Summary
본 프로토콜은 비비만 당뇨병(NOD)-scid 인터루킨-2 감마사슬 수용체(NSG) 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 설명합니다. 이식을 위한 인간 피부의 준비, 이식을 위한 마우스의 준비, 분할 두께의 인간 피부의 이식 및 이식 후 회복 절차에 대한 자세한 설명이 보고서에 포함되어 있습니다.
Abstract
인간 기증자 피부를 면역결핍 마우스 숙주에 이식하는 인간 피부 이종이식 모델은 피부 면역학의 중개 연구를 위한 중요한 옵션입니다. 뮤린 및 인간의 피부는 해부학적 및 면역 세포 조성에서 실질적으로 상이하다. 따라서 전통적인 마우스 모델은 피부과 연구 및 약물 발견에 한계가 있습니다. 그러나 성공적인 이종 이식은 기술적으로 어렵고 이식 및 숙주 생존을 위해 최적의 표본 및 마우스 이식 부위 준비가 필요합니다. 본 프로토콜은 마우스 상에 인간 피부를 이식하기 위한 최적화된 기술을 제공하고 다운스트림 실험 목표에 필요한 고려사항을 논의한다. 이 보고서는 인간 기증자 피부 샘플의 적절한 준비, 수술 설정의 조립, 마우스 및 수술 부위 준비, 피부 이식 및 수술 후 모니터링을 설명합니다. 이러한 방법을 준수하면 수술 후 6 주 이상 이종 이식편을 유지할 수 있습니다. 아래에 설명된 기술은 엔지니어링 제어, 멸균 기술 및 수술 전 및 수술 후 컨디셔닝의 개발로 인해 최대 이식 효율성을 허용합니다. 이종이식 모델의 적절한 성능은 인간 피부의 실험적 특성화 및 생체내 화합물의 전임상 시험을 위한 수명이 긴 인간 피부 이식편 샘플을 초래합니다.
Introduction
마우스 모델은 인간 생물학 및 질병에 대한 추론을 위해 자주 사용되며, 부분적으로는 실험적 재현성과 유전자 조작 능력 때문입니다. 그러나, 마우스 생리학은 인간 장기 시스템, 특히 피부를 완전히 재현하지 못하므로,약물 개발에서 전임상 모델로 사용하기에는 한계가 있다1. 마우스와 인간 피부의 해부학적 차이에는 상피 두께와 구조의 차이, 쥐 에크린 땀샘의 부족, 모발 순환의 변화가포함됩니다2. 또한, 면역계의 선천적 팔과 적응 팔은 두 종 사이에서 갈라진다3. 마우스 피부는 수지상 표피 T 세포 (DETC)의 독특한 면역 집단을 함유하고, 진피 γδ T 세포의 풍부함이 더 많으며, 인간 조직과 비교하여 면역 세포 하위 집합 국소화가 다양합니다4. 따라서 인간 피부 생물학 및 염증에 관한 실험 결과는 인간 조직을 사용한 검증의 이점을 얻습니다. 시험관 내 및 오가노이드 배양 시스템은 인체 조직을 연구하기 위해 널리 활용되는 도구이지만, 이러한 시스템은 부재하거나 불완전한 면역 재구성 및 말초 혈관구조에 대한 연결 부족으로 인해제한됩니다5. 인간화 이종이식 피부 이식 모델은 생체 내에서 인간 조직에서 면역 및 비면역 경로의 치료적 또는 생물학적 조작을 허용하는 것을 목표로 합니다.
인간 피부 이종이식 모델은 피부 생리학 및 약리학을 연구하고, 면역 거부 반응 및 반응을 분석하고, 인간 피부암 메커니즘을 해부하고, 피부 질환 및상처 치유를 이해하는 데 활용되었습니다6. 피부 연구의 여러 분야에 적용 할 수 있지만, 이종 이식 모델은 시험관 내 연구보다 처리량이 낮고 마우스 모델에 사용되는 유전자 조작의 용이성이 부족합니다. 이 모델 내의 시점은 몇 주에서 몇 달까지 다양할 수 있으며 성공적인 이식을 위해서는 이러한 수술을 수행하기 위한 적절한 시설과 장비가 필요합니다. 그러나 이종이식 모델은 실험에 생물학적 및 생리학적 맥락을 제공하는 반면, 조직 외식편과 같은 유기체 배양 시스템은 종종 특정 시간 간격으로 외인성 신호와 같은 무수한 움직이는 부분을 복제해야합니다7. 따라서 이 모델은 시험관 내 및 마우스 모델 내에서 관찰된 결과를 추가로 검증하거나 생물학적으로 실현 가능하지 않은 작업에 가장 잘 활용됩니다. 이종이식 모델의 적절한 사용은 생체 내에서 온전한 인간 조직을 연구하고 조작할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다.
이종이식 피부 이식 모델의 최적화는 시간이 지남에 따라 이식편 무결성을 보존하기 위해 수십 년의 연구에 의존해 왔습니다. 이 과정에서 중요한 것은 B 및 T 적응 면역 세포, 기능성 NK 세포가 부족하고 대 식세포 및 수지상 세포8이 결핍 된 비 비만 당뇨병 (NOD) - scid 인터루킨 -2 감마 사슬 수용체 (NSG) 마우스를 활용하는 것입니다. 이들 NSG 숙주의 면역결핍 성질은 인간 조혈 세포, 환자-유래 암, 및 피부 8,9,10의 이식을 허용한다. 이러한 면역억제 숙주 환경에도 불구하고, 이식 성공10을 위해서는 항-GR1 투여에 의한 마우스 호중구 면역 반응의 추가의 억제가 필요하다. 손상되지 않은 조직을 이식하는 데 있어 주요 장애물은 감염, 거부 및 이식편으로의 혈류 재설정의 어려움이며 때로는 피부 및 표피 완전성의 손실로 이어집니다11. 항-FR1의 투여 및 적절한 이식 깊이의 사용을 포함하는 기술은 이식편 생존을 개선한다10. 세심한 최적화를 통해 NSG 마우스에서 인간 이종 이식 피부 이식을 90 % -100 % 범위의 높은 효율성과 생존율로 수행 할 수 있습니다.
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Protocol
본 연구는 UCSF IACUC (AN191105-01H) 및 IRB (13-11307) 프로토콜에 따라 승인되고 수행되었다. 탈장 복구와 같은 일상적인 선택적 수술 절차의 일부로 폐기 된 피부 샘플이 본 연구에 사용되었습니다. 피부 샘플은 비식별화되고 비인간 피험자 연구로 인증되거나, 다운스트림 분석을 위해 임상적으로 식별 정보가 필요한 경우 환자는 IRB 프로토콜 13-11307에 따라 서면 동의를 제공했습니다. 다른 포함 또는 제외 기준은 사용되지 않았습니다. 어느 한 성별의, 8-10주령의 NSG 마우스를 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
1. 기증자 인간 피부 샘플 처리
참고: 이 이식에 사용된 인간 피부 샘플은 건강한 환자의 복부에서 수집된 큰 샘플이었습니다. 샘플은 15cm x 7.5cm 이상이어야합니다. 크기 제한은 피부를 사용할 수 있는 마우스의 수와 이식편 크기의 선택에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 준비 및 이식하기 전에 피부 샘플을 차가운 온도 (얼음 위, 4 ° C)로 유지하십시오. 인산염 완충 식염수(PBS)에 거즈를 적신 상태로 밀폐된 검체 수집 컵에 시료를 촉촉하게 유지하십시오.
알림: 피부 샘플을 4°C에서 2일 이상 보관하는 것은 권장하지 않습니다. 그러나, 피부 샘플이 더 오랜 시간 동안 저장되는 보고가 존재한다12.
주의 : 모든 인체 조직을 표준 생물학적 위험 예방 조치로 처리하십시오. - 인간 피부 샘플을 멸균된 해부 보드 상의 멸균된 음압 조직 배양 후드에서 박피할 준비를 한다.
- 피부 샘플을 표피 쪽이 위로 향하게 하여 해부 보드에 놓습니다. 멸균 알코올 준비 패드로 표피를 닦은 다음 PBS로 닦습니다.
- 해부 T- 핀으로 피부의 더 가까운 가장자리를 제자리에 고정합니다 ( 재료 표 참조).
- 피부 표본을 400μm 두께로 피부화하고 일정한 압력을 가하면서 30°-45° 각도로 앞으로 절단합니다. 모든 기기별 지침과 안전 조치를 따르십시오( 재료 표 참조).
참고: 피부 분열 기술에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 보고서13을 참조하십시오. - 접시 바닥에 멸균 PBS에 적신 멸균 거즈를 놓아 100mm x 20mm 페트리 접시를 준비합니다. 피부가 위로 향하도록 피부를 젖은 거즈 위에 놓습니다.
- 샘플이 오염되지 않도록 반투명 밀봉 필름( 재료 표 참조)으로 플레이트 가장자리를 밀봉하고 덮습니다. 접목 전에 샘플을 4°C에서 보관하십시오.
2. 수술 전 컨디셔닝 및 준비
- 이식을 위해 멸균기구와 멸균 수술 스테이션을 준비하십시오. 고압 멸균 된 종이 타월을 기기 및 마우스 배치를위한 멸균 표면으로 사용하십시오.
참고: 마우스는 이유 후 접목할 수 있지만 생후 8-10주 사이에 접목하는 것이 좋습니다. 두 성별의 마우스를 이식 할 수 있습니다. - 수술실에서 물리적으로 분리된 부위에서 제모와 같은 수술 준비를 수행합니다.
- 항-GR1( 재료 표 참조)을 멸균 식염수에 1mg/mL로 희석하여 준비합니다. 마취 유도 후 각 마우스에 100μg/100μL의 항-GR1 용액을 복강 내 투여합니다.
- 마우스를 한 번에 하나씩 이소플루란 또는 기타 기관적으로 승인된 마취제로 마취하십시오.
참고: 이소플루란은 유도 중에 3%-5% 농도로 투여해야 합니다. 마우스가 움직이지 않으면 수술 기간 동안 효과가 있도록 이소플루란 농도를 1%-3%로 낮춥니다.- 호흡수, 발가락 핀치 반응의 부재, 귀와 입의 적절한 분홍색 착색을 관찰하여 적절한 마취 깊이에 대해 마우스를 모니터링합니다.
주의 : 적절한 마취 기계 및 청소 방법을 사용하고 이소 플루 란 증기에 노출되지 않도록하십시오.
- 호흡수, 발가락 핀치 반응의 부재, 귀와 입의 적절한 분홍색 착색을 관찰하여 적절한 마취 깊이에 대해 마우스를 모니터링합니다.
- 마우스를 가열 패드 또는 다른 열원으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
- 장갑을 낀 손가락으로 눈에 작은 연고 방울을 두드려 안과 연고를 투여하십시오.
- 진통제 부 프레 노르 핀 (0.08 mg / kg)과 카프로 펜 (5 mg / kg) ( 재료 표 참조)을 피부를 꼬집고 신체와 평행 한 각도로 주사하여 피하 투여하십시오.
참고: 기관 프로토콜에 따라 치료 전 진통제를 준비하십시오. 진통제의 선택 및 관리에 대한 제도적 지침을 따르십시오. 이 연구에서 사용 된 진통 방법은 2.7 단계 및 보충 그림 1에 요약되어 있습니다. - 마우스를 꼬리로 약간 들어 올리고, 복부를 노출시키고, 인슐린 1mL (12.7mm) 주사기를 사용하여 30 ° 각도로 주사하여 항 GR1 (2.4 단계에서 제조)을 복강 내 투여합니다.
- 동물에 안전한 전기 클리퍼( 재료 표 참조)를 사용하여 마우스 등쪽의 중간 및 윗부분을 면도합니다.
- 모든 모발을 지우고 면도한 피부에 30초에서 1분 동안 충분한 양의 제모 연고를 바르십시오.
- 종이 타월과 PBS로 제모 연고를 완전히 닦아냅니다.
3. 이식 절차
- 마우스를 제모 스테이션에서 떨어진 보조 수술 위치로 옮깁니다.
- 요오드 면봉 스틱으로 수술 부위를 원으로 멸균하고 중앙에서 시작하여 탈모 부위의 가장자리쪽으로 운동합니다.
- 마우스 위에 멸균 플라스틱 랩을 놓고 접목 할 영역의 크기보다 약간 큰 플라스틱의 창을 자릅니다.
- 메스로 이식 할 기증자 피부의 직사각형 모양의 10mm x 10mm 부분을 자릅니다. 집게의 뒷면으로 기증자 피부를 제자리에 단단히 잡고 메스로 집게를 따라 절단하여이를 수행하십시오.
- 수술 용 가위를 사용하여 기증자 피부 조각의 크기와 일치하는 마우스 피부의 직사각형 영역을 잘라내어 이식 침대를 만듭니다. 집게를 사용하여 몸에서 피부를 빼내고 가위를 몸에서 멀리 비스듬히 기울여 피부를 잘라 얼굴이 깊숙이 베이지 않도록 합니다.
- 기증자 피부 조각을 표피 쪽이 위로 향하게 하여 준비된 이식편 베드에 놓습니다.
- 집게의 뒷면을 사용하여 기증자 피부가 이식 침대에 완전히 평평해질 때까지 앞뒤로 미끄러 져 피부를 조작합니다.
- 기증자 피부가 마우스 피부와 만나는 곳에 수술용 접착제 조직 접착제( 재료 표 참조)를 한 방울 추가하고 접착제가 조직에 부착되도록 마우스와 기증자 피부를 집게로 1-2초 동안 유지합니다. 이식편의 가장자리를 완전히 밀봉하고 접착제가 완전히 건조되도록 합니다.
- 아래 단계에 따라 마우스(그림 1)에 붕대를 감습니다.
- 이식편 부위를 완전히 덮을 수있을만큼 큰 바셀린 거즈 조각 ( 재료 표 참조)을 자릅니다.
- 바셀린 거즈로 이식편을 덮고 집게를 사용하여 거즈를 피부에 가볍게 누르십시오.
- 투명 필름 드레싱 스트립을 세로로 잘라 너비가 마우스의 상처를 덮을만큼 충분히 커지도록합니다.
- 투명 필름 드레싱을 접착면이 아래로 향하도록 거즈 위로 단단히 누릅니다. 마우스를 빠르게 굴려 드레싱을 몸통 주위로 완전히 감싸서 호흡을 방해하지 않고 단단히 고정되고 모든 팔다리가 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
- 마우스를 복구 케이지에 넣고 경계하고 움직일 때까지 모니터링합니다. 회수 후 최소 15분 동안 케이지 일부에 열원을 제공하십시오.
알림: 동물은 회복 케이지에 넣은 후 1-5 분 이내에 회복 될 것으로 예상됩니다.
- 접목 후 마우스를 단독으로 수용하십시오.
- 기관 프로토콜에서 요구하는 대로 수술 후 진통제를 관리합니다.
참고 : 부 프레 노르 핀 (0.08 mg / kg)은 본 연구에서 4-6 시간 후에 피하 투여되었습니다.
4. 수술 후 절차
- 이식 거부를 방지하기 위해 이식 후 4일, 7일 및 11일에 100μL(100μg)의 anti-GR1을 복강 내 주사합니다(보충 그림 1).
- 필요에 따라 붕대를 교체하고 마우스로 제거한 경우 붕대를 교체하십시오.
- 7 일째에 모든 마우스를 붕대로 감습니다.
- 14 일에 붕대를 제거하십시오.
- 이식 거부 및 전신 염증 (체중 감소, 탈모, 극심한 혼수 상태)의 징후가 있는지 마우스를 모니터링하십시오.
- 이식 후 3 주에서 6 주 사이에 생쥐를 수확하십시오.
- 조절자-제어된 이산화탄소(CO2) 투여를 통해 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 이룩한다.
참고: 안락사에 대한 제도적 지침을 따르십시오. - 마우스14로부터 피부 이식편을 해부한다. 파라핀 매립 및 조직학 염색을 위한 절편 전에 24시간 동안 10% 포르말린에 이식편의 일부를 배치합니다9.
- 피부 이식편을 가위로 다지고 밤새 세포 배양 배지에서 250IU/mL의 콜라게나제 IV 및 0.02mg/mL의 DNase로 효소적으로 소화합니다. 표면 및 세포내 마커에 대한 세포를 앞서 기술된 절차14에 따라 염색한다.
- 조절자-제어된 이산화탄소(CO2) 투여를 통해 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 이룩한다.
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Representative Results
인간 피부 이종 이식은 슈퍼 배리어 동물 시설 내부의 NSG 마우스에서 수행되었습니다. 성공은 이식 후 마우스의 연장 이식편 및 마우스 생존 및 행동 건강에 의해 정의되었습니다. 수술 후 일주일 동안의 열악한 생존은 처음에는 실험 성공의 가장 큰 장벽으로 관찰되었으며, 마우스의 최대 50 %가 안락사를 필요로했습니다. 멸균 기술을 개선하고 수술 중 및 수술 직후 마우스 체온을 더 잘 지원하면 수술 생존율이 지속적으로 80% 이상, 종종 90%-100% 생존율로 증가했습니다. 마우스 식수에 항생제를 첨가하는 것이 시도되었지만 결과를 개선하는 것으로 확인되지 않았으며 결과의 잠재적 혼란으로 중단되었습니다. 성공적으로 이식 된 마우스는 이식 후 며칠 동안 활동적이고 건강하게 보일 것입니다. 쥐들은 평소와 같이 우리 주위를 돌아 다니며 탐험하고 둥지를 짓고 먹고 마셨다. 몸이 좋지 않은 마우스는 게으르고 반응이없는 것처럼 보일 수 있으며 체중을 유지하기에 충분히 먹거나 마시지 않을 수 있습니다. 무기력한 쥐에게 부드러운 사료와 경구 수분 공급 옵션을 보충하면 수술 후 회복에 도움이 될 수 있습니다.
올바르게 치유되는 이종 이식편은 먼저 딱지가 생기고 수술 후 약 50 일 이내에 회복됩니다. 이식편은 시간이 지남에 따라 수축할 수 있지만 기증자 피부가 마우스의 피부와 만나는 가장자리 주위에 부착된 상태를 유지합니다(그림 2). 이식편 딱지는 가라앉지만 이식편은 건강한 사람의 피부보다 두껍고 염증이 더 많이 남아 있습니다(그림 2). 이식편의 과도한 수축이 발생하여 종점 분석에 사용할 수 있는 조직이 감소할 수 있습니다. 일관된 크기의 이식편과 적절한 이식편 배치를 활용하면 이러한 문제를 완화 할 것으로 예상됩니다. 5 개의 독립적 인 실험을 통해 모든 이식편은 이식 후 최대 50 일까지 수확 시점까지 생존했습니다.
조직 분석에는 효소 소화 후 면역 조직 화학 및 단일 세포 분석이 포함될 수 있습니다. 피부의 일부를 세포 배양 배지에서 250IU/mL의 콜라게나제 유형 IV 및 0.02mg/mL의 DNase에서 밤새 소화에 의해 처리하고( 재료 표 참조), 이전에 설명된 바와 같이 표면 및 세포내 마커에 대해 염색하였다14. 유세포 분석에 의한 분석은 대부분의 이식편 내에서 인간 면역 세포의 지속적인 존재를 밝혀 냈지만 개수는 이종 이식편간에 다양했습니다 (그림 3A). 그림 3B 는 성공적인 이식편(왼쪽)과 인간 면역 세포를 유지하지 못한 이식편(오른쪽)의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이식편의 중심에서 채취 한 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 (H & E) 섹션을 분석 한 결과, 35 일과 50 일 시점 모두에서 인간 진피와 표피로 구성된 손상되지 않은 비 활력 피부가 밝혀졌습니다 (그림 4).
그림 1: 수술 후 마우스에 붕대를 감는 방법. 마우스는 마취 상태에서 바셀린 거즈와 투명 필름 드레싱으로 단단히 싸여 있습니다. (A) 바셀린 거즈를 수술 상처보다 약간 큰 부위에 놓습니다. (B) 투명 필름 드레싱이 준비됩니다 : 긴 스트립이 바셀린 거즈보다 약간 넓게 절단됩니다. 투명 필름 드레싱의 접착면을 덮는 뒷면이 부분적으로 제거됩니다. (C) 필름의 접착면이 마우스 뒷면에 단단히 밀착되어 필름의 앞쪽 끝에 1 인치의 공간이 남습니다. (D) 마우스가 등을 켭니다. 필름의 돌출된 앞부분이 마우스에 눌려지고 뒷면이 제거됩니다. (E) 마우스를 필름에 단단히 감싸고 마우스를 감쌀 때 나머지 지지체를 제거합니다. (F) 마우스가 드레싱에 성공적으로 싸여 있고 팔과 다리가 제한되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이식 후 10일부터 21일까지의 이식 동물의 대표 이미지. (A-C) 10 일째에 최적의 이식을받은 3 마리의 다른 마우스. (D-E) 21 일에 이식을받은 두 마리의 다른 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이식된 피부의 면역 세포 키메라. 이종 이식편으로부터 인간 면역 세포 회수의 유세포 분석 데이터. 데이터는 일중항, 라이브, 인간 CD45+ 마우스 CD45-의 이벤트에 대해 게이팅됩니다. (A) 2개의 독립적인 실험으로부터 회수된 세포 수(살아있는 인간 CD45+ 이벤트). (B) 인간 및 마우스 CD45+ 면역 세포 염색의 대표 플롯은 인간 면역 구획의 유지에 실패한 이식편(오른쪽)과 비교하여 성공적인 이식편(왼쪽)에서 염색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 35일 및 50일에 이식된 인간 피부의 조직학. 이식 된 피부를 35 일 (A) 또는 50 일 (B)에 마우스로부터 수확하고, 10 % 포르말린으로 보존하고, 파라핀을 포매하고 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)에 대해 염색 하였다. (A) 표피는 중등도 과형성(아칸토시스), 경미한 과육아증 및 조밀한 각화각화증을 보인다. 유두 진피에는 때때로 확장되고 혼잡 한 모세 혈관이 있습니다. 멜라닌 세포와 멜라닌 색소는 표피의 기저층에 존재합니다. 진피는 적당히 세포질이며 창백한 세포 융합 세포질과 흩어져있는 림프구가있는 통통한 타원형 섬유 아세포로 구성됩니다. (B) 표피는 층상 편평 상피, 각화 된 층의 바구니 직조 오르토 각화증을 포함하며 정상 두께입니다. 멜라닌 세포와 멜라닌 색소는 표피의 기저층에 존재합니다. 진피는 타원형 섬유 아세포와 약간 강화 된 세포 외 기질 침착을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 이종이식 연구를 위해 채택된 프로토콜의 타임라인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스 이종이식 피부 이식 모델은 생체내 설정14에서 인간 피부 면역 반응을 기계적으로 해부하는 핵심 기술이다. 성공적인 피부 이종 이식 이식은 마우스 및 피부 표본 및 마우스의 적절한 준비와 무균 설치류 수술 방법15의 준수에 달려 있습니다. 배지(예: 멸균 식염수)의 차가운 온도에서 피부 샘플을 급속 냉각 및 적절하게 보관하는 것은 이식 전에 지속적인 조직 건강을 보장하는 데 중요합니다12. dermatome과 같은 도구를 사용하여 분할 두께 샘플을 수집하면 마우스 간의 샘플 깊이의 일관성을 허용하고 숙주로부터의 영양소 공급을 증가시켜 이식 생존을 개선합니다10. 표피 슬라우잉을 갖는 이식편 완전성의 손실이 관찰될 수 있으며, 특히 혈액 공급이 중단된 전-두께 이식편에서 관찰될 수 있다(16). 수술을 통한 및 수술 후의 마우스 생존은 멸균 기술, 수술 중 및 수술 후의 열 공급, 및 수술 접착제(15)를 이용하는 것과 같은 수술 시간을 최소화하는 기술에 의해 보조된다. 이식 후 항-GR1의 투여는 이식편 생존을 촉진하기 위해 면역결핍 숙주에서 나머지 마우스 면역 반응의 억제를 허용한다10. 이러한 방법은 이종이식 이식 모델 동안 마우스 및 이식편 생존 가능성을 높이고 한 실험에서 다음 실험으로 실험 횟수와 재현성을 향상시킵니다.
매우 유용하지만, 입증 된 바와 같이 이종 이식 피부 이식 모델에는 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이식편은 염증 환경에 존재하며, 일과적 허혈 및 쥐 골수 세포를 이용한 인간 이식 조직의 침윤에 이차적 일 가능성이 가장 높습니다. 따라서, 그것은 정상 상태에서 인간 피부를 반사하지 않으며, 모든 인간 염증성 피부 질환을 완전히 반영하지 않을 수 있다(10, 14). 병변 피부에서 임상 생검을 이식하여 인간 염증성 질환을 연구하는 것은 대안적인 전략이지만 사용 가능한 생검 수의 제한과 이식 깊이의 일관되지 않은 제어로 인해 이 옵션이 덜 유리합니다. 또한, 이종 이식 이식은 인간의 말초 면역 구조를 요약하지 않습니다. 마우스 주변을 인간 세포로 재구성하는 것은 NSG 마우스 림프 구조가 인간 세포 생착 전에 위축되기 때문에주의 사항을 가질 수도 있습니다. 이것은 일부 설정(10,17)에서 우선적인 셀 선택으로 이어질 수 있다. 또한 피부 표본의 피부 생착 및 면역 세포 회복은 치료가 없는 경우에도 마우스마다 다를 수 있습니다. 이 모형이 그룹 간의 일관된 차이를 관찰하려면 조건당 최소 10번의 반복실험을 수행하는 것이 좋습니다. 이식 후 초기 몇 주 동안 이식편 치유 및 재 혈관 형성이 발생하고 중재의 효과는 생착 단계에 따라 달라질 수 있으므로 실험적 질문에 대해 적절한 분석 기간을 조정해야 할 수 있습니다.
이러한 단점에도 불구하고, 인간 이종이식 피부 이식 모델은 생체내에서 온전한 기관에서 인간 피부 면역 반응을 연구하기 위한 몇 안 되는 분석 중 하나로 남아 있다. 트랜스제닉 마우스 모델은 기계론적 경로 해부를 허용할 수 있지만, 해부학, 면역 세포 구성 및 우성 면역 경로의 차이는인간 질병으로의 번역을 제한합니다1. 인간 유래 세포의 생체외 배양, 피부 오가노이드 모델, 및 인간 조직 체외이식편 연구가 대안적으로 사용될 수 있지만, 또한 면역 세포 네트워크의 파괴 및 온전한 조직으로부터의 면역 세포의 이탈을 포함하는 제한이 있을 수 있다18,19. 따라서, 이종이식 피부 이식 모델은 전임상 생체내 환경에서 염증에 대한 치료 후보 및 인간 피부 반응을 연구하기 위한 핵심 방법으로 남아 있다.
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Disclosures
MDR은 TRex Bio 및 Sitryx의 설립자입니다. MDR과 MML은 Sitryx, Q32 및 TRex Bio로부터 연구 자금을 지원받습니다.
Acknowledgments
이 연구는 TRex Bio의 후원 연구 계약과 NIH (1R01AR075864-01A1)의 보조금으로 부분적으로 자금을 지원했습니다. JMM은 암 연구 학회 (보조금 26005)의 지원을 받고 있습니다. 우리는 NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 및 S10 1S10OD018040-01에 의해 부분적으로 지원되는 Parnassus 유세포 분석 코어를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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