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Neuroscience

शारीरिक रूप से विशिष्ट एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विधियों के साथ व्यसन व्यवहार में एंटीरिवार्ड के ड्राइवरों की जांच करना

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन और माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर का संयोजन एकल न्यूरॉन्स और ग्लिया में ट्रांसस्क्रिप्टम को मापने में शारीरिक और जैव तकनीकी विशिष्टता प्रदान करता है। मनोवैज्ञानिक रोग के लिए एक प्रणाली के जीव विज्ञान दृष्टिकोण के साथ रचनात्मक तरीकों को लागू करने से लत में न्यूरोइन्फ्लेमेशन एंटीरिवार्ड परिकल्पना जैसे समझ और उपचार में सफलताएं मिल सकती हैं।

Abstract

व्यसन व्यवहार की बढ़ती दरों ने मानसिक स्वास्थ्य शोधकर्ताओं और चिकित्सकों को समान रूप से एंटीरिवार्ड और रिकवरी को समझने के लिए प्रेरित किया है। इनाम और शुरुआत से दूर इस बदलाव के लिए लत की जांच के लिए लागू तरीकों के विस्तार के साथ-साथ नए दृष्टिकोण, प्रतिमान और परिकल्पना की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक उदाहरण प्रदान करते हैं: एंटीरिवार्ड की जांच करने के लिए एक सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण जो लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (आरटी-क्यूपीसीआर) को जोड़ता है। जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क गतिशीलता को मापा गया और शराब और ओपिओइड वापसी, न्यूरोइन्फ्लेमेशन में न्यूरोविसेरल डिसरेग्यूलेशन के एक प्रमुख चालक की पहचान की गई। प्रौद्योगिकियों का यह संयोजन उच्च-थ्रूपुट संवेदनशीलता और विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति उपायों के साथ एकल-कोशिका संकल्प पर शारीरिक और फेनोटाइपिक विशिष्टता प्रदान करता है जो परिकल्पना पैदा करने वाले डेटासेट और यांत्रिक संभावनाओं दोनों को उत्पन्न करता है जो नवीन अंतर्दृष्टि और उपचार के अवसर उत्पन्न करते हैं।

Introduction

विकसित दुनिया में लत एक बढ़ती हुई चुनौती बनी हुई है 1,2. प्रमुख वैज्ञानिक और नैदानिक प्रगति के बावजूद, व्यसन की दर में वृद्धि जारी है, जबकि स्थापित उपचारों की प्रभावकारितासर्वोत्तम 3,4,5 पर स्थिर रहती है। हालांकि, जैव प्रौद्योगिकी और वैज्ञानिक दृष्टिकोण में प्रगति ने पदार्थ निर्भरता 6,7,8 के पैथोफिज़ियोलॉजी की जांच करने के लिए नए तरीकों और परिकल्पनाओं को जन्म दिया है। दरअसल, हाल के घटनाक्रमों से पता चलता है कि नई अवधारणाओं और उपचार प्रतिमानों से सामाजिक, आर्थिक और राजनीतिक परिणामों के साथ सफलताएं हो सकती हैं 9,10,11,12।

हमने शराब और ओपिओइड निर्भरता13,14,15,16 की वापसी में एंटीरिवॉर्ड की जांच की। विधियाँ इस प्रतिमान17,18 के लिए केंद्रीय हैं। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) उच्च शारीरिक विशिष्टता के साथ एकल कोशिकाओं का चयन कर सकता है। यह कार्यक्षमता न्यूरोइन्फ्लेमेशन एंटीरिवार्ड परिकल्पना का अभिन्न अंग है क्योंकि ग्लिया और न्यूरॉन्स दोनों को एक ही जानवर 13,14,15,16,19 में एक ही न्यूरोनल सबन्यूक्लियस से एकत्र और विश्लेषण किया जा सकता है। चयनित कोशिकाओं के प्रतिलेख के एक प्रासंगिक हिस्से को तब उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) के साथ मापा जा सकता है, जो कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए उच्च आयामी डेटासेट प्रदान करता है जो कार्यात्मक नेटवर्क20,21 में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

एक विशिष्ट मस्तिष्क नाभिक में न्यूरॉन्स और ग्लिया में ट्रांसस्क्रिप्टम के उप-समूह को मापना एक डेटासेट उत्पन्न करता है जो नमूना संख्या और जीन दोनों में मजबूत होता है और संवेदनशील और विशिष्ट होता है। ये उपकरण मनोवैज्ञानिक रोग के लिए एक प्रणाली के तंत्रिका विज्ञान दृष्टिकोण के लिए इष्टतम हैं क्योंकि ग्लिया, मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया, ने पिछले दशक22,23 में न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग रोग में एक केंद्रीय भूमिका का प्रदर्शन किया है। हमारा दृष्टिकोण स्थानीय पैराक्राइन सिग्नलिंग में शामिल कई रिसेप्टर्स और लिगेंड में ग्लिया और न्यूरॉन्स की अभिव्यंजक प्रतिक्रिया को माप सकता है। दरअसल, फजी लॉजिक24 जैसे विभिन्न मात्रात्मक तरीकों का उपयोग करके इन डेटासेट से सिग्नलिंग का अनुमान लगाया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स या ग्लिया में सेलुलर सबफेनोटाइप्स की पहचान और उनके कार्य इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि विशिष्ट नाभिक में मस्तिष्क कोशिकाएं एकल-कोशिका स्तर पर कैसे व्यवस्थित, प्रतिक्रिया और विनियमन करती हैं। इस कार्यात्मक प्रणाली की गतिशीलता को समय श्रृंखलाप्रयोगों 16 के साथ भी मॉडलिंग किया जा सकता है। अंत में, पशु मॉडल को इस प्रणाली के दृष्टिकोण के लिए एक यंत्रवत स्थिति देने के लिए शारीरिक या औषधीय रूप से परेशान किया जा सकता है।

प्रतिनिधि प्रयोग:
नीचे, हम इन विधियों के आवेदन का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। इस अध्ययन ने शराब निर्भरता और बाद में वापसी के जवाब में एकान्त नाभिक (एनटीएस) में चूहे न्यूरोनल और माइक्रोग्लिया जीन अभिव्यक्ति की जांचकी। चूहे के समूहों में 1) नियंत्रण, 2) इथेनॉल-निर्भर (ईटीओएच), 3) 8 एच निकासी (डब्ल्यूडी), 4) 32 एच डब्ल्यूडी, और 5) 176 एच डब्ल्यूडी (चित्रा 1 ए) शामिल थे। तेजी से विघटन के बाद, ब्रेनस्टेम को फोरब्रेन और क्रायोसेक्शन से अलग किया गया था, और टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज-पॉजिटिव (टीएच +) न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया (चित्रा 1 बी) के लिए स्लाइस दाग दिए गए थे। एलसीएम का उपयोग टीएच + और टीएच- न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया दोनों को इकट्ठा करने के लिए किया गया था। सभी कोशिकाएं एनटीएस से थीं और 10-सेल पूल के नमूने के रूप में विश्लेषण किया गया था। आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म पर 65 जीन (चित्रा 1 बी-सी) को मापने वाले चार 96 x 96 माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर गतिशील सरणी चलाए गए थे। डेटा को -1सीटी विधि का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था और आर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था, और एकल-सेल चयन को आणविक मार्करों (चित्रा 1 डी-ई) के साथ मान्य किया गया था। तकनीकी सत्यापन को एक बैच के भीतर और बैचों में विश्लेषण किए गए तकनीकी प्रतिकृतियों द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्रा 2 और चित्रा 3)। टीएच + और टीएच- न्यूरॉन्स समान भड़काऊ जीन समूहों के साथ विभिन्न उप फेनोटाइप में संगठित होते हैं, लेकिन अलग-अलग γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) रिसेप्टर (आर) क्लस्टर (चित्रा 4 और चित्रा 5)। भड़काऊ जीन समूहों की उच्च अभिव्यक्ति वाले उप फेनोटाइप ्स को 32 एच डब्ल्यूडी पर अधिक प्रतिनिधित्व दिया गया था, जबकि जीएबीए-रिसेप्टर (जीएबीएआर) अभिव्यक्ति लंबे समय तक शराब वापसी (176 एच डब्ल्यूडी) में कम रही। यह काम शराब और ओपिओइड निर्भरता की एंटीरिवार्ड परिकल्पना में योगदान देता है जो अनुमान लगाता है कि वापसी में विसरा से इंटरसेप्टिव फीडबैक आंत-भावनात्मक न्यूरोनल नाभिक (यानी, एनटीएस और एमिग्डाला) के डिसरेग्यूलेशन में योगदान देता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक गंभीर स्वायत्त और भावनात्मक सीक्वेल होते हैं, जो पदार्थ निर्भरता में योगदान करते हैं (चित्रा 6)।

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Protocol

यह अध्ययन थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) की सिफारिशों के अनुसार किया गया था। प्रोटोकॉल थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु मॉडल

  1. हाउस नर स्प्राग डॉवले (>120 ग्राम, हार्लन, इंडियानापोलिस, आईएन, यूएसए) चूहे अलग-अलग इथेनॉल-चाउ (2 चूहे) या कंट्रोल-चाउ मिश्रण (1 चूहा) तक मुफ्त पहुंच के साथ तीन गुना।
    नोट: इस प्रतिनिधि प्रयोग ने शराब वापसी25,26 के न्यूरोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए लिबर-डेकार्ली प्रोटोकॉल को नियोजित किया। चूहे के ट्रिपल में तीन-चूहे समूह होते हैं जिन्हें समान मात्रा में कैलोरी खिलाया जाता है, लेकिन बलिदान में अध्ययन की विभिन्न बाहों में समाप्त होता है। इस अध्ययन के लिए तीन भुजाएं हैं: 1) नियंत्रण, 2) इथेनॉल-निर्भर (ईटीओएच), और 3) वापसी (डब्ल्यूडी) (चित्रा 1 ए)। इस अध्ययन में पांच कुल स्थितियां हैं क्योंकि तीन शराब वापसी समय बिंदु हैं (चित्रा 1 ए)।
    1. हर दूसरे दिन, डब्ल्यूडी चूहे द्वारा खपत इथेनॉल-चाउ मिश्रण को मापें और ईटीओएच चूहे फीडर में इथेनॉल मिश्रण की समान मात्रा के साथ खपत की गई मात्रा को बदलें। नियंत्रण चूहे के फीडर में नियंत्रण मिश्रण की बराबर कैलोरी राशि जोड़ें।
      नोट: औसत दैनिक इथेनॉल की खपत 3 सप्ताह 26 के बाद लगभग12-16 ग्राम / किलोग्राम है।
    2. स्थिर दीर्घकालिक इथेनॉल खपत और निर्भरता (>5 सप्ताह) के बाद, अपने खाद्य कंटेनर को खाली करके और इसे नियंत्रण मिश्रण से भरकर डब्ल्यूडी चूहे में तीव्र शराब वापसी को प्रेरित करें। इसे इस तरह से करें कि सभी तीन चूहों को एक ही सर्कैडियन टाइम पॉइंट21 पर बलिदान किया जाता है।
    3. पूर्व-चुने गए समय बिंदु पर, एक ही समय बिंदु (नियंत्रण, ईटीओएच और डब्ल्यूडी) पर ट्रिपल में सभी तीन चूहों का बलिदान करें।

2. नमूना कटाई

  1. उचित डब्ल्यूडी समय बिंदु (8 घंटे, 32 घंटे, 176 घंटे) पर प्रत्येक चूहे ट्रिपल के लिए एक ही सर्कैडियन समय बिंदु पर मस्तिष्क का उत्पादन करें।
    1. आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए ताजा ऊतक के तेजी से ठंडा होने के लिए एक मेथनॉल और सूखी बर्फ स्नान तैयार करें। साइड में रखो।
    2. चूहे को ~ 30 सेकंड के लिए या चेतना की हानि होने तक आइसोफ्लुरेन टैंक (ऑक्सीजन में 5%) में रखें, जैसा कि कम श्वसन दर और मोटर गतिविधि की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है। चूहे के सिर को तेजी से सिर काटने के लिए ठीक से तेज किए गए गिलोटिन में डालें।
    3. बल का उपयोग करके मस्तिष्क को विच्छेदित करने के लिए जानवर की खोपड़ी खोलें। सेरिबैलम को ताजा मस्तिष्क से हाथ से पकड़े गए रेजर के साथ सकल टुकड़े करके निकालें और इसे त्याग दें। अनुप्रस्थ चीरा द्वारा, मस्तिष्क को मस्तिष्क से काट लें।
      नोट: एक हाथ से पकड़े गए रेजर का उपयोग प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बाएं और दाएं गोलार्धों में फोरब्रेन या ब्रेनस्टेम को अर्ध-संप्रदाय करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न तरीकों के साथ एक गोलार्ध से निष्कर्षों को मान्य करने के लिए, बाएं-दाएं विचलन की जांच करें, या नमूना संख्या में वृद्धि करें।
    4. ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड में लगभग 3-4 सेमी गहराई तक इष्टतम काटने का तापमान (ओसीटी) माध्यम जोड़ें ताकि ऊतक का नमूना पूरी तरह से डूबा हो सके। ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड में ऊतक, फोरब्रेन और / या ब्रेनस्टेम रखें और ऊतक के नमूने को पूरी तरह से कवर करने के लिए अधिक ओसीटी जोड़ें।
    5. ऊतक के नमूने को तुरंत फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ और मेथनॉल के शीतलन स्नान में ऊतक नमूना (चूहे के अग्रमस्तिष्क) युक्त प्लास्टिक ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड जोड़ें। एम्बेडिंग मोल्ड में ऊतक के नमूने को शीतलन स्नान में रहने दें जब तक कि ऊतक संग्रह पूरा न हो जाए लेकिन 15 मिनट से अधिक न हो।
      नोट: मेथनॉल को ऊतक कंटेनर में फैलने से रोकने के लिए सावधान रहें।
    6. -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक के नमूनों को तेजी से स्टोर करें।
      नोट: माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर एमआरएनए प्रतिलेख को बढ़ाकर और मापकर जीन अभिव्यक्ति को मापता है। ये प्रतिलेख अपेक्षाकृत अस्थिर हैं, इसलिए एमआरएनए क्षरण को रोकने के लिए नमूने को यथासंभव ठंडा रखने के लिए इस प्रक्रिया में कई कदम उठाए जाते हैं।

3. क्रायोसेक्शनिंग

नोट: एक चूहा न्यूरोनल नाभिक लगभग 10 μm है। इस प्रकार, 10 μm इस पशु मॉडल के लिए इष्टतम टुकड़ा मोटाई है। अध्ययन के लिए पशु मॉडल के अनुसार स्लाइस मोटाई को समायोजित किया जाता है।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से, ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड को बाहर निकालें जिसमें जमे हुए ब्रेनस्टेम होते हैं और 5-10 मिनट के लिए क्रायोस्टैट में -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को पिघलाएं। एमआरएनए संरक्षण के लिए केवल एक बार -20 डिग्री सेल्सियस तक इस फ्रीज-पिघलना करें।
  2. हाथ से पकड़े गए रेजर के साथ, प्लास्टिक एम्बेडिंग मोल्ड के कोनों को लंबवत रूप से काटें। प्लास्टिक ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड से ओसीटी में एम्बेडेड ब्रेनस्टेम को हटा दें। -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट क्रायोस्टेट के चक पर, कोरोनल क्रायोसेक्शनिंग के लिए रोस्ट्रल में ब्रेनस्टेम को पुच्छल दिशा में माउंट करने के लिए गोंद के रूप में कमरे के तापमान तरल ओसीटी का उपयोग करें।
  3. रोस्ट्रल में 10 μm कोरोनल क्रायोसेक्शन को चूहे के ब्रेनस्टेम से पुच्छल दिशा में काटें जब तक कि रुचि के क्षेत्र (एनटीएस) वाले खंडों तक नहीं पहुंच जाते। प्लास्टिक एम्बेडिंग मोल्ड के आयामों के आधार पर इन क्रायोसेक्शन की ऊंचाई और चौड़ाई ~ 200 मिमी है।
  4. कमरे के तापमान सादे ग्लास स्लाइड पर पिघला-माउंटिंग करके ब्रेनस्टेम ऊतक के 10 μm क्रायोसेक्शन एकत्र करें जिसमें एनटीएस, या अध्ययन के आधार पर रुचि का अन्य क्षेत्र शामिल है। जल्दी से, इन स्लाइडों को अनुभागों के साथ एक शीतलन धातु पैन में रखें जो सूखी बर्फ के शीर्ष पर स्थित है। जितनी जल्दी हो सके, भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में क्रायोसेक्शन युक्त ग्लास स्लाइड रखें।
    नोट: एक एकल ग्लास स्लाइड कई 10 μm क्रायोसेक्शन फिट कर सकती है क्योंकि चौड़ाई और ऊंचाई ~ 200 मिमी है। इस प्रकार, एक ही स्लाइड में क्रायोसेक्शन हो सकते हैं जो अलग-अलग सेल प्रकारों के लिए दागदार होते हैं।
    1. जब कई खंड स्लाइड पर होते हैं, तो सुनिश्चित करें कि वे 100 मिमी खाली स्थान से अलग हैं। क्रायोसेक्शन के बीच एक सीमा बनाने के लिए, हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें। यह एक ही ग्लास स्लाइड पर विभिन्न सेल प्रकारों के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी समाधानों को दागने की अनुमति देता है। ग्लास स्लाइड के किनारे से क्रायोसेक्शन के लिए 20 मिमी जगह बनाए रखें।

4. एकल कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना

  1. एलसीएम का उपयोग करके संग्रह के लिए वांछित मस्तिष्क सेल प्रकारों (न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स, आदि) को लेबल करने के लिए मस्तिष्क क्रायोसेक्शन पर तेजी से धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    नोट: इन प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग प्रोटोकॉल को इस प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त एमआरएनए गिरावट को रोकने के लिए तेजी से डिज़ाइन किया गया था।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से, एनटीएस युक्त चूहे के ब्रेनस्टेम के 10 μm क्रायोसेक्शन युक्त ग्लास स्लाइड ्स निकालें। क्रायोसेक्शन ऊतक को ठीक करने के लिए 75% इथेनॉल स्नान में 30 सेकंड के लिए स्लाइड करें। अतिरिक्त तरल को हटा दें।
    2. फिक्स्ड क्रायोसेक्शन्ड ब्रेनस्टेम ऊतक पर, एंटीबॉडी के अलक्षित बंधन को अवरुद्ध करने के लिए 30 सेकंड के लिए फॉस्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस) में 2% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) लागू करें। बाद में, पीबीएस के साथ धो लें।
    3. क्रायोसेक्शन ऊतक (अब तय और अवरुद्ध) को कवर करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की पर्याप्त मात्रा लागू करें। 2 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में ऊतक अनुभाग को इनक्यूबेट करें। ऊतक को 2% बीएसए समाधान के साथ एक बार धो लें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में ब्लॉकिंग के लिए बीएसए-पीबीएस समाधान का 96%, प्राथमिक एंटीबॉडी और 1% आरएनएस अवरोधक होता है। प्राथमिक एंटीबॉडी को 1: 25 के अनुपात में पतला किया गया था।
      नोट: इस प्रतिनिधि प्रयोग में, प्राथमिक एंटीबॉडी में एंटी-न्यून एंटीबॉडी और एंटी-सीडी 11 एंटीबॉडी शामिल हैं। न्यूरॉन्स को आगे टीएच + और टीएच-उपसमूहों में विभाजित किया गया था, इसलिए न्यूरोनल धुंधला होने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधानों में बीएसए पीबीएस समाधान का 93%, एंटी-न्यून एंटीबॉडी, 3% एंटी-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज एंटीबॉडी और 1% आरएनएस आउट शामिल था।
    4. ब्रेनस्टेम ऊतक को कवर करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 200) समाधान की पर्याप्त मात्रा लागू करें। द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को ऊतक को स्नान करने दें। 3 मिनट के बाद, ऊतक को 2% बीएसए समाधान के साथ एक बार धो लें।
      नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त समाधान 2% बीएसए के 196.5 μL, सेल प्रकार के लिए बकरी विरोधी माउस 555 nm फ्लोरोसेंट टैग के 1 μL, TH धुंधला होने के लिए 1 μL गधे विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 nm, 2.5 μL RNase अवरोधक, और DAPI (1: 10000) के 1.3 μL से बना था।

5. मानक इथेनॉल और जाइलीन ऊतक निर्जलीकरण श्रृंखला

  1. ग्लास स्लाइड रखें जिस पर दाग वाले क्रायोसेक्शन ऊतक 30 सेकंड के लिए 75% इथेनॉल स्नान में टिका हुआ है, इसके बाद 30 सेकंड के लिए 95% इथेनॉल स्नान, 30 सेकंड के लिए 100% इथेनॉल स्नान और अंत में 30 सेकंड (एक दूसरे कंटेनर में) के लिए 100% इथेनॉल दोनों में रखा जाता है।
  2. इथेनॉल निर्जलीकरण श्रृंखला को पूरा करने के बाद, दो ताजा 100% जाइलीन स्नान डालें। फिर, ग्लास स्लाइड को 1 मिनट के लिए पहले जाइलीन स्नान में रखें। तेजी से हटा दें और स्लाइड्स को 4 मिनट के लिए अन्य ताजा जाइलीन स्नान में रखें।
  3. जाइलीन से दाग और निर्जलित ऊतक क्रायोसेक्शन युक्त ग्लास स्लाइड लें और हवा में सूखने के लिए 5 मिनट के लिए एक अंधेरे लेकिन हवादार कंटेनर में रखें। हवा सूखने के बाद, अंतिम सुखाने के लिए 5 मिनट के लिए एक डेसिकेटर में ग्लास स्लाइड रखें।

6. लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) का उपयोग करके एकल कोशिकाओं का चयन करें

  1. एलसीएम माइक्रोस्कोप नमूना धारक में सना हुआ, स्थिर और निर्जलित ऊतक क्रायोसेक्शन युक्त ग्लास स्लाइड डालें। रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के लिए एनाटॉमिक लैंडमार्क का उपयोग करें जहां से सेल संग्रह होगा (इस प्रतिनिधि उदाहरण में एनटीएस)।
  2. माइक्रोस्कोप फ्लोरेसेंस चालू करें और रुचि के दाग वाले सेल प्रकार (ओं) का पता लगाएं। सुनिश्चित करें कि वांछित कोशिका का नाभिक रुचि के क्षेत्र में है और अन्य कोशिकाओं के नाभिक से >3 मिमी की दूरी से अलग है। एलसीएम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एकत्र करने के लिए एक सेल (यदि प्रयोग सही एकल-सेल है) या एकाधिक कोशिकाओं (यदि प्रयोग इस प्रतिनिधि प्रयोग में दिखाए गए एकल-सेल नमूने [यानी, एकल-सेल स्केल] के लिए कहता है) को पहचानें और चिह्नित करें।
    नोट: इस प्रतिनिधि प्रयोग में 10-सेल पूल वाले नमूने का उपयोग किया गया था। यह नमूनों के बीच जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनशीलता को कम करने और विश्लेषण किए गए एकल-कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए किया जाता है, हालांकि यह अभी भी एक एकल-सेल स्केल प्रयोग बना हुआ है। सच्चे एकल सेल प्रयोगों को इस विधि20,27 के साथ पूरा किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बड़े ऊतक वर्गों को भी चुना जा सकताहै।
  3. वांछित कोशिकाओं का चयन करने के बाद, एलसीएम रोबोट आर्म का उपयोग करें, चिह्नित ऊतक क्रायोसेक्शन पर रुचि के क्षेत्र पर एलसीएम कैप रखें।
  4. परीक्षण शॉट्स का उपयोग करके इन्फ्रारेड (आईआर) लेजर की तीव्रता और लक्ष्यीकरण को कैलिब्रेट करें।
    नोट: यह प्रत्येक नमूने के लिए किया जाता है। अंशांकन कैप के एक खंड पर किया जाना चाहिए जो सीधे ऊतक पर नहीं है ताकि गलती से गैर-प्रयोगात्मक ऊतक का चयन न किया जा सके।
    1. तीव्रता को कैलिब्रेट करने के लिए, आईआर लेजर शॉट की अवधि, ताकत और आकार को समायोजित करें ताकि एक शॉट केवल एक सेलुलर नाभिक का चयन करने के लिए पर्याप्त कैप चिपकने वाला पिघल जाए और स्लाइड पर क्रायोसेक्शन में कैप को पिघलाने के लिए भी पर्याप्त मजबूत हो। ये मान प्रत्येक टोपी के लिए अलग-अलग होंगे।
    2. लेजर क्रॉसहेयर को ठीक उसी स्थान पर स्थानीयकृत करके लक्ष्यीकरण को कैलिब्रेट करें जहां लेजर ने टोपी को पिघला दिया।
  5. उन कोशिकाओं पर क्रायोसेक्शन ऊतक पर टोपी को पिघलाने के लिए एलसीएम इन्फ्रारेड लेजर को फायर करके पहचानी गई कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि एलसीएम माइक्रोस्कोप के गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) क्षेत्र में टोपी का पता लगाने के लिए रोबोट हाथ का उपयोग करके ऊतक स्लाइस से केवल चयनित कोशिकाओं को उठाया गया था। कैप पर किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए, अतिरिक्त कोशिकाओं की आनुवंशिक सामग्री को मिटाने के लिए पराबैंगनी (यूवी) लेजर का उपयोग करें।
  6. एलसीएम सॉफ्टवेयर कैमरे के साथ शारीरिक विशिष्टता रिकॉर्ड करें। क्रायोसेक्शन ऊतक की एक तस्वीर स्नैप करें जिसमें से सेल (ओं) को हटा दिया गया था।
  7. ब्रेग्मा से इस ऊतक स्लाइस की दूरी निर्धारित करने के लिए एक शारीरिक एटलस (इस उदाहरण में चूहे के अग्रमस्तिष्क का एटलस) का उपयोग करें और इस जानकारी को जेड दूरी28 के रूप में रिकॉर्ड करें। चयनित कक्ष को पूरी तरह से स्थानीयकृत करने के लिए फ़ोटो से X और/या Y विमान में स्थान निर्धारित करें.
  8. हाथों से, क्यूसी क्षेत्र से एलसीएम टोपी को हटा दें। इसके बाद, नमूना निष्कर्षण डिवाइस को एलसीएम कैप पर बांधें। चयनित सेल (ओं) पर लाइसिस बफर के 5.5 μL को लागू करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। इसे अब नमूना के रूप में जाना जाता है।
    नोट: लाइसिस बफर समाधान 0.5 μL लाइसिस एन्हांसर के साथ 5 μL रीसस्पेंशन बफर से बना है।
  9. नमूना निष्कर्षण डिवाइस पर 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब फिट करें जो एलसीएम कैप से जुड़ा हुआ है। इस व्यवस्था को प्लेट के करीब नमूना और लाइसिस बफर के साथ 75 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर रखें। नमूना को 15 मिनट के लिए गर्म होने दें।
  10. नमूना और लाइसिस बफर को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल में घुमाने के लिए 0.01-0.02 x g पर कम गति वाले सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें। माइक्रोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. प्लेटफॉर्म पर माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर पर क्यूपीसीआर चिप चलाएं

  1. एकल-कोशिका नमूनों के लिए जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए, नीचे वर्णित एमआरएनए पूर्व-प्रवर्धन करें।
    नोट: प्रोटोकॉल में एमआरएनए निष्कर्षण शामिल नहीं है क्योंकि नमूने एकल कोशिकाएं हैं जिनमें आरएनए (10 पीजी) की बहुत कम मात्रा होती है, जो एमआरएनए अलगाव चरण के दौरान खो जाएगी। एकल कोशिकाओं को अलग किया जाता है और नमूना हानि को कम करने के लिए सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए आगे बढ़ाया जाता है।
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में परख किए जा रहे प्रत्येक जीन के लिए एमआरएनए क्यूपीसीआर जीन प्राइमर (आगे और पीछे) जोड़कर एक प्राइमर पूल बनाएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्राइमर की अंतिम एकाग्रता 500 एनएम है। इस उदाहरण प्रयोग में प्राइमर पूरक तालिका 1 16 में सूचीबद्ध हैं।
    2. पिपेट 1 5x cDNA प्रतिक्रिया का 1 μL 96-वेल पीसीआर प्लेट के हर कुएं में मिश्रित होता है।
    3. एकल-कोशिका नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से निकालकर और उन्हें कमरे के तापमान पर बैठने देकर संक्षेप में (2-3 मिनट) पिघलने दें। 20-30 सेकंड के लिए नमूने को स्पिन करने के लिए 0.01-0.02 x g पर कम गति वाले सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।
      नोट: इस चरण को शुरू करने से पहले प्रत्येक कुएं में डाली जाने वाली नमूना संख्या और प्रकार निर्धारित किया जाता है।
    4. 96-वेल पीसीआर प्लेट में अब सीडीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण है और प्रत्येक कुएं में एक एकल-सेल नमूना जोड़ा गया है। सीडीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण को सक्रिय करने के लिए इस प्लेट को 65 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिनट के लिए थर्मोसाइक्लर में रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 1,300 x g पर उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके सामग्री को स्पिन करें और पीसीआर प्लेट को गीली बर्फ पर रखें।
    5. पीसीआर प्लेट में प्रत्येक कुएं में, टी 4 जीन 32 प्रोटीन का पिपेट 0.12 μL, डीएनए निलंबन बफर का 0.73 μL, और 10x cDNA संश्लेषण मास्टर मिश्रण का 0.15 μL। थर्मोसाइक्लर में निम्नलिखित प्रोटोकॉल के माध्यम से पीसीआर प्लेट चलाएं: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 25 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम पकड़।
      नोट: टी 4 जीन 32 प्रोटीन (एक एकल-फंसे हुए डीएनए (एसएसडीएनए) बाध्यकारी प्रोटीन) बैक्टीरियोफेज टी 4 प्रतिकृति और मरम्मत के लिए आवश्यक है। टी 4 जीन 32 प्रोटीन का उपयोग प्रोटोकॉल के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की उपज और दक्षता में सुधार करने और पीसीआर उत्पाद उपज को बढ़ाने के लिए किया गया था।
    6. पीसीआर प्लेट में प्रत्येक कुएं में, टैक पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण का 7.5 μL पिपेट। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में, चरण 7.1.1 में बनाए गए प्राइमर पूल का 1.5 μL। थर्मोसाइक्लर में निम्नलिखित रैखिक प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण के माध्यम से पीसीआर प्लेट चलाएं: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 22 चक्र: 5 सेकंड के लिए 96 डिग्री सेल्सियस और 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
    7. पीसीआर प्लेट में प्रत्येक कुएं में, 1.2 μL एक्सॉनोक्लिज़ I, 4.2 μL डीएनए निलंबन बफर और 0.6 μL 10x एक्सोन्यूक्लिज़ I प्रतिक्रिया बफर का उपयोग करें। थर्मोसाइक्लर में निम्नलिखित प्रोटोकॉल के माध्यम से पीसीआर प्लेट चलाएं: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: एक्सोन्यूक्लिज़ 3 ' से 5 ' दिशा में रैखिक एकल-फंसे डीएनए से न्यूक्लियोटाइड को हटाने के लिए उत्प्रेरित करता है। हम अनिगमित प्राइमरों और किसी भी एकल-फंसे हुए सीडीएनए को हटाने के लिए नमूना सफाई के लिए एक्सोन्यूक्लिज़ का उपयोग करते हैं जो पूर्व-प्रवर्धन के बाद मौजूद हो सकते हैं।
    8. पीसीआर प्लेट में प्रत्येक कुएं में, टीई बफर के 54 μL पिपेट। पीसीआर प्लेट की सामग्री को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,300 x g पर एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।
    9. प्रोटोकॉल के अगले चरण को जारी रखने की योजना बनाते समय, पीसीआर प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें। यदि पूर्व-प्रवर्धन चरण के पूरा होने और माइक्रोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर के शुरू होने के बीच 12 घंटे से अधिक हैं, तो क्यूपीसीआर प्लेट को कवर करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  2. क्यूपीसीआर चिप के लिए नमूना प्लेट (नई 96-वेल पीसीआर प्लेट) बनाएं जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. यदि चरण 7.1 से पूर्व-प्रवर्धन पीसीआर प्लेट को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा गया था, तो हटा दें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पिघलने दें।
    2. एक नई 96-वेल पीसीआर प्लेट में, प्रत्येक कुएं में पीसीआर सुपरमिक्स लो रॉक्स के 4.55 μL और 20x डीएनए बाइंडिंग डाई के 0.45 μL में पाइपेट करें। फिर, चरण 7.1 में बनाई गई पीसीआर प्लेट से पूर्व-प्रवर्धित नमूने का पिपेट 3 μL। पीसीआर प्लेट को नीचे घुमाने और पीसीआर नमूना प्लेट को बर्फ पर रखने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,300 x g पर उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करें।
  3. क्यूपीसीआर चिप के लिए एक परख प्लेट (एक नई 96-वेल पीसीआर प्लेट) बनाएं जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. एक नई 96-वेल पीसीआर प्लेट में, प्रत्येक कुएं में 1.25 μL डीएनए सस्पेंशन बफर और 3.75 μL 2x परख लोडिंग अभिकर्मक में प्रवेश करें। फिर, संबंधित क्यूपीसीआर प्राइमर को 10 μM प्राइमर के 2.5 μL पर रखें। पीसीआर प्लेट को नीचे घुमाने और पीसीआर परख प्लेट को बर्फ पर रखने के लिए 5 मिनट के लिए 1,300 x g पर उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।
  4. माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म में लोड करने के लिए क्यूपीसीआर चिप तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    नोट: क्यूपीसीआर चिप एक वास्तविक समय क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म है जो माइक्रोफ्लुइडिक सिद्धांतों पर काम करता है। क्यूपीसीआर चिप अनिवार्य रूप से 96 नमूना चैनलों और 96 आरएनए क्यूपीसीआर प्राइमर चैनलों (यानी, परख) का एक मैट्रिक्स है जो 9,216 (96 x 96) कक्षों में प्रतिच्छेद करता है। सरणी के प्रत्येक कक्ष में एक नमूना और एक विशिष्ट परख संयुक्त होती है जिसमें वास्तविक समय क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया होती है। रीडआउट को उपयोग किए गए प्राइमरों के लिए थ्रेशोल्ड चक्र (सीटी) मानों और प्रवर्धन भूखंडों के रूप में उत्पन्न किया जाता है।
    1. प्राइमिंग के लिए क्यूपीसीआर चिप में नियंत्रण रेखा द्रव इंजेक्ट करें। क्यूपीसीआर चिप को माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस में डालें। प्राइम (136x) स्क्रिप्ट का चयन करें और इस प्रोग्राम को चलाएँ।
    2. जब प्रोग्राम ~ 45 मिनट के बाद पूरा हो जाता है, तो प्राइमेड क्यूपीसीआर चिप को हटा दें। प्राइमेड क्यूपीसीआर चिप में, पीसीआर नमूना प्लेट से क्यूपीसीआर चिप में संबंधित नमूने में प्रतिक्रिया का 6 μL।
    3. प्राइमेड क्यूपीसीआर चिप में, पीसीआर परख प्लेट से क्यूपीसीआर चिप में संबंधित परख में प्रतिक्रिया का 6 μL।
      नोट: क्यूपीसीआर चिप में नमूने और परख कुओं के निचले भाग में हवा के बुलबुले बन सकते हैं, जो माइक्रोफ्लुइडिक नाली में प्रवेश करने वाले समाधानों को रोक सकते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस में क्यूपीसीआर चिप डालने से पहले इन हवा के बुलबुले को पॉप या हटाने के लिए एक तेज सुई का उपयोग किया जा सकता है।
    4. क्यूपीसीआर चिप को माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस में डालें। लोड मिश्रण (136x) स्क्रिप्ट का चयन करें और इस प्रोग्राम को चलाएँ।
  5. माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म में क्यूपीसीआर चिप लोड करें।
    1. माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म चालू करें और बल्ब को गर्म करें (~ 20 मिनट)। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस से क्यूपीसीआर चिप को हटा दें। क्यूपीसीआर चिप के नीचे से सुरक्षात्मक स्टिकर को छीलें।
    2. माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म खोलें और क्यूपीसीआर चिप को माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म में लोड करें। माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म पर तेजी से 96 x 96 पीसीआर प्रोटोकॉल (30 चक्र) चलाएं।
    3. डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें-नया रन प्रारंभ करें पर क्लिक करें.
    4. चिप बारकोड की जाँच करें और अगला पर चिप प्रकार-क्लिक करें। चिप रन फ़ाइल पर क्लिक करें और डेटा संग्रह संग्रहण के लिए फ़ाइल स्थान ब्राउज़ करें.
    5. एप्लिकेशन प्रकार पर क्लिक करें और जीन अभिव्यक्ति का चयन करें; निष्क्रिय संदर्भ के लिए आरओएक्स का चयन करें, सिंगल प्रोब का चयन करें और जांच प्रकार के लिए ईवाग्रीन का चयन करें।
    6. थर्मल साइक्लिंग प्रोग्राम का चयन करने के लिए क्लिक करें और बायोमार्क एचडी का चयन करें: GE Fast 96x96 PCR + Melt v2.pcl फ़ाइल।

8. डेटा विश्लेषण

  1. क्यूपीसीआर चिप से डेटा अपलोड करें जो क्यूसी के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर चलता है जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें। यह निम्नलिखित वेबसाइट पर पाया जा सकता है: https://www.fluidigm.com/products-services/software # माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
    2. सॉफ़्टवेयर के भीतर, चिप रन खोलें। उसके बाद, CHIPRun.bml फ़ाइल खोलें जो प्रयोग द्वारा बनाई गई थी। निष्क्रिय संदर्भ, जांच और पीसीआर थर्मल प्रोग्राम सहित प्रयोगात्मक विवरणों के साथ एक विंडो दिखाई देगी।
      नोट: गुणवत्ता नियंत्रण (QC) और डेटा विश्लेषण माइक्रोफ्लुइडिक RT-qPCR प्लेटफ़ॉर्म से जुड़े कंप्यूटर पर या फ्लैश ड्राइव या अन्य माध्यमों से .bml फ़ाइल को एक अलग कंप्यूटर पर स्थानांतरित करके किया जा सकता है।
  2. नीचे वर्णित नमूना सेटअप को परिभाषित करें।
    नोट: यह चरण गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं के लिए नमूने और परख (क्यूपीसीआर प्राइमर) का एक लेबल टेम्पलेट बनाता है।
    1. नमूना प्लेट सेटअप > चिप एक्सप्लोरर का चयन करें और एक नई नमूना प्लेट बनाएँ। उपयुक्त कंटेनर प्रकार और कंटेनर प्रारूप का चयन करें (इस प्रतिनिधि प्रयोग में उपयोग की जाने वाली 96-वेल प्लेट के लिए एसबीएस 96)।
    2. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार सॉफ्टवेयर स्प्रेडशीट में नमूना लेबल पेस्ट करें और कार्य मेनू से मानचित्र का चयन करें। SBS96-Left.dsp का चयन करें। नमूना सेटअप अब मैप किया गया है। फ़ाइल में इन परिवर्तनों को अद्यतन करने के लिए विस्तृत दृश्य > विश्लेषण का चयन करें.
      नोट: इस सॉफ़्टवेयर में किए गए किसी भी परिवर्तन को तब तक सहेजा नहीं जाएगा जब तक कि विश्लेषण बटन क्लिक नहीं किया जाता है।
  3. सॉफ़्टवेयर में नियंत्रण नमूने निर्धारित करें। चयन के लिए कक्षों के माध्यम से खींचते समय बाएं क्लिक और पकड़ कर नियंत्रण नमूने के लिए कक्षों का चयन करें. अलग-अलग कोशिकाओं को Ctrl कुंजी दबाकर और पकड़कर और अलग-अलग कक्षों पर क्लिक करके चुना जा सकता है। आरएनए मानक नमूने (तनुकरण श्रृंखला) के लिए, नमूना नाम और उपयोग किए गए आरएनए एकाग्रता दर्ज करें। सहेजने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें।
  4. ऊपर दिए गए चरण 8.2 के समान स्थापित डिटेक्टर को परिभाषित करें, लेकिन आरटी-क्यूपीसीआर परख नामों के साथ, यानी, जीन के नाम परख किए गए। डिटेक्टर प्लेट सेटअप का चयन करें और एक नई परख प्लेट बनाएं। उपयुक्त कंटेनर प्रकार और प्रारूप का चयन करें (96-वेल प्लेट के लिए एसबीएस 96)। प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार परख नाम पेस्ट करें और सहेजने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें।
  5. उपयोगकर्ता गुणवत्ता नियंत्रण (QC) प्रक्रिया शुरू करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    नोट: इस प्रतिनिधि प्रयोग ने एक चक्र समय (सीटी) थ्रेशोल्डिंग विधि का उपयोग किया। यही है, जो नमूने सॉफ्टवेयर (ऑटो ग्लोबल) या मैन्युअल रूप से (उपयोगकर्ता ग्लोबल) द्वारा परिभाषित थ्रेशोल्ड सिग्नल तक नहीं पहुंचे, उन्हें असफल प्रतिक्रियाएं माना जाएगा और डेटासेट में शामिल नहीं किया जाएगा।
    1. विश्लेषण दृश्य > कार्य फ़्रेम का चयन करें. विश्लेषण सेटिंग्स फलक में, सेटिंग्स को Auto Global (स्वचालित रूप से संपूर्ण चिप पर लागू सीमा की गणना करता है) या User Global में बदलें. बेसलाइन सुधार को रैखिक व्युत्पन्न पर सेट करें। यदि User Global का उपयोग किया जाता है, तो विफलता सीमा को प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में मैन्युअल रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
    2. इस प्रतिनिधि प्रयोग ने क्यूसी नियम का उपयोग निम्नानुसार किया: यदि किसी व्यक्तिगत परख या नमूने में 70% या उससे अधिक की विफलता दर थी, तो डेटासेट में वह पूरी पंक्ति या कॉलम विफल हो गया था।
    3. मैन्युअल रूप से 96 x 96 चिप में प्रत्येक प्रतिक्रिया की समीक्षा करें। प्रवर्धन वक्रों और पिघल वक्रों की कल्पना करें ताकि यह माना जा सके कि प्रत्येक प्रतिक्रिया अपेक्षित क्यूपीसीआर पैटर्न का पालन करती है या नहीं। यदि प्रवर्धन या पिघल वक्र अपेक्षित के साथ मेल नहीं खाता है, तो उस प्रतिक्रिया को विफल करें।
  6. QC के बाद, फ़ाइल > निर्यात का चयन करके डेटा निर्यात करें और डेटासेट को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  7. डेटासेट को प्रून करें क्योंकि निर्यात की गई .csv फ़ाइल में पास-फेल मैट्रिक्स और कच्चे सीटी मानों के साथ मैट्रिक्स दोनों हैं। डेटा सेट में किसी भी विफल कक्ष को NA से बदलने के लिए Pass-Fail मैट्रिक्स का उपयोग करें।
  8. ओपन-सोर्स R सॉफ़्टवेयर का सबसे अद्यतित संस्करण डाउनलोड करें, और उसके बाद R-Studio अनुप्रयोग डाउनलोड करें। सामान्यीकृत डेटासेट को आर में अपलोड करें अध्ययन के लिए उपयुक्त डेटा का विश्लेषण करें।
  9. नीचे वर्णित के रूप में -3सी टी विधि का उपयोग करके डेटासेट को सामान्य करें।
    नोट: मेडियन सेंटरिंग या हाउसकीपिंग जीन सामान्यीकरण का उपयोग -ऍसी टी मान उत्पन्न करने के लिए नमूना पंक्ति में किया जासकता है । प्रतिनिधि प्रयोग में, हाउसकीपिंग जीन सामान्यीकरण द्वारा औसत केंद्रीकरण का उपयोग और मान्य किया गया था। यह .csv प्रारूप में या डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर अपलोड करके किया जा सकता है।
    1. औसत केंद्रीकरण के लिए, एक व्यक्तिगत नमूने (10-सेल पूल) के लिए सभी सीटी मानों से गणना किए गए औसत सीटी मान की गणना करें। फिर, इस औसत मान से सभी अलग-अलग सीटी मानों को घटाएं। यह एक -3सी टी मान उत्पन्नकरता है ।
    2. हाउसकीपिंग जीन सामान्यीकरण के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए हाउसकीपिंग जीन (प्रतिनिधि प्रयोग में एक्टबी, गैप्ड और एलडीएच ) की औसत अभिव्यक्ति की गणना करें और इस मान का उपयोग उस के रूप में करें जिसमें से व्यक्तिगत सीटी मानों को घटाया जाए।
    3. एक -3सीटी मान उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक परख कॉलम का औसत लें, जिसमें अब -1सीटी मान है। प्रत्येक -3सीटी मान से परख माध्य को घटाएं ताकि -3सी टी मान का उत्पादनकिया जा सके ।
  10. R में स्केल फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रत्येक -3Ct मान के लिए z-स्कोर की गणना करें। हीट मैप उत्पन्न करने के लिए R हीट मैप फ़ंक्शन या एक अलग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
  11. प्रत्येक जीन के बीच पियर्सन सहसंबंधों की गणना करने के लिए पियरसन सहसंबंध फ़ंक्शन का उपयोग करें। अन्य कार्यक्षमता के लिए डेटासेट को व्यवस्थित करने के लिए आर में पिघल फ़ंक्शन का उपयोग करें। इस डेटा को निर्यात करें और इसे जीन सहसंबंध नेटवर्क सॉफ्टवेयर में अपलोड करें।

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Representative Results

एकल-सेल संग्रह का सत्यापन एलसीएम प्रक्रियाओं के दौरान नेत्रहीन रूप से किया जाता है। क्यूसी स्टेशन पर सेल नाभिक का मूल्यांकन किया जाता है। सेल प्रकार को उस सेल प्रकार और इसकी सामान्य आकृति विज्ञान के लिए टैग किए गए फ्लोरोफोरे के उत्सर्जन से निर्धारित किया जा सकता है। यदि टोपी पर गैर-वांछित कोशिकाओं का चयन किया गया है, तो उनकी आनुवंशिक सामग्री को क्यूसी स्टेशन पर यूवी लेजर के साथ नष्ट किया जा सकता है। आणविक विश्लेषण द्वारा आगे सत्यापन भी आवश्यक है। इस प्रतिनिधि उदाहरण16 में, माइक्रोग्लिया के अलावा, दो प्रकार के न्यूरॉन्स का चयन किया गया था- टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) पॉजिटिव (+) और टीएच नेगेटिव (-)। चित्रा 1 डी दर्शाता है कि न्यूरॉन्स होने वाले नमूनों ने न्यूरोनल मार्कर, न्यूएन की सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण ऊंची अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। समवर्ती रूप से, माइक्रोग्लियल नमूनों में माइक्रोग्लियल मार्कर, सीडी 34 और सीएक्स 3 एक्सआर 1 की महत्वपूर्ण ऊंचाई थी, यह सुझाव देते हुए कि नमूना चयन उच्च निष्ठा के साथ किया गया था। इसके अतिरिक्त, टीएच + न्यूरोनल नमूनों ने टीएच-न्यूरोनल नमूनों और माइक्रोग्लिया नमूनों की तुलना में टीएच की काफी ऊंची अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जबकि टीएच-न्यूरॉन्स ने जीसीजी (एक प्रीप्रोग्लूकागन कोडिंग जीन) की काफी ऊंची अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जिससे पता चलता है कि ये टीएच-न्यूरोनल नमूने न्यूरॉन्स से समृद्ध हैं जो जीएलपी -1 को न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में उपयोग करते हैं (चित्रा 1 डी)। ). रैखिक भेदभाव विश्लेषण के रूप में जाना जाने वाला एक अधिक वैश्विक कम्प्यूटेशनल उपाय से पता चला है कि इन तीन सेल प्रकारों में एक्स-अक्ष और टीएच + और टीएच-न्यूरोनल नमूनों के साथ अलग-अलग न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया के साथ मापा गया सभी 65 जीनों में अलग-अलग जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल थे (चित्रा 1 ई)।

डेटा की गुणवत्ता को इंट्रा और इंटर-बैच तकनीकी प्रतिकृति (चित्रा 2 और चित्रा 3) के साथ भी मान्य किया गया था। इंट्रा-बैच उस विशिष्ट बैच से डेटा की गुणवत्ता के लिए नियंत्रण दोहराता है। यदि इंट्रा-बैच प्रतिकृतियां संरेखित नहीं होती हैं, तो एक और क्यूपीसीआर चिप प्रयोग उसी नमूने और परख प्लेटों से किया जा सकता है जो पहले बैच को चलाने के लिए बनाए गए थे। इंटर-बैच प्रतिकृतियां सुनिश्चित करती हैं कि सभी बैचों के डेटा की तुलना की जा सकती है। यह उन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है जिनमें बड़ी संख्या में नमूनों की परख की जाती है, जिसमें इस प्रतिनिधि उदाहरण जैसे कई बैचों की आवश्यकता होती है। बैच 4 (चित्रा 3) में नमूना 40 के रूप में इस प्रयोग में एक आउटलायर था। हालांकि, बैच 1, 2 और 3 में नमूना 40 सही ढंग से संरेखित किया गया है, और बैच 4 से अन्य प्रतिकृतियां बैच 1, 2 और 3 के साथ संरेखित हैं, यह सुझाव देते हुए कि यह एक अलग खराब प्रतिक्रिया थी, जो इस एक प्रतिकृति में हुई थी। बैचों में तुलना करने के लिए उचित डेटा सामान्यीकरण तकनीकों की भी आवश्यकता होती है। इस प्रयोग ने औसत केंद्रीकरण का उपयोग किया, हालांकि हाउसकीपिंग जीन (एक्टबी, गैप्ड, एलडीएच), को भी इस प्रयोग में परख लिया गया और औसत-केंद्रीकरण विधि के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य किया गया। यही है, दोनों विधियों ने उच्च डेटा गुणवत्ता का सुझाव देते हुए अत्यधिक अनुरूप डेटासेट प्राप्त किए।

चित्रा 4 जीएलपी -1 समृद्ध न्यूरोनल नमूनों का एक गर्मी मानचित्र प्रदर्शित करता है जो सेलुलर सबफेनोटाइप द्वारा आयोजित किया जाता है। यह आंकड़ा न केवल न्यूरोबायोलॉजी में सेलुलर सबफेनोटाइप्स के महत्व को प्रदर्शित करता है, बल्कि यह भी दर्शाता है कि शराब वापसी के माध्यम से सबफेनोटाइप के अनुपात कैसे बदलते हैं। हीट मैप से पता चलता है कि सबफेनोटाइप ए, जो भड़काऊ जीन क्लस्टर 1 को अत्यधिक व्यक्त करता है, 8 एच डब्ल्यूडी समय बिंदु पर अनुपात में बढ़ता है और अधिकतम 32 एच डब्ल्यूडी तक पहुंचता है। 176 एचडब्ल्यूडी तक, यह भड़काऊ सबफेनोटाइप इसके प्रसार को नियंत्रण में वापस सामान्य कर रहा है। सबफेनोटाइप बी, जो जीएबीएआर जीन क्लस्टर 2 को अत्यधिक व्यक्त करता है, 176 एच डब्ल्यूडी स्थिति द्वारा इस जीन क्लस्टर की अभिव्यक्ति में समग्र दमन को दर्शाता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि यह जीएलपी -1 न्यूरोनल सेल प्रकार अपने भड़काऊ सबफेनोयप को बढ़ाकर और शराब वापसी के दौरान अपने जीएबीए सबफेनोटाइप में जीएबीएआर की अभिव्यक्ति के स्तर को समवर्ती रूप से कम करके हाइपरएक्साइटेबल कैसे हो जाता है। चित्रा 5 व्यक्तिगत नमूनों की जीन अभिव्यक्ति को औसत में जोड़ता है ताकि जीन के समूहों की अभिव्यक्ति और उस जीन प्रतिलेख के प्रोटीन के स्थान को पूरे समय श्रृंखला में देखा जा सके।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक डिजाइन और एकल-कोशिका चयन। (A) रैट ट्रिपल को यादृच्छिक रूप से पांच उपचार स्थितियों में से एक को सौंपा गया था। (बी) एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टम डेटा उत्पादन। (सी) जांच किए गए जीन और उनके कार्य का कार्टून प्रतिनिधित्व। हरे रंग में जीन की परख नहीं की गई थी। आधिकारिक जीन प्रतीक का उपयोग किया जाता है। (डी) सेल प्रकार मार्करों की जीन अभिव्यक्ति। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि दिखाती हैं. माइक्रोग्लिया की तुलना में न्यूरॉन्स, पी-मान = 0.0273, 3.94 x 10-10, 7.73 x 10-12, क्रमशः। Th+ न्यूरॉन्स ने Th - न्यूरॉन्स (p = 4.56 x 10-11) और माइक्रोग्लिया (p = 2.95678 x 10-15) की तुलना में ऊंचा Th अभिव्यक्ति दिखाई। टीएच- न्यूरॉन्स ने टीएच + न्यूरॉन्स (पी = 0.0106) और माइक्रोग्लिया (पी = 0.0435) की तुलना में जीसीजी की उच्च अभिव्यक्ति दिखाई, यह दर्शाता है कि वे जीएलपी -1 + न्यूरॉन्स हैं। * पी < 0.05, *** पी < 4 x 10-10। (ई) सभी नमूनों का रैखिक भेदभाव विश्लेषण दो-आयाम स्थान में एकत्र किए गए तीन सेल प्रकारों के बीच मापा गया सभी जीनों में अंतर प्रदर्शित करता है। एनई न्यूरॉन्स और जीएलपी -1 न्यूरॉन्स के बीच केन्द्रक दूरी = 3.30, एनई न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया = 1.57, जीएलपी -1 न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया = 2.92। इस आंकड़े को ओ'सुलिवन एट अल 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक बैच के भीतर कच्चे सीटी मानों के तकनीकी प्रतिकृति भूखंड। प्रत्येक ग्राफ तकनीकी प्रयोगात्मक अखंडता का प्रदर्शन करने वाले एक दूसरे के खिलाफ प्लॉट किए गए इंट्राचिप तकनीकी प्रतिकृति के लिएकच्चे सीटी मान प्रदर्शित करता है। इस आंकड़े को ओ'सुलिवन एट अल 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: बैचों के बीच कच्चे सीटी मानों के तकनीकी प्रतिकृति भूखंड। प्रत्येक ग्राफ इंटरचिप तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए कच्चे सीटी मानों को प्रदर्शित करता है जो एक दूसरे के खिलाफ प्लॉट किएजाते हैं, यह दर्शाता है कि सभी बैच एक दूसरे के बराबर हैं। इस आंकड़े को ओ'सुलिवन एट अल 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: जीएलपी -1 समृद्ध न्यूरोनल नमूने का गर्मी मानचित्र। हीट मैप अल्कोहल वापसी समय श्रृंखला के माध्यम से जीएलपी -1 समृद्ध न्यूरॉन नमूनों के सेलुलर सबफेनोटाइप प्रदर्शित करता है। पंक्तियाँ ऊपरी अक्षरों के साथ लेबल किए गए सेलुलर सबफेनोटाइप क्लस्टर के साथ 10-सेल पूल किए गए नमूनों का प्रतिनिधित्व करती हैं। कॉलम उस नमूने में उस जीन के लिए -1 से +1 रंगपैमाने पर -1 से +1 जीन अभिव्यक्ति मूल्यों के जेड-स्कोर का प्रतिनिधित्व करते हैं। जीन क्लस्टर को संख्या द्वारा लेबल किया जाता है। इस आंकड़े को ओ'सुलिवन एट अल 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जीएलपी -1 समृद्ध न्यूरोनल नमूनों में सुफेनोटाइप जीन अभिव्यक्ति। सेलुलर आरेख चित्र 4 में हीटमैप में दिखाए गए सबफेनोटाइप्स के सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति (-एओसी टी मानों का औसत जेड-स्कोर) का प्रतिनिधित्व करने वालेबक्से प्रदर्शित करते हैं। आरेखों का निर्माण साइटोस्केप संस्करण 3.8.0 का उपयोग करके किया गया था और जेड-स्कोर की गणना आर संस्करण 3.5.2 में स्केल फ़ंक्शन का उपयोग करके की गई थी। दाईं ओर टी लेबल दिखाते हैं कि कौन सेबक्से किस जीन के अनुरूप हैं और रंग अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है (नीला कम अभिव्यक्ति है और पीला उच्च अभिव्यक्ति है)। बॉक्स का स्थान उस जीन प्रतिलेख से प्रोटीन उत्पाद के स्थानीयकरण या कार्य का प्रतिनिधित्व करता है। हरी संख्याएं सबफेनोटाइप के भीतर उपसमूहों को इंगित करती हैं। इस आंकड़े को ओ'सुलिवन एट अल 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: इंटरोसेप्टिव वेगल सर्किट, आंत-भावनात्मक न्यूरेक्सिस, और व्यसन के विरोधी-प्रक्रिया मॉडल का योजनाबद्ध। (ए) इंटरोसेप्टिव वेगल अभिवाही आंत की स्थिति को रिले करते हैं, जो आंत माइक्रोफ्लोरा और अन्य परिधीय अंगों से न्यूक्लियस ट्रैक्टस सोलिटेरियस (एनटीएस) से अत्यधिक प्रभावित होता है। यह जानकारी बाद में एमिग्डाला को रिले की जाती है और भावनात्मक स्थितियों को प्रभावित करती है। (बी) भावना, तनाव और स्वायत्त विनियमन में न्यूक्लियस ट्रैक्टस सोलिटेरियस (एनटीएस) और एमिग्डाला (सीईए) के केंद्रीय नाभिक की एकीकृत भूमिकाओं को दिखाने वाला एक सरलीकृत कार्टून प्रतिनिधित्व। दो न्यूरोनल उपप्रकार, जीएलपी -1 और एनई न्यूरॉन्स पर प्रकाश डाला गया है। स्पष्टता के लिए कई शारीरिक और कार्यात्मक कनेक्शन छोड़ दिए जाते हैं। संक्षिप्तीकरण: एनई = नॉरपेनेफ्रिन; जीएलपी -1 = ग्लूकागन जैसा पेप्टाइड 1; जीएबीए = γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड; एचपीए अक्ष = हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी-एड्रेनल अक्ष; सीआरएफ = कॉर्टिकोट्रोपिन रिलीजिंग हार्मोन। (सी) शराब और / या ओपिओइड एक्सपोजर की दो क्रियाएं होती हैं: मेसोलिम्बिक डोपामाइन मार्ग के माध्यम से इनाम को प्रोत्साहित करें, और एंटीरिवार्ड को रोकें। ये क्रियाएं सकारात्मक सुदृढीकरण के माध्यम से पदार्थ के उपयोग को प्रेरित करती हैं। (डी) शराब और / या ओपिओइड वापसी के दो कार्य हैं: मेसोलिम्बिक डोपामाइन मार्ग (नहीं दिखाया गया) को रोककर इनाम को रोकना और एंटीरिवॉर्ड को उत्तेजित करना। इस अध्ययन का प्रस्ताव है कि आंत-भावनात्मक न्यूरोइन्फ्लेमेशन एंटीरिवार्ड उत्तेजना में एक समापन बिंदु है, हालांकि यह परिकल्पना आगे के परीक्षण की आवश्यकता है। ये क्रियाएं, जो भी तंत्र हैं, नकारात्मक सुदृढीकरण के माध्यम से पदार्थ निर्भरता को प्रेरित करती हैं। इस आंकड़े को ओ'सुलिवन एट अल 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के लिए प्राइमर। एमआरएनए प्रवर्धन के लिए सभी प्राइमर जोड़े प्रत्येक प्राइमर जोड़ी द्वारा गठित एम्प्लिकॉन लंबाई के साथ सूचीबद्ध हैं। इस तालिका को ओ'सुलिवन एट अल. 202116 से संशोधित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

शराब का उपयोग विकार इलाज के लिए एक चुनौतीपूर्ण बीमारी बनी हुई है। हमारे समूह ने सिस्टम न्यूरोसाइंस परिप्रेक्ष्य के साथ एंटीरिवॉर्ड प्रक्रियाओं की जांच करके इस विकार से संपर्क किया है। हमने अल्कोहल वापसी समय श्रृंखला16 में एकल एनटीएस न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को मापा। एनटीएस को अल्कोहल वापसी सिंड्रोम में होने वाले स्वायत्त विकृति में इसकी प्रमुख भूमिका के लिए चुना गया था। हम एलसीएम को एकल-कोशिका माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के साथ जोड़ते हैं, जिससे शारीरिक और आणविक संवेदनशीलता और विशिष्टता (चित्रा 1 बी-सी) के साथ कम लागत पर नमूनों और जीनों की मजबूत संख्या को मापा जा सकता है। एकल-कोशिकाओं की पहचान और चयन आईएचसी धुंधला द्वारा किया गया था, और इन सेलुलर सबफेनोटाइप समूहों को आणविक अभिव्यक्ति (चित्रा 1 डी-ई) के साथ मान्य किया गया था। हालांकि, कुछ जीएलपी -1 समृद्ध न्यूरोनल नमूने (टीएच-न्यूरॉन्स) मध्यम रूप से व्यक्त किए गए थे (चित्रा 4)। सेल फेनोटाइप की स्थापना फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन के आधार पर सेल चयन पर की गई थी, और इस मानदंड का उपयोग अध्ययन के लिए एकल जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर आणविक समूहीकरण के रूप में किया गया था, टीएच, सेलुलर फेनोटाइप16 के संकेत देने वाले अभिव्यक्ति पैटर्न को परिभाषित करने में विफल रहा। इस प्रकार, परिणाम प्रमुख एनटीएस माइक्रोग्लियल और न्यूरोनल सबफेनोटाइप और शराब वापसी में उनकी गतिशीलता को चिह्नित करते हैं।

यह पांडुलिपि एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के लिए एक विधि का वर्णन करती है, और यह जरूरी है कि प्रोटोकॉल में सभी चरणों का वर्णन के अनुसार पालन किया जाए। एक अलग अंग ऊतकों या सेल प्रकारों के साथ काम करते समय कुछ संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल की चुनौतियों में से एक एलसीएम के दौरान आरएनए गुणवत्ता और अखंडता को बनाए रखना है। हमने ऊपर वर्णित चुनौतियों का समाधान करने के लिए आईएचसी स्टेनिंग, एलसीएम और माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के लिए प्रोटोकॉल स्थापित किए हैं। संक्षेप में, इन प्रक्रियाओं में आरएनए क्षरण को रोकने के लिए सभी धुंधला समाधानों के लिए आरएनएस अवरोधक को जोड़ना, संभावित आरएनए क्षरण को रोकने के लिए एक तेजी से धुंधला प्रोटोकॉल, आईएचसी धुंधला होने और निर्जलीकरण के तुरंत बाद एलसीएम के लिए स्लाइड संसाधित करना और नमूना प्रसंस्करण या हस्तांतरण के दौरान जब भी संभव हो उचित ठंड की स्थिति बनाए रखना शामिल है।

ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परख आरएनए अलगाव के बिना लाइस्ड एकल कोशिकाओं पर किया जाता है, इसके बाद रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, प्री-एम्प्लीफिकेशन और क्यूपीसीआर होता है। पूर्व-प्रवर्धन चरण चुनिंदा रूप से क्यूपीसीआर के लिए पता लगाने योग्य स्तरों तक सीडीएनए अणुओं को बढ़ाना है। पूर्व-प्रवर्धन चरण की कई सीमाएं हैं। इनमें जीन प्रतिलेख शामिल हैं जो प्रवर्धित होने में विफल रहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर में कोई पहचान नहीं होगी। प्राइमर डिमर गठन की संभावना भी है क्योंकि पीसीआर प्रतिक्रिया में प्रयोगात्मक परख के लिए सभी प्राइमर शामिल हैं। यही है, एकल प्राइमर जोड़ी के आगे और पीछे के अनुक्रम के साथ और प्रयोग में सभी आगे और पीछे के अनुक्रमों के साथ डिमर का गठन संभव है। इसलिए, आरएनए मानकों जैसे सकारात्मक प्रयोगात्मक नियंत्रण का उपयोग करके प्राइमर परीक्षण की सलाह दी जाती है।

आरटी-क्यूपीसीआर चिप डिजाइन गुणवत्ता नियंत्रण और बैच प्रभावों के लिए इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू है। सकारात्मक नियंत्रण में जानवर और अंग से मानक आरएनए शामिल होता है (इस प्रतिनिधि उदाहरण में चूहा मस्तिष्क)। एक आरएनए तनुकरण श्रृंखला को तब प्रत्येक चिप में लोड किया जा सकता है और प्रत्येक जीन परख के लिए उपयुक्त मात्रात्मक संकेत प्रदर्शित करना चाहिए। पानी को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये नियंत्रण उचित सामान्यीकरण के लिए महत्वपूर्ण हैं जो बैच प्रभावों को नियंत्रित करते हैं जो विभिन्न चिप्स से डेटा के संयोजन के दौरान हो सकते हैं। इस पर चरण 8 में विस्तार से चर्चा की गई है।

यहां दिखाए गए प्रतिनिधि प्रयोग में, इन विधियों को परिकल्पना-सृजन और संभावित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लागू किया गया था। अध्ययन एक अन्य काम के संदर्भ में किया गया था और इंटरसेप्टिव एंटीरिवार्ड परिकल्पना13 के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। संक्षेप में, यह मॉडल अनुमान लगाता है कि एनटीएस के माध्यम से वेगस से एमिग्डाला तक इंटरोसेप्टिव सिग्नलिंग द्वारा पदार्थ वापसी में एंटीरिवार्ड उत्तेजित होता है और इस एंटीरिवार्ड का प्रारंभिक सब्सट्रेट न्यूरोइन्फ्लेमेशन है (चित्रा 6)। यह काम शराब वापसी पर न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया में जीन अभिव्यक्ति में भड़काऊ परिवर्तन स्थापित करके इस परिकल्पना का समर्थन करता है।

इस अध्ययन की एक बड़ी कमजोरी यांत्रिक दावों की कमी है। हालांकि, इन विधियों का उपयोग बेसलाइन प्रयोग के बाद एक तंत्र निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जैसे कि यह प्रदर्शन किया जाता है। उदाहरण के लिए, एक पशु मॉडल हस्तक्षेप या गड़बड़ी, जैसे कि एक उप-डायाफ्रामिक वैगोटॉमी या जीन नॉकआउट, भड़काऊ नियामकों के शारीरिक या आनुवंशिक तंत्र का प्रदर्शन कर सकते हैं। भविष्य के अध्ययन जो इस दृष्टिकोण को लेते हैं, वे इंटरोसेप्टिव एंटीरिवार्ड परिकल्पना के विकास में योगदान कर सकते हैं, जिसका उद्देश्य व्यसन उपचार के लिए नैदानिक अभ्यास में इन अंतर्दृष्टि को लागू करना है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

यहां प्रस्तुत कार्य को एनआईएच एचएलबी यू01 एचएल133360 के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, एनआईडीए आर 21 डीए 036372 जेएस और ईवीबी को सम्मानित किया गया था, टी 32 एए -007463 एसजेओ के समर्थन में जान होक को सम्मानित किया गया था, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ अल्कोहलिज्म एंड अल्कोहल एब्यूज: आर01 एए018873।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 186 एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर व्यसन आंत-भावनात्मक न्यूरेक्सिस न्यूरोइन्फ्लेमेशन एंटीरिवार्ड
शारीरिक रूप से विशिष्ट एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विधियों के साथ व्यसन व्यवहार में एंटीरिवार्ड के ड्राइवरों की जांच करना
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O'Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

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