organization of membrane constituents in living cells. Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).
  3. Honigmann, A., et al. A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes. eLife. 3, 01671 (2014).
  4. Das, A., et al. Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex. Science Advances. 6 (11), (2020).
  5. Köster, D. V., et al. Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).
  6. Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. The design of MACs (minimal actin cortices). Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).
  7. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Reconstitution of contractile actomyosin arrays. Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).
  8. Mosby, L. S., et al. Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy. Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).
  9. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 4948 (2018).
  10. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7, 12615 (2016).
  11. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, 00116 (2013).
  12. Ditlev, J. A., et al. A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin. eLife. 8, 42695 (2019).
  13. Banjade, S., Rosen, M. K. Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors. eLife. 3, 04123 (2014).
  14. Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex. Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).
  15. Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex. eLife. 6, 24350 (2017).
  16. Block, S. Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers. Biomolecules. 8 (2), 30 (2018).
  17. JoVE, JoVE. JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
  18. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).
  19. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  20. Pollard, T. D. Myosin purification and characterization. Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).
  21. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
  22. Bieling, P., et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).
  23. Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro. PLoS One. 10 (4), 0123428 (2015).
  24. Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
  25. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, 5412 (2014).
  26. Selden, N. S., et al. Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).
  27. Seu, K. J., et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  28. Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data. Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).
  29. Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes. Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).
  30. Lorén, N., et al. Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).
  31. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).
  32. Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).
  33. Lin, W. -C., et al. Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology. Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).
  34. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  35. Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing. Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).
  36. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  37. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2022).
  38. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), e63332 (2021).
  39. Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2022).

Tags

Biologi udgave 185
Rekonstitution af membranbundne minimale actin-kortika på understøttede lipiddobbeltlag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Köster, D. V., Bhat, A.,… More

Köster, D. V., Bhat, A., Talluri, S., Mayor, S. Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (185), e63968, doi:10.3791/63968 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter