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Bioengineering

इन विट्रो में विशालकाय यूनिलामेलर पुटिकाओं के अंदर एक्टिन साइटोस्केलेटन का पुनर्गठन

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

इस पांडुलिपि में, हम एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटन को विशाल यूनिलामेलर लिपिड पुटिकाओं (जिसे लिपोसोम भी कहा जाता है) में समाहित करने के लिए प्रयोगात्मक तकनीकों का प्रदर्शन करते हैं, और लिपोसोम झिल्ली के आंतरिक पत्रक पर एक कॉर्टेक्स-बायोमिमिकिंग एफ-एक्टिन परत बनाने की विधि।

Abstract

एक्टिन साइटोस्केलेटन, कोशिका में प्रमुख यांत्रिक मशीनरी, कोशिका विरूपण, विभाजन, प्रवास और आसंजन सहित कई आवश्यक शारीरिक सेलुलर गतिविधियों की मध्यस्थता करती है। हालांकि, विवो में एक्टिन नेटवर्क की गतिशीलता और संरचना का अध्ययन करना जीवित कोशिकाओं के भीतर जैव रासायनिक और आनुवंशिक विनियमन से जटिल है। इंट्रासेल्युलर जैव रासायनिक विनियमन से रहित एक न्यूनतम मॉडल बनाने के लिए, एक्टिन को विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी, जिसे लिपोसोम भी कहा जाता है) के अंदर समझाया जाता है। बायोमिमेटिक लिपोसोम कोशिका के आकार के होते हैं और साइटोस्केलेटन नेटवर्क के यांत्रिक और गतिशील गुणों में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि की सुविधा प्रदान करते हैं, जो नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक व्यवहार्य मार्ग खोलते हैं। एनकैप्सुलेशन के लिए लिपोसोम उत्पन्न करने के लिए, उल्टे पायस विधि (जिसे इमल्शन ट्रांसफर विधि भी कहा जाता है) का उपयोग किया जाता है, जो विभिन्न सेल-नकल प्रणालियों को तैयार करने के लिए लिपोसोम में जटिल समाधानों को एनकैप्सुलेट करने के लिए सबसे सफल तकनीकों में से एक है। इस विधि के साथ, ब्याज के प्रोटीन का मिश्रण आंतरिक बफर में जोड़ा जाता है, जिसे बाद में मोनोलेयर लिपिड बूंदों को बनाने के लिए फॉस्फोलिपिड युक्त खनिज तेल समाधान में पायसीकृत किया जाता है। वांछित लिपोसोम मोनोलेयर लिपिड बूंदों से उत्पन्न होते हैं जो लिपिड / तेल-पानी इंटरफ़ेस को पार करते हैं। यह विधि वांछित लिपिड घटकों के साथ लिपोसोम में केंद्रित एक्टिन पॉलिमर के एनकैप्सुलेशन को सक्षम बनाती है, जिससे बायोमिमिकिंग साइटोस्केलेटन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन का मार्ग प्रशस्त होता है।

Introduction

एक्टिन साइटोस्केलेटन आणविक स्तर के संकुचन और बल उत्पादन 1,2,3 का समन्वय करके सेल के इंट्रासेल्युलर आर्किटेक्चर के निर्माण में एक मौलिक भूमिका निभाता है। नतीजतन, यह कई आवश्यक सेलुलर गतिविधियों की मध्यस्थता करता है, जिसमें सेल विरूपण 4,5, विभाजन6, माइग्रेशन 7,8 और आसंजन 9 शामिलहैं। एक्टिन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन ने हाल के वर्षों में 10,11,12,13,14,15,16,17 में जबरदस्त ध्यान आकर्षित किया है। पुनर्गठन का लक्ष्य जीवित कोशिकाओं के भीतर मौजूद जटिल जैव रासायनिक विनियमन से रहित सेल का एक न्यूनतम मॉडल बनाना है। यह विशिष्ट इंट्रासेल्युलर गतिविधियों की जांच करने के लिए एक नियंत्रणीय वातावरण प्रदान करता है और एक्टिन साइटोस्केलेटन18,19 के विभिन्न घटकों की पहचान और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, फॉस्फोलिपिड विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी, लिपोसोम) के अंदर इन विट्रो एक्टिन नेटवर्क का एनकैप्सुलेशन अर्ध-पारगम्य सीमा के साथ एक सीमित लेकिन विकृत स्थान प्रदान करता है। यह सेल 9,20,21,22 के भीतर एक्टिन मशीनरी के शारीरिक और यांत्रिक सूक्ष्म वातावरण की नकल करता है।

लिपोसोम तैयार करने के विभिन्न तरीकों में, लिपिड फिल्म हाइड्रेशन विधि (जिसे सूजन विधि के रूप में भी जाना जाता है) सबसे शुरुआती तकनीकों में से एक है23. शुष्क लिपिड फिल्म बफ़र्स के अलावा हाइड्रेट करती है, जिससे झिल्लीदार बुलबुले बनते हैं जो अंततः पुटिका24 बन जाते हैं। उच्च उपज के साथ बड़े पुटिकाओं का उत्पादन करने के लिए, फिल्म हाइड्रेशन विधि से आगे बढ़ने वाली एक बेहतर विधि, जिसे इलेक्ट्रोफॉर्मेशन विधि 25 के रूप में जाना जाता है,जलयोजन प्रक्रिया 26 कोकुशलतापूर्वक बढ़ावा देने के लिए एक एसी विद्युत क्षेत्र लागू करता है। एक्टिन एनकैप्सुलेशन के लिए इन जलयोजन-आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाएं यह हैं कि इसमें अत्यधिक केंद्रित प्रोटीन की कम एनकैप्सुलेशन दक्षता है, और यह केवल विशिष्ट लिपिड रचनाओं के साथ संगत है24. उल्टे पायस तकनीक, तुलना में, लिपिड घटकों और प्रोटीन सांद्रता 20,27,28,29 के लिए कम सीमाएं हैं। इस विधि में, एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटीन का मिश्रण आंतरिक जलीय बफर में जोड़ा जाता है, जिसे बाद में लिपिड युक्त खनिज तेल समाधान में पायसीकृत किया जाता है, जिससे लिपिड-मोनोलेयर बूंदें बनती हैं। मोनोलेयर लिपिड बूंदें तब बाइलेयर लिपिड पुटिकाओं (लिपोसोम्स) बनाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एक और लिपिड / यह तकनीक एक्टिन एनकैप्सुलेशन24,30 के लिए सबसे सफल रणनीतियों में से एक साबित हुई है। अलग-अलग, कुछ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विधियां हैं, जिनमें स्पंदित जेटिंग31,32, क्षणिक झिल्ली इजेक्शन33 और सीडीआईएएसई विधि34 शामिल हैं। उल्टे पायस विधि और माइक्रोफ्लुइडिक विधि के बीच समानताएं लिपिड विलायक (तेल) हैं जिनका उपयोग किया जाता है और लिपोसोम के बाहरी पत्रक के गठन के लिए लिपिड / इसके विपरीत, माइक्रोफ्लुइडिक विधि द्वारा लिपोसोम की पीढ़ी को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के सेट-अप की आवश्यकता होती है और बाइलेयर के दो पत्रकों के बीच फंसे तेल के साथ होता है, जिसके लिए तेल हटाने के लिए एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती है35.

इस पांडुलिपि में, हमने एक बहुलकीकृत एफ-एक्टिन नेटवर्क को एनकैप्सुलेट करने वाले लिपोसोम तैयार करने के लिए उल्टे पायस तकनीक का उपयोग किया जैसा कि पहले22 उपयोग किया गया था। एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटीन मिश्रण को पहले एक बफर में रखा गया था जिसमें एक्टिन को अपने गोलाकार (जी) रूप में बनाए रखने के लिए गैर-बहुलक स्थितियां थीं। प्रारंभिक एक्टिन पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर की गई थी, जिसे बाद में नमूने को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति देकर ट्रिगर किया गया था। एक बार कमरे के तापमान पर, एक्टिन अपने फिलामेंटस (एफ) रूप में पॉलीमराइज़ करता है। प्रोटीन कार्यक्षमताओं और गुणों का अध्ययन करने के लिए आंतरिक जलीय बफर समाधान में विभिन्न प्रकार के एक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन जोड़े जा सकते हैं, इस प्रकार, एक्टिन नेटवर्क और झिल्ली की सतह के साथ इसकी बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इस विधि को ब्याज के विभिन्न प्रोटीनों के एनकैप्सुलेशन पर भी लागू किया जा सकताहै 36 और बड़ी वस्तुओं (माइक्रोपार्टिकल्स, स्व-चालित माइक्रोस्विमर्स, आदि) अंतिम लिपोसोम28,37 के आकार के करीब।

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Protocol

1. बफर और प्रोटीन समाधान की तैयारी

  1. 0.1 एमएम सीएसीएल 2, 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.5), 1 एमएम डीटीटी, 0.5 एमएम डाबको,320 एमएम सुक्रोज और 0.2 एमएम एटीपी को मिलाकर 5 एमएल की कुल मात्रा में जलीय इनर नॉन-पॉलिमराइजेशन (आईएनपी) बफर तैयार करें।
  2. निम्नलिखित सांद्रता के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर आईएनपी बफर में प्रोटीन जोड़कर प्रोटीन मिक्स (पीएम) तैयार करें: 11.2 μM गैर-फ्लोरोसेंट जी-एक्टिन, 2.8 μM फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन, और 0.24 μM Arp2/3 (सामग्री की तालिका)। एफ-एक्टिन परत बनाने के लिए, पीएम में 100 एनएम जेलसोलिन, 4 μM कोफिलिन और 2.2 μM वीसीए-हिज़ जोड़ें। एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, पीएम को 100 μg / एमएल फ्लोरोसेंट डाई (सामग्री की तालिका) द्वारा प्रतिस्थापित करें।
  3. 100 एमएम केसीएल, 4 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.5), 1 एमएम डीटीटी, 0.5 एमएम डाको, 10 एमएम एटीपी और 80 एमएम सुक्रोज को मिलाकर 5 एमएल की कुल मात्रा में जलीय इनर पॉलिमराइजेशन (आईपी) बफर (जलीय) तैयार करें।
  4. लिपोसोम के भीतर एनकैप्सुलेट किए जाने वाले 30 μL की कुल मात्रा में आंतरिक जलीय घोल का उत्पादन करने के लिए 1: 1 के वॉल्यूम अनुपात में आईएनपी बफर (पीएम युक्त) और आईपी बफर को मिलाकर अंतिम बफर (एफबी) तैयार करें।
  5. 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.5), 50 एमएम केसीएल, 2 एमएम एमजीसीएल 2, 0.2 एमएम सीएसीएल2, 2 एमएम एटीपी, 1 एमएम डीटीटी, 0.5 एमएम डबको, 212 एमएम ग्लूकोज, और 0.1 मिलीग्राम / एमएल β-कैसिइन को मिलाकर 150 μL की कुल मात्रा में जलीय आउटसाइड बफर (ओबी) तैयार करें।
    नोट: ओबी की ऑस्मोलरिटी को ग्लूकोज के साथ समायोजित किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ओबी का आसमाटिक दबाव एफबी (20-60 एमओएसएम) की तुलना में थोड़ा बड़ा है। एफबी का घनत्व ओबी की तुलना में थोड़ा अधिक होना चाहिए।

2. उल्टे पायस तकनीकों के आधार पर लिपोसोम की तैयारी

  1. लिपिड-तेल मिश्रण तैयार करें
    1. एमएल एल-α-फॉस्फेटिडिलकोलाइन (गैर-फ्लोरोसेंट अंडा पीसी, जिसे ईपीसी भी कहा जाता है, जिसमें 1% डीएचपीई भी शामिल है) के 100 μL को कांच की शीशी में जोड़ें। आर्गन गैस के साथ क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें, शीशी के तल पर एक सूखी ठोस लिपिड फिल्म (2.5 मिलीग्राम) छोड़ दें।
      1. एफ-एक्टिन परत बनाने के लिए, 1,2-डायोलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-{[एन (5-एमिनो-1-कार्बोक्सीपेंटाइल) इमिनोडायसेटिक एसिड] सक्सिनाइल} निकल नमक (डॉग-एनटीए-नी) ईपीसी के 10: 1 अनुपात में कुत्तों-एनटीए-नी में जोड़ें और क्लोरोफॉर्म के वाष्पीकरण से पहले मिलाएं।
    2. 2 मिलीलीटर खनिज तेल जोड़ें और लिपिड को फिर से निलंबित करने के लिए 1 घंटे के लिए स्नान में कमरे के तापमान पर लिपिड-तेल मिश्रण को सोनिकेट करें।
      नोट: सोनिकेशन के बाद लिपिड-तेल मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए रखा जा सकता है। उपयोग करने से पहले पुन: सोनिकेशन का सुझाव दिया जाता है।
  2. ब्याज की प्रोटीन युक्त मोनोलेयर लिपिड बूंदों को तैयार करने के लिए तेल (एफबी / तेल) पायस में एक अंतिम बफर तैयार करें।
    1. प्लास्टिक ट्यूब में लिए गए लिपिड-तेल मिश्रण के 100 μL में, 10 μL FFB जोड़ें। सुनिश्चित करें कि एफबी एक बूंद में है।
    2. एक ग्लास सिरिंज का उपयोग करके, लिपिड-तेल-एफबी मिश्रण खींचें और इसे पायसीकारी करने के लिए कई बार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे की आकांक्षा करें; पहले लिपिड-तेल मिश्रण की एक छोटी मात्रा खींचें, और फिर छोटी बूंदों में तोड़ने के लिए छोटी बूंद की परिधि में सिरिंज की नोक रखकर एफबी बूंद। ऊपर और नीचे आकांक्षा को दोहराएं जब तक कि एक सफेद और बादल पायस न बन जाए।
  3. एक अलग प्लास्टिक ट्यूब में ओबी के 30 μL रखो। ओबी के शीर्ष पर लिपिड-तेल मिश्रण के 30 μL रखें और इंटरफ़ेस पर लिपिड मोनोलेयर विकसित करने के लिए ~ 10 मिनट तक बैठने दें।
    नोट: यदि लिपिड चार्ज किए जाते हैं या प्रोटीन को शामिल किया जाता है, तो इस चरण की अवधि38 तक बढ़ाई जानी चाहिए।
  4. लिपोसोम तैयार करें
    1. ध्यान से चरण 2.3 से ट्यूब के शीर्ष तेल चरण के लिए एफबी/तेल पायस (चरण 2.2) के 50 μL जोड़ें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100 एक्स जी पर प्लास्टिक ट्यूब अपकेंद्रित्र। लिपोसोम गठन के लिए अनुकूलित करने के लिए समय और सेंट्रीफ्यूजेशन गति बदलें।
      नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, शीर्ष तेल चरण स्पष्ट होना चाहिए, और नीचे ओबी (लिपोसोम युक्त) थोड़ा बादल होना चाहिए।
    3. ध्यान से विंदुक द्वारा तेल चरण दूर हटा दें। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त मात्रा में एस्पिरेट करें। सुनिश्चित करें कि लिपोसोम चरण के शीर्ष पर तेल का मेनिस्कस बनाने से बचने के लिए ट्यूब के किनारे पिपेट टिप न डालें।
    4. एक नए पिपेट के साथ, धीरे-धीरे शेष निचले चरण में पिपेट टिप छड़ी और लिपोसोम इकट्ठा करने के लिए जलीय मात्रा की आकांक्षा।
      नोट: तेल को शामिल करने की तुलना में मात्रा खोना बेहतर है। तेल के समावेश से लिपोसोम टूट जाएंगे, और आंतरिक घटकों को बाहरी बफर में जारी किया जाएगा। कतरनी को कम करने के लिए एक पिपेट की नोक काट लें।

3. माइक्रोस्कोपी अवलोकन

  1. एक इनक्यूबेशन कक्ष (12 मिमी गोल कवरलिप्स युक्त 4-अच्छी तरह से प्लेट) के कुएं में ओबी के 100 μL डालो। धीरे-धीरे एकत्र किए गए लिपोसोम (चरण 2.4.4) को ओबी में जमा करें, और फिर कक्ष के शीर्ष पर एक और कवरस्लिप रखें।
    नोट: ओबी में कांच की सतह को निष्क्रिय करने और लिपोसोम20 के बीच चिपकने को कम करने के लिए β-कैसिइन होता है।
  2. 63x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ लिपोसोम का निरीक्षण करें। फ्लोरोसेंटली लेबल लिपिड, एनकैप्सुलेटेड फ्लोरोसेंट डाई, और एनकैप्सुलेटेड फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन का निरीक्षण करने के लिए क्रमशः 488 एनएम, 647 एनएम और 561 एनएम लेजर लाइनों का उपयोग करें। ब्याज के फ्रेम पर कब्जा और टीआईएफएफ प्रारूप में छवियों को बचाने के लिए।
  3. फिजी39 में छवियों को संसाधित और विश्लेषण करें। फिजी के नए उपयोगकर्ताओं के लिए, एक ऑनलाइन ट्यूटोरियल उपलब्ध है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके टीआईएफएफ फ़ाइल खोलें।
    2. छवि पर जाएं > चमक / कंट्रास्ट > समायोजित करें। न्यूनतम और अधिकतम सेटिंग्स, और चमक, और कंट्रास्ट स्लाइडर्स को समायोजित करके वांछित पैमाने पर छवि की चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें।
    3. टूलबार में आयत चयन उपकरण पर क्लिक करें और ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का चयन करें। आरओआई फसल के लिए छवि > फसल पर जाएं।
    4. विश्लेषण > सेट स्केल पर जाएं। पॉप-अप विंडो में, पिक्सेल पहलू अनुपात फ़ील्ड में 1.0 दर्ज करें और लंबाई की इकाई के रूप में μm सेट करें। पिक्सेल में दूरी फ़ील्ड में, पिक्सेल में छवि चौड़ाई दर्ज करें। ज्ञात दूरी फ़ील्ड में, माइक्रोन में वास्तविक छवि चौड़ाई दर्ज करें।
    5. लिपोसोम के आकार को मापने के लिए, टूलबार में ओवल चयन उपकरण का उपयोग करके, लिपोसोम के किनारे के साथ एक सर्कल खींचें। सर्कल के क्षेत्र को मापने के लिए विश्लेषण > माप पर जाएं, जिसमें से लिपोसोम के व्यास की गणना की जा सकती है।

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Representative Results

उल्टे पायस तकनीक के आधार पर लिपोसोम की तैयारी चित्रा 1 में ग्राफिक और योजनाबद्ध रूप से सचित्र है।

सबसे पहले, खाली (नंगे) लिपोसोम (~ 5-50 μm व्यास) जो फॉस्फोलिपिड (ईपीसी) और फ्लोरोसेंट लिपिड (डीएचपीई) से बने थे, तैयार किए गए थे। एक उज्ज्वल, दूर-लाल फ्लोरोसेंट डाई को नियंत्रण प्रयोग के रूप में नंगे लिपोसोम के भीतर समझाया गया था। चाहे एक लिपिड मोनोलेयर सफलतापूर्वक छोटी बूंद के परिधीय में गठित किया गया है पायस में फ्लोरोसेंट डाई को शामिल मोनोलेयर लिपिड बूंदों का अवलोकन करके निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। सफल लिपोसोम पीढ़ी पतली परिपत्र अंगूठी के दृश्य के माध्यम से सत्यापित किया जा सकता है, जो हरे-फ्लोरोसेंट लिपिड बाइलेयर (डीएचपीई के साथ लिपिड का संयुग्मन) है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 ए, दाएं-सबसे पैनल) का उपयोग करके 488 एनएम लेजर के तहत। फ्लोरोसेंट डाई के एनकैप्सुलेशन की पुष्टि करने के लिए, लिपोसोम के आंतरिक वातावरण को दूर-लाल फ्लोरोसेंट डाई (सामग्री की तालिका) के कारण 647 एनएम लेजर (चित्रा 2 ए; ओवरले छवि) के तहत समान रूप से फ्लोरोसेंट होना चाहिए।

मोनोलेयर लिपिड छोटी बूंद के अंदर एनकैप्सुलेटेड एक्टिन के विभिन्न रूपों को चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। बाएं से दाएं छवियां गोलाकार एक्टिन (जी-एक्टिन), फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन), एक्टिन को वीसीए-हिज के अलावा एक पतली एफ-एक्टिन परत बनाती हैं और झिल्ली में निकल-लिपिड, और एक्टिन वीसीए-हिज, कोफिलिन और जेलसोलिन के अलावा अंतिम बफर और निकल-लिपिड के अलावा एक पतली एफ-एक्टिन परत बनाती हैं।

इसके बाद, शुद्ध जी-एक्टिन और संबंधित एफ-एक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन को लिपोसोम के भीतर समझाया गया था। उपरोक्त के रूप में एक ही झिल्ली घटकों से बना (ईपीसी डीएचपीई के साथ मिश्रित), यहां लिपोसोम व्यास में ~ 5-50 μm थे। लिपोसोम के गठन को चित्रा 3 ए, बी में दिखाए गए पतले हरे परिपत्र छल्ले द्वारा कल्पना की जा सकती है। एक्टिन पोलीमराइजेशन को नमूने को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति देकर ट्रिगर किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, लिपोसोम के अंदर पुनर्गठित एफ-एक्टिन नेटवर्क (20% फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन के साथ) विषम हैं, जो एक्टिन फिलामेंट्स की शाखित नेटवर्क संरचनाओं के रूप में प्रकट होते हैं। शाखित वास्तुकला को एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स की शुरूआत से ट्रिगर किया गया था, जो एक साथ वीसीए-हिज 40,41,42,43,44,45 के साथ एक्टिन फिलामेंट्स के न्यूक्लिएशन और ब्रांचिंग को नियंत्रित करता है।

अंत में, एक एफ-एक्टिन कॉर्टेक्स-बायोमिमिकिंग सिस्टम बनाया गया था। एक पतली, लेकिन घनी शाखाओं वाली एफ-एक्टिन परत लिपोसोम22 के बाइलेयर के आंतरिक पत्रक पर बनाई गई थी, जिसे फ्लोरोसेंट खोल (चित्रा 3 सी) के रूप में देखा जा सकता है। इस मामले में, इसके अतिरिक्त, वीसीए-हिज, कोफिलिन और जेलसोलिन को लिपोसोम में समझाया गया था। लिपिड झिल्ली के घटक में निकल-लिपिड की आवश्यकता थी। वीसीए-हिज, एक डब्ल्यूएएसपी टुकड़ा, लिपिड झिल्ली के निकल-लिपिड के साथ बातचीत में एक हिस्टिडीन टैग रखता है। इस बीच, यह एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स 20,46,47,48 की भर्ती करता है। नतीजतन, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स द्वारा न्यूक्लिएटेड एक्टिन कोफिलिन और जेलसोलिन की उपस्थिति में झिल्ली की आंतरिक परत के साथ लेपित एक एफ-एक्टिन परत उत्पन्न करता है।

Figure 1
चित्रा 1: उल्टे पायस तकनीक के आधार पर लिपोसोम की तैयारी। (ए) लिपोसोम तैयारी में दो चरण होते हैं। चरण एक: ब्याज के प्रोटीन ले जाने वाले अंतिम बफर (एफबी) के 10 μL की एक बूंद को 1:10 के अनुपात में फॉस्फोलिपिड-तेल मिश्रण के 100 μL में जोड़ा गया था और धीरे-धीरे एक गिलास सिरिंज के साथ ऊपर और नीचे आकांक्षा करके निलंबित कर दिया गया था। मोनोलेयर लिपिड बूंदों वाले समाधान आगे-पीछे आकांक्षा के बाद सफेद हो गए। चरण दो: एक अलग प्लास्टिक ट्यूब में, लिपिड-तेल मिश्रण के कुछ माइक्रोलीटर को ओबी की समान मात्रा के शीर्ष पर रखा गया था और ओबी / तेल इंटरफ़ेस पर लिपिड मोनोलेयर विकसित करने के लिए ~ 10 मिनट तक बैठने की अनुमति दी गई थी। चरण एक से पायस चरण दो से तेल चरण के शीर्ष पर डाला गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज (100 एक्स जी; 15 मिनट) था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, शीर्ष तेल समाधान स्पष्ट होना चाहिए, और नीचे ओबी समाधान (लिपोसोम युक्त) थोड़ा बादल होना चाहिए। (बी) एक उल्टे पायस से लिपोसोम तैयारी की योजनाबद्धता। शीर्ष पर सफेद पायस में मोनोलेयर लिपिड बूंदें थीं जो अंदर एक शाखित एक्टिन नेटवर्क को शामिल करती थीं। सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, मोनोलेयर लिपिड बूंदें एक बाहरी पत्रक बनाने के लिए ओबी / तेल इंटरफ़ेस से गुजरती हैं जैसे कि प्लास्टिक ट्यूब के तल पर लिपोसोम बनाए और जमा किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मोनोलेयर लिपिड छोटी बूंद की सूक्ष्म छवियां ( ए) पायस में फ्लोरोसेंट डाई को शामिल करने वाली मोनोलेयर लिपिड बूंद। बाएं से दाएं छवियां क्रमशः डीआईसी चैनल, फ्लोरोसेंट 640 एनएम चैनल, डीआईसी और 640 एनएम चैनल के ओवरले और फ्लोरोसेंट 488 एनएम चैनल के तहत एक मोनोलेयर लिपिड बूंद दिखाती हैं। (बी) फ्लोरोसेंट 561 एनएम चैनल के तहत मोनोलेयर लिपिड छोटी बूंद के अंदर एनकैप्सुलेटेड एक्टिन के विभिन्न रूप। बाएं से दाएं छवियां गोलाकार एक्टिन (जी-एक्टिन), फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन), एक्टिन को वीसीए-हिज के अलावा एक पतली एफ-एक्टिन परत बनाती हैं और झिल्ली में निकल-लिपिड, और एक्टिन वीसीए-हिज़, कोफिलिन और जेलसोलिन के अलावा झिल्ली में वीसीए-हिज़, कोफिलिन और जेलसोलिन के अलावा एक पतली एफ-एक्टिन परत बनाती हैं। स्केल सलाखों 63x आवर्धन पर 10 μm कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: लिपोसोम के अंदर एक्टिन नेटवर्क के एनकैप्सुलेशन की सूक्ष्म छवियां( ए) एक लिपोसोम एनकैप्सुलेटिंग पॉलीमराइज्ड ब्रांच्ड (एआरपी 2/3 न्यूक्लिएटेड) एफ-एक्टिन नेटवर्क। बाएं से दाएं: फ्लोरोसेंट 488 एनएम चैनल (बाएं), फ्लोरोसेंट 561 एनएम चैनल (केंद्र), ओवरले (दाएं)। (बी) पॉलीमराइज्ड ब्रांच्ड (एआरपी 2/3 न्यूक्लिएटेड) एफ-एक्टिन नेटवर्क को एनकैप्सुलेट करने वाले लिपोसोम के निलंबन का एक प्रतिनिधि परिणाम। बाएं से दाएं: फ्लोरोसेंट 488 एनएम चैनल (बाएं), फ्लोरोसेंट 561 एनएम चैनल (केंद्र), और ओवरले (दाएं)। (सी) एक लिपोसोम के लिपिड झिल्ली की आंतरिक परत के साथ लेपित एक पतली लेकिन घने एफ-एक्टिन परत के गठन की उपस्थिति। ऊपर से नीचे: फ्लोरोसेंट 488 एनएम चैनल (शीर्ष), फ्लोरोसेंट 561 एनएम चैनल (केंद्र), ओवरले (नीचे)। स्केल सलाखों 63x आवर्धन पर 10 μm कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कई महत्वपूर्ण चरण तैयारी प्रक्रिया के दौरान लिपोसोम की उच्च उपज की सफलता का निर्धारण करते हैं। तेल में लिपिड फिल्म को पूरी तरह से भंग करने के लिए, नमूने को तब तक सोनीकेट किया जाना चाहिए जब तक कि कांच की शीशी के तल पर लिपिड फिल्म पूरी तरह से गायब न हो जाए। सोनिकेशन के बाद, लिपिड-तेल मिश्रण को लिपिड अणुओं को आगे फैलाने के लिए अंधेरे परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर रात भर संग्रहीत किया जाना चाहिए29. मिश्रण को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ब्याज की प्रोटीन युक्त मोनोलेयर लिपिड बूंदों के साथ एक एफबी / तेल पायस तैयार करते समय, लिपिड-तेल-एफबी मिश्रण को हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए ग्लास सिरिंज के माध्यम से धीरे-धीरे आगे और पीछे पंप किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया के दौरान, एक बड़ी बूंद को कई पुनरावृत्तियों के बाद कई छोटी बूंदों (~ 5-100 μm व्यास) में कांच सिरिंज की नोक पर बंद कर दिया जाता है। प्रक्रिया30 के बाद मिश्रण सफेद होना चाहिए। फॉस्फोलिपिड्स की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, और क्या एक लिपिड मोनोलेयर सफलतापूर्वक एफबी युक्त छोटी बूंद के परिधीय में गठित हुआ था, फ्लोरोसेंट डाई को शामिल करने वाली मोनोलेयर लिपिड बूंदों की पायस में जांच की गई थी, जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान ओबी / तेल इंटरफ़ेस के माध्यम से मोनोलेयर लिपिड बूंदों के पारित होने को सुनिश्चित करने के लिए, और ओबी में एकत्र लिपोसोम को कांच की सतह पर बसने की अनुमति दें, एफबी का घनत्व ओबी की तुलना में थोड़ा अधिक होना चाहिए। इसलिए, सुक्रोज और ग्लूकोज को क्रमशः आंतरिक (एफबी) और बाहरी (ओबी) जलीय घोल के मुख्य घटक के रूप में चुना गया था। पिछले काम में, डेक्सट्रान का उपयोग आंतरिक जलीय घोल20 के घनत्व को समायोजित करने के लिए किया गया था, जो इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है। इसके अलावा, ओबी की परासरणता को ग्लूकोज के साथ समायोजित किया गया था जैसे कि ओबी का आसमाटिक दबाव एफबी (20-60 एमओएसएम) की तुलना में थोड़ा बड़ा है जैसा कि पिछले काम20,22 में बताया गया है। बड़े ऑस्मोलरिटी अंतर ने लिपोसोम के संकोचन (जब ओबी की परासरणता एफबी की तुलना में अधिक होती है) या टूटना (जब एफबी की परासरण ओबी की तुलना में अधिक होती है) का कारण बना। बफ़र्स की परासरणता की जाँच करने के लिए एक ऑस्मोमीटर का उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल में, β-कैसिइन को ओबी में जोड़ा गया था ताकि इमेजिंग चैंबर की प्लास्टिक ट्यूब सतहों और कांच की सतहों दोनों को निष्क्रिय किया जा सके और लिपोसोम20,49 के बीच चिपके हुए को कम किया जा सके। खनिज तेल का उपयोग तेल समाधान (यानी, लिपिड विलायक) के रूप में किया गया था। डोडेकेन50, तरल पैराफिन30, स्क्वालेन51, आदि सहित अन्य जगहों पर विभिन्न लिपिड सॉल्वैंट्स की सूचना दी गई है। तदनुसार, विभिन्न लिपिड सॉल्वैंट्स के लिए विभिन्न सेंट्रीफ्यूजेशन गति और अवधि का उपयोग किया जाता है क्योंकि उनके चिपचिपाहट अंतर और लिपोसोम सतह तनाव पर प्रभाव पड़ता है। चरण 2.3 की अवधि को चार्ज किए गए लिपिड के लिए बढ़ाया जाना चाहिए क्योंकि, मोनोलेयर में, ये चार्ज अणु एक दूसरे को पीछे हटाते हैं, इस प्रकार लिपिड / तेल मिश्रण और ओबी38 के बीच इंटरफ़ेस पर अच्छी तरह से फैलाने और व्यवस्थित करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। ब्याज के प्रोटीन के साथ शामिल लिपिड के लिए, बेहतर मोनोलेयर गठन52 सुनिश्चित करने के लिए इस कदम के विस्तार की भी सिफारिश की जाती है। बहुलकीकृत एफ-एक्टिन नेटवर्क को एनकैप्सुलेट करने वाले लिपोसोम की लिपोसोम उपज के लिए, प्रति क्षेत्र (100 μm x 100 μm) लिपोसोम की संख्या 20 μm के औसत व्यास के साथ लगभग 5-10 है। एक ठेठ माइक्रोस्कोपी नमूने की एक ज़ूम-आउट छवि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। उल्टे पायस विधि के माध्यम से उत्पादित लिपोसोम की अधिक ज़ूम-आउट कॉन्फोकल छवियों को हाल के एक अध्ययन में पाया जा सकता हैजहां विभिन्न मापदंडों (घनत्व अंतर, सेंट्रीफ्यूजेशन गति / समय, लिपिड एकाग्रता, पीएच, तापमान, आदि) को लिपोसोम के उच्च उपज उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया है।

एफ-एक्टिन नेटवर्क के पुनर्गठन के लिए, एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), डाइथियोथ्रिटोल (डीटीटी), संबंधित लवण और पीएच स्थिति की उचित एकाग्रता चुनना आवश्यक है। पुनर्गठित एफ-एक्टिन नेटवर्क का एक मध्यवर्ती चेकपॉइंट अंदर एनकैप्सुलेटेड एक्टिन के साथ मोनोलेयर लिपिड बूंदों को देखकर किया जा सकता है। मोनोलेयर लिपिड छोटी बूंद के अंदर एनकैप्सुलेटेड एक्टिन के विभिन्न रूपों को चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। एक्टिन पोलीमराइजेशन >20 एमएम के + नमक और >0.2 एमएम एमजी2+ नमक में पीएच के साथ 6.5 और 8.5 के बीच स्थिर होता है, जैसा कि पहले 53,54,55 बताया गया था। लिपोसोम की इमेजिंग से पहले, प्रारंभिक एक्टिन पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए सभी समाधान बर्फ पर रखे गए थे। नमूनों को एक्टिन पोलीमराइजेशन को ट्रिगर करने के लिए कमरे के तापमान पर चित्रित किया गया था। पुनर्गठित एफ-एक्टिन नेटवर्क की वास्तुकला मुख्य रूप से एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स की गतिविधि द्वारा विनियमित होती है। डेंड्राइटिक आर्किटेक्चर56,57 उत्पन्न करने के लिए मौजूदा मदर फिलामेंट की तरफ से एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स न्यूक्लिएट्स और शाखाएं एक्टिन फिलामेंट्स। निकल-लिपिड (कुत्तों-एनटीए-नी) और वीसीए-हिज एफ-एक्टिन परत के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं। वीसीए-हिज एक न्यूक्लिएशन-बढ़ावा देने वाले कारक के रूप में कार्य करता है, जो झिल्ली22,58 पर निकल-लिपिड से जुड़ा हुआ है। एक शाखित एफ-एक्टिन नेटवर्क को तब वीसीए से न्यूक्लिएट किया जाता है- एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स की सुविधा देता है, और परिणामस्वरूप, लिपिड झिल्ली के आंतरिक पत्रक पर एक घने एफ-एक्टिन शेल का गठन होता है। लिपोसोम के भीतर वीसीए-हिज की एकाग्रता एफ-एक्टिन परत की मोटाई निर्धारित करती है। एक्टिन नियामक प्रोटीन (कोफिलिन और जेलसोलिन) के अलावा एफ-एक्टिन परत के गठन को भी बढ़ावा देता है। कोफिलिन फिलामेंट सिरों की संख्या बढ़ाने के लिए एक्टिन फिलामेंट्स को अलग करता है, जबकि जेलसोलिन उनकी वृद्धि को सीमित करने के लिए एक्टिन फिलामेंट्स के कांटेदार सिरों को बांधता है। इस प्रकार, कोफिलिन और जेलसोलिन की उपस्थिति में, बड़ी संख्या में फिलामेंट्स को एआरपी 2/3 द्वारा न्यूक्लिएट किया जा सकता है, और फिर एफ-एक्टिन परत बनाने के लिए वीसीए-हिज द्वारा भर्ती किया जा सकता है।

प्रोटीन एनकैप्सुलेशन के लिए इमल्शन ट्रांसफर विधि पर आधारित इसी तरह के पेपर हाल के वर्षोंमें 28,30,34 प्रकाशित किए गए हैं। यहां प्रोटोकॉल और इन पत्रों में प्रोटोकॉल के बीच एक बड़ा अंतर लिपोसोम के लिए प्राथमिक लिपिड की पसंद है। इस काम में, हम लिपोसोम झिल्ली के मुख्य घटक के रूप में एल-α-फॉस्फेटिडिलकोलाइन (ईपीसी, विभिन्न फॉस्फेटिडिलकोलाइन प्रजातियों का मिश्रण जिसमें लगभग 60% पीओपीसी59 होता है) का उपयोग करते हैं। एफ-एक्टिन परत बनाने के लिए, ईपीसी और निकल-लिपिड (कुत्तों-एनटीए-नी) का मिश्रण 10: 1 के अनुपात में उपयोग किया गया था। पिछले काम में, लिपोसोम को पॉलीहिस्टिडाइन लेपित ग्लास पर फैलाया गया था, और ईपीसी, कोलेस्ट्रॉल और निकल-लिपिड को 53: 37: 1020 के अनुपात में मिलाया गया था। इसकी तुलना में, नात्सुमे एट अल और बशीरज़ादेह एट अल ने क्रमशः माइक्रोस्फीयर28 और फासीन-एक्टिन बंडलों34 को समाहित करने के लिए डायोलॉयल-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी, एक एकल प्रकार का फॉस्फोलिपिड) चुना, जबकि फुजी एट अल ने 1-पामिटॉयल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी) की सिफारिश की। . प्राथमिक लिपिड की पसंद लिपोसोम के भौतिक गुणों को प्रभावित करती है। उदाहरण के लिए, जैसे-जैसे एसाइल श्रृंखला के असंतृप्ति की डिग्री बढ़ती है (यानी, पीओपीसी< ईपीसी< डीओपीसी60), बाइलेयर के माध्यम से विभिन्न अणुओं के पारगम्यता गुण61 कम हो जाते हैं। विकल्प ब्याज के लिपिड मिश्रित होने पर भी निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, कोलेस्ट्रॉल के अलावा ईपीसी लिपोसोम को अधिक स्थिर बनाता है, जबकि यह डीओपीसी / डीओपीई मिश्रण61 की बाइलेयर संरचना को अस्थिर करता है।

इस काम और बशीरज़ादेह एट अल .34 के हालिया प्रकाशन के बीच समानताएं एक्टिन एनकैप्सुलेशन के एक ही विषय पर पड़ती हैं। इस बीच, स्पष्ट भेद हैं। बशीरज़ादेह एट अल ने 3 डी-मुद्रित घूर्णन कक्ष का उपयोग करके एक संशोधित सीडीआईआईसीई दृष्टिकोण की सूचना दी। यहां, हम एक सिरिंज और एक अपकेंद्रित्र मशीन का उपयोग करके सरल, पारंपरिक उलटा पायस हस्तांतरण विधि को अपनाते हैं। ये दोनों विधियां लिपोसोम की उच्च उपज उत्पन्न करती हैं और बड़े बायोमोलेक्यूल्स24 के लिए उच्च एनकैप्सुलेशन क्षमता होती है। ऊपर वर्णित लिपिड घटकों में अंतर के अलावा, एनकैप्सुलेटेड एक्टिन नेटवर्क के आर्किटेक्चर भी बदल जाते हैं। बशीरज़ादेह एट अल लिपोसोम के भीतर फासीन-एक्टिन बंडलों को समझाया, जबकि इस काम में, हमने आर्प 2/3 कॉम्प्लेक्स द्वारा ट्रिगर किए गए एक शाखित नेटवर्क को समझाया। इसके अलावा, उपस्थिति वीसीए-हिज में कॉर्टेक्स-बायोमिमिकिंग सिस्टम बनाने के लिए एक एफ-एक्टिन परत का गठन यहां विस्तृत किया गया है।

यहां बताई गई विधि की दो सीमाएं हैं। एक यह है कि इन विट्रो पुनर्गठित एक्टिन नेटवर्क में शामिल लिपोसोम के आकार को ठीक से हेरफेर नहीं किया जा सकता है (व्यास में 5 से 50 μm तक भिन्न), और इलेक्ट्रोफॉर्मेशन विधि की तुलना में उपज कम है। पानी-तेल-आधारित विधि की दूसरी सीमा यह है कि तेल की ट्रेस मात्रा बाइलेयर पत्रक24 के बीच फंस जाती है। यद्यपि यह झिल्ली की मोटाई या इन जैव-नकल लिपोसोम 24,35,62,63 की जैव संगतता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है, तेल-डाले गए लिपोसोम की झिल्ली गतिशीलताको 62 में बदला जा सकता है। इस विधि में, एक्टिन न्यूक्लिएटर एआरपी 2/3 को शामिल किया गया है। भविष्य के अध्ययनों में अन्य साइटोस्केलेटन प्रोटीन 64,65,66,67, न्यूक्लिएटर, जैसे फॉर्मिन 68, या मायोसिन द्वितीय69 जैसे आणविक मोटर्स शामिल हो सकतेहैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम एमपीएम के लिए एआरओ मुरी डब्ल्यू 911 एनएफ-14-1-0403, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) आर 01 1 आर 01 जीएम 126256 से एमपीएम, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) यू 54 सीए 209992, एनआईएच आरओ 1 जीएम 126256, एनआईएच यू 54 सीए 209992, मिशिगन विश्वविद्यालय / इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों (ओं) की हैं और जरूरी नहीं कि एआरओ, एनआईएच या एचएफएसपी के विचारों को प्रतिबिंबित करें। एससी वी यादव, सी मुरेसन और एस अमीरी के साथ सार्थक चर्चा को स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

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बायोइंजीनियरिंग अंक 186
<em>इन विट्रो में</em> विशालकाय यूनिलामेलर पुटिकाओं के अंदर एक्टिन साइटोस्केलेटन का पुनर्गठन
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

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