Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Rekonstitution af Actin Cytoskelettet Inde i Giant Unilamellar Vesikler

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

I dette manuskript demonstrerer vi de eksperimentelle teknikker til at indkapsle F-actincytoskelettet i gigantiske unilamellare lipidvesikler (også kaldet liposomer) og metoden til at danne et cortex-biomimicking F-actinlag ved den indre folder af liposommembranen.

Abstract

Actincytoskelettet, det vigtigste mekaniske maskineri i cellen, formidler adskillige væsentlige fysiske cellulære aktiviteter, herunder celledeformation, opdeling, migration og vedhæftning. Imidlertid kompliceres studiet af dynamikken og strukturen i actinnetværket in vivo af den biokemiske og genetiske regulering i levende celler. For at opbygge en minimal model uden intracellulær biokemisk regulering er actin indkapslet inde i gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er, også kaldet liposomer). De biomimetiske liposomer er cellestørrelse og letter en kvantitativ indsigt i cytoskeletnetværkets mekaniske og dynamiske egenskaber, hvilket åbner en levedygtig rute for bottom-up syntetisk biologi. For at generere liposomer til indkapsling anvendes den omvendte emulsionsmetode (også kaldet emulsionsoverførselsmetoden), hvilket er en af de mest succesrige teknikker til indkapsling af komplekse opløsninger i liposomer til fremstilling af forskellige celleefterlignende systemer. Med denne metode tilsættes en blanding af proteiner af interesse til den indre buffer, som senere emulgeres i en phospholipidholdig mineralolieopløsning til dannelse af monolags lipiddråber. De ønskede liposomer genereres fra monolags lipiddråber, der krydser en lipid / olie-vand-grænseflade. Denne metode muliggør indkapsling af koncentrerede actinpolymerer i liposomerne med ønskede lipidkomponenter, hvilket baner vejen for in vitro-rekonstitution af et biomimicking cytoskeletnetværk.

Introduction

Actincytoskelettet spiller en grundlæggende rolle i konstruktionen af cellens intracellulære arkitektur ved at koordinere kontraktilitet på molekylært niveau og kraftgenerering 1,2,3. Som et resultat formidler det adskillige væsentlige cellulære aktiviteter, herunder celledeformation 4,5, division6, migration 7,8 og adhæsion9. In vitro-rekonstitutionen af actin-netværk har fået enorm opmærksomhed i de senere år 10,11,12,13,14,15,16,17. Målet med rekonstitution er at opbygge en minimal model af cellen blottet for den komplekse biokemiske regulering, der findes i levende celler. Dette giver et kontrollerbart miljø til at undersøge specifikke intracellulære aktiviteter og letter identifikation og analyse af forskellige komponenter i actincytoskelettet18,19. Endvidere giver indkapslingen af in vitro actinnetværk inde i phospholipid gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er, liposomer) et begrænset, men deformerbart rum med en semipermeabel grænse. Det efterligner det fysiologiske og mekaniske mikromiljø af actinmaskineriet i cellen 9,20,21,22.

Blandt forskellige metoder til fremstilling af liposomer er lipidfilmhydreringsmetoden (også kendt som hævelsesmetoden) en af de tidligste teknikker23. Den tørre lipidfilm hydrerer med tilsætning af buffere og danner membranøse bobler, der til sidst bliver vesikler24. For at producere større vesikler med et højere udbytte anvender en forbedret metode, der går videre fra filmhydreringsmetoden, kendt som elektroformationsmetoden25, et AC-elektrisk felt til effektivt at fremme hydreringsprocessen26. De største begrænsninger ved disse hydreringsbaserede metoder til actinindkapsling er, at den har lav indkapslingseffektivitet af stærkt koncentrerede proteiner, og den er kun kompatibel med specifikke lipidsammensætninger24. Den omvendte emulsionsteknik har til sammenligning færre begrænsninger for lipidkomponenter og proteinkoncentrationer 20,27,28,29. I denne metode tilsættes en blanding af proteiner til indkapsling til den indre vandige buffer, som senere emulgeres i en lipidholdig mineralolieopløsning, der danner lipid-monolagsdråber. Monolags lipiddråber krydser derefter gennem en anden lipid / olie-vand-grænseflade gennem centrifugering for at danne dobbeltlags lipidvesikler (liposomer). Denne teknik har vist sig at være en af de mest succesrige strategier til actinindkapsling24,30. Separat er der nogle mikrofluidiske enhedsmetoder, herunder pulserende jetting31,32, forbigående membranudstødning33 og cDICE-metoden34. Lighederne mellem den omvendte emulsionsmetode og den mikrofluidiske metode er lipidopløsningsmiddelet (olie), der anvendes, og indførelsen af lipid / olie-vand-grænseflade til dannelse af den ydre folder af liposomer. I modsætning hertil kræver dannelsen af liposomer ved den mikrofluidiske metode en opsætning af mikrofluidiske anordninger og ledsages af olie fanget mellem dobbeltlagets to foldere, hvilket kræver et ekstra trin til fjernelse af olie35.

I dette manuskript brugte vi den omvendte emulsionsteknik til at fremstille liposomer, der indkapslede et polymeriseret F-actin-netværk som tidligere anvendt22. Proteinblandingen til indkapsling blev først anbragt i en buffer med ikke-polymeriserende betingelser for at opretholde actin i sin kugleformede (G) form. Hele processen blev udført ved 4 °C for at forhindre tidlig actinpolymerisation, som senere blev udløst ved at lade prøven varme op til stuetemperatur. En gang ved stuetemperatur polymeriserer actinet i sin filamentøse (F) form. En række actinbindende proteiner kan tilsættes til den indre vandige bufferopløsning for at studere proteinfunktionaliteter og egenskaber og dermed yderligere give indsigt i dets interaktion med actinnetværket og membranoverfladen. Denne metode kan også anvendes til indkapsling af forskellige proteiner af interesse36 og store genstande (mikropartikler, selvkørende mikrosvømmere osv.) tæt på størrelsen af de endelige liposomer28,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af buffere og proteinopløsninger

  1. Den vandige indre ikke-polymerisationsbuffer (INP) fremstilles i et samlet volumen på 5 ml ved at blande 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccharose og 0,2 mM ATP.
  2. Forbered proteinblandingen (PM) ved at tilsætte proteiner til INP-bufferen ved 4 °C med følgende koncentrationer: 11,2 μM ikke-fluorescerende G-actin, 2,8 μM fluorescerende mærket actin og 0,24 μM Arp2/3 (materialetabel). For at danne et F-actinlag tilsættes 100 nM gelsolin, 4 μM cofilin og 2,2 μM VCA-His til PM. Som et kontroleksperiment skal PM udskiftes med 100 μg / ml fluorescerende farvestof (materialetabel).
  3. Den vandige indre polymerisationsbuffer (IP) (vandig) fremstilles i et samlet volumen på 5 ml ved at blande 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP og 80 mM saccharose.
  4. Forbered den endelige buffer (FB) ved at blande INP-buffer (indeholdende PM) og IP-buffer i et volumenforhold på 1: 1 for at give den indre vandige opløsning i et samlet volumen på 30 μL, der vil blive indkapslet i liposomet.
  5. Den vandige udvendige buffer (OB) fremstilles i et samlet volumen på 150 μL ved at blande 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucose og 0,1 mg / ml β kasein.
    BEMÆRK: OB's osmolaritet kan justeres med glukose for at sikre, at OB's osmotiske tryk er lidt større end FB (20-60 mOsm). Tætheden af FB skal være lidt højere end OB.

2. Fremstilling af liposomer baseret på de omvendte emulsionsteknikker

  1. Forbered lipid-olieblandingen
    1. Tilsæt 100 μL 25 mg / ml L-α-phosphatidylcholin (ikke-fluorescerende Æg PC, også kaldet EPC, herunder 1% DHPE) i et hætteglas. Inddamp chloroform med argongas, og efterlad en tør fast lipidfilm (2,5 mg) i bunden af hætteglasset.
      1. For at danne et F-actinlag tilsættes 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) iminodieddikesyre] succinyl} nikkelsalt (DOGS-NTA-Ni) i forholdet 10:1 mellem EPC og DOGS-NTA-Ni og blandes før fordampning af chloroform.
    2. Tilsæt 2 ml mineralolie og sonikere lipid-olieblandingen ved stuetemperatur i et bad i 1 time for at suspendere lipiderne igen.
      BEMÆRK: Lipid-olieblandingen efter sonikering kan opbevares i 1 uge ved 4 °C. Re-sonikering foreslås før brug.
  2. Forbered en endelig buffer i olie (FB / olie) emulsion til fremstilling af monolags lipiddråber indeholdende proteinet af interesse.
    1. Til 100 μL lipid-olie blanding taget i et plastrør tilsættes 10 μL FB. Sørg for, at FB er i en dråbe.
    2. Brug en glassprøjte til at trække lipid-olie-FB-blandingen og forsigtigt aspirere op og ned flere gange for at emulgere den; træk først en lille mængde lipid-olieblanding og derefter FB-dråben ved at placere spidsen af sprøjten i periferien af dråben for at bryde den op i små dråber. Gentag op og ned aspiration, indtil der dannes en hvidlig og overskyet emulsion.
  3. Sæt 30 μL OB i et separat plastrør. Placer 30 μL af lipid-olieblandingen oven på OB og lad den sidde i ~ 10 minutter for at udvikle et lipidmonolag ved grænsefladen.
    BEMÆRK: Hvis lipiderne er ladet eller proteinet er inkorporeret, skal varigheden af dette trin forlænges38.
  4. Forbered liposomerne
    1. Der tilsættes forsigtigt 50 μL FB/olieemulsionen (trin 2.2) til rørets øverste oliefase fra trin 2.3.
    2. Plastrøret centrifugeres ved 100 x g i 15 minutter ved 4 °C. Varier tid og centrifugeringshastighed for at optimere til liposomdannelse.
      BEMÆRK: Efter centrifugering skal den øverste oliefase være klar, og den nederste OB (indeholdende liposomer) skal være lidt overskyet.
    3. Fjern forsigtigt oliefasen væk med pipette. Aspirer ekstra volumen, hvis det er nødvendigt. Sørg for ikke at sætte pipettespidsen på siden af røret for at undgå at skabe en menisk olie oven på liposomfasen.
    4. Med en ny pipette skal du langsomt sætte pipettespidsen ind i den resterende bundfase og aspirere det vandige volumen for at opsamle liposomer.
      BEMÆRK: Det er bedre at miste volumen end at inkorporere olien. Inkluderingen af olie vil få liposomer til at briste, og de interne komponenter frigives i den eksterne buffer. Skær spidsen af en pipette for at reducere forskydningen.

3. Mikroskopi observation

  1. Hæld 100 μL OB i brønden i et inkubationskammer (4-brøndplade indeholdende 12 mm runde dæksler). De opsamlede liposomer (trin 2.4.4) anbringes forsigtigt i OB, hvorefter der anbringes endnu en dækslip oven på kammeret.
    BEMÆRK: OB indeholder β-kasein til passivering af glasoverfladen og minimere stikning mellem liposomerne20.
  2. Overhold liposomer med et konfokalt mikroskop ved hjælp af et 63x olie-nedsænkningsmål. Brug 488 nm, 647 nm og 561 nm laserlinjer til at observere henholdsvis fluorescerende mærket lipid, indkapslet fluorescerende farvestof og indkapslet fluorescerende mærket actin. Fang rammerne af interesse, og gem billederne i TIFF-format.
  3. Behandl og analysér billeder i ImageJ/Fiji39. For nye brugere af ImageJ/Fiji er en online tutorial tilgængelig (se Materialetabel).
    1. Åbn filen TIFF ved hjælp af ImageJ/Fiji software.
    2. Gå til Billede > Juster > lysstyrke / kontrast. Juster billedets lysstyrke og kontrast til den ønskede skala ved at justere indstillingerne Minimum og Maksimum og skyderne Lysstyrke og Kontrast .
    3. Klik på værktøjet til valg af rektangel på værktøjslinjen, og vælg interesseområdet (ROI). Gå til Billede > Beskær for at beskære roi.
    4. Gå til Analysér > Indstil skala. I pop op-vinduet skal du indtaste 1.0 i feltet Pixel Aspect Ratio og indstille μm som længdeenhed. I feltet Afstand i pixel skal du angive billedbredden i pixel. I feltet Kendt afstand skal du indtaste den reelle billedbredde i mikron.
    5. For at måle liposomets størrelse skal du bruge det ovale markeringsværktøj i værktøjslinjen til at tegne en cirkel langs kanten af liposomet. Gå til Analyser > Mål for at måle cirklens areal, hvorfra liposomets diameter kan beregnes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstillingen af liposomer baseret på den omvendte emulsionsteknik er illustreret grafisk og skematisk i figur 1.

Først blev tomme (bare) liposomer (~ 5-50 μm i diameter), der var sammensat af phospholipid (EPC) og fluorescerende lipid (DHPE) fremstillet. Et lyst, langt rødt fluorescerende farvestof blev indkapslet i bare liposomer som et kontroleksperiment. Hvorvidt et lipidmonolag med succes er dannet i dråbens perifere enhed, kunne bestemmes ved at observere monolags lipiddråber, der inkorporerer fluorescerende farvestof i emulsionen, som vist i figur 2A. Vellykket liposomgenerering kunne verificeres gennem visualisering af den tynde cirkulære ring, som er det grøn-fluorescerende lipiddobbeltlag (konjugation af lipider med DHPE), under 488 nm laser ved hjælp af konfokal mikroskopi (figur 2A, højre panel). For at bekræfte indkapsling af det fluorescerende farvestof skal liposomernes indre miljø være ensartet fluorescerende under en 647 nm laser (figur 2A; overlejringsbillede) på grund af det langt røde fluorescerende farvestof (Materialetabel).

Forskellige former for indkapslet actin inde i monolags lipiddråben er vist i figur 2B. Billeder fra venstre mod højre viser kugleformet actin (G-actin), filamentøs actin (F-actin), actin, der danner et tyndt F-actinlag med tilsætning af VCA-His til den endelige buffer og nikkel-lipid til membranen, og actin danner et tyndt F-actinlag med tilsætning af VCA-His, cofilin og gelsolin til den endelige buffer og nikkel-lipid til membranen.

Dernæst blev rensede G-actin og tilhørende F-actinbindende proteiner indkapslet i liposomet. Sammensat af de samme membrankomponenter som ovenfor (EPC blandet med DHPE) var liposomer her ~ 5-50 μm i diameter. Dannelsen af liposomer kunne visualiseres af de tynde grønne cirkulære ringe vist i figur 3A, B. Actinpolymerisation blev udløst ved at lade prøven varme op til stuetemperatur. Som vist i figur 3A er de rekonstituerede F-actin-netværk (med 20% fluorescerende mærket actin) inde i liposomer heterogene og manifesterer sig som forgrenede netværksstrukturer af actinfilamenter. Den forgrenede arkitektur blev udløst af introduktionen af Arp2/3-komplekset, som samtidig styrer kimdannelsen og forgreningen af actinfilamenter sammen med VCA-His 40,41,42,43,44,45.

Endelig blev der oprettet et F-actin cortex-biomimicking system. Et tyndt, men tæt forgrenet F-actinlag blev skabt ved den indre folder af dobbeltlaget af liposomer22, som kunne visualiseres som en fluorescerende skal (figur 3C). I dette tilfælde blev VCA-His, cofilin og gelsolin desuden indkapslet i liposomer. Nikkellipider var påkrævet i komponenten af lipidmembranen. VCA-His, et WASP-fragment, bærer et histidinmærke i samspil med nikkellipiderne i lipidmembranen. I mellemtiden rekrutterer den Arp2/3-komplekset 20,46,47,48. Som et resultat genererer actin nukleeret af Arp2/3-komplekset et F-actinlag belagt langs membranens indre lag i nærvær af cofilin og gelsolin.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling af liposomer baseret på den omvendte emulsionsteknik. (A) Liposompræparat består af to trin. Trin et: En dråbe på 10 μL Final Buffer (FB) med proteiner af interesse blev tilsat til 100 μL af phospholipid-olieblandingen i et forhold på 1:10 og suspenderet ved forsigtigt at aspirere op og ned med en glassprøjte. Opløsninger indeholdende monolags lipiddråber blev hvidlige efter frem og tilbage aspiration. Trin to: I et separat plastrør blev et par mikroliter af lipid-olieblandingen anbragt oven på den samme mængde OB og fik lov til at sidde i ~ 10 minutter for at udvikle et lipidmonolag ved OB / oliegrænseflade. Emulsionen fra trin et blev hældt oven på oliefasen fra trin to og blev centrifugeret (100 x g; 15 minutter) ved 4 °C. Efter centrifugering skal den øverste olieopløsning være klar, og den nederste OB-opløsning (indeholdende liposomer) skal være let overskyet. (B) Skemaer af liposompræparatet fra en omvendt emulsion. Den hvidlige emulsion på toppen indeholdt monolags lipiddråber, der inkorporerede et forgrenet actinnetværk indeni. Under centrifugering passerede monolags lipiddråber gennem OB / olie-grænsefladen for at danne en ydre folder, således at liposomer blev skabt og akkumuleret i bunden af plastrøret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopiske billeder af monolags lipiddråben. (A) Monolagets lipiddråbe, der indeholder fluorescerende farvestof i emulsionen. Billeder fra venstre mod højre viser en monolags lipiddråbe under DIC-kanalen, henholdsvis fluorescerende 640 nm kanal, overlejring af DIC- og 640 nm-kanalen og fluorescerende 488 nm kanal. (B) Forskellige former for indkapslet actin inde i monolagets lipiddråbe under en fluorescerende 561 nm kanal. Billeder fra venstre mod højre viser kugleformet actin (G-actin), filamentøs actin (F-actin), actin, der danner et tyndt F-actinlag med tilsætning af VCA-His til den endelige buffer og nikkellipid til membranen, og actin danner et tyndt F-actinlag med tilsætning af VCA-His, cofilin og gelsolin til den endelige buffer og nikkel-lipid til membranen. Skalastænger er 10 μm ved 63x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Mikroskopiske billeder af indkapslingen af actinnetværk inde i liposomer. (A) Et liposomindkapslerende polymeriseret forgrenet (Arp 2/3 nukleeret) F-actinnetværk. Fra venstre mod højre: fluorescerende 488 nm kanal (venstre), fluorescerende 561 nm kanal (midten), overlay (højre). (B) Et repræsentativt resultat af suspensioner af liposomer, der indkapsler polymeriserede forgrenede (Arp 2/3 nukleerede) F-actinnetværk. Fra venstre mod højre: fluorescerende 488 nm kanal (venstre), fluorescerende 561 nm kanal (midten) og overlay (højre). (C) Udseendet af dannelsen af et tyndt, men tæt F-actinlag belagt langs det indre lag af lipidmembranen i et liposom. Top til bund: fluorescerende 488 nm kanal (øverst), fluorescerende 561 nm kanal (i midten), overlay (bund). Skalastænger er 10 μm ved 63x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere nøgletrin bestemmer succesen med et højt udbytte af liposomer under forberedelsesprocessen. For helt at opløse lipidfilmen i olien skal prøven sonikeres, indtil lipidfilmen i bunden af hætteglasset forsvinder helt. Efter sonikeringen skal lipid-olieblandingen opbevares natten over ved stuetemperatur under mørke forhold for at lipidmolekylerne kan sprede sig yderligere29. Blandingen kan opbevares ved 4 °C i op til en uge. Ved fremstilling af en FB/olieemulsion med monolags lipiddråber indeholdende protein af interesse, skal lipid-olie-FB-blandingen forsigtigt pumpes frem og tilbage gennem en glassprøjte for at undgå at indføre luftbobler. Under denne proces skæres en stor dråbe af ved spidsen af glassprøjten i mange mindre dråber (~ 5-100 μm i diameter) efter flere gentagelser. Blandingen skal være hvidlig efter processen30. For at kontrollere kvaliteten af fosfolipider, og om et lipidmonolag med succes var dannet i periferien af FB indeholdende dråbe, blev monolags lipiddråber, der indeholdt fluorescerende farvestof, undersøgt i emulsionen, som vist i figur 2A. For at sikre passage af monolags lipiddråber gennem OB / olie-grænsefladen under centrifugering og tillade de opsamlede liposomer i OB at slå sig ned på glasoverfladen, bør densiteten af FB være lidt højere end OB. Derfor blev saccharose og glucose valgt som hovedkomponenten i henholdsvis de indre (FB) og ydre (OB) vandige opløsninger. I det foregående arbejde blev dextran brugt til at justere densiteten af den indre vandige opløsning20, som ikke er inkluderet i denne protokol. Desuden blev OB's osmolaritet justeret med glucose, således at OB's osmotiske tryk er lidt større end FB (20-60 mOsm) som rapporteret i det foregående arbejde20,22. Stor osmolaritetsforskel førte til krympning (når OB's osmolaritet er større end FB's) eller brud (når FB's osmolaritet er større end OB)af liposomerne. Et osmometer blev brugt til at kontrollere buffernes osmolariteter. I protokollen blev der tilføjet β-kasein i OB for at passivere både plastrøroverflader og glasoverflader i billedkammeret og minimere klæbning mellem liposomerne 20,49. Mineralolie blev anvendt som olieopløsning (dvs. lipidopløsningsmiddelet). Forskellige lipidopløsningsmidler er blevet rapporteret andre steder, herunder dodecan50, flydende paraffin30,squalane 51 osv. Følgelig anvendes forskellige centrifugeringshastigheder og varigheder til forskellige lipidopløsningsmidler på grund af deres viskositetsforskelle og den indflydelse, de medfører på liposomoverfladespændingen. Varigheden af trin 2.3 skal forlænges for ladede lipider, fordi disse ladede molekyler i monolaget afviser hinanden, hvilket kræver mere tid til at diffundere og organisere godt ved grænsefladen mellem lipid / olieblandingen og OB38. For lipider inkorporeret med proteiner af interesse anbefales også en udvidelse af dette trin for at sikre bedre dannelse af monolag52. For liposomudbyttet af liposomer, der indkapsler polymeriseret F-actin-netværk, er antallet af liposomer pr. Synsfelt (100 μm x 100 μm) omkring 5-10 med en gennemsnitlig diameter på 20 μm. Et zoomet billede af en typisk mikroskopiprøve er vist i figur 3B. Mere zoomede konfokale billeder af liposomerne produceret gennem den omvendte emulsionsmetode kan findes i en nylig undersøgelse52, hvor forskellige parametre (densitetsforskel, centrifugeringshastighed / tid, lipidkoncentration, pH, temperatur osv.) er optimeret til højtydende produktion af liposomer.

Til rekonstitution af F-actin-netværket er det vigtigt at vælge en passende koncentration af adenosintrifosfat (ATP), dithiothreitol (DTT), de tilknyttede salte og pH-tilstanden. Et mellemliggende kontrolpunkt for det rekonstituerede F-actin-netværk kan udføres ved at observere monolags lipiddråber med indkapslet actin indeni. Forskellige former for indkapslet actin inde i monolags lipiddråben er vist i figur 2B. Actinpolymerisation forekommer ved >20 mM K + salt og i >0,2 mM Mg2 + salt med pH stabiliseret mellem 6,5 og 8,5, som tidligere rapporteret 53,54,55. Før billeddannelse af liposomer blev alle opløsninger opbevaret på is for at forhindre tidlig actinpolymerisation. Prøverne blev afbildet ved stuetemperatur for at udløse actinpolymerisation. Arkitekturen af det rekonstituerede F-actin-netværk er overvejende reguleret af aktiviteten i Arp2/3-komplekset. Arp 2/3 komplekse nukleater og grene actinfilamenter fra siden af en eksisterende moderfilament for at generere dendritiske arkitekturer 56,57. Nikkel-lipid (DOGS-NTA-Ni) og VCA-His er kritiske for dannelsen af F-actinlaget. VCA-His fungerer som en kimdannelsesfremmende faktor, som er forbundet med nikkellipider ved membranen22,58. Et forgrenet F-actin-netværk nukleeres derefter fra VCA-His, hvilket letter Arp2/3-komplekset, og som et resultat dannes en tæt F-actinskal ved lipidmembranens indre folder. Koncentrationen af VCA-His i liposomet bestemmer tykkelsen af F-actinlaget. Tilsætningen af de actinregulerende proteiner (cofilin og gelsolin) fremmer også dannelsen af F-actinlaget. Cofilinet skærer actinfilamenter for at øge antallet af filamentender, mens gelsolinen binder til de piggede ender af actinfilamenter for at begrænse deres vækst. Derved kan et større antal filamenter i nærværelse af cofilin og gelsolin nukleeres af Arp2/3 og derefter rekrutteres af VCA-His til dannelse af F-actinlaget.

Lignende artikler baseret på emulsionsoverførselsmetoden til proteinindkapsling er blevet offentliggjort i de senere år 28,30,34. En stor forskel mellem protokollen her og protokollerne i disse papirer er valget af det primære lipid til liposomer. I dette arbejde bruger vi L-α-phosphatidylcholin (EPC, en blanding af forskellige phosphatidylcholinarter indeholdende ca. 60% POPC59) som hovedkomponenten i liposommembranen. For at danne et F-actinlag blev en blanding af EPC og nikkel-lipid (DOGS-NTA-Ni) anvendt i et forhold på 10: 1. I et tidligere arbejde blev liposomer spredt på polyhistidinbelagt glas, og EPC, kolesterol og nikkel-lipid blev blandet i et forhold på 53:37:1020. Til sammenligning valgte Natsume et al. og Bashirzadeh et al. dioleoyl-phosphocholin (DOPC, en enkelt type phospholipid) til at indkapsle henholdsvis mikrosfærerne28 og fascin-actinbundterne34, mens Fujii et al. anbefalede 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC, et rent syntetisk phospholipid) som det primære lipid til etablering af en liposombaseret membranproteinsynteseteknologi30 . Valget af de primære lipider påvirker liposomernes fysiske egenskaber. For eksempel, når graden af umættethed af acylkæden stiger (dvs. POPC< EPC< DOPC60), falder permeabilitetsegenskaberne for forskellige molekyler gennem dobbeltlaget61. Valget afhænger også af, at lipiderne af interesse blandes. For eksempel gør tilsætningen af kolesterol EPC liposomer mere stabile, mens det destabiliserer dobbeltlagsstrukturen af DOPC / DOPE blanding61.

Lighederne mellem dette arbejde og en nylig publikation fra Bashirzadeh et al.34 falder om det samme emne om actinindkapsling. I mellemtiden er der klare forskelle. Bashirzadeh et al. rapporterede en modificeret cDICE-tilgang ved hjælp af et 3D-printet roterende kammer. Her anvender vi den enkle, traditionelle omvendte emulsionsoverførselsmetode ved hjælp af en sprøjte og en centrifugemaskine. Begge disse to metoder genererer et højt udbytte af liposomer og har høj indkapslingseffektivitet for store biomolekyler24. Udover forskellen i lipidkomponenterne som nævnt ovenfor ændres arkitekturerne i det indkapslede actinnetværk også. Bashirzadeh et al. indkapslede fascin-actinbundter i liposomet, mens vi i dette arbejde indkapslede et forgrenet netværk udløst af Arp2/3-komplekset. Derudover er dannelsen af et F-actinlag for at skabe et cortex-biomimicking system i nærværelse VCA-His blevet uddybet her.

Metoden, der rapporteres her, har to begrænsninger. Den ene er, at størrelsen af liposomerne, der inkorporerer in vitro-rekonstituerede actinnetværk, ikke kan manipuleres præcist (varierende fra 5 til 50 μm i diameter), og udbyttet er lavt sammenlignet med elektroformationsmetoden. Den anden begrænsning ved en vandoliebaseret metode er, at spormængder af olie fanges mellem dobbeltlagsbladene24. Selv om det ikke i væsentlig grad påvirker membrantykkelsen eller biokompatibiliteten af disse bioefterlignende liposomer 24,35,62,63, kan membrandynamikken i de olieindsatte liposomer ændres 62. I denne metode inkorporeres actinnukleatoren Arp2/3. Fremtidige undersøgelser kan omfatte andre cytoskeletproteiner 64,65,66,67, nukleatorer, såsom formin 68, eller molekylære motorer såsom myosin II69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi anerkender finansiering af ARO MURI W911NF-14-1-0403 til MPM, National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 til MPM, National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 og Human Frontiers Science Program (HFSP) tilskudsnummer RGY0073/2018 til M.P.M. Enhver mening, resultater, konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne fra ARO, NIH eller HFSP. S.C. anerkender frugtbare diskussioner med V. Yadav, C. Muresan og S. Amiri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Tags

Bioengineering udgave 186
<em>In vitro</em> Rekonstitution af Actin Cytoskelettet Inde i Giant Unilamellar Vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter