Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Fange kromosomkonformasjon på tvers av lengdeskalaer

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64001
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Systems Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Howard Hughes Medical Institute

Summary

Hi-C 3.0 er en forbedret Hi-C-protokoll som kombinerer formaldehyd og disuccinimidylglutaratkryssbindinger med en cocktail av DpnII- og DdeI-restriksjonsenzymer for å øke signal-til-støy-forholdet og oppløsningen av kromatininteraksjonsdeteksjon.

Abstract

Kromosomkonformasjonsfangst (3C) brukes til å oppdage tredimensjonale kromatininteraksjoner. Vanligvis brukes kjemisk tverrbinding med formaldehyd (FA) for å fikse kromatininteraksjoner. Deretter konverterer kromatinfordøyelse med et restriksjonsenzym og påfølgende religering av fragmentender tredimensjonal (3D) nærhet til unike ligeringsprodukter. Til slutt, etter reversering av tverrbindinger, proteinfjerning og DNA-isolasjon, blir DNA kuttet og forberedt på sekvensering med høy gjennomstrømning. Frekvensen av nærhetsligering av par av loci er et mål på frekvensen av deres colocalization i tredimensjonalt rom i en cellepopulasjon.

Et sekvensert Hi-C-bibliotek gir genomomfattende informasjon om interaksjonsfrekvenser mellom alle par loci. Oppløsningen og presisjonen til Hi-C er avhengig av effektiv tverrbinding som opprettholder kromatinkontakter og hyppig og jevn fragmentering av kromatinet. Dette papiret beskriver en forbedret in situ Hi-C-protokoll, Hi-C 3.0, som øker effektiviteten av tverrbinding ved å kombinere to tverrbindinger (formaldehyd [FA] og disuccinimidylglutarat [DSG]), etterfulgt av finere fordøyelse ved bruk av to restriksjonsenzymer (DpnII og DdeI). Hi-C 3.0 er en enkelt protokoll for nøyaktig kvantifisering av genomfoldingsfunksjoner på mindre skalaer som løkker og topologisk assosierende domener (TADs), samt funksjoner på større kjerne-brede skalaer som rom.

Introduction

Kromosomkonformasjonsfangst har blitt brukt siden 20021. I utgangspunktet er hver konformasjonsfangstvariant avhengig av fiksering av DNA-protein og protein-protein-interaksjoner for å bevare 3D-kromatinorganisasjon. Dette etterfølges av DNA-fragmentering, vanligvis ved restriksjonsfordøyelse, og til slutt slutter religering av nærliggende DNA for å konvertere romlig proksimale loci til unike kovalente DNA-sekvenser. Innledende 3C-protokoller brukte PCR for å prøve spesifikke "en-til-en" interaksjoner. Påfølgende 4C-analyser tillot påvisning av "en-til-alle" interaksjoner2, mens 5C oppdaget "mange-til-mange" interaksjoner3. Kromosomkonformasjonsfangst kom til full utførelse etter implementering av neste generasjon, høy gjennomstrømningssekvensering (NGS), som tillot påvisning av "alle-til-alle" genomiske interaksjoner ved bruk av genom-bred Hi-C4 og sammenlignbare teknikker som 3C-seq5, TCC6 og Micro-C 7,8 (se også gjennomgang av Denker og De Laat9).

I Hi-C brukes biotinylerte nukleotider for å markere 5 'overheng etter fordøyelsen og før ligering (figur 1). Dette gjør det mulig å velge riktig fordøyde og religerte fragmenter ved bruk av streptavidinbelagte perler, og skille den fra GCC10. En viktig oppdatering av Hi-C-protokollen ble implementert av Rao et al.11, som utførte fordøyelsen og religasjonen i intakte kjerner (dvs. in situ) for å redusere falske ligeringsprodukter. Videre reduserte erstatning av HindIII-fordøyelse med MboI (eller DpnII) fordøyelse fragmentstørrelsen og økte oppløsningspotensialet til Hi-C. Denne økningen tillot påvisning av relativt småskala strukturer og en mer presis genomisk lokalisering av kontaktpunkter, for eksempel DNA-løkker mellom små cis-elementer, for eksempel løkker mellom CTCF-bundne steder generert av sløyfeekstrudering11,12. Dette potensialet kommer imidlertid til en pris. For det første krever en todobling av oppløsningen en firedobling (22) økning i sekvensering av13. For det andre øker de små fragmentstørrelsene muligheten for å forveksle ufordøyd nabofragment med fordøyde og religerte fragmenter14. Som nevnt, i Hi-C, er fordøyde og religerte fragmenter forskjellig fra ufordøyd fragmenter ved tilstedeværelse av biotin ved ligeringskrysset. Imidlertid er det nødvendig med riktig biotinfjerning fra uligerte ender for å sikre at bare ligeringskryss trekkes ned14,15.

Med den reduserte kostnaden for NGS blir det mulig å studere kromosomfolding i større detalj. For å redusere størrelsen på DNA-fragmenter, og dermed øke oppløsningen, kan Hi-C-protokollen tilpasses for å bruke oftere kutte restriksjonsenzymer16 eller å bruke kombinasjoner av restriksjonsenzymer17,18,19. Alternativt kan MNase 7,8 i Micro-C og DNase i DNase Hi-C20 titreres for å oppnå optimal fordøyelse.

En nylig systematisk evaluering av det grunnleggende ved 3C-metoder viste at deteksjonen av kromosomfoldingsfunksjoner ved hver lengdeskala forbedret seg kraftig med sekvensiell tverrbinding med 1% FA etterfulgt av 3 mM DSG17. Videre var Hi-C med HindIII-fordøyelse det beste alternativet for å oppdage store foldefunksjoner, for eksempel rom, og at Micro-C var overlegen til å oppdage småskala foldefunksjoner som DNA-løkker. Disse resultatene førte til utviklingen av en enkelt, høyoppløselig "Hi-C 3.0" -strategi, som bruker kombinasjonen av FA- og DSG-tverrbindinger etterfulgt av dobbel fordøyelse med DpnII og DdeI-endonukleaser21. Hi-C 3.0 gir en effektiv strategi for generell bruk fordi den nøyaktig oppdager foldefunksjoner på tvers av alle lengdeskalaer17. Den eksperimentelle delen av Hi-C 3.0-protokollen er detaljert her, og typiske resultater som kan forventes etter sekvensering vises.

Figure 1
Figur 1: Hi-C-prosedyre i seks trinn. Celler fikses først med FA, og deretter DSG (1). Deretter går lysis foran en dobbel fordøyelse med DdeI og DpnII (2). Biotin tilsettes ved overhengsutfylling og proksimale stumpe ender ligeres (3) før DNA-rensing (4). Biotin fjernes fra unligated ender før sonikering og størrelsesvalg (5). Til slutt tillater nedtrekk av biotin adapterligering og bibliotekforsterkning ved PCR (6). Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; B = Biotin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Fiksering ved kryssbinding

  1. Formaldehydfiksering: starter fra celler i monolag
    1. Få celler sådd i passende medium for å høste 5 × 106 celler per 150 mm plate.
      MERK: Brukere kan velge hvilken som helst foretrukket beholder som sikrer optimal vekst av enhver pattedyrcellelinje. I tillegg kan celler isoleres fra vev.
    2. Aspirer mediet med en Pasteur-pipette koblet til en vakuumfelle fra 150 mm plate, vask 2x med ~10 ml HBSS.
    3. Umiddelbart før tverrbinding, lag en 1% FA tverrbindingsløsning i et 50 ml rør ved å kombinere 22,5 ml HBSS og 625 μL 37% FA til en endelig 1% konsentrasjon. Bland forsiktig ved å rocke.
      FORSIKTIG: Bruk avtrekksvifte; formaldehyd er giftig.
    4. For å kryssbinde cellene, hell 23.125 ml av 1% FA-løsningen til hver 15 cm plate.
    5. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter og vugg platene forsiktig for hånd hvert 2. minutt.
    6. Tilsett 1,25 ml 2,5 M glycin (128 mM endelig) og virvle platen forsiktig for å slukke tverrbindingsreaksjonen.
    7. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter og fortsett inkubasjonen på is i minst 15 minutter for å stoppe tverrbindingen.
    8. Skrap cellene fra platene med en celleskrape eller gummipolitimann.
    9. Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml konisk rør med en pipette. Sentrifuge ved 1000 × g i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten ved aspirasjon.
    10. Vask cellepelleten en gang med 10 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS), ved hjelp av en pipet for å resuspendere. Sentrifuger deretter ved 1000 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Fortsett umiddelbart til DSG tverrbinding.
      MERK: Vær forsiktig når du vasker cellepellets, da cellepellets kan være løs, og celler kan gå tapt.
  2. Formaldehydfiksering: starter fra celler i suspensjon
    1. Få celler sådd i passende medium for å høste 5 × 106 celler per fartøy.
      MERK: Brukere kan velge hvilken som helst foretrukket beholder som sikrer optimal cellevekst av en hvilken som helst pattedyrcellelinje.
    2. Umiddelbart før høsting, telle cellene og overfør 5 × 106 celler til et 50 ml konisk rør.
    3. Pellet cellene forsiktig ved sentrifugering ved 300 × g i 10 minutter ved romtemperatur.
    4. Forbered 1% FA tverrbindingsløsning ved å tilsette 1,25 ml 37% FA til 45 ml HBSS og bland ved å invertere røret flere ganger.
      MERK: Legg til hele 1,25 ml FA uten å dele beløpet.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er svært giftig.
    5. Resuspend cellepelleten i 46,25 ml 1% FA tverrbindingsløsning fremstilt i forrige trinn ved pipettering opp og ned.
    6. Inkuber ved romtemperatur i nøyaktig 10 minutter på rotator, rocker eller ved forsiktig manuell inversjon av røret hvert 1-2 minutt.
    7. Slukk tverrbindingsreaksjonen ved å tilsette 2,5 ml 2,5 M glycin (128 mM endelig) og bland godt ved å invertere røret.
    8. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur, og deretter på is i minst 15 minutter for å stoppe tverrbindingen helt.
    9. Sentrifuge ved romtemperatur for å pelletere de tverrbundne cellene ved 1000 × g i 10 minutter og kast supernatanten ved aspirasjon.
    10. Vask cellene en gang med 10 ml DPBS, og sentrifuger deretter ved 1000 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten helt med en pipet og fortsett umiddelbart til DSG-tverrbinding.
      MERK: Vær forsiktig når du vasker cellepellets, da cellepellets kan være løs, og celler kan gå tapt.
  3. Tverrbinding med disuccinimidylglutarat
    1. Resuspend de pelleterte cellene i 9,9 ml DPBS før du tilsetter 100 μL 300 mM DSG (3 mM endelig). Bland ved inversjon.
      MERK: DSG er fuktfølsom. Det er viktig å tilberede et nytt lager på 300 mM DSG i DMSO på dagen for tverrbinding.
      FORSIKTIG: DSG i DMSO er svært giftig.
    2. Krysskoble cellene ved romtemperatur i 40 minutter på en rotator.
    3. Tilsett 1,925 ml 2,5 M glycin (400 mM endelig), inverter for å blande og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    4. Sentrifuger cellene ved 2000 × g i 15 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Vær forsiktig når du fjerner supernatanten fra løse cellepellets.
    5. Resuspendere pelleten i 1 ml 0,05% bovint serumalbumin (BSA)-DPBS og overfør til et 1,7 ml rør.
      MERK: Tilsetningen av BSA kan bidra til å redusere celleklumping.
    6. Sentrifuger cellene ved 2000 × g i 15 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten med pipet.
      MERK: For å unngå å miste pelleten, fjern supernatanten raskt og helt.
    7. Frys pelleten i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C eller fortsett umiddelbart til neste trinn.

2. Opptak av kromosomkonformasjon

  1. Cellelyse og kromatin fordøyelse
    1. Resuspend (pipetter) de tverrbundne cellealiquotene (~ 5 × 106 celler) i 1 ml iskald lysisbuffer (oppskrift i tilleggstabell S1) som inneholder 10 μL proteasehemmercocktail og overføres til en dounce homogenisator for en 15 min inkubasjon på is.
      MERK: Legg proteasehemmere til lysebufferen umiddelbart før bruk.
    2. Beveg deg sakte opp og ned 30 ganger for å homogenisere cellene på is og inkubere på is i 1 minutt for å la cellene kjøle seg ned, før ytterligere 30 slag.
    3. Overfør lysatet til et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
      MERK: Hold suspensjonen i bevegelse fordi noen ganger celler stikker i pipettespissen.
    4. Sentrifuger den lysede fjæringen ved 2 500 × g i 5 minutter ved romtemperatur.
    5. Kast supernatanten og flikk eller virvle den våte pelleten for å resuspendere. Fjern så mye av supernatanten som mulig for å få et yoghurtlignende stoff med minimale klumper.
    6. Resuspend pelleten i 500 μL iskald 1x restriksjonsbuffer (fra 10x; se oppskrift i tilleggstabell S1) og sentrifuge i 5 minutter ved 2,500 × g. Gjenta dette trinnet for en ny vask.
      MERK: Pelleten i 1x restriksjonsbuffer er mer granulær enn den forrige pelleten i lysisbuffer.
    7. Resuspend cellene i et siste volum på 360 μL av 1x restriksjonsbuffer ved pipettering etter tilsetning av ~ 340 μL til overføringsvolumet av pelleten, som avhenger av cellestørrelsen.
    8. Sett av 18 μL av hvert lysat for testing av kromatinintegritet (CI). Oppbevar CI-prøvene ved 4 °C.
    9. Tilsett 38 μL 1% natriumdodecylsulfat (SDS) til hvert Hi-C-rør (totalt volum på 380 μL) og bland forsiktig ved pipettering uten å introdusere bobler.
      FORSIKTIG: SDS er giftig.
    10. Inkuber prøvene ved 65 °C uten å riste i nøyaktig 10 minutter for å åpne kromatinet.
    11. Legg rørene umiddelbart på is og klargjør fordøyelsesblandingen med Triton X-100 for å slukke SDS som beskrevet i tabell 1.
    12. Tilsett 107 μL av fordøyelsesblandingen til Hi-C-røret (487 μL totalt) for å fordøye kromatinet over natten (~ 16 timer) ved 37 ° C i en termomikser med intervallristing (f.eks. 900 o / min, 30 s på, 4 minutter av).
      MERK: Tilsetningen av Triton til en endelig konsentrasjon på 1% tjener til å slukke SDS.
  2. Biotinylering av DNA-ender
    1. Etter fordøyelsen over natten, overfør prøvene til 65 ° C i 20 minutter for å deaktivere den gjenværende endonukleaseaktiviteten.
    2. Under inkubasjonen tilbereder du en utfyllingsmasterblanding som vist i tabell 2.
    3. Etter inkubasjon, legg prøvene umiddelbart på is.
    4. Sett av en 10 μL fordøyelseskontroll (DC) for hver prøve og oppbevar ved 4 °C.
    5. Fjern kondensen fra lokket med en pipet eller ved å spinne. Til hver prøve tilsettes 58 μL biotinutfyllingsblanding (totalt prøvevolum 535 μL) og pipet forsiktig uten å danne bobler.
    6. Inkuber prøvene ved 23 °C i 4 timer i en termomikser (f.eks. 900 o/min, 30 s på, 4 minutter av).
  3. Ligering av proksimale DNA-fragmenter
    1. Forbered ligeringsblandingen som vist i tabell 3 mens biotinutfyllingen inkuberes.
    2. Tilsett 665 μL av ligeringsblandingen til hver prøve (totalt prøvevolum 1,200 μL). Bland forsiktig ved pipettering.
    3. Inkuber prøvene ved 16 °C i 4 timer i en termomikser med intervallristing (f.eks. 900 o / min, 30 s på, 4 min av). Oppbevar disse prøvene som inneholder kovalent koblet kromatin ved 4 ° C i noen dager.
  4. Reversering av krysskobling
    1. Ta volumene av CI- og DC-prøvene til 50 μL med 1x Tris Low EDTA (TLE; se oppskriften i tilleggstabell S1).
    2. Tilsett 10 μL 10 mg / ml proteinase K til CI- og DC-prøver.
    3. Inkuber ved 65 °C over natten med intervallristing (f.eks. 900 o/min, 30 s på, 4 min rabatt). Alternativt kan du utføre en 30 minutters reversering av tverrbinding for disse kontrollene under DNA-rensing av Hi-C-prøvene.
    4. Til hver Hi-C-prøve tilsettes 50 μL 10 mg/ml proteinase K og inkuberer ved 65 °C i minst 2 timer med intervallristing (f.eks. 900 o/min, 30 s på, 4 minutter av).
    5. Tilsett ytterligere 50 μL 10 mg / ml proteinase K til hvert Hi-C-rør (totalt prøvevolum 1,300 μL) og fortsett å inkubere ved 65 ° C over natten. Oppbevares ved 4 °C til DNA-rensing.
      MERK: Splitting opp Proteinase K-inkubasjoner sikrer total proteinfordøyelse.
  5. DNA-rensing
    1. La slangene avkjøles fra 65 °C og ned til romtemperatur.
    2. Overfør hver prøve til et 15 ml konisk rør og tilsett et 2,6 ml (2x volum) fenol: kloroform: isoamylalkohol til hvert rør.
      FORSIKTIG: fenol: kloroform: isoamylalkohol er en svært giftig irriterende og er potensielt kreftfremkallende.
    3. Vortex hvert rør i 1 min og overfør deretter innholdet til et 15 ml faselåsrør.
    4. Sentrifuge prøvene i 5 minutter med maksimal hastighet (1.500-3.500 × g) i en stasjonær sentrifuge.
    5. Hell forsiktig den vandige fasen i et 35 ml ultracentrifugerør og tilsett ultrarent vann til et sluttvolum på 1,250 μL.
      MERK: Bruk rør for å passe til den tilgjengelige ultracentrifuge eller delt inn i flere mikrocentrifuge rør.
    6. Tilsett et volum på 1/10th (~ 125 μL) av 3 M natriumacetat og bland godt ved inversjon.
    7. Tilsett et 2,5x volum (~ 3,4 ml) iskald 100% etanol til hver prøve, balanser rørene for ultracentrifugering ved å tilsette iskald 100% etanol, og bland godt ved inversjon.
    8. Inkuber rørene på tørris i ~15 min (unngå størkning).
    9. Sentrifuge rørene ved 18 000 × g i 30 min ved 4 °C.
      MERK: For vinklede rotorer: merk rørene for hvor pelleten skal være.
    10. Bruk en pipette, fjern og kast supernatanten helt fra ikke-pelletssiden.
      NOTAT: På dette tidspunktet skal pelleten bli synlig og kan merkes på røret, fordi den kanskje ikke er tydelig synlig etter tørking i neste trinn.
    11. Lufttørk prøvene i ca. 10 minutter eller til de er synlig tørre.
    12. Solubiliser hver pellet i 450 μL 1x TLE ved pipettering eller virvling og overfør til 0,5 ml sentrifugalfilterenhet (CFU) med en 3 kDa molekylvekt cut-off.
    13. Sentrifuger CFU med maksimal hastighet i 10 minutter og kast gjennomstrømningen. Vask hvert ultracentrifugerør med ytterligere 450 μL 1x TLE og overfør til CFU for en annen vask.
      MERK: Vasking av CFU på denne måten begrenser DNA-tap samtidig som saltkonsentrasjonen reduseres.
    14. Sentrifuger CFU med maksimal hastighet i 10 minutter og kast gjennomstrømningen.
    15. Tilsett 80 μL 1x TLE i kolonnen og gjør kolonnen om til et nytt oppsamlingsrør før sentrifugering i 2 minutter ved maksimal hastighet for å oppnå et endelig volum på ~ 100 μL.
    16. Tilsett 1 μL RnaseA (1 mg/ml; 10 ganger fortynning av 10 mg/ml stamløsning) til hver prøve og inkubert ved 37 °C på en varmeblokk, i et vannbad eller en termomikser i minst 30 minutter.
    17. Etter Rnase-behandlingen fjernes prøvene fra 37 °C og oppbevares ved 4 °C til kvalitetskontrolltrinnet.
  6. Kontrollerer kromatinkvalitet, enzymfordøyelse og prøveligering
    1. Avkjøl CI- og DC-prøvene til romtemperatur etter reversering av tverrbindingene i trinn 2.4.5. Overfør deretter til et forhåndsspunnet 2 ml faselåsrør.
      NOTAT: Forsikre deg om at faselåsinnholdet er sentrifugert til en pellet (maksimal hastighet i 2 min).
    2. Tilsett 200 μL fenol:kloroform:isoamylalkohol og bland prøvene ved å vortexere i 1 min.
    3. Sentrifuge rørene i 5 minutter ved maksimal hastighet.
    4. Overfør den vandige fasen fra hver prøve (~ 50 μL) til et nytt 1,7 ml mikrofugerør.
    5. Tilsett 1 μL Rnase A (fra 1 mg/ml) og inkuber ved 37 °C i minst 30 minutter.
    6. Legg prøvene på en 0,8% agarosegel som anbefalt i tabell 4.
      MERK: Resultatene som forventes fra en kvalitetskontroll er vist i figur 2.
    7. Kvantifiser DNA ved densitometri fra gelen eller ved hjelp av Qubit eller Nanodrop.
      MERK: Nøyaktig kvantifisering sikrer riktig inngangsvolum i neste del av protokollen. Bruk flere standarder med et kjent antall for å konstruere en standardkurve.

Tabell 1: Fordøyelsesreagenser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Biotin utfyllingsreagenser. *Merk at endring av enzymer kan kreve forskjellige buffere og biotinylerte dNTP-er. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Ligeringsblandingsreagenser. Forkortelse: BSA = bovint serumalbumin. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Gelbelastningsparametere for vurdering av kvalitet og størrelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 2
Figur 2: Agarosegel som viser typiske kvalitetskontrollresultater etter DNA-rensing . (A) CI-kontrollen skal indikere et bånd med DNA med høy molekylvekt. (B) DC- og Hi-C-prøvene viser en rekke DNA-størrelser. Hi-C-prøven, som har blitt kombinert i større fragmenter, bør ha høyere molekylvekt enn DC. Konsentrasjonsområdet for markører gjør det mulig å generere en standardkurve. Merk at i dette eksemplet ble CI lastet på en egen gel, men det anbefales å laste og kjøre alle prøver og kontroller sammen. Forkortelser: CI = kromatin integritet; DC = fordøyelseskontroll; Hi-C = nærhet-ligated. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Forberedelse av Hi-C-sekvenseringsbibliotek

  1. Fjerning av biotin fra uforpliktede ender
    1. Forbered biotinfjerningsreaksjoner som vist i tabell 5.
      MERK: Vanligvis er 10 μg DNA tilstrekkelig, men opptil 30 μg kan brukes.
    2. Fordel 2 x 65 μL aliquots fra hver 130 μL reaksjon i to PCR-rør.
    3. Overfør til termocykler eller PCR-maskin og inkuber som beskrevet i tabell 5.
      MERK: Prøver kan lagres her ved 4 ° C (dager til uker), -20 ° C (langsiktig), eller umiddelbart overføres til sonikering.
  2. Sonikering
    1. Samle prøveduplikatene fra biotinfjerningstrinnet (130 μL totalt prøvevolum) til et 130 μL sonikatorrør for sonikering.
    2. Sonikere prøvene ved hjelp av parametrene gitt i tabell 6 for å oppnå en tett smal fordeling under 500 bp.
      MERK: Ulike sonikatortyper kan brukes, men for en smal fragmentfordeling (100-500 bp) kan sonikerinnstillinger kreve optimalisering.
  3. Størrelsesvalg med magnetiske perler
    1. Pipet det sonikerte DNA fra sonikatorrøret (e) til et 1,7 ml lavbindingsrør.
    2. Ta hver prøve til et totalt volum på 500 μL med 1x TLE. Prøv å få volumet så nært som mulig til 500 μL, siden forholdet mellom prøve og magnetiske perler blanding er avgjørende for størrelsesvalg.
    3. Tilsett 400 μL magnetisk perleblanding til hvert rør for å oppnå et forhold mellom magnetisk perleblanding og prøvevolumet på 0,8.
      MERK: Under disse forholdene fanger perler DNA-fragmenter >300 bp, som vil være den øvre fraksjonen. Supernatanten vil inneholde fragmenter <300 bp, som vil være den nedre fraksjonen.
    4. Bland rørene ved vortexing og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur på en rotator. For dette og andre størrelsesvalgforhold, sørg for at hele volumet av prøven blandes godt. Se etter "uberegnelig modus" som noen rotorer har, som fungerer bra for mindre volumer.
    5. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur på en magnetisk partikkelseparator (MPS).
    6. Mens du inkuberer, tilsett 500 μL av den magnetiske perleblandingen til et nytt 1,7 μL lavbindingsrør for hver prøve.
      MERK: Disse rørene vil bli brukt til neste størrelsesvalg av den nedre fraksjonen ved å generere en magnetisk perleblanding til prøveforhold på 1,1: 1.
    7. La rørene stå på MPS i 5 minutter.
    8. Fjern supernatanten fra perlene og resuspend med 150 μL av den magnetiske perleblandingen.
      MERK: Dette trinnet unngår metning av perlene med DNA ved å øke antall perler uten å øke volumet.
    9. Overfør supernatanten fra trinn 3.3.5 til det merkede røret som er klargjort for å velge nedre fraksjon (trinn 3.3.8).
      MERK: 150 μL magnetisk perleblanding + 400 μL 0,8x magnetisk perleblanding (550 μL totalt) delt på 500 μL innledende prøve = 1,1x magnetisk perleblanding til prøveforhold.
    10. Bland nedre fraksjonsrør ved å virvle og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur på en rotator.
      MERK: Perlene vil binde DNA-fragmenter >100 bp, noe som resulterer i en endelig perlebundet fraksjon på 100-300 bp.
    11. Sett nedre fraksjonsrør på MPS i 5 minutter (romtemperatur).
    12. Fjern supernatanten og sentrifuger rørene kort for å fjerne supernatanten ytterligere så mye som mulig.
    13. Vask perlene fra begge fraksjonene to ganger med 200 μL 70% etanol og gjenvinne perlene i 5 minutter på MPS hver gang.
    14. Etter en rask spinn i en sentrifuge, fjern etanolen helt og tørk perlene ytterligere på MPS.
      MERK: Tørk til alkoholen er helt fordampet. Pelleten skal se ut som mørk sjokolade uten å sprekke (kan ta ~ 10 min).
    15. Resuspend begge fraksjonene i 50 μL av 1x TLE buffer. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter og trykk eller sveip på rørene hvert andre minutt for å stimulere blanding og eluering.
    16. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 5 minutter for begge fraksjonene.
    17. Hold supernatanten fra hver prøve. Pipet supernatanten inn i et 1,7 ml rør med lav binding.
      MERK: Prøvene kan oppbevares ved 4 °C i noen dager eller ved -20 °C på lang sikt.
    18. Kjør en 2% agarosegel som i tabell 4 for å bestemme prøvekvaliteten og kvantiteten. Se figur 3 for et eksempel på en slik gel.
      NOTAT: Hvis det av erfaring er sonikering svært reproduserbart, kan man hoppe over denne gelen og fortsette å avslutte reparasjonen umiddelbart. Det anbefales at brukerne holder på de øvre fraksjonene til etter titrerings-PCR. Suboptimale DNA-mengder som vil kreve mye PCR-forsterkning, kan reddes fra materiale i øvre fraksjon.
    19. Kvantifiser mengden DNA fra gelen direkte etter å ha generert en standardkurve fra den kjente DNA-stigeinngangen eller ved å bruke en Qubit eller Nanodrop.
  4. Avslutt reparasjon
    1. Klargjør sluttreparasjonsblandingen som i tabell 7 (mengde per gitt reaksjon).
    2. Overfør de resterende 46 μL eluert DNA fra nedre fraksjon til PCR-rør og tilsett 24 μL av den tilberedte sluttreparasjonsblandingen. Inkubere i en PCR-maskin, som foreslått i tabell 7.
    3. Når programmet er fullført, hold prøvene på 4 °C til nedtrekk.
  5. Nedtrekk av biotinylerte ligeringsprodukter med streptavidinbelagte perler
    1. Bestem mengden streptavidinbelagte perler for hvert bibliotek fra det kvantifiserte størrelsesvalget (trinn 3.3.19).
      MERK: Disse streptavidinbelagte perlene (10 mg / ml løsning) kan binde 20 μg dobbeltstrenget DNA per mg perler (= 20 μg / 100 μL perler). Bruk 2 μL for hver 1 μg Hi-C DNA, men ikke mindre enn 10 μL.
    2. Bland streptavidinbelagte perler og pipet volumet av perler som trengs for hvert bibliotek (beregnet i forrige trinn) i individuelle 1,7 ml lavbindingsrør.
    3. Resuspend perlene i 400 μL Tween vaskebuffer (TWB; se oppskrift i tilleggstabell S1) og inkuber i ~ 3 minutter ved romtemperatur på en rotator (se instruksjonene i trinn 3.3.4).
    4. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og fjern supernatanten.
    5. Vask perlene ved å pipettere ytterligere 400 μL TWB.
    6. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og fjern supernatanten.
    7. Tilsett 400 μL 2x bindingsbuffer (BB) (oppskrift i tilleggstabell S1) i perlene og resuspendere. I tillegg legger du til 330 μL 1x TLE og løsningen fra Sluttreparasjon (fra trinn 3.4.3).
    8. Inkuber prøvene i 15 minutter ved romtemperatur mens du blander på en rotator.
    9. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og fjern supernatanten.
    10. Tilsett 400 μL 1x BB i perlene og resuspend.
    11. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og fjern supernatanten.
    12. Tilsett 100 μL 1x TLE for å vaske perlene.
    13. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og fjern supernatanten.
    14. Til slutt legger du til 41 μL 1x TLE for å resuspendere perlene.
  6. A-tailing
    1. Forbered A-tailing-blandingen som i tabell 8.
    2. Pipet reaksjonene inn i PCR-rør og inkuber som i tabell 8.
    3. Plasser PCR-rørene på is umiddelbart etter fjerning fra termocyklen og overfør innholdet til 1,7 ml rør med lav binding.
    4. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og kast supernatanten.
    5. Tilsett 400 μL 1x ligeringsbuffer, fortynnet fra 5x T4 DNA ligase buffer med ultrarent vann.
    6. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min, og kast deretter supernatanten.
    7. Legg til 1x ligeringsbuffer til et endelig volum på 40 μL.
  7. Annealing adapter oligoer
    1. Forbered adapter oligo lager på 100 μM (tabell 9).
      MERK: Bestill 250 nmol HPLC-rensede oligoer.
    2. Anneal adapterne i PCR-rør som beskrevet i tabell 9.
    3. Bruk en PCR-termocykler til gradvis å øke temperaturen ved 0,5 °C/s til 97,5 °C. Oppbevares ved 97,5 °C i 2,5 minutter.
    4. Bruk en PCR-termocykler til gradvis å øke temperaturen ved 0,1 °C/s i 775 sykluser (når 20 °C). Hold temperaturen på 4 °C til videre bruk.
    5. Tilsett 83 μL 1x Annealing Buffer (oppskrift i tilleggstabell S1) for å fortynne adapterne til 15 μM. Oppbevar adapterne ved -20 °C.
  8. Sekvensering av adapterligering
    1. Klargjør adapterligeringsblandingen i et 1,7 ml lavt bindingsrør (tabell 10).
    2. Ligate i 2 timer ved romtemperatur.
    3. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 1 min og kast supernatanten.
    4. Tilsett 400 μL TWB og pipet perlene forsiktig opp og ned før inkubering på rotatoren i 5 minutter ved romtemperatur. Skill perlene fra supernatanten på MPS og gjenta dette trinnet en gang til.
    5. Skill perlene fra supernatanten på MPS (~ 1 min), kast supernatanten og legg til 200 μL 1x BB.
    6. Skill perlene fra supernatanten på MPS (~ 1 min) og kast supernatanten.
    7. Tilsett 200 μL 1x pre-PCR Buffer (fra 10x; oppskrift i tilleggstabell S1) og overfør til et nytt 1,7 ml lavbindingsrør.
    8. Skill perlene fra supernatanten på MPS (~ 1 min) og kast supernatanten.
    9. Tilsett 20 μL 1x pre-PCR Buffer og bland med pipettering.
    10. Hold rørene på is mens de er i bruk eller oppbevares ved 4 °C.
  9. Optimalisering av PCR-syklusnummeret ved titrering
    1. Sett opp 30 μL masterblandingsreaksjoner per prøve som i tabell 11 (mengde per gitt reaksjon).
    2. Kjør det laveste antall sykluser og ta en 5 μL aliquot. Kjør ytterligere 2-3 sykluser på den gjenværende reaksjonen før du tar de neste 5 μL aliquot. Gjenta for å samle fire aliquots.
    3. Bruk PCR-parametere fra tabell 11 for hver aliquot.
    4. Tilsett 5 μL vann og 2 μL 6x fargestoff til hver 5 μL prøve. Kjør på en 2% agarose TBE gel (oppskrift i supplerende tabell S1) med 25-150 ng lavmolekylær stige. Se figur 4 for forventede resultater.
      MERK: Et optimalt antall sykluser for det endelige biblioteket PCR-forsterkning [trinn 3.10] er det laveste antallet sykluser for å få synlig produkt på gelen minus en syklus.
  10. Endelig bibliotek PCR-forsterkning
    1. Sett opp 12 x 30 μL reaksjoner for å forsterke hvert siste bibliotek for sekvensering som i tabell 11.
    2. PCR-reaksjonene behandles i henhold til tabell 11 etter bestemmelse av antall sykluser etter PCR-titrering (trinn 3.9.3).
    3. Når PCR er fullført, samler du replikasjonsprøvene i et 1,7 ml mikrofugerør med lav binding.
    4. Plasser rørene på MPS og overfør supernatanten til et nytt 1,7 ml mikrofugerør med lav binding.
    5. Resuspend de resterende streptavidinbelagte perlene i 20 μL 1x pre-PCR Buffer.
      MERK: Denne malen kan gjenbrukes ved oppbevaring ved 4 °C i dager til uker eller langtids ved -20 °C.
  11. Fjerning av primere med magnetisk perleblanding
    1. Bruk 1x TLE-buffer (oppskrift i tilleggstabell S1) for å justere volumet fra trinn 3.10.4 til nøyaktig 360 μL.
    2. Til hver prøve tilsettes 360 μL av den magnetiske perleblandingen og pipetten opp og ned for å blande.
    3. På en rotator blander du prøvene i 10 minutter ved romtemperatur.
    4. Skill perlene fra supernatanten på MPS ved romtemperatur (3-5 min).
    5. Vask perlene to ganger med 200 μL 70% etanol og gjenvinne perlene i 5 minutter på MPS hver gang.
    6. Hurtigspinn i en sentrifuge og helt pipette av etanolen. Tørk perlene i luft på MPS for å fordampe etanolen ytterligere.
      NOTAT: Pelleten skal se ut som mørk sjokolade uten å sprekke (kan ta ~ 10 min).
    7. Tilsett 30 μL ultrarent vann og resuspend for å eluere DNA i 10 minutter ved romtemperatur. Sveip rørene hvert 2. minutt for å hjelpe til med blandingen.
    8. Skill perlene fra supernatanten på MPS i 5 minutter.
    9. Samle supernatanten fra hver prøve i et nytt 1,7 ml rør.
    10. Kjør 1 μL av biblioteket på en 2% agarose TBE (oppskrift i tilleggstabell S1) gel for å oppnå en fragmentstørrelsesfordeling og for å kvantifisere det endelige biblioteket (figur 5).
      MERK: ClaI-fordøyelse kan bare forekomme for DpnII-DpnII-kryss og fungerer som en positiv ligeringskontroll som skal resultere i en lavere fragmentstørrelsesfordeling for det endelige biblioteket. Endelige biblioteker kan lagres i noen dager ved 4 °C, langtids ved -20 °C, eller umiddelbart fortynnes og sendes inn for sekvensering.

Tabell 5: Reagenser og temperaturer for fjerning av biotin Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Parametre for sonikering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: Slutt reparasjonsreagenser og temperaturer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 8: A-tailing reagenser og temperaturer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 9: PCR-primere og paired-end-adapter oligoer med reagenser annealing for glødning. Forkortelse: 5PHOS = 5' fosfat. Stjerner indikerer fosforioerte DNA-baser. # Kombiner en indeksert oligo med Universal oligo til anneal i en indeksert adapter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 10: Adapterligeringsreagenser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 11: PCR-reagenser og sykkelparametere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 3
Figur 3: Agarosegel som viser typiske valgresultater etter størrelse. Øvre og nedre brøker for fire prøver (nummerert 1-4) av DpnII-DdeI Hi-C vises. Den første banen for hver prøve inneholder den øvre fraksjonen, avledet fra en 0,8x magnetisk perleblanding, og den andre og tredje banen inneholder en fortynning av den nedre fraksjonen avledet fra en 1,1x magnetisk perleblanding. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Agarosegel med PCR-titreringsresultater. Fra og med 5 sykluser med PCR tas prøver etter hver 2 syklus (5, 7, 9 og 11 sykluser) for hvert av fire biblioteker. Basert på denne figuren ble 6 sykluser valgt som den optimale syklusen for hver prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Endelige PCR-produkter. Etter rengjøring og størrelsesvalg ble PCR-produkter (Hi-C) lastet ved siden av en ClaI-fordøyd brøkdel av samme bibliotek (ClaI). ClaI-fordøyde fragmenter indikerer tilstedeværelsen av ettertraktede DpnII-DpnII-ligasjoner. Merk at ClaI ikke fordøyer DpnII-DdeI-kryss, og derfor vil ikke alle ligeringer bidra til en størrelsesreduksjon fra denne begrensningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Figurene i dette manuskriptet ble generert fra et eget, replikerende eksperiment av det som tidligere ble publisert av Lafontaine et al.21. Etter å ha oppnådd sekvenseringsdata med høy gjennomstrømning, ble Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) brukt til å behandle Hi-C-dataene. En lignende rørledning finnes på dataportalen til 4D Nucleome-prosjektet (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kort fortalt ble Nextflow-rørledningsdestillatøren (https://github.com/open2c/distiller-nf) implementert for å (1) justere sekvensene av Hi-C-molekyler til referansegenomet, (2) analysere .sam-justering og formfiler med Hi-C-par, (3) filtrere PCR-duplikater og (4) aggregerte par i binned matriser av Hi-C-interaksjoner. Disse HDF5-formaterte matrisene, kalt kjølere, kan deretter (1) vises på en HiGlass-server (https://higlass.io/) og (2) analyseres ved hjelp av et stort sett med åpen kildekode-beregningsverktøy som finnes i "cooltools" -samlingen som vedlikeholdes av Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) for å trekke ut og kvantifisere foldefunksjoner som rom, TADs og looper.

Noen kvalitetsindikatorer for Hi-C3.0-bibliotekene kan vurderes umiddelbart etter kartlegging av lesepar til et referansegenom, ved hjelp av noen få enkle beregninger / indikatorer. For det første kan vanligvis ~ 50% av sekvenserte lesepar være unikt kartlagt for menneskelige celler. På grunn av kromosomenes polymere natur representerer de fleste av disse kartlagte lesningene (~ 60% -90%) interaksjoner i et kromosom (cis), med interaksjonsfrekvenser som raskt forfaller med økende genomisk avstand (avstandsavhengig forfall). Det avstandsavhengige forfallet kan visualiseres best i et "skaleringsplott", som viser kontaktsannsynligheten (per kromosomarm) som en funksjon av genomisk avstand. Vi fant at bruk av forskjellige tverrbindinger og enzymer kan endre avstandsavhengig forfall på lange og korte avstander17. Tilsetningen av DSG-tverrbinding øker detekterbarheten av interaksjoner på korte avstander når det kombineres med enzymer som Mnase og kombinasjoner av DpnII-DdeI som produserer mindre fragmenter (figur 6A).

Avstandsavhengig henfall kan også observeres direkte fra 2D-interaksjonsmatriser: interaksjoner blir sjeldnere når de ligger lenger unna den sentrale diagonalen (figur 6B). I tillegg kan genomiske foldefunksjoner, som rom, TADs og løkker, identifiseres fra Hi-C-matriser og skaleringsplott som avvik fra det generelle genomomfattende gjennomsnittlige avstandsavhengige forfallet. Det er viktig at tverrbinding med DSG i tillegg til FA reduserer tilfeldige ligeringer, som er ubegrenset på grunn av kromosomenes polymernatur og derfor mer sannsynlig å forekomme mellom kromosomer (i trans) (figur 6C). Reduksjon av tilfeldig ligering fører til økte signal-til-støy-forhold, spesielt for interkromosomale og svært langdistanse (>10-50 Mb) intrakromosomale interaksjoner.

Figure 6
Figur 6: Representative resultater av kartlagte og filtrerte Hi-C-biblioteker. (A) Skaleringsplott med kontaktsannsynlighet og dens derivat for forskjellige enzymer, sortert etter fragmentlengde (øverst) og tverrbinding med enten FA eller FA + DSG (nederst). Fordøyelse med MNAse (microC) eller DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) øker kortdistansekontaktene betydelig (øverst) og legger DSG til FA (nederst). (B) Kolonner viser Hi-C varmekart over DpnII fordøyelse etter bare FA tverrbinding og DpnII eller DdeI fordøyelse etter FA + DSG tverrbinding. Hvite piler viser økende styrke av "prikker" etter DSG-tverrbinding og DdeI-fordøyelse, noe som innebærer bedre påvisning av DNA-løkker. Rader viser forskjellige deler av kromosom 3 ved økende oppløsning, på linje med panel C: øverste rad: hele kromosom 3 (0-198,295,559 Mb); midterste rad: 186-196 Mb; nederste rad: 191,0-191,5 Mb. (C) Dekningsgrafer for regionene som er avbildet i A. Svarte piler viser lavere dekning (% cis leser) for FA-bare tverrbinding. Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; chr = kromosom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ikke alle kartlagte lesninger er nyttige. En annen kvalitetsindikator er antall PCR-duplikater. Eksakte dupliserte avlesninger er svært lite sannsynlig å oppstå ved en tilfeldighet etter ligering og sonikering. Dermed er slike avlesninger sannsynligvis et resultat av PCR-forsterkning og må filtreres ut. Duplikater oppstår ofte når det kreves for mange PCR-sykluser for å forsterke biblioteker med lav kompleksitet. Generelt, for Hi-C, trenger de fleste biblioteker bare 5-8 sykluser med endelig PCR-forsterkning, som bestemt av titrerings-PCR (se trinn 3.9; Figur 4). Imidlertid kan biblioteker med tilstrekkelig kompleksitet oppnås selv etter 14 sykluser med PCR-forsterkning.

En annen kategori av dupliserte avlesninger, såkalte optiske duplikater, kan oppstå fra forsterkningsprosessen på Illumina-sekvenseringsplattformer som bruker mønstrede strømningsceller (for eksempel HiSeq4000). Optiske duplikater er funnet fra enten overbelastning av strømningscellen, noe som fører til at (store) klynger kalles to separate klynger, eller fra lokal reclustering av det opprinnelige parede endemolekylet etter en første runde med PCR. Fordi begge typer optiske duplikater er lokale, kan de identifiseres og skilles fra PCR-duplikater ved deres plassering på flytcellen. Mens biblioteker med >15% PCR-duplikater trenger regenerering, kan biblioteker med optiske duplikater lastes på nytt etter optimalisering av lasteprosessen.

Tilleggstabell S1: Buffere og løsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Kritiske trinn for cellehåndtering
Selv om det er mulig å bruke et lavere antall inngangsceller, har denne protokollen blitt optimalisert for ~ 5 × 106 celler per sekvenseringsfelt (~ 400 M leser) for å sikre riktig kompleksitet etter dyp sekvensering. Celler telles best før fiksering. For generering av ultradeep-biblioteker multipliserer vi vanligvis antall baner (og celler) til ønsket lesedybde er nådd. For optimal fiksering bør serumholdig medium erstattes med PBS før FA-fiksering, og fikseringsløsninger bør tilsettes umiddelbart og uten konsentrasjonsgradienter 15,22. For cellehøsting foretrekkes skraping fremfor trypsinisering, fordi overgangen fra en flatere til en sfærisk form etter trypsinisering kan påvirke atomkonformasjonen. Etter tilsetning av DSG blir løse og klumpete cellepellets lett tapt. Vær forsiktig når du håndterer celler på dette stadiet og legg opp til 0,05% BSA for å redusere klumping.

Endringer i metoden
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av menneskelige celler17. Likevel, basert på erfaring med kromosomkonformasjonsfangst, bør denne protokollen fungere for de fleste eukaryote celler. For en betydelig lavere inngang (~ 1 × 106 celler), anbefaler vi at du bruker halvparten av volumene for lysis- og konformasjonsfangstprosedyrene [trinn 2.1-2.4]. Dette vil også tillate DNA-isolering [trinn 2.5] å bli utført i en bordplate sentrifuge med 1,7 ml rør, noe som kan forbedre pelletering for lave DNA-konsentrasjoner. Kvantifiseringen av DNA (trinn 2.6.6) vil indikere hvordan man går frem. For lave mengder isolert DNA (1-5 μg) foreslår vi å hoppe over størrelsesvalget (trinn 3.3) og fortsette med biotinfjerning etter å ha redusert volumet fra 130 μL til ~ 45 μL med CFU.

Denne protokollen ble utviklet spesielt for å sikre data av høy kvalitet etter påfølgende kryssbinding med FA og DSG og fordøyelse med DpnII og DdeI. Imidlertid kan alternative tverrbindingsstrategier som FA etterfulgt av EGS (etylenglykol bis (succinimidyl succinate)), som også brukes i ChIP-seq23 og ChIA-PET24, fungere like bra17. På samme måte kan forskjellige enzymkombinasjoner, som DpnII og HinfI18 eller MboI, MseI og NlaIII19 brukes til fordøyelse. Når du tilpasser enzymkombinasjoner, må du huske å bruke biotinylerte nukleotider som kan fylle ut de spesifikke 5 'overhengene og bruke de mest optimale bufferne for hver cocktail. DpnII kommer med sin egen buffer, og enzymprodusenten anbefaler en spesifikk buffer for DdeI-fordøyelsen. Likevel, for dobbeltfordøyelsen med DpnII og DdeI i denne protokollen, anbefales restriksjonsbuffer fordi den er vurdert til 100% aktivitet for begge enzymer.

Feilsøking av konformasjonsregistrering
De tre nøkkeltrinnene i kromosomkonformasjonsfangst: tverrbinding, fordøyelse og religasjon har alle blitt utført før resultatene kan visualiseres på gel. For å bestemme kvaliteten på hvert av disse tre trinnene og skjelne hvor problemer kunne ha oppstått, blir aliquots før (CI) og etter fordøyelsen (DC) tatt og lastet på gelen sammen med den ligerte Hi-C-prøven (figur 2). Denne gelen brukes til å bestemme kvaliteten på Hi-C-prøven og om det vil være verdt å fortsette protokollen. Uten CI og DC er det vanskelig å finne potensielle suboptimale trinn. Det er verdt å merke seg at suboptimal ligering kan skyldes et problem i selve ligeringen, utfyllingen eller et problem med tverrbinding. For å feilsøke kryssbinding, må du ikke bruke mer enn 1 × 107 celler per bibliotek og starte med ferske tverrbindingsreagenser og rene celler (dvs. skyllet med PBS). For ligering, sørg for at celler og ligeringsblanding holdes på is. Tilsett T4 DNA-ligase rett før 4-timers inkubasjon ved 16 °C og bland godt.

Feilsøking av bibliotekforberedelse
Hvis det er behov for mer enn 10 PCR-sykluser eller ikke noe PCR-produkt kan ses på gel etter PCR-titrering (figur 4), er det noen alternativer for å lagre Hi-C-prøven. Når du arbeider tilbake fra PCR-titreringen, er det første alternativet å prøve PCR igjen. Hvis det fortsatt ikke er nok produkt, er det mulig å prøve en ny runde med A-tailing og adapterligering (trinn 3.6) etter å ha vasket perlene to ganger med 1x TLE-buffer. Etter denne ekstra A-tailing og adapter ligering, kan man fortsette til PCR-titrering som før. Hvis det fortsatt ikke er noe produkt, er det siste alternativet å resonikere 0,8x-fraksjonen fra trinn 3.3 og fortsette derfra.

Begrensninger og fordeler med Hi-C3.0
Det er viktig å innse at Hi-C er en populasjonsbasert metode som fanger den gjennomsnittlige frekvensen av interaksjoner mellom par av loci i cellepopulasjonen. Noen beregningsanalyser er utformet for å skille kombinasjoner av konformasjoner fra en populasjon25, men i prinsippet er Hi-C blind for forskjeller mellom celler. Selv om det er mulig å utføre encellet Hi-C26,27 og beregningsmessige slutninger kan gjøres28, er encellet Hi-C ikke egnet for å oppnå ultrahøyoppløselig 3C-informasjon. En ekstra begrensning av Hi-C er at den bare oppdager parvise interaksjoner. For å oppdage multikontaktinteraksjoner kan man enten bruke hyppige kuttere kombinert med kortlesingssekvensering (Illumina)16 eller utføre multikontakt3C 29 eller 4C30, ved hjelp av langlest sekvensering fra PacBio eller Oxford Nanopore-plattformer. Hi-C-derivater for spesifikt å oppdage kontakter mellom og langs søsterkromatider er også utviklet31,32.

Selv om Hi-C19 og Micro-C33 kan brukes til å generere kontaktkart ved subkilobaseoppløsninger, krever begge en stor mengde sekvenseringsavlesninger, og dette kan bli et kostbart foretak. For å komme til lignende eller enda høyere oppløsning uten kostnadene, kan anrikning for spesifikke genomiske regioner (fangst-C34) eller spesifikke proteininteraksjoner (ChiA-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) brukes. Styrken og ulempen med disse anrikningsapplikasjonene er at bare et begrenset antall interaksjoner blir samplet. Med slike berikelser går det globale aspektet av Hi-C (og muligheten for global normalisering) tapt.

Viktighet og potensielle anvendelser av Hi-C3.0
Denne protokollen ble designet for å muliggjøre ultradyp 3C med høy oppløsning samtidig som den oppdager store foldefunksjoner som TADs og rom17 (figur 6). Denne protokollen starter med 5 × 106 celler per rør for hvert Hi-C-bibliotek, som skal være mer enn nok materiale til å sekvensere en eller to baner på en strømningscelle for å oppnå opptil 1 milliard parede avlesninger. For ultradeep sekvensering bør flere rør på 5 × 106 celler klargjøres, avhengig av antall kartlagte avlesninger og PCR-duplikater. Ved høyeste oppløsning (<1 kb) er looping-interaksjoner for det meste funnet mellom CTCF-steder, men promotorforsterkerinteraksjoner kan også oppdages. Leserne kan henvise til Akgol Oksuz et al.17 for en detaljert beskrivelse av dataanalysen.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Vi vil takke Denis Lafontaine for protokollutvikling og Sergey Venev for bioinformatisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program til JD (U54-DK107980, UM1-HG011536). JD er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute.

Denne artikkelen er underlagt HHMIs retningslinjer for åpen tilgang til publikasjoner. HHMI lab heads har tidligere gitt en ikke-eksklusiv CC BY 4.0 lisens til publikum og en underlisensierbar lisens til HHMI i sine forskningsartikler. I henhold til disse lisensene kan det forfatteraksepterte manuskriptet til denne artikkelen gjøres fritt tilgjengelig under en CC BY 4.0-lisens umiddelbart etter publisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Ladder New England Biolabs N3232L
Agarose Invitrogen 16500100
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL Beckman Coulter A63881
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) EMD Millipore UFC500396
Annealing Buffer (5x) See recipe in supplemental materials
ATP 10 mM ThermoFisher R0441
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge Beckman Coulter
beckman ultracentrifuge tube 35 mL Beckman Coulter 357002
Binding Buffer (2x) See recipe in supplemental materials
biotin-14-dATP 0.4 mM Invitrogen 19524-016
BSA 10 mg/mL New England Biolabs B9000S dilute from 20 mg/mL
Cell scraper Falcon 353089
Cell scraper Corning 3008
Conical polypropylene tubes 50 mL Denville C1062-P
Conical tube 15 mL Denville C1017-P
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL Covaris 520045/520077
Covaris Sonicator Covaris E220/E220evolution/M220
Culture flask 175 cm2 Falcon 353112
Culture plates 150 mm x 25 mm Corning 430599
dATP 1 mM Invitrogen 56172
dATP 10 mM Invitrogen 56172
dCTP 10 mM Invitrogen 56173
DdeI New England Biolabs R0175L
dGTP 10 mM Invitrogen 56174
DMSO Sigma D2650-5x10ML
dNTP mix 25 mM Invitrogen 10297117
Dounce homogenizer DWK Life Sciences 8853010002/8853030002
DPBS Gibco 14190-144
DpnII New England Biolabs R0543M
DSG ThermoScientific 20593
dTTP 10 mM Invitrogen 56175
Ethanol 70% Fisher A409-4 Diluted from 100%
Ethidium Bromide Fisher BP1302-10
Formaldehyde (37%) Fisher BP531-500
Gel loading dye (6x ) New England Biolabs B7024S
Glycine in ultrapure water 2.5 M Sigma G8898-1KG
HBSS Gibco 14025-092
Igepal CA-630 detergent MP Biomedicals 198596
Klenow DNA polymerase 5 U/µL New England Biolabs M0210L
Klenow Fragment 3-->5’ exo-, 5 U/µL New England Biolabs M0212L
ligation buffer (10x) New England Biolabs B7203S
Liquid nitrogen
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL Eppendorf 22431021
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L
Lysis buffer See recipe in supplemental materials
Magnetic Particle separator ThermoFisher 12321D
Microfuge tubes 1.7 mL Axygen MCT-175-C
MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65001
NEBuffer 2.1 (10x) New England Biolabs B7002S
NEBuffer 3.1 (10x) New England Biolabs B7203S
PBS Gibco 70013-032
PCR (strip) tubes Biorad TBS0201/ TCS0803
PCR thermocycler Biorad T100
Pfu Ultra II Buffer (10x) Agilent Comes with Pfu Ultra
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase  Agilent 600674
Phase lock tube 15 mL Qiagen 129065
Phase lock tubes 2 mL Qiagen 129056
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol Invitrogen 15593-049
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher 78440
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL Invitrogen 25530-031
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5810R
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL Thermo Scientific EN0531
Rotator Argos technologies EW-04397-40 or rocking platform
SDS 1% Fisher BP13111
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M Sigma
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Biorad 1704401
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 100004817
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203L
T4 DNA polymerase 3 U/µL New England Biolabs M0203L
T4 ligation buffer (5x) Invitrogen Y90001
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL New England Biolabs M0201L
Tabletop centrifuge Eppendorf 5425
TBE buffer See recipe in supplemental materials
Tris Low EDTA Buffer (TLE) See recipe in supplemental materials
Triton X-100 (10%) Sigma 93443
Truseq adapter oligos Integrated DNA Technologies (IDT)) https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 250 nmole and HPLC purified
Tween 20 detergent Fisher 9005-64-5
Tween Wash Buffer See recipe in supplemental materials
Vortex Scientific Industries (G560)SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  2. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  3. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  4. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  5. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  6. Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling. Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).
  7. Hsieh, T. H., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  8. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  9. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  10. Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture. Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).
  11. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  12. Alipour, E., Marko, J. F. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).
  13. Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
  14. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  15. Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time. Methods. 142, 47-58 (2018).
  16. Darrow, E. M., et al. Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).
  17. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  18. Ghuryeid, J., et al. Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly. PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).
  19. Gu, H., et al. Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not. bioRxiv. , (2021).
  20. Ramani, V., et al. Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C. Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).
  21. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
  22. Belton, J. -M. M., et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  23. Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example. Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).
  24. Wang, P., et al. In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).
  25. Tjong, H., et al. Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).
  26. Nagano, T., et al. Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution. Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).
  27. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  28. Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data. Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).
  29. Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).
  30. Vermeulen, C., et al. Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies. Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).
  31. Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC. Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).
  32. Mitter, M., et al. Conformation of sister chromatids in the replicated human genome. Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).
  33. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  34. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  35. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  36. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  37. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Tags

Genetikk utgave 191 Kromosomkonformasjonsfangst tverrbinding restriksjonsfordøyelse kromatinløkker prikker topologisk assosierende domener compartmentalization
Fange kromosomkonformasjon på tvers av lengdeskalaer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker,… More

Yang, L., Akgol Oksuz, B., Dekker, J., Gibcus, J. H. Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales. J. Vis. Exp. (191), e64001, doi:10.3791/64001 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter