Summary
يصف هذا البروتوكول فحصا لتحديد الاستجابة لليفاميسول ، وهو ناهض دوائي لفئة واحدة من مستقبلات Caenorhabditis elegans acetylcholine. في اختبار السباحة الليفاميزول السائل هذا ، يلاحظ الباحثون بصريا ويقدرون الشلل المعتمد على الوقت للحيوانات المزروعة في ألواح 24 بئرا.
Abstract
عند التقاطع العصبي العضلي (NMJ) ، يؤدي ربط الناقل العصبي المثير أستيل كولين (ACh) بمستقبلات ما بعد المشبكي إلى تقلص العضلات. كما هو الحال في العضلات الهيكلية الفقارية ، مطلوب الإشارات الكولينية في عضلات جدار الجسم للكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans للحركة. التعرض لليفاميسول ، وهو ناهض دوائي لفئة واحدة من مستقبلات ACh على عضلات جدار الجسم ، يسبب شللا يعتمد على الوقت للحيوانات البرية. تشير الحساسية المتغيرة للليفاميزول إلى وجود عيوب في الإشارات في NMJ أو وظيفة العضلات. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص ليفاميزول السائل الذي يتم إجراؤه على C. elegans المزروع في لوحات 24 بئرا. تسمح السباحة القوية للحيوانات في السائل بتقييم وقياس الشلل الناجم عن الليفاميزول في مئات الديدان على مدى ساعة زمنية واحدة دون الحاجة إلى التلاعب المادي. يمكن استخدام هذا الإجراء مع كل من النوع البري والمتحورات التي غيرت الحساسية للليفاميزول لإظهار العواقب الوظيفية للإشارات المتغيرة في NMJ.
Introduction
يؤدي تنشيط مستقبلات الأسيتيل كولين بعد المشبكي (AChRs) على العضلات الهيكلية إلى إشارة كهربائية تؤدي إلى تقلص العضلات. اضطراب الوظيفة العصبية العضلية يؤدي إلى متلازمات الوهن العضلي وضمور العضلات في البشر1،2،3،4. تم استخدام الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans على نطاق واسع للتعرف على العمليات البيولوجية الأساسية المحفوظة تطوريا وآليات المرض. عضلات الهيكل العظمي الفقارية وعضلات جدار الجسم C. elegans مكافئة وظيفيا في التحكم في الحركة5. هنا ، يتم تقديم فحص بسيط يمكن استخدامه لمقارنة C. elegans من النوع البري مع الطفرات التي غيرت الإشارات العصبية العضلية أو وظيفة العضلات.
تتسبب المدخلات المثيرة والمثبطة الواردة من الخلايا العصبية الحركية الكولينية و GABAergic ، على التوالي ، في تقلص العضلات على جانب واحد من جسم C. elegans بينما تسترخي العضلات الموجودة على الجانب الآخر ، مما يتيح الحركة المنسقة6. Levamisole ، وهو عامل مضاد للديدان يستخدم لعلاج عدوى الديدان الخيطية الطفيلية ، يرتبط وينشط بشكل أساسي فئة واحدة من AChRs على عضلات جدار الجسم ، مما يؤدي إلى شلل يعتمد على الوقت7. وبالتالي ، يمكن استخدام الحساسية المتغيرة للليفاميزول لتحديد C. elegans مع عيوب في توازن الإشارات المثيرة والمثبطة 7,8,9,10,11,12,13,14,15. على سبيل المثال ، الطفرات في الوحدات الفرعية من AChR الحساسة لليفاميزول (L-AChR) ، مثل UNC-63 ، وكذلك تجانس C. elegans من Cubilin ، LEV-10 ، وهو مطلوب لتجميع L-AChR في المشبك ، وتأثير الإشارات المثيرة ويؤدي إلى مقاومة الليفاميزول 7,8. الطفرات في مستقبلات GABAA UNC-49 تقلل من الإشارات المثبطة وتسبب فرط الحساسية للليفاميزول12.
تم تقييم فرط الحساسية أو مقاومة الليفاميزول تقليديا عن طريق نقل الحيوانات إلى ألواح أجار التي تحتوي على ليفاميزول ثم حث الديدان بانتظام لتحديد النقطة الزمنية التي يحدث فيها الشلل13،14،15. لقد طورنا مقايسة سباحة ليفاميزول سائلة تلغي الحاجة إلى التلاعب المادي بالحيوانات وتسمح بفحص مئات الحيوانات في 1 ساعة فقط. هنا ، يتم وصف استخدام هذا الفحص مع الحيوانات من النوع البري ، unc-63 (x26) ، lev-10 (x17) ، و unc-49 (e407). ومع ذلك ، يمكن أيضا إجراء هذا البروتوكول على C. elegans المعرضة ل RNAi ، كما حدث للتحقق من صحة الضربات القاضية المحددة في شاشة RNAi على مستوى الجينوم لحساسية ليفاميزول المتغيرة11.
بالنسبة لهذا الفحص الدوائي ، نمت الديدان حتى سن البلوغ في لوحات 24 بئرا ، وتمت إضافة 0.4 mM levamisole في المخزن المؤقت M9 إلى كل بئر ، وتم تسجيل عدد الحيوانات المتحركة كل 5 دقائق لمدة 1 ساعة. لوحظ الشلل الناجم عن ليفاميسول بصريا بمرور الوقت ، وبعد الانتهاء من الفحص ، تم تحديد البيانات كميا. يسمح تقييم الطفرات جنبا إلى جنب مع C. elegans من النوع البري للطلاب بإجراء تنبؤات حول تأثيرات النمط الظاهري المحتملة أولا ثم إجراء تجارب لاختبار فرضياتهم. في الختام ، يعد هذا الفحص البسيط وغير المكلف والسائل ليفاميزول طريقة مثالية لإثبات تأثير فقدان جينات معينة على وظيفة NMJ.
Protocol
1. إعداد لوحات لفحص ليفاميزول
- تحضير وسائط نمو الديدان الخيطية المتوسطة (NGM) عن طريق الجمع بين 3 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 2.5 غرام من الببتون ، و 17 غرام من الأجار مع 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI) في قارورة مع شريط تحريك.
- بعد التعقيم ، ضع الوسائط على صفيحة ساخنة مضبوطة على 70 درجة مئوية وحرك بسرعة معتدلة لمدة 1 ساعة.
- أضف 1 مل من 5 ملغم / مل من الكوليسترول بقطرة لمنع هطول الأمطار ، و 1 مل من 1 م كاكل2 ، و 1 مل من 1 م ملغم سو4 ، و 25 مل من 1 م درجة الحموضة 6.0 فوسفات البوتاسيوم العازلة إلى وسائل الإعلام.
- نقل 2 مل من وسائط NGM إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا مع ماصة مصلية معقمة (الشكل 1).
- اترك الألواح لتجف على سطح الطاولة لمدة 2 أيام قبل البذر بالبكتيريا. للتخزين على المدى الطويل ، ضعها في 4 درجات مئوية.
- اخرج OP50 E. coli على صفيحة مرق ليسوجيني (LB) وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- اختر مستعمرة OP50 واحدة في مرق B (10 جم من التربتون و 5 جم من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من DI H2O) واضبط الثقافة تهتز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- باستخدام ماصة معقمة ، قم بإسقاط 30 ميكرولتر من تعليق OP50 على الأجار في منتصف كل بئر (الشكل 1).
ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف سطح الأجار لأن هذا سيؤدي إلى حفر الدودة. - دع الألواح تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أيام على الأقل بعد البذر للسماح بتكوين العشب البكتيري.
ملاحظة: إذا لم تكن البكتيريا الموجودة في الآبار المركزية جافة بعد يومين ، فاترك الألواح مفتوحة في الغطاء لمدة 20 دقيقة (الشكل 1). يجب سكب الألواح وبذورها بالبكتيريا قبل 1-2 أسابيع من الفحص.
2. مزامنة C. elegans (اليوم 1)
- تنمو من النوع البري ، unc-63 (x26) ، lev-10 (x17) ، و unc-49 (e407) C. elegans إلى مرحلة البلوغ على ألواح 6 سم ، وإعداد ما لا يقل عن ثمانية لوحات لكل سلالة. تأكد من وجود العديد من البالغين غير الجائعين على اللوحات.
ملاحظة: هذا هو ضعف عدد الأطباق حسب الحاجة. ومع ذلك ، من المهم أن يكون لديك لوحات احتياطية في حالة تدمير الدفعة الأولى من البيض أثناء التبييض. - اصنع 10x M9 عازلا عن طريق إذابة 59.6 جم من Na 2 HPO 4 (ثنائي الأساس) ، و 29.9 جم من KH 2 PO 4 (أحادي القاعدة) ، و 12.8 جم من كلوريد الصوديوم ، و2.5جم منMgSO4 في 750 مل من ماء DI مع التحريك. بمجرد إذابته ، ارفع مستوى الصوت إلى 1 لتر وقم بتعقيم التصفية. تمييع 1:10 والأوتوكلاف لجعل 1x M9 المخزن المؤقت.
ملاحظة: يمكن إجراء المخزن المؤقت M9 1x قبل أسابيع أو أشهر. - تحضير محلول التبييض تحت غطاء المحرك في يوم المزامنة. امزج 10 مل من المبيض (جدول المواد) ، و 2.5 مل من 10 N NaOH ، و 37.5 مل من ماء DI في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ارتد نظارات واقية وقفازات ومعطفا مختبريا عند العمل مع محلول التبييض.
- باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، اغسل الديدان البالغة الجرافية من أربعة ألواح على الأقل مع مخزن مؤقت M9 1x وانقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- تدور في 716 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة supernatant باستخدام ماصة نقل.
- أضف 10 مل من محلول التبييض. قم بعكس الأنبوب أو هزه بلطف لمدة 4 دقائق تقريبا حتى تذوب معظم جثث الدودة ، ولكن ليس كلها ، (الشكل 1).
ملاحظة: احرص على عدم الإفراط في تبييض الديدان لأن هذا سيدمر البيض. قد تزيد بعض الطفرات من صعوبة عزل البيض. - تدور في 716 × غرام لمدة 1 دقيقة.
- صب محلول التبييض في حركة واحدة ؛ طالما أن الأنبوب لا يهتز في هذه المرحلة ، فإن البيض سوف يلتصق بجانب الأنبوب.
- أضف 15 مل من المخزن المؤقت M9 1x وعكسه. تدور بسرعة 716 × جم لمدة 1 دقيقة، وتصب المخزن المؤقت M9 في حركة واحدة سلسة.
- قم بإجراء ثلاث غسلات في المجموع باستخدام المخزن المؤقت M9 1x، كما هو موضح في الخطوة 2.9.
- بعد الغسيل النهائي ، أضف 10 مل من 1x M9 الطازج وضعه على دوار طوال الليل عند 15 درجة مئوية لعزل مجموعة متزامنة من مرحلة اليرقات الأولى (L1) الجائعة.
ملاحظة: قبل وضعه على الدوار، تحقق للتأكد من وجود بيض في المخزن المؤقت M9. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر الإعداد مع لوحات احتياطية وتبييض لفترة أقصر.
3. طلاء متزامن C. elegans (اليوم 2)
- اطبع خريطة لوحة من 24 بئرا وقم بتعيين السلالات إلى أماكن عشوائية. يجب تمثيل كل سلالة في لوحة 24 بئرا ست مرات على الأقل.
- بعد حوالي 24 ساعة من إعداد المبيض ، قم بتدوير ديدان L1 الجائعة في المخزن المؤقت M9 عند 716 × g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة ~ 9 مل من المخزن المؤقت M9 باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، ثم امزج بلطف ديدان المرحلة اليرقية الأولى الجائعة (L1s) في المخزن المؤقت M9 المتبقي.
- ماصة على الفور 3 ميكرولتر من الديدان في المخزن المؤقت M9 على شريحة المجهر وتحديد عدد L1s ؛ الرقم المطلوب هو 20-30 L1s في 3 ميكرولتر.
ملاحظة: تحقق من عدد الديدان لكل 3 ميكرولتر على الأقل 2x ، مع عكس الأنبوب في كل مرة. - Pipet 3 ميكرولتر من L1s (إجمالي 20-30 ديدان) في كل بئر وفقا لخريطة اللوحة المعدة مسبقا (الخطوة 3.1 ؛ الشكل 1).
ملاحظة: قم بعكس الأنبوب باستخدام L1s في M9 بشكل متكرر للحفاظ على توزيع متساو للديدان لأنها سوف تستقر في القاع. إذا لم يتم ذلك ، فستحتوي بعض الآبار على عدد قليل جدا من الديدان ، في حين أن البعض الآخر سيكون لديه الكثير جدا. أيضا ، لا تخترق الآجار بطرف الماصة لأن هذا سيؤدي إلى حفر الحيوانات. - دع الديدان تنمو إلى مرحلة البلوغ لمدة 3 أيام عند 20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يؤثر استخدام درجات حرارة نمو مختلفة وبعض الطفرات على سرعة النضج ، لذا تأكد من مراعاة دورة حياة C. elegans.
4. إجراء فحص ليفاميزول (اليوم 5)
- اطبع ورقة بيانات فارغة ، والتي سيتم استخدامها لتسجيل عدد الديدان التي تتحرك في كل بئر كل 5 دقائق لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: سيتمكن الطلاب من إحصاء الديدان في 12 بئرا على الأكثر كل 5 دقائق. يتم فحص أعلى 12 بئرا في الساعة الأولى ، مع فحص الآبار ال 12 السفلية في الساعة اللاحقة. - تحقق من الديدان في لوحات 24 بئر. باستخدام علامة ، اصنع علامة "X" على غطاء اللوحة فوق أي آبار بها تلوث أو تتضور جوعا أو تحتوي على الكثير من الديدان (>40) ، مما سيجعل العد صعبا.
- اصنع محلول ليفاميزول 0.4 مللي متر عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من مخزون ليفاميزول 100 مللي متر إلى 50 مل من 1x M9. تحضير مخزون ليفاميزول 100 مللي متر عن طريق إذابة 240.76 ملغ من هيدروكلوريد الليفاميزول في 10 مل من H2O وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب تخفيف ليفاميزول في M9 ؛ التخفيف في H2O يسرع الشلل. يجب على الطلاب ارتداء القفازات. ابتلاع تركيزات عالية من الليفاميزول سام. - ابدأ تشغيل مؤقت ثم ، باستخدام ماصة نقل ، أضف 1 مل من 0.4 mM levamisole إلى البئرين الأولين ، بحيث تسبح الحيوانات بحرية. استمر في إضافة ليفاميزول إلى الآبار المجاورة ، مما يضاعف الوقت وفقا لعدد الآبار المراد فحصها.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم فحص 10 آبار، إضافة ليفاميزول بالطريقة التالية: الآبار 1 و 2 في الوقت 0، الآبار 3 و 4 بعد 1 دقيقة، الآبار 5 و 6 بعد 2 دقيقة، الآبار 7 و 8 بعد 3 دقائق، والآبار 9 و 10 بعد 4 دقائق. - في 5 دقائق، ابدأ يدويا في عد عدد الديدان المتحركة في كل بئر فقط، بدءا من البئر الأول، وسجل هذا الرقم في ورقة البيانات (الشكل 1). يمكن استخدام العدادات ولكنها ليست مطلوبة لتحديد عدد الديدان المتحركة بدقة.
ملاحظة: يحتاج الطلاب إلى مراقبة المؤقت لأنهم في بعض الأحيان سوف يتخلفون خلال النقاط الزمنية المبكرة قبل أن تشل العديد من الديدان. يمكن تعديل عدد النقاط الزمنية ، أو يمكن فحص عدد أقل من الآبار في كل نقطة زمنية إذا لزم الأمر. - استمر في حساب عدد الديدان المتحركة في كل بئر كل 5 دقائق لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: الغمر في M9 يحفز حركة السباحة المستمرة على مدار هذا الفحص لمدة 1 ساعة ، مما يلغي الحاجة إلى حث الديدان لتقييم الشلل (الشكل 2A). التعرض لمحلول ليفاميزول 0.4 mM يؤدي إلى شلل يعتمد على الوقت كما لوحظ من خلال التوقف عن السباحة. الديدان التي تشل لا تتعافى. - كرر الخطوات 4.4.-4.6. لبقية الآبار في اللوحة.
- في نهاية الفحص ، أو عندما يسمح الوقت ، سجل العدد الإجمالي للديدان في كل بئر.
5. تحليل البيانات
- احصل على خريطة اللوحة (الخطوة 3.1) وسجل السلالة التي تتوافق مع كل بئر.
ملاحظة: نظرا لكمية البيانات التي تم جمعها، سيستغرق التحليل والمناقشة اللاحقان للبيانات ساعتين على الأقل. - أدخل البيانات في جدول بيانات، بدءا من العدد الإجمالي للديدان في كل بئر وتنظيمها حسب النمط الوراثي.
- الجمع بين البيانات من الآبار ، وتحديد عدد الديدان التي تتحرك في كل نقطة زمنية لكل سلالة.
- استخدم هذه البيانات لإنشاء "منحنى البقاء على قيد الحياة" في البرنامج الإحصائي (جدول المواد) لعرض الشلل المعتمد على الوقت للسكان بصريا (الشكل 2 ب).
- أنشئ جدول بيانات بحيث يشير العمود الأيمن إلى الوقت وتحتوي الأعمدة اللاحقة على البيانات الخاصة بكل سلالة. لكل مشلول خلال أول 5 دقائق ، قم بإنشاء صف وأدخل "1" لمدة 5 دقائق. كرر هذا لكل نقطة زمنية. بالنسبة لجميع الحيوانات التي لا تشل بنهاية الفحص ، أدخل "0" لمدة 60 دقيقة.
- قم بإجراء مقارنات زوجية باستخدام اختبار الرتبة القياسية (Mantel-Cox) في البرنامج الإحصائي (جدول المواد) لتحديد ما إذا كان هناك فرق ذي دلالة إحصائية بين سلالتين مختلفتين.
- للتحليل الإضافي/البديل، بدلا من تنفيذ الخطوة 5.3. والخطوة 5.4.، تحديد النسبة المئوية للحيوانات التي تتحرك في كل بئر في كل نقطة زمنية. ارسم المتوسط بخطأ قياسي في كل نقطة زمنية لجميع السلالات التي تم فحصها باستخدام برنامج جدول بيانات أو برنامج إحصائي (الشكل 2C).
Representative Results
تسمح الإشارات من خلال مستقبلات AChRs و GABA للعضلات الموجودة على جانب واحد من جسم C. elegans بالانقباض بينما تسترخي العضلات الموجودة على الجانب الآخر ، مما يتيح الحركة المنسقة 6,16. يؤدي ارتباط الليفاميزول ب L-AChRs المتأين إلى انكماش ، مما يؤدي إلى شلل يعتمد على الوقت للحيوانات البرية. هنا ، قمنا بتقييم حساسية النوع البري ، ومتحور unc-63 L-AChR ، ومتحور تجميع lev-10 L-AChR ، ومتحور مستقبلات unc-49 GABAA C. elegans إلى ليفاميزول. الطفرات في الوحدات الفرعية من L-AChR ، وكذلك في الجينات اللازمة للاتجار ب L-AChRs إلى غشاء البلازما العضلية ، وتجميع L-AChRs بعد المشبكي ، وإشارات Ca2 + في اتجاه المصب ، تسبب مقاومة للشلل الناجم عن الليفاميزول 7,8,9,10,11,11,16,17 ، كما لوحظ في الطفرات unc-63 و lev-10 (الشكل 2B ، ج). تسبب فقدان القناة الأيونية ذات بوابات GABA UNC-49 في فرط حساسية الليفاميزول (الشكل 2B ، C) بسبب اضطراب التوازن السليم للإشارات الكولينية و GABAergic12. عندما تم إجراء هذا الفحص مؤخرا من قبل الطلاب الجامعيين في مختبر علم الوراثة المتقدم ، لاحظ 100٪ من الطلاب مقاومة الليفاميزول مع المتحورات unc-63 و lev-10 ، في حين لاحظ 88٪ فرط حساسية الليفاميسول مع المتحور unc-49. هذه البيانات التي تم جمعها باستخدام مقايسة السباحة الليفاميزول السائل تتفق مع الأنماط الظاهرية التي لوحظت في مقايسات الليفاميزول التقليدية القائمة على الألواح7،8،11،12،13.
الشكل 1: مخطط لإعداد وتنفيذ مقايسة الليفاميزول. بعد 2 أيام ، يتم زرع OP50 Escherichia coli في الآبار. تتم مزامنة C. elegans من خلال إعداد التبييض ، المرحلة اليرقية الأولى (L1) لكل سلالة يتم فحصها (النوع البري ، الأسود ؛ unc-63 (x26) ، أرجواني ؛ ليف-10 (x17) ، أخضر ؛ unc-49 (e407) ، أزرق) يتم ماصها في الآبار وفقا لخريطة لوحة محددة مسبقا في اليوم التالي. بعد 3 أيام من النمو عند 20 درجة مئوية ، أو عندما تصل الحيوانات إلى مرحلة البلوغ ، تتم إضافة 0.4 mM levamisole في المخزن المؤقت M9 إلى كل بئر ، ويتم حساب عدد الحيوانات المتحركة كل 5 دقائق لمدة 1 ساعة .
الشكل 2: الشلل الناجم عن ليفاميسول في النوع البري والمتحور التمثيلي C. elegans. (أ) التعرض للليفاميزول 0.4 مللي متر يسبب شللا يعتمد على الوقت؛ لم يلاحظ هذا بالنسبة للحيوانات التي تسبح في المخزن المؤقت M9 1x لمدة 1 ساعة (B) الشلل المعتمد على الوقت للحيوانات من النوع البري (أسود) ، unc-63 (x26) (أرجواني) ، lev-10 (x17) (أخضر) ، و unc-49 (e407) (أزرق) في فحص السباحة levamisol. أدى فقدان الوحدة الفرعية L-AChR UNC-63 أو L-AChR تجميع البروتين LEV-10 إلى مقاومة الليفاميزول ، وتسبب فقدان مستقبل GABAA UNC-49 في فرط حساسية الليفاميسول. n ≥ 50 لكل نمط وراثي ، p < 0.0001 لجميع المتحورات مقارنة بالنوع البري في هذه التجربة التمثيلية. (ج) باستخدام نفس البيانات الواردة في اللوحة (ب)، تم تحديد النسبة المئوية للحيوانات المتحركة في كل نقطة زمنية (متوسط النسب المئوية لكل بئر ± SE) لكل سلالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يمكن للاستجابة المتغيرة لليفاميزول تحديد الجينات اللازمة للإشارات الكولينية بعد المشبكي ووظيفة العضلات. يصف البروتوكول هنا فحص ليفاميزول السائل المستخدم لقياس الشلل المعتمد على الوقت على مدى فترة زمنية مدتها 1 ساعة. يقوم الطلاب بإجراء تنبؤات حول آثار بعض الطفرات الجينية ، وإجراء تجربة بحجم عينة كبير ، ثم تحديد نتائجهم. هذا الفحص هو وسيلة بسيطة وفعالة لقياس الشلل الناجم عن الليفاميزول دون انتقاء الحيوانات أو حثها ، مما يجعلها مناسبة للمختبرات الجامعية ، وكذلك الباحثين الذين يدرسون الانتقال العصبي العضلي. نوقشت هنا بعض المزالق الأكثر شيوعا ، وقيود الفحص ، واختلاف البروتوكول الذي يمكن من استخدامه مع RNAi القاضية. كما نوقش هنا كيف يمكن تضمين هذا الفحص في تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة التدريبية.
التحضير السليم للوحات 24 بئر أمر ضروري. أولا ، يجب أن تكون المروج البكتيرية جافة تماما قبل اكتشاف L1 في الآبار. إذا لم يتم تجفيفها بما فيه الكفاية ، فإن البكتيريا تختلط بمحلول الليفاميزول أثناء الفحص ، مما يحول السائل إلى غائم ويمنع الأفراد من القدرة على حساب الديدان. ثانيا ، عند مزامنة الديدان من خلال إعداد التبييض ، يجب ألا تتعرض الحيوانات لمحلول التبييض لفترة طويلة جدا لأن هذا سيؤدي إلى تفكك الطبقة الواقية على البيض. ثالثا ، من الأهمية بمكان تحديد 20-30 L1s فقط لكل بئر ، لأن الكثير من الديدان في الآبار تجعل من الصعب للغاية حساب العدد الذي يتحرك بدقة في الوقت المخصص. أخيرا ، من المهم الحفاظ على تقنية معقمة أثناء إعداد الألواح حيث لا يمكن فحص الآبار الملوثة.
هناك بعض القيود التي يجب مراعاتها عند إجراء هذا الفحص. أولا، قد يكون حساب عدد الديدان المتحركة في كل بئر كل 5 دقائق أمرا ساحقا للأفراد الذين يفتقرون إلى الخبرة المختبرية السابقة، وقد يؤدي ذلك إلى جمع بيانات غير دقيقة. أما بالنسبة للفحوصات الأخرى المستخدمة لتحديد حساسية الدواء18,19 ، فيمكن إجراء هذه التجربة بنقاط زمنية أقل. ثانيا ، يعد طلاء L1s الجائع المعزول من إعداد التبييض طريقة سهلة للحصول على مجموعة متزامنة. ومع ذلك ، يجب إجراء تعديلات إذا كان توقيت التطوير يختلف بين السلالات التي يتم فحصها. من الممكن اختيار المرحلة الرابعة المتأخرة من اليرقات (L4s) في لوحة من 24 بئرا لهذا الفحص ؛ ومع ذلك ، عند إعداد العديد من اللوحات ، يكون هذا كثيف العمالة. بدلا من ذلك ، ينبغي للمرء أن يحدد طول الوقت الذي تستغرقه كل سلالة للوصول إلى L4 ثم وضع L1s في الآبار في أوقات مختلفة للتكيف مع الاختلافات في سرعة النضج. أخيرا ، في حين يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد الجينات الجديدة المهمة لوظيفة العضلات ما بعد المشبكي11 ، يمكن أيضا أن تحدث استجابة ليفاميزول المتغيرة بسبب طفرة أو ضربة قاضية RNAi للجينات قبل المشبكي12. إذا لوحظت حساسية ليفاميزول متغيرة ، فيجب إجراء تجارب إضافية لتحديد سبب هذا النمط الظاهري.
من خلال إجراء بعض التعديلات على لوحات 24 بئرا ، يمكن أيضا إجراء فحص السباحة ليفاميزول الموصوف على RNAi القاضية11. يمكن تحقيق ضربة قاضية للجين من خلال الحمض النووي الريبي عن طريق تغذية بكتيريا C. elegans التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل المقابلة للجين محل الاهتمام20. لإعداد لوحات RNAi ، يجب إضافة 1 مل من 1M IPTG و 1 مل من 25 ملغ / مل من كاربينيسيلين لكل لتر من الوسائط بعد إزالتها من الأوتوكلاف. تزرع المزارع البكتيرية عن طريق اختيار مستعمرة واحدة إلى 3 مل من مرق LB بالإضافة إلى 3 ميكرولتر من 25 ملغ / mLcarbenicillin ، وتهتز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، ويتم عمل خريطة اللوحة عندما يتم رصد البكتيريا المختلفة في الآبار. C. تتم مزامنة elegans بواسطة إعداد التبييض كما هو موضح ؛ ومع ذلك ، يجب استخدام سلالة RNAi شديدة الحساسية eri-1 (mg366) بدلا من النوع البري لزيادة ضربة القاضية للجينات. تؤدي ضربات RNAi القاضية إلى نفس الأنماط الظاهرية للليفاميزول التي لوحظت للطفرات المفقودةللوظيفة 11.
يمكن استخدام البروتوكول المعروض هنا في الأبحاث المختبرية ، كتجربة قائمة بذاتها في المختبر الجامعي ، أو في الأسابيع الأولى من دورة جامعية متقدمة كمقدمة لتقنيات C. elegans الأساسية والوظيفة العصبية العضلية. في دورة أكثر تقدما قائمة على الاكتشاف ، يمكن للطلاب استخدام هذا الفحص لتحديد ما إذا كان فقدان متجانسات C. elegans للجينات المتحورة في الأفراد الذين يعانون من متلازمات الوهن العضلي أو الضمور العضلي أو الاعتلالات العضلية يغير حساسية الليفاميزول. في الختام ، يوفر اختبار حساسية الليفاميزول البسيط وغير المكلف هذا نهجا عمليا للتعلم عن الإشارات في NMJ واكتساب الخبرة في العمل مع نظام نموذج C. elegans.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر ريا داتاني ولورين هوغستروم ، اللذين جمعا البيانات في الشكل 2B ، C الأعمى عن النمط الوراثي في مختبر BISC413 المتقدم لعلم الوراثة (ربيع 2022) في جامعة ديلاوير. تتوفر معلومات إضافية حول تجربة البحث الجامعي القائمة على الدورة التدريبية BISC413 (CURE) ، بالإضافة إلى الوصول إلى دليل المختبر الذي صممه J. Tanis ، عند الطلب. تم توفير سلالات الديدان الخيطية من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center ، الذي تدعمه NIH-ORIP (P40 OD010440). تم دعم هذا العمل من خلال جائزة P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (إلى J.E.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
